Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61549

⸱

30 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College, 2Physics Department, UC San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Wypławki słodkowodne wykazują trzy chody (ślizganie się, perystaltyka i zgniatanie), które można rozróżnić za pomocą ilościowej analizy behawioralnej. Opisujemy metodę wywoływania zgniecania za pomocą różnych szkodliwych bodźców, ich kwantyfikację oraz odróżnienie od perystaltyki i ślizgu. Korzystając z knockdownu genów, demonstrujemy specyfikę zgniatania jako ilościowego odczytu fenotypowego.

Streszczenie

Słodkowodne wypławki zwykle płynnie ślizgają się przez napęd rzęskowy po swojej brzusznej stronie. Pewne warunki środowiskowe mogą jednak indukować formy lokomocji napędzane przez mięśnie: perystaltykę jelit lub zgniatanie. Podczas gdy perystaltyka wynika z ubytku rzęsek, zgniatanie jest niezależne od funkcji rzęsek i jest specyficzną reakcją na określone bodźce, w tym amputację, szkodliwą temperaturę, ekstremalne pH i etanol. Tak więc te dwa chody napędzane mięśniami są mechanicznie różne. Jednak mogą być trudne do odróżnienia jakościowo. Tutaj przedstawiamy protokół wywoływania zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych i chemicznych. Szczegółowo opisujemy ilościową charakterystykę zgniatania, którą można wykorzystać do odróżnienia go od perystaltyki i ślizgu, korzystając z ogólnodostępnego oprogramowania. Ponieważ zgniatanie jest uniwersalnym chodem wypławkowym, choć z charakterystycznymi różnicami specyficznymi dla gatunku, protokół ten może być szeroko stosowany do wszystkich gatunków wypławków, przy zastosowaniu odpowiednich rozważań. Aby to zademonstrować, porównujemy reakcję dwóch najpopularniejszych gatunków wypławków wykorzystywanych w badaniach behawioralnych, Dugesia japonica i Schmidtea mediterranea, na ten sam zestaw bodźców fizycznych i chemicznych. Co więcej, specyfika zgniatania pozwala na stosowanie tego protokołu w połączeniu z interferencją RNA i/lub ekspozycją farmakologiczną w celu przeanalizowania zaangażowanych celów molekularnych i obwodów neuronalnych, potencjalnie zapewniając mechanistyczny wgląd w ważne aspekty nocycepcji i komunikacji nerwowo-mięśniowej.

Wprowadzenie

Oprócz ich popularności w badaniach nad komórkami macierzystymi i regeneracją1,2,3, słodkowodne wypławki od dawna są wykorzystywane w badaniach behawioralnych4,5, wykorzystując ich stosunkowo duży rozmiar (kilka milimetrów długości), łatwość i niski koszt utrzymania laboratorium oraz szerokie spektrum obserwowalnych zachowań. Wprowadzenie wizji komputerowej i automatycznego śledzenia do badań nad zachowaniem wypławków6,7,8,9,10,11 umożliwiły ilościowe zróżnicowanie fenotypów behawioralnych. Zachowanie zwierząt to bezpośredni odczyt funkcji neuronalnych. Ponieważ płaski układ nerwowy jest średniej wielkości i złożoności, ale dzieli konserwatywne kluczowe elementy z mózgiem kręgowców12,13,14, badanie zachowania wypławków może dostarczyć wglądu w konserwatywne mechanizmy działania neuronów, które mogą być trudne do bezpośredniego zbadania w bardziej złożonych organizmach. Tak więc wypławki są cennym modelem dla porównawczych badań neurobiologicznych8,12,15,16,17,18,19,20,21. Ponadto środowisko wodne pozwala na szybką i łatwą ekspozycję na chemikalia w celu zbadania ich wpływu na funkcjonowanie mózgu u regenerujących się i dorosłych wypławków, co czyni je popularnym systemem w neurotoksykologii22,23,24,25,26.

Planarianie posiadają trzy różne chody, określane jako ślizganie, perystaltyka i zgniatanie. Każdy chód jest prezentowany w określonych okolicznościach: ślizganie się jest chodem domyślnym, perystaltyka występuje, gdy funkcja rzęsek jest zaburzona7,27, a zgniatanie to chód ucieczki – niezależny od funkcji rzęsek – w odpowiedzi na pewne szkodliwe bodźce7. Wykazaliśmy, że zgniatanie jest specyficzną reakcją, wywoływaną przez odczuwanie pewnych sygnałów chemicznych lub fizycznych, w tym ekstremalnych temperatur lub pH, urazów mechanicznych lub określonych induktorów chemicznych, a zatem nie jest ogólną reakcją na stres7,28,29.

