Artykuł metodologiczny

Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

DOI:

10.3791/61549

⸱

30 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College, 2Physics Department, UC San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wypławki słodkowodne wykazują trzy chody (ślizganie się, perystaltyka i zgniatanie), które można rozróżnić za pomocą ilościowej analizy behawioralnej. Opisujemy metodę wywoływania zgniecania za pomocą różnych szkodliwych bodźców, ich kwantyfikację oraz odróżnienie od perystaltyki i ślizgu. Korzystając z knockdownu genów, demonstrujemy specyfikę zgniatania jako ilościowego odczytu fenotypowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Słodkowodne wypławki zwykle płynnie ślizgają się przez napęd rzęskowy po swojej brzusznej stronie. Pewne warunki środowiskowe mogą jednak indukować formy lokomocji napędzane przez mięśnie: perystaltykę jelit lub zgniatanie. Podczas gdy perystaltyka wynika z ubytku rzęsek, zgniatanie jest niezależne od funkcji rzęsek i jest specyficzną reakcją na określone bodźce, w tym amputację, szkodliwą temperaturę, ekstremalne pH i etanol. Tak więc te dwa chody napędzane mięśniami są mechanicznie różne. Jednak mogą być trudne do odróżnienia jakościowo. Tutaj przedstawiamy protokół wywoływania zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych i chemicznych. Szczegółowo opisujemy ilościową charakterystykę zgniatania, którą można wykorzystać do odróżnienia go od perystaltyki i ślizgu, korzystając z ogólnodostępnego oprogramowania. Ponieważ zgniatanie jest uniwersalnym chodem wypławkowym, choć z charakterystycznymi różnicami specyficznymi dla gatunku, protokół ten może być szeroko stosowany do wszystkich gatunków wypławków, przy zastosowaniu odpowiednich rozważań. Aby to zademonstrować, porównujemy reakcję dwóch najpopularniejszych gatunków wypławków wykorzystywanych w badaniach behawioralnych, Dugesia japonica i Schmidtea mediterranea, na ten sam zestaw bodźców fizycznych i chemicznych. Co więcej, specyfika zgniatania pozwala na stosowanie tego protokołu w połączeniu z interferencją RNA i/lub ekspozycją farmakologiczną w celu przeanalizowania zaangażowanych celów molekularnych i obwodów neuronalnych, potencjalnie zapewniając mechanistyczny wgląd w ważne aspekty nocycepcji i komunikacji nerwowo-mięśniowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz ich popularności w badaniach nad komórkami macierzystymi i regeneracją1,2,3, słodkowodne wypławki od dawna są wykorzystywane w badaniach behawioralnych4,5, wykorzystując ich stosunkowo duży rozmiar (kilka milimetrów długości), łatwość i niski koszt utrzymania laboratorium oraz szerokie spektrum obserwowalnych zachowań. Wprowadzenie wizji komputerowej i automatycznego śledzenia do badań nad zachowaniem wypławków6,7,8,9,10,11 umożliwiły ilościowe zróżnicowanie fenotypów behawioralnych. Zachowanie zwierząt to bezpośredni odczyt funkcji neuronalnych. Ponieważ płaski układ nerwowy jest średniej wielkości i złożoności, ale dzieli konserwatywne kluczowe elementy z mózgiem kręgowców12,13,14, badanie zachowania wypławków może dostarczyć wglądu w konserwatywne mechanizmy działania neuronów, które mogą być trudne do bezpośredniego zbadania w bardziej złożonych organizmach. Tak więc wypławki są cennym modelem dla porównawczych badań neurobiologicznych8,12,15,16,17,18,19,20,21. Ponadto środowisko wodne pozwala na szybką i łatwą ekspozycję na chemikalia w celu zbadania ich wpływu na funkcjonowanie mózgu u regenerujących się i dorosłych wypławków, co czyni je popularnym systemem w neurotoksykologii22,23,24,25,26.

Planarianie posiadają trzy różne chody, określane jako ślizganie, perystaltyka i zgniatanie. Każdy chód jest prezentowany w określonych okolicznościach: ślizganie się jest chodem domyślnym, perystaltyka występuje, gdy funkcja rzęsek jest zaburzona7,27, a zgniatanie to chód ucieczki – niezależny od funkcji rzęsek – w odpowiedzi na pewne szkodliwe bodźce7. Wykazaliśmy, że zgniatanie jest specyficzną reakcją, wywoływaną przez odczuwanie pewnych sygnałów chemicznych lub fizycznych, w tym ekstremalnych temperatur lub pH, urazów mechanicznych lub określonych induktorów chemicznych, a zatem nie jest ogólną reakcją na stres7,28,29.

Ze względu na swoją specyficzność i stereotypowe parametry, które można łatwo określić ilościowo za pomocą tego protokołu, zgniatanie jest potężnym fenotypem behawioralnym, który umożliwia badaczom przeprowadzanie badań mechanistycznych analizujących ścieżki czuciowe i neuronalną kontrolę zachowania25,28. Ponadto wykazano, że zgniatanie jest czułym punktem końcowym do oznaczania niekorzystnego wpływu chemicznego na rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego w badaniach neurotoksykologicznych22,24,25,30. Ponieważ kilka różnych ścieżek czuciowych wydaje się zbiegać, aby wywołać zgniatanie za pomocą różnych mechanizmów28, zgniatanie różni się od innych zachowań wypławkowych, ponieważ różne, ale specyficzne bodźce mogą być wykorzystywane do analizowania odrębnych obwodów neuronalnych i badania, w jaki sposób różne sygnały są integrowane w celu wytworzenia fenotypu zgniatania.

Co ważne, istnieją różnice gatunkowe, gdzie jedna substancja chemiczna może wywołać zgniatanie u jednego gatunku wypławków, ale inną reakcję behawioralną u innego. Na przykład odkryliśmy, że anandamid indukuje zgniatanie u wypławków Dugesia japonica, ale wywołuje perystaltykę u Schmidtea mediterranea28. Przykład ten podkreśla, jak ważna jest umiejętność niezawodnego rozróżniania różnych chodów, ponieważ są one fenotypowymi przejawami różnych mechanizmów molekularnych. Jednak odróżnienie zgniatania od perystaltyki jelit jest trudne przy użyciu jakościowych danych obserwacyjnych, ponieważ oba chody są napędzane muskulaturą i mają podobieństwa jakościowe7,28. W związku z tym, aby rozróżnić chody, konieczne jest wykonanie obrazowania rzęsek lub ilościowego badania behawioralnego, które pozwala na rozróżnienie na podstawie charakterystycznych parametrów7,28. Ponieważ obrazowanie rzęsek jest eksperymentalnie trudne i wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak mikroskop złożony o dużym powiększeniu i szybka kamera7,28, nie jest tak szeroko dostępne dla badaczy, jak ilościowa analiza behawioralna.

Tutaj prezentujemy protokół (1) indukcji zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych (szkodliwa temperatura, amputacja, światło bliskie UV) i chemicznych (izotiocyjanian allilu (AITC), aldehyd cynamonowy) oraz (2) ilościowej analizy zachowania wypławków za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania. Określając ilościowo cztery parametry (częstotliwość oscylacji długości ciała, prędkość względna, maksymalna amplituda oraz asymetria wydłużania i kurczenia się ciała)7, zgniatanie można odróżnić od szybowania, perystaltyki jelit i innych stanów behawioralnych opisywanych w literaturze, takich jak lokomocja przypominająca węża15 lub epilepsje15. Co więcej, podczas gdy zgniatanie jest zachowane wśród różnych gatunków wypławków7, każdy gatunek ma swoją własną charakterystyczną częstotliwość i prędkość; W związku z tym, po ustaleniu prędkości ślizgania i zgniatania gatunku, sama prędkość może być użyta jako środek do odróżnienia zgniatania od ślizgania się i perystaltyki29. Protokół zakłada brak wcześniejszego szkolenia w zakresie obliczeniowej analizy obrazu lub badań behawioralnych, a zatem może być również stosowany do eksperymentów behawioralnych wypławków w kontekście laboratorium dydaktycznego na poziomie licencjackim. Przykładowe dane ułatwiające adaptację protokołu znajdują się w materiałach uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ilościowe testy zachowania wypławków

  1. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Umieść ściemnialny panel LED na płaskiej powierzchni. Panel LED służy dwóm celom: (1) zapewnia jednolite białe tło oraz (2) służy jako regulowane źródło światła w celu uzyskania odpowiedniego kontrastu. Umieść arenę na szalce Petriego o średnicy 100 mm na panelu LED.
      UWAGA: Aby zwiększyć przepustowość, płytka wielodołkowa może być używana jako arena23,24, ale większe areny ułatwiają automatyczną analizę obrazu.
    2. Zamontuj kamerę na stojaku ringowym nad areną (Rysunek 1A). W razie potrzeby dostosuj pozycję, wysokość i ostrość kamery, tak aby cała arena była wyśrodkowana w polu widzenia i była wyostrzona (Rysunek 1B).
      UWAGA: Rozdzielczość kamery musi być wystarczająco wysoka, aby wyraźnie odróżnić płaszczyznę od jednorodnego tła zapewnianego przez panel LED.
    3. Napełnij arenę odpowiednim medium ekspozycyjnym (woda płaska lub roztwór chemiczny) do połowy maksymalnej objętości (będzie to określane jako kąpiel). Odpowiada to około 25 ml dla szalki Petriego o średnicy 100 mm. Włącz panel LED i wyłącz wszelkie inne źródła światła, które mogą negatywnie wpływać na jakość nagrywania (np. pobliskie źródła światła, które powodują odblaski na arenie).
      UWAGA: Odpowiednio zarządzaj niebezpiecznymi roztworami chemicznymi, nosząc pełne środki ochrony osobistej (PPE) i w razie potrzeby przenosząc zestaw eksperymentalny do dygestoria. Postępuj zgodnie z przepisami federalnymi i stanowymi dotyczącymi utylizacji odpadów.
    4. Upuść wypławkę w kierunku środka areny za pomocą pipety transferowej. Rozpocznij nagrywanie. Zapisuj dane jako sekwencje obrazów w natywnym formacie Fiji31 (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM lub FITS; patrz sekcja 1.2 Analiza obrazu).
      UWAGA: Ponieważ zachowania i wrażliwość na bodźce zewnętrzne różnią się u poszczególnych wypławków, ważne jest, aby oprócz wykonywania powtórzeń technicznych zbierać dane na temat wystarczająco dużej liczby powtórzeń biologicznych. Pracowaliśmy jednocześnie z maksymalnie 10 średniej wielkości (4-7 mm) wypławkami na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Chociaż jest to efektywne czasowo, wiele wypławków na szalce Petriego jednocześnie utrudnia analizę danych, ponieważ ścieżki wypławków mogą się krzyżować.
      1. W przypadku eksperymentów szybowniczych nagrywaj z co najmniej 1 klatką na sekundę (FPS). W przypadku eksperymentów z zgniataniem/perystaltyką należy nagrywać przy użyciu liczby klatek na sekundę, która jest co najmniej dwukrotnie większa niż częstotliwość zgniatania/perystaltyki gatunków wypławków. Jeśli gatunek wypławkowy ma nieznaną częstotliwość zgniatania/perystaltyki, użyj 10 FPS jako punktu wyjścia i odpowiednio zwiększaj/zmniejszaj.
      2. Używając roztworu chemicznego, przenieś wypławkę, używając jak najmniejszej liczby kropli wody wypławkowej, aby stężenie roztworu chemicznego nie uległo znacznej zmianie.
    5. W przypadku eksperymentów szybowniczych nagraj 1-2 minuty zachowania szybowania. W przypadku eksperymentów z zgniataniem/perystaltyką jelit nagrywaj wystarczająco długo, aby uchwycić co najmniej 3 kolejne oscylacje występujące w linii prostej. Po zakończeniu eksperymentu zakończ nagrywanie.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z zgniataniem/perystaltyką, jeśli wypławka nie spełnia kryterium zakończenia w ustalonym czasie, który musi być spójny we wszystkich powtórzeniach i jest empirycznie określony na podstawie bodźca, zakończ zapis i przetestuj inną wypławkę.
      1. Jeśli wypławka dotrze do granicy areny, nie spełniając kryterium zakończenia, pipetuj wypławkę z powrotem do środka areny.
        UWAGA: Należy unikać wielokrotnego pipetowania danej osoby w celu nagrania, ponieważ może to zmienić jej zachowanie.
    6. Usuń wypławkę (wypławki) z areny i wyrzuć wodę lub roztwór chemiczny wypławków do odpowiednich pojemników na odpady. Wypławki, które znajdowały się w wodzie wypławkowej, można zwrócić do swojego domowego pojemnika.
      UWAGA: Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego poprzez używanie różnych aren dla różnych mediów (tj. Ślizganie się w eksperymentach z wodą wypławkową nie powinno być przeprowadzane na arenie wcześniej używanej do eksperymentów ze zgniataniem/perystaltyką z ekspozycją chemiczną).
      1. Seryjnie opłucz wypławki wystawione na działanie roztworu chemicznego w 3 czystych 100-milimetrowych szalkach Petriego wypełnionych 25 ml wody z wypławkami, aby dokładnie rozcieńczyć wszelkie chemikalia. Jeśli zaindukowane zostało zgniatanie lub perystaltyka, umieść te wypławki w osobnym pojemniku. Planarianie mogą zostać zwrócone do swojego domowego pojemnika po miesiącu, ponieważ do tego czasu większość komórek by się przewróciła1.
        UWAGA: Jeśli potrzebnych jest wiele różnych eksperymentów dla tej samej populacji wypławków, np. dla populacji RNAi, pozwól wypławkom na regenerację przez 24 godziny przed uruchomieniem następnego eksperymentu. Uporządkuj eksperymenty w taki sposób, aby najmniej inwazyjny eksperyment był przeprowadzany jako pierwszy, a najbardziej inwazyjny eksperyment (np. amputacja) był przeprowadzany jako ostatni.
      2. Jeśli przeprowadzasz wiele eksperymentów na tej samej arenie, odpowiednio wyrzuć roztwór do kąpieli i usuń wszelkie ślady śluzu, wycierając arenę ręcznikiem papierowym między biegami.
        UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Analiza ilościowa zachowania wypławków
    1. Wykonać testy zachowania wypławków zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
    2. Otwórz sekwencję obrazów RAW dla eksperymentu na Fidżi (Plik > Importuj > Sekwencja obrazów) i wybierz pierwszy obraz w sekwencji obrazów. W oknie Opcje sekwencji zaznacz pole "Sortuj nazwy numerycznie" i kliknij "OK". Po załadowaniu sekwencji obrazów przekonwertuj ją na 8-bitową (Typ > obrazu > 8-bitowa) i użyj narzędzia strzałki lub suwaka u dołu stosu obrazów, aby obejrzeć lub przesunąć sekwencję obrazów.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z szybowaniem wszystkie dane mogą być wykorzystane, o ile wypławka jest wyraźnie widoczna przez całe nagranie. Jednak zwykle wystarczy przeanalizować swobodny ruch w środku areny, wyodrębniając odpowiednie części, jak opisano poniżej.
    3. Aby wyodrębnić okres czasu i obszar zainteresowania, narysuj obszar zainteresowania obejmujący pełną ścieżkę wypławka za pomocą narzędzia prostokąta (Rysunek 2A, 2B). Kliknij prawym przyciskiem myszy stos obrazów i wybierz Duplikuj..., zaznacz pole Zduplikuj stos, wprowadź pierwszą i ostatnią klatkę interesującej Cię sekwencji i kliknij OK. Jeśli wiele wypławków zostało zobrazowanych jednocześnie, powtórz ten krok wyboru regionu i duplikacji dla każdego planarian na arenie, tak aby było tyle otwartych stosów obrazów, ile jest planarian na arenie. Poniższe kroki (kroki 1.2.4-1.2.10) należy wykonać na każdym stosie obrazów, pojedynczo.
      1. W przypadku eksperymentów z szybowaniem wyodrębnij okres szybowania, w którym wypławka porusza się co najmniej dwukrotnie większą długością ciała.
        UWAGA: Im więcej danych ślizgowych zostanie wyodrębnionych na wypławkę, tym bardziej wiarygodne będą dane. Wypławka nie musi poruszać się w linii prostej, aby przeprowadzić analizę ślizgu.
      2. W przypadku eksperymentów z zgniataniem/perystaltyką wyodrębnij przypadek, w którym wypławka przechodzi co najmniej trzy kolejne (najlepiej więcej) oscylacje ciała w linii prostej, upewniając się, że każda oscylacja jest pełnym cyklem wydłużenia-skurczu, ponieważ pełne oscylacje są niezbędne do dokładnego określenia częstotliwości.
        UWAGA: Im więcej oscylacji można wyodrębnić, tym bardziej wiarygodne będą dane. Nie używaj sekwencji, w których wypławka się obraca, ponieważ spowoduje to niedokładne pomiary długości.
    4. Zastosuj próg do zduplikowanego stosu obrazów (Obraz > Dostosuj próg >), aby zbinaryzować obraz i wyodrębnić wypławkę z tła. W razie potrzeby wyreguluj pręty przesuwne tak, aby cała wypławka była podświetlona na czerwono. Dokładne wartości zależą od jakości obrazowania. Pozostaw niezaznaczone pola Ciemne tło, Histogram stosu i Nie resetuj zakresu. Przewiń stos obrazów, aby upewnić się, że ma dobry zakres progowy (tj. wypławka jest dobrze oddzielona od tła w całym stosie), a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
    5. W oknie Konwertuj stos na binarny ustaw Metodę na Domyślną, a Tło na Jasne. Usuń zaznaczenie wszystkich pól w tym oknie, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się binaryzowany obraz przedstawiający czarnego wypławka na białym tle (Rysunek 2C). Upewnij się, że cała wypławka jest widoczna we wszystkich klatkach sekwencji obrazów.
      UWAGA: Niepożądane obiekty w binaryzowanej sekwencji obrazu, które są mniejsze lub większe niż wypławka, można odfiltrować w kolejnej analizie za pomocą filtra rozmiaru (Rysunek 2Ciii).
    6. Ustaw pomiary, klikając przycisk Analizuj > Ustaw miary. Zaznacz pola Powierzchnia, Środek masy, Położenie stosu i Dopasuj elipsę, a następnie kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Te parametry należy ustawić tylko raz na sesję Fidżi.
    7. Wybierz otwarty stos obrazów, a następnie wybierz opcję Analizuj > Analizuj cząstki.
    8. W oknie Analizuj cząstki wybierz opcję Pokaż maski >, aby otworzyć nowy stos pokazujący wszystkie obiekty, które zostały wykryte z wybranymi parametrami. Można to wykorzystać do wizualnego sprawdzenia, czy wykonywane są tylko pomiary wypławka. Na tym etapie można ustawić filtr rozmiaru, aby usunąć niechciane szumy, wprowadzając przybliżony obszar wypławka (w jednostkach piksela2) w przewidzianym miejscu. Zaznacz pola Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki, a następnie kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Jeśli w oknie Wyniki indeks (pierwsza kolumna) nie jest równy numerowi wycinka dla wszystkich wierszy, oznacza to, że śledzono zbyt wiele lub zbyt mało obiektów. Jedną z możliwości tej rozbieżności jest obecność innych obiektów poza wypławką lub to, że wypławka nie była śledzona w określonych ramkach.
    9. Przesuwanie stosu obrazów maski za pomocą suwaka u dołu panelu. Jeśli słychać szum lub ramki, w których brakuje płaszczyzny, zamknij okno Wyniki i stos obrazów maski. Powtórz kroki 1.2.7-1.2.8, dostosowując filtr obszaru, aby usuwać tylko obiekty inne niż płaski.
      UWAGA: Jeśli w ramce maski brakuje wypławka, oznacza to, że dolna granica filtra obszaru została ustawiona zbyt wysoko.
    10. W oknie Wyniki zapisz dane za pomocą polecenia Plik>Zapisz jako. Dodaj rozszerzenie .csv do nazwy pliku, aby zapisać dane jako wartości rozdzielane przecinkami. Po zapisaniu danych stosu obrazów zamknij odpowiedni stos obrazów oraz okna Wyniki i Maska.
    11. Importuj dane i analizuj je dalej za pomocą dowolnego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych lub darmowego oprogramowania. Aby obliczyć prędkość ślizgu, patrz rozdział 1.3. Aby obliczyć pełny zestaw parametrów zgniatania/perystaltyki, patrz sekcja 1.4.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    12. Aby określić konwersję pikseli na rzeczywistą długość, otwórz obraz w Fidżi z długością odniesienia (np. średnicą areny). Wybierz narzędzie Linia i narysuj linię o znanej długości.
    13. Przekonwertuj jednostki pikseli na standardową jednostkę długości, klikając przycisk Analizuj > Ustaw skalę. Wprowadź długość odpowiadającą linii narysowanej na obrazie w polu Znana odległość i zmień jednostkę długości z piksela na wybraną standardową jednostkę długości. Współczynnik konwersji jest zapisany obok Scale.
      UWAGA: Wartość konwersji pikseli nie jest wymagana w przypadku analiz ślizgu lub zgniatania/perystaltyki jelit w sekcjach 1.3 i 1.4.
  3. Obliczanie prędkości ślizgu
    1. Korzystając z pliku danych zapisanego w sekcji 1.2, załaduj współrzędne x i y środka masy (COM) oraz dane osi głównej. Jeśli dane są zapisywane jako plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami, listy te odpowiadają odpowiednio kolumnom "XM", "YM" i "Główne".
    2. Oblicz przemieszczenie (d) płaskiego środka masy w pikselach dla każdej klatki w odniesieniu do następnej klatki, korzystając z kolumn danych "XM" i "YM". Przemieszczenie (d) jest określone wzorem:
      figure-protocol-1
      gdzie x1 i y1 odnoszą się do współrzędnych COM (XM, YM) jednej ramki, a x2 i y2 odnoszą się do współrzędnych COM (XM, YM) kolejnej ramki.
    3. Ustaw długość ciała wypławka jako 95. percentyl kolumny "Główny". Ponieważ wypławki wykazują zachowanie preferencji ściany32, gwarantuje to, że obliczona długość ciała wypławka jest reprezentatywna dla momentu, gdy wypławka jest wydłużona24.
    4. Znormalizuj przemieszczenie według długości ciała wypławki, dzieląc przemieszczenia pikseli na klatkę przez długość ciała wypławki (l). Przemieszczenie znormalizowane (d n) jest określone wzorem:
      figure-protocol-2
    5. Wygeneruj listę znormalizowanych prędkości, dzieląc znormalizowane przemieszczenia przez czas, który upłynął na klatkę (odwrotność zarejestrowanej liczby klatek na sekundę). Znormalizowana prędkość ślizgu (sn) jest wyrażona wzorem:
      figure-protocol-3
    6. Oblicz znormalizowaną prędkość ślizgania wypławka, biorąc średnią z listy znormalizowanych prędkości (sn). Odchylenie standardowe może być używane jako miara niepewności dla wypławka.
    7. Powtórz kroki 1.3.1-1.3.6 dla każdego wypławka, który ma być analizowany. Uśrednić i przyjąć odchylenie standardowe prędkości ślizgania dla wszystkich wypławków, aby uzyskać odpowiednio prędkość ślizgania i związaną z nią niepewność dla populacji wypławków.
  4. Rozróżnienie chodów zgniatanych i perystaltycznych przy użyciu pełnego zestawu parametrów
    1. Załaduj listę danych osi głównej z pliku danych zapisanego w sekcji 1.2. Jeśli dane są zapisywane jako plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami, odpowiada to kolumnie Główna.
    2. Utwórz listę, która numeruje każdy punkt danych w kolumnie Główne, zaczynając od 0. Przekonwertuj tę listę na czas, który upłynął na klatkę, dzieląc przez zarejestrowaną liczbę klatek na sekundę.
    3. Wykreśl dane z kolumny głównej w odniesieniu do czasu, który upłynął, aby wygenerować wykres oscylacji zgniatania/perystaltyki (Rysunek 3A). Korzystając z wykresu oscylacji, przytnij dane do co najmniej trzech następujących po sobie oscylacji w linii prostej (Rysunek 3Bi). Przytnij dane, aby zaczynały się i kończyły na lokalnych szczytach (maksymalne wydłużenie oscylacji) lub dołkach (minimalne wydłużenie oscylacji).
      UWAGA: Jeśli lokalne ekstrema nie są w przybliżeniu równe (szczyty/dołki różnią się znacznie wysokością), sugeruje to, że oscylacje nie są liniowe (Rysunek 3Bii). Wyodrębnij kolejną sekwencję co najmniej trzech następujących po sobie oscylacji w linii prostej. Patrz rozdział 1.2.
    4. Upewnij się, że interesująca Cię sekwencja oscylacji została prawidłowo wyodrębniona i przycięta, ponownie wykreślając przycięte dane główne w odniesieniu do czasu. Tej przyciętej listy danych należy używać we wszystkich kolejnych obliczeniach.
    5. Aby obliczyć częstotliwość oscylacji (νm), podziel liczbę oscylacji (On) przez całkowitą liczbę punktów danych na przyciętej liście danych osi głównej (N). Pomnóż liczbę klatek na sekundę przez tę wartość, aby uzyskać częstotliwość w oscylacjach na sekundę.
      figure-protocol-4
    6. Aby obliczyć maksymalne wydłużenie (|Δε|max), odejmij bezwzględną minimalną długość ciała (lmin) od bezwzględnej maksymalnej długości ciała (lmax). Normalizuj do wydłużonej długości ciała, dzieląc przez bezwzględną maksymalną długość ciała.
      figure-protocol-5
    7. Aby obliczyć prędkość na długość ciała (v*m), pomnóż obliczone maksymalne wydłużenie przez częstotliwość oscylacji.
      figure-protocol-6
      UWAGA: Sama prędkość może być użyta do rozróżnienia chodów zgniatania i perystaltyki7.
    8. Aby obliczyć ułamek czasu spędzonego na wydłużaniu (fwzdłuż), weź pochodną przyciętej listy danych osi głównej w odniesieniu do czasu. Podziel liczbę dodatnich punktów danych (tj. gdy pochodna wynosi >0 (np)) przez całkowitą liczbę punktów danych na liście danych osi głównej (nt)).
      figure-protocol-7
      UWAGA: Wypławki z wypławkami wykazują asymetryczny ułamek czasu spędzonego na wydłużaniu, podczas gdy wypławki wykonujące perystaltykę spędzają tyle samo czasu na wydłużaniu i kurczeniu się7.
    9. Powtórz kroki 1.4.1-1.4.8 dla każdego wypławka, który ma być analizowany. Oblicz zestaw parametrów populacji wypławków, biorąc średnią i odchylenie standardowe każdego parametru.
      UWAGA: Zestaw parametrów może być użyty do określenia, czy zachowanie oscylacyjne to zgniatanie, perystaltyka lub inna forma lokomocji z okresowymi zmianami kształtu ciała. Zarówno zgniatanie, jak i perystaltyka mają stałe parametry dla danego gatunku7, przy czym parametry zgniatania są zazwyczaj większe niż parametry perystaltyki7. Chociaż możliwe jest, że jeden z parametrów może wykraczać poza zakres specyficzny dla gatunku, jak wcześniej zaobserwowaliśmy w przypadku indukcji chemicznej28, obserwowane zachowanie musi zgadzać się z co najmniej 3 z 4 opublikowanych parametrów, aby można je było sklasyfikować jako perystaltykę lub zgniatanie.

2. Indukcja zgniatania

  1. Bodźce fizyczne (szkodliwa temperatura, promieniowanie UV, amputacja)
    1. W przypadku wszystkich eksperymentów z bodźcami fizycznymi, patrz Sekcja 1.1, aby zapoznać się z konfiguracją eksperymentalną.
      UWAGA: Najlepiej jest używać dużej areny, takiej jak szalka Petriego o średnicy 100 mm, do eksperymentów z bodźcami fizycznymi, aby zapewnić więcej otwartej przestrzeni do manewrowania pipetą i/lub żyletką.
    2. Aby wywołać zgniatanie za pomocą szkodliwej temperatury, podgrzej wodę płaską w szklanej zlewce (co najmniej 100 μl na badaną pławkę) do 65 °C na gorącej płycie.
      1. Umieść planariana na środku areny. Poczekaj, aż wypławka ustawi się pionowo i zacznie szybować. Rozpocznij nagrywanie.
      2. Za pomocą pipety P-200 powoli odpipetuj 100 μl wody płaśnikowej o temperaturze 65 °C po gardle na tylny koniec wypławka, aby wywołać zgniatanie.
        UWAGA: Upewnij się, że podgrzana woda płaska pozostaje w temperaturze 65°C. W razie potrzeby podgrzej wodę do 65°C przed rozpoczęciem kolejnego eksperymentu. Ponieważ ciśnienie może również powodować zgniatanie, konieczne jest powolne pipetowanie. Pipetowanie wody o temperaturze pokojowej w taki sam sposób, jak w eksperymencie, może służyć jako opcja kontrolna i ćwiczeniowa.
      3. Zatrzymaj nagrywanie, gdy ustanie zgniatanie. Umieść wypławka w pojemniku do odzyskiwania i wymień pożywkę na szalce Petriego na świeżą wodę o temperaturze pokojowej, jeśli przeprowadzasz więcej eksperymentów.
    3. Aby wywołać zgniatanie poprzez amputację, przenieś wypławka na środek areny i poczekaj, aż wypławka ustawi się pionowo i zacznie ślizgać się. Rozpocznij nagrywanie.
      1. Amputuj wypławkę za pomocą czystej żyletki. Amputacje mogą być wykonywane w dowolnym miejscu wzdłuż wypławka, o ile miejsce cięcia jest spójne we wszystkich eksperymentach.
        UWAGA: Parametry zgniatania są pobierane z części przedniej. Dlatego unikaj zasłaniania kamerze view tej części wypławka podczas wykonywania cięcia, zbliżając się od tylnego końca. Szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego dobrze sprawdzają się również do cięcia i są bezpieczniejszą opcją, zwłaszcza w środowisku dydaktycznym.
      2. Przerwij nagrywanie, gdy przednia część przestanie się zgniatać. Usuń obie części, umieść je w osobnym pojemniku i pozwól im się zregenerować przez 7 dni. Amputowane wypławki mogą być ponownie włączone do domowego pojemnika po regeneracji.
    4. Aby wywołać zgniatanie za pomocą światła bliskiego UV, należy przymocować odpowiednie filtry (np. filtry Roscolux) do obiektywu aparatu, aby zmniejszyć ilość odbitego światła bliskiego UV, które jest zbierane przez aparat i może zakłócać obrazowanie reakcji wypławka. Zamiast używać panelu LED do oświetlania areny od dołu, użyj czerwonego oświetlenia otoczenia, na które wypławki są niewrażliwe33.
      1. Napełnij arenę na szalkę Petriego o średnicy 100 mm wodą z wypławkami i umieść pojedynczą płaśnik (5-9 mm) na środku areny. Rozpocznij nagrywanie z szybkością 10 kl./s.
      2. Trzymaj wskaźnik laserowy UV klasy II (405 ± 10 nm, moc wyjściowa <5 mW) w odległości około 30 cm od areny. Ustaw wskaźnik laserowy pod kątem 45° od ślizgającego się wypławka, a następnie świec wskaźnikiem laserowym przez 5-10 sekund w połowie odległości między tylnym końcem gardła a końcem ogona, aby wywołać zgniatanie.
        UWAGA: Moc wskaźnika laserowego można zmierzyć za pomocą miernika mocy wrażliwego na promieniowanie UV.
      3. Poczekaj, aż wypławk zacznie ponownie ślizgać się, zanim spróbujesz dwóch kolejnych stymulacji na tej samej osobie, aby przetestować powtarzalność reakcji. Jeśli wypławka nadal wykazuje to samo zachowanie, przerwij nagrywanie i włóż ją z powrotem do pojemnika. Jeśli zachowanie zmieni się między stymulacjami, dodatkowe testy pokażą, która reakcja jest najbardziej widoczna.
        UWAGA: Wypławki mogą stać się niewrażliwe na światło bliskie UV i przestaną reagować. Kolejne stymulacje wymagają okresu odpoczynku trwającego 8-10 sekund.
  2. Bodziec chemiczny (AITC)
    1. Aby wywołać zgniatanie za pomocą substancji chemicznej, np. agonisty TRPA1 AITC28, wypławki najlepiej zanurzyć w kąpieli chemicznej. W razie potrzeby można zastosować pipetowanie zgodnie z opisem w sekcji 2.1.2.3.
      UWAGA: AITC jest łatwopalny, silnie toksyczny, może powodować podrażnienie skóry i oczu, uczulenie dróg oddechowych i skóry oraz jest niebezpieczny dla organizmów wodnych. Z olejem AITC należy obchodzić się pod wyciągiem. Przed przystąpieniem do sporządzania roztworów podstawowych AITC należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice nitrylowe i fartuch laboratoryjny) oraz ustawić odpowiednie pojemniki na stałe i płynne odpady niebezpieczne.
    2. W dygestorium przygotować 10 mM roztwór podstawowy AITC w wodzie wypławkowej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Ten roztwór podstawowy nadaje się do użytku przez okres do jednego miesiąca przy przechowywaniu w temperaturze 4°C.
      1. Z tego wywaru przygotuj 25 ml roztworu roboczego 100 μM AITC w wodzie wypławkowej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Ten roztwór AITC o wielkości 100 μM zostanie użyty do wywołania zgniatania u wypławków.
        UWAGA: 100 μM AITC indukuje konsekwentne zgniatanie u D. japonica i S. mediterranea planarians28. W przypadku innych wypławków wodnych 100 μM może służyć jako stężenie wyjściowe i można je odpowiednio dostosować.
      2. Skonfiguruj konfigurację eksperymentalną (patrz Sekcja 1.1). Napełnij arenę roztworem roboczym AITC i umieść go w dodatkowym pojemniku. Dodatkowy pojemnik powinien pomieścić co najmniej dwa razy większą objętość niż arena.
        UWAGA: Eksperymenty można przeprowadzać wewnątrz dygestorium dla dodatkowego bezpieczeństwa.
      3. Przenieś do 10 wypławków na środek areny i rozpocznij nagrywanie.
      4. Gdy wypławki staną się znieczulone i przestaną się zgniatać, przerwij nagrywanie. Wyjąć wypławki z roztworu AITC i spłukać (patrz punkt 1.1). Stałe i płynne odpady AITC należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na odpady.
      5. Sprawdź swoistość odpowiedzi na AITC przy użyciu RNAi do TRPA128 zgodnie ze standardowymi protokołami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnątrzgałkowa percepcja bliskiego UV u wypławków S. mediterranea jest zależna od TRPA1 i zaproponowano powiązanie z uwolnieniem H2O217. Ponieważ ekspozycjana H2O2 indukuje zgniatanie zależne od TRPA1 u S. mediterranea i D. japonica planarians28, kroki opisane w sekcji 2.1.4 można zastosować do sprawdzenia, czy ekspozycja na światło bliskie UV wywołuje zgniatanie u obu gatunków. Podczas gdy wypławki

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, można ilościowo badać wpływ bodźców fizycznych i chemicznych 7,28,29 lub manipulacji genetycznej (RNAi)28,29 na lokomocję wypławków. Aby zmaksymalizować rozdzielczość przestrzenną, najlepiej jest przesunąć kamerę jak najbliżej areny, upewniając się, że cała arena znajduje się w polu widzenia. Aby zwiększyć przepustowość, zachowanie wielu wyp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Panu Tapan Goelowi za komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana ze środków NSF CAREER Grant 1555109.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izotiocyjanian allilu, 95% (AITC)Sigma-Aldrich377430-5GUWAGA:  Łatwopalny i silnie toksyczny; w dygestorium z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
Obiektyw aparatu, 2/3 25mm F/1.4 Tamron23FM25SP
Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe, poddane hodowli tkankowejGenesee Scientific 25-105
Probówki wirówkowe, 50 ml polipropylenu, sterylneMedSupply Partners62-1019-2
Aldehyd cynamonowy, >95%Sigma-AldrichW228613-100G-K
Ściemnialna kaseton świetlny A4 LED TracerAmazonB07HD631RP
Flea3 Kamera USB3FLIRFL3-U3-13E4M
Rękawice żaroodporneFisher Scientific11-394-298
Płyta grzejnaFisher ScientificHP88854200
Instant Ocean Sea Salt, przygotowana w wodzie dejonizowanejInstant OceanSS15-10Przygotować w wodzie dejonizowanej w stężeniu 0,5 g/L.
Montjü sole krzemowe, przygotowane w wodzie Milli-QSigma-AldrichróżnePrzygotować w wodzie mili-Q o stężeniu 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3 dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl.
szalki Petriego, 100 mm x 20 mm, sterylny polistyrenPipeta SimportD210-7
, 20-200 μ Seria LZlewka Rainin
PYREX 150 mlSigma-AldrichCLS1000150
Żyletka, 0,22 mmVWR55411-050
Roscolux:  Golden AmberRoscoR21Alternatywnie kup selektor kolorów Roscolux Designer (produkt Musson Theatrical #SBLUX0306), który zawiera wszystkie 3 filtry kolorów razem.
Filtr kolorów Roscolux:  Średni czerwonyRoscoR27
Roscolux:  Storaro RedRoscoR2001
Pipeta transferowa Samco, 62 i mikro; L StojakThermo Fisher691TS
 Termometr Fisher Scientific12-947-976
VWR89095-600
Wskaźnik laserowy UVAmazonB082DGS86RJest to laser klasy II (405nm ± 10nm) o mocy wyjściowej < 5 mW.
17008652 Filtr barwny filtr barwny pomocniczy o dużej aperturze

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
  2. Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
  3. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
  4. Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
  5. Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
  6. Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
  7. Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001(2015).
  8. Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
  9. Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
  10. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  11. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
  12. Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266(2017).
  13. Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
  14. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
  15. Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
  16. Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
  17. Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
  18. Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
  19. Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
  20. Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
  21. Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
  22. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
  23. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
  24. Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
  25. Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
  26. Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
  27. Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
  28. Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244(2019).
  29. Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
  30. Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  32. Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214(2015).
  33. Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708(2014).
  34. Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40(2007).
  35. Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
  36. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
  37. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowa analiza behawioralnaswobodnie poruszaj ce si planarieanaliza w oprogramowaniu Fijikurczenie wywo ane temperaturodpowied na bodziec chemicznykurczenie wywo ane amputacjDugesia japonicaSchmidtea mediterranea

Powiązane artykuły