Artykuł metodologiczny

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61546

⸱

3 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Streszczenie

Istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem komórek macierzystych (SC) do odzyskiwania funkcji serca u osób z urazami mięśnia sercowego. Najczęściej terapia komórkami macierzystymi serca jest badana poprzez dostarczanie SC jednocześnie z indukcją uszkodzenia mięśnia sercowego. Podejście to ma jednak dwa istotne ograniczenia: wczesne, wrogie, prozapalne środowisko niedokrwienne może wpływać na przeżycie przeszczepionych SC i nie reprezentuje scenariusza podostrego zawału, w którym prawdopodobnie zostaną zastosowane SC. W tym miejscu opisujemy dwuczęściową serię zabiegów chirurgicznych mających na celu indukcję uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego i dostarczenie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Ta metoda podawania komórek macierzystych może pozwolić na dłuższą żywotność i zatrzymanie wokół uszkodzonej tkanki poprzez obejście początkowej odpowiedzi immunologicznej. Model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego został wywołany u myszy, któremu towarzyszyło dostarczenie mezenchymalnych komórek macierzystych (3,0 x 105), stabilnie eksprymujących lucyferazy genu reporterowego świetlika pod konstytutywnie eksprymowanym promotorem CMV, domięśniowo 7 dni później. Zwierzęta zostały zobrazowane za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego w celu potwierdzenia urazu i wstrzyknięcia komórek. Co ważne, nie stwierdzono dodatkowego wskaźnika powikłań podczas wykonywania tego dwuzabiegowego podejścia do porodu SC. Ta metoda podawania komórek macierzystych, w połączeniu z wykorzystaniem najnowocześniejszych genów reporterowych, może pozwolić na badanie in vivo żywotności i retencji przeszczepionych SC w sytuacji przewlekłego niedokrwienia powszechnie obserwowanego klinicznie, przy jednoczesnym obejściu początkowej odpowiedzi prozapalnej. Podsumowując, opracowaliśmy protokół opóźnionego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego, który może być wykorzystany jako potencjalne nowe podejście do promowania regeneracji uszkodzonej tkanki.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia pozostają najczęstszą przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Stwierdzono, że zdarzenia niedokrwienne serca są szkodliwe dla ogólnej funkcji mięśnia sercowego i otaczających komórek1. Tylko ̴0.45-1.0% kardiomiocytów będzie się regenerować co roku po wystąpieniu uszkodzenia mięśnia sercowego2. Pomimo rosnącego popytu i nieodłącznego skupienia się na opracowywaniu metod leczenia, terapie wspomagające regenerację uszkodzonych tkanek były trudne do opracowania i nadal wymagają dalszej optymalizacji3,4,5. Terapie komórkami macierzystymi zostały wprowadzone jako alternatywna ścieżka odmładzania uszkodzonej tkanki po zdarzeniu niedokrwiennym; Jednak postęp tych terapii został zakwestionowany przez ograniczoną przeżywalność i zatrzymywanie komórek w uszkodzonym obszarze6.

Mikrośrodowisko serca po zdarzeniu niedokrwiennym można scharakteryzować jako niedotlenienie, prooksydacyjne i prozapalne, stwarzając nieprzyjazne warunki dla terapeutycznych komórek macierzystych, które muszą się przystosować do przetrwania7,8. Ponieważ odpowiedź immunologiczna jest wyzwalana w wyniku urazu, naiwne limfocyty, makrofagi, neutrofile i komórki tuczne próbują naprawić uszkodzenie, usuwając umierające komórki i modulując proces przebudowy tkanek9,10,11. W ciągu pierwszych 3 dni po niedokrwieniu stan zapalny osiąga szczyt wraz z uwalnianiem cytokin prozapalnych z dużą liczbą neutrofili i monocytów w obszarze10,12. Po 7 dniach znaczna część stanu zapalnego ustąpiła i rozpoczyna się przejście do komórek naprawczych, trwające aż do zakończenia kaskady przebudowy, około 14 dni u myszy13. Nasza metoda chirurgiczna jest potencjalnym alternatywnym podejściem do wprowadzania leków biologicznych do mięśnia sercowego w celu ominięcia szczytowej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej po uszkodzeniu reperfuzyjnym niedokrwiennym. Jednocześnie pozwoli to na badanie wszelkich metod leczenia w stanie podostrego/przewlekłego niedokrwienia, w którym mogą występować różne zmienne do rozważenia w porównaniu z ostrym zawałem mięśnia sercowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty przeprowadzono na samicach myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni i masie ciała 20-25 g. Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne ze standardami określonymi w Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Narodowa Akademia Nauk, Bethesda, MD, USA) i zostały zatwierdzone przez Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie i intubacja

  1. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem. Jeśli podczas jednej sesji ma być wykonanych wiele operacji, wyczyść narzędzia po każdym zwierzęciu i ponownie wysterylizuj za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami.
  2. Znieczulić myszy 3,5-4% izofluranem w stężeniu 1 l/minO2 w komorze indukcyjnej.
  3. Buprenorfinę SR w dawce 1 mg/kg (przeciwbólową) podawać podskórnie, zważyć zwierzę i wprowadzić masę ciała do respiratora.
  4. Ogol lewą stronę klatki piersiowej od mostka do poziomu ramienia i nałóż krem do depilacji, aby usunąć nadmiar sierści.
  5. W przypadku procedury reperfuzji niedokrwiennej należy utrzymać dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe (PEEP) na respiratorze na poziomie 2cmH 2O. W przypadku procedury opóźnionego wstrzykiwania komórek zmień PEEP na 3 cmH2O, aby zapobiec zapadaniu się płuc.
  6. Zaintubować zwierzę za pomocą rurki dotchawiczej o sile 20 G, przenieść do kontrolowanej poduszki grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała 35-37 °C.
  7. Umieść mysz na respiratorze w pozycji bocznej z końcem czaszki po lewej stronie i końcem ogonowym po prawej.
  8. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-2,5% izofluranu w stężeniu 1 l/minO2 przez pozostałą część zabiegu.
  9. Wyszoruj obszar operowany na przemian wacikami z jodonem i alkoholem trzy razy i nałóż maść okulistyczną na oba oczy.

2. Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne

  1. Za pomocą skalpela z ostrzem #10 wykonaj pionowe nacięcie 2,5 mm na prawo od skrajnego lewego sutka w polu view.
  2. Za pomocą nożyczek przetnij powierzchowne warstwy mięśni, aż mięśnie międzyżebrowe i żebra będą widoczne.
  3. Unosząc żebra i otaczającą tkankę, przetnij przestrzeń międzyżebrową między 4. a 5. żebrem, a następnie włóż retraktor powiek w otwartą przestrzeń.
  4. Cofnij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy, przesuwając płuco do góry i poza zasięgiem wzroku.
  5. Uwidocznij tętnicę LAD i za pomocą nylonowego szwu 9-0 przejdź przez mięsień sercowy pod tętnicą 2,5 mm dystalnie do lewej małżowiny usznej i zawiąż luźny kwadratowy węzeł.
  6. Wytnij 1 cm rurki polietylenowej i umieść ją w luźnym węźle.
  7. Zabezpiecz szew wokół rurki, potwierdź niedokrwienie, a następnie zwolnij po 35 min.
    UWAGA: Potwierdź niedokrwienie bladość i arytmię komorową.
  8. Po zwolnieniu podwiązania i usunięciu rurki należy odczekać 5 minut, aby potwierdzić reperfuzję mięśnia sercowego.
  9. Umieść rurkę cewnika dożylnego 24 G w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.
  10. Zamknij nacięcie międzyżebrowe wchłanialnym szwem 6-0 w prostym przerywanym wzorze.
  11. Zamknij warstwę mięśniową za pomocą wchłanialnego szwu 6-0 w ciągłym wzorze szwów.
  12. Po zamknięciu powierzchownej warstwy mięśniowej należy zdjąć rurkę piersiową, jednocześnie pobierając powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.
  13. Zamknij nacięcie skóry wchłanialnym szwem 6-0 w ciągłym poziomym wzorze materaca
    UWAGA: Szwy nylonowe i nieciągły wzór szwów mogą być również stosowane do warstwy skóry.
  14. Podawać podskórnie 1,5 ml ciepłej soli fizjologicznej i nakładać maść z potrójnym antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.
  15. Wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać przez wentylator na 100%O2 do momentu, gdy będzie w stanie oddychać w sposób ciągły bez pomocy.
  16. Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką (ręcznik papierowy lub zasłona) na ciepłej podkładce o temperaturze 35-37 °C, aż do całkowitego wyzdrowienia.

3. Dostarczanie mezenchymalnych komórek macierzystych myszy

UWAGA: Szczep myszy użyty do zabiegu jest linią wsobną i jest uważany za genetycznie identyczny. Mezenchymalne komórki macierzyste uzyskano od zwierząt tego samego szczepu i, zgodnie z projektem protokołu, immunosupresja nie została wywołana1.

  1. Wykonaj etapy przygotowania i intubacji, tak jak wcześniej dla pierwszego zabiegu.
  2. Usuń szew z warstwy skóry za pomocą nożyczek i kleszczy.
  3. Za pomocą skalpela #10 wykonaj nacięcie w tym samym miejscu, co podczas poprzedniej operacji.
  4. Kontynuuj używanie skalpela do przecinania tkanki bliznowatej, aż pojawi się szew warstwy mięśniowej
  5. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń szew i rozetnij warstwę mięśniową.
  6. Wizualizuj i usuń szwy łączące żebra i kontynuuj przecinanie mięśnia międzyżebrowego z poprzedniego nacięcia.
    UWAGA: Płuca mogły przylgnąć do ściany klatki piersiowej, jeśli tak się stanie, użyj lub zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie je oddzielić i uwolnić.
  7. Umieść zwijacz powieki w przestrzeni międzyżebrowej i zlokalizuj obszar poprzedniego podwiązania.
  8. Załaduj mezenchymalne komórki macierzyste (3,0 x 105), zawieszone w 20 μl PBS, do strzykawki insulinowej 30 G, lekko zgnij igłę w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiedni kąt wstrzyknięcia.
    UWAGA: Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowano z tkanki tłuszczowej 4-6-tygodniowych myszy C56BL/6. Komórki wczesnego pasażu (p3) zostały transdukowane wektorem wyrażającym gen lucyferazy świetlika pod promotorem CMV, aby umożliwić monitorowanie żywotności komórek in vivo. Mysie MSC pochodzące z tkanki tłuszczowej scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki były dodatnie dla CD44, CD29, CD90 i CD105, ale ujemne dla markera krwiotwórczego CD4514. Przed wstrzyknięciem MSCs hodowano przez co najmniej jedno pasaż, aby uniknąć utraty komórek w procesie rozmrażania.
  9. Poruszając się w kierunku wierzchołka w kierunku podstawy serca, włóż strzykawkę w obszar okołozawałowy, aż otwór igły znajdzie się całkowicie wewnątrz mięśnia sercowego.
  10. Po wejściu do środka powoli wstrzyknij komórki do mięśnia sercowego, odczekaj 3 s, a następnie wyjmij igłę.
  11. Uważnie obserwuj serce przez 3 minuty, aby upewnić się, że nie ma nieprawidłowych reakcji na komórki, takich jak migotanie komór.
  12. Umieść rurkę cewnika dożylnego 24 G w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.
  13. Zamknij warstwy międzyżebrowe, mięśniowe i skórne i usuń rurkę klatki piersiowej w taki sam sposób, jak w przypadku pierwszego zabiegu.
  14. Podawać podskórnie 1,5 ml ciepłej soli fizjologicznej i nakładać maść z potrójnym antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.
  15. Wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać przez wentylator na 100%O2 do momentu, gdy będzie w stanie oddychać w sposób ciągły bez pomocy.
  16. Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką (ręcznik papierowy lub zasłona) na ciepłej podkładce o temperaturze 35-37 °C, aż do całkowitego wyzdrowienia.

4. Opieka pooperacyjna po obu zabiegach

  1. Obserwuj zwierzę w sposób ciągły, aż do momentu ustalenia spontanicznego oddechu, leżenia mostka i normalnego ruchu.
  2. Obserwację należy kontynuować co 15-30 minut przez co najmniej 3 godziny w dniu zabiegu.
  3. Sprawdzaj myszy pod kątem rozejścia się rany lub nietypowego bólu raz dziennie przez 5 dni, a następnie 2-3 razy w tygodniu.
  4. Jeśli zwierzę wykazuje oznaki bólu (np. wygięty grzbiet, minimalny ruch, grymas lub niechlujna sierść) po 72 godzinach od operacji, należy podać dodatkową dawkę leku przeciwbólowego Buprenorfina SR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

U myszy w dniu 0 wywołano uraz niedokrwienno-reperfuzyjny, po czym w dniu poprzedzającym implantację komórek macierzystych wykonano pooperacyjną echokardiografię i elektrokardiogram. Analiza obrazowania ultradźwiękowego i elektrokardiogramu potwierdziła wystąpienie zawału oraz zmniejszenie kurczliwości komór (Rycina 1A-D). Dalsza analiza danych wykazała, że frakcja wyrzutowa oraz skrócenie frakcyjne były zmniejszone u myszy z urazem niedokrwiennym, podczas gdy objętość końco...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponad 85 milionów ludzi na całym świecie cierpi na choroby układu krążenia3. Wysokie rozpowszechnienie tych zdarzeń niedokrwiennych uzasadnia dalszy rozwój i ekspansję alternatywnych terapii wspomagających regenerację uszkodzonych tkanek. Tradycyjne metody wykorzystują procedurę reperfuzji niedokrwiennej w ostrym stanie, a następnie podawanie środków terapeutycznych1. Reakcje zapalne osiągają szczyt między 3-4 dniami po incydencie niedokrwiennym serca, z naciekiem neutrofil...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% Irygacja NaCl, USPBaxter0338-0048-04
11x12" Obłożnica chirurgiczna Press n' Seal, autoklawowalnaSAI Infusion TechnologiesPSS-SD
24G 3/4" Rurka do cewnika dożylnegoJelco4053
28G x 1/2" 1mL strzykawka alergicznaBD305500Wstrzyknięcie przeciwbólowej
strzykawki insulinowej 30G x 1/2" 3/10ccUlticare08222.0933.56Iniekcja komórek macierzystych
6-0 S-29, 12" Szew VicrylEthiconJ556GMiędzyżebrowe, powierzchowne nacięcie warstwy mięśni i skóry
9-0 BV100-4, 5" Szew ethilonEthicon2829GPodwiązanie tętnicy LAD
Podkład chłonnyThermo Fischer Scientific14-206-64Do spodu zwierzęcia
Wkładki nasączone alkoholem, 2-warstwowe, średnieCoviden6818
Maska przeciwmgielna na twarzFał49235
Nożyczki do zeza Bonn, zakrzywione,Fine Science Tools14085-09
Buprenorfina HCL SR LAB 1mg/ml, 5 mlZooPharm AptekaBuprenorfina narkotyczny środek przeciwbólowy sformułowany w postaci polimeru, który spowalnia wchłanianie, wydłużając czas działania (72 godziny czasu trwania działalności gospodarczej).
Uchwyty do igieł Castroviejo, zakrzywioneFine Science Tools12061-01
Curity sterylne gąbki z gazyCoviden397310
Delikatne kleszczyki do wiązania szwów, 45 wygięte pod kątemFine Science Tools11063-07
Elektryczna maszynka do goleniaWahlUsuwanie futra
Izofluran 100 mlCardinal HealthPI23238Anestezjolog
Fartuch
Monoject 1 ml strzykawka podskórnaCoviden8881501400
Kleszczyki do tęczówki Moria, zakrzywione, ząbkowane (x2)Fine Science Tools11370-31
Retraktor wziernika MoriaFine Science Tools17370-53
Zestaw do intubacji dotchawiczej myszyKent Scientific
Nair krem do depilacjiJohnson & JohnsonUsuwanie sierści
Optixcare lubrykant do oczu plusAventixSterylny lubrykant do oczu
Wentylator PhysiosuiteKent Scientific
PolyE Rurki polietylenoweAparat Harvarda72-0191Tymczasowe uciskanie tętnicy LAD
Wymazy powidonowo-jodowePDIS41125
Skalpel, 10-ostrzowyBard-Parker371610
Sterylne 3-calowe aplikatory z bawełnianą końcówkąCardinal HealthC15055-003
Sterylne 6-calowe aplikatory z bawełnianą końcówką stożkowąPuritan25-826-5WC
Sterylne rękawiczkiCardinal HealthN8830
Woreczki do sterylizacjiMedlineMPP100525GS
Czapkachirurgiczna
Mikroskop chirurgicznyLeicaM125
Kleszcze do wiązania szwów, proste (x2)Fine Science Tools10825-10
Taśma chirurgiczna Transpore3M1527-1
Maść z potrójnym antybiotykiemG& W Laboratories11-2683ILNC2Miejscowe stosowanie w celu zapobiegania infekcji
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen, zakrzywioneFine Science Tools15004-08
Waporyzator VetfloKent Scientific
laboratoryjny

Bibliografia

  1. Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
  2. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  3. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38(2016).
  4. Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
  6. Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
  7. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
  8. Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Op nione podanie kom rek macierzystychmezenchymalne kom rki macierzystewtryskiwanie domi nioweobrazowanie bioluminescencyjneprotok chirurgicznymonitorowanie funkcji sercaocena ywotno ci kom rekleczenie po urazie

Powiązane artykuły