Ze względu na swoją specyficzność i stereotypowe parametry, które można łatwo określić ilościowo za pomocą tego protokołu, zgniatanie jest potężnym fenotypem behawioralnym, który umożliwia badaczom przeprowadzanie badań mechanistycznych analizujących ścieżki czuciowe i neuronalną kontrolę zachowania25,28. Ponadto wykazano, że zgniatanie jest czułym punktem końcowym do oznaczania niekorzystnego wpływu chemicznego na rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego w badaniach neurotoksykologicznych22,24,25,30. Ponieważ kilka różnych ścieżek czuciowych wydaje się zbiegać, aby wywołać zgniatanie za pomocą różnych mechanizmów28, zgniatanie różni się od innych zachowań wypławkowych, ponieważ różne, ale specyficzne bodźce mogą być wykorzystywane do analizowania odrębnych obwodów neuronalnych i badania, w jaki sposób różne sygnały są integrowane w celu wytworzenia fenotypu zgniatania.

Co ważne, istnieją różnice gatunkowe, gdzie jedna substancja chemiczna może wywołać zgniatanie u jednego gatunku wypławków, ale inną reakcję behawioralną u innego. Na przykład odkryliśmy, że anandamid indukuje zgniatanie u wypławków Dugesia japonica, ale wywołuje perystaltykę u Schmidtea mediterranea28. Przykład ten podkreśla, jak ważna jest umiejętność niezawodnego rozróżniania różnych chodów, ponieważ są one fenotypowymi przejawami różnych mechanizmów molekularnych. Jednak odróżnienie zgniatania od perystaltyki jelit jest trudne przy użyciu jakościowych danych obserwacyjnych, ponieważ oba chody są napędzane muskulaturą i mają podobieństwa jakościowe7,28. W związku z tym, aby rozróżnić chody, konieczne jest wykonanie obrazowania rzęsek lub ilościowego badania behawioralnego, które pozwala na rozróżnienie na podstawie charakterystycznych parametrów7,28. Ponieważ obrazowanie rzęsek jest eksperymentalnie trudne i wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak mikroskop złożony o dużym powiększeniu i szybka kamera7,28, nie jest tak szeroko dostępne dla badaczy, jak ilościowa analiza behawioralna.

Tutaj prezentujemy protokół (1) indukcji zgniatania za pomocą różnych bodźców fizycznych (szkodliwa temperatura, amputacja, światło bliskie UV) i chemicznych (izotiocyjanian allilu (AITC), aldehyd cynamonowy) oraz (2) ilościowej analizy zachowania wypławków za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania. Określając ilościowo cztery parametry (częstotliwość oscylacji długości ciała, prędkość względna, maksymalna amplituda oraz asymetria wydłużania i kurczenia się ciała)7, zgniatanie można odróżnić od szybowania, perystaltyki jelit i innych stanów behawioralnych opisywanych w literaturze, takich jak lokomocja przypominająca węża15 lub epilepsje15. Co więcej, podczas gdy zgniatanie jest zachowane wśród różnych gatunków wypławków7, każdy gatunek ma swoją własną charakterystyczną częstotliwość i prędkość; W związku z tym, po ustaleniu prędkości ślizgania i zgniatania gatunku, sama prędkość może być użyta jako środek do odróżnienia zgniatania od ślizgania się i perystaltyki29. Protokół zakłada brak wcześniejszego szkolenia w zakresie obliczeniowej analizy obrazu lub badań behawioralnych, a zatem może być również stosowany do eksperymentów behawioralnych wypławków w kontekście laboratorium dydaktycznego na poziomie licencjackim. Przykładowe dane ułatwiające adaptację protokołu znajdują się w materiałach uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ilościowe testy zachowania planarii

  1. Układ eksperymentalny
    1. Ustaw panel LED z regulacją jasności na płaskiej powierzchni. Panel LED pełni dwie funkcje: (1) zapewnia jednorodne białe tło oraz (2) służy jako regulowane źródło światła w celu uzyskania odpowiedniego kontrastu. Na panelu LED umieść arenę w postaci płytki Petriego o średnicy 10 mm.
      UWAGA: W celu zwiększenia przepustowości jako arena może zostać użyta płytka wielodołkowa23,24natomiast większe areny ułatwiają zautomatyzowaną analizę obrazu.
    2. Zamocuj kamerę na statywie laboratoryjnym nad areną (Rycina 1A). W razie potrzeby dostosować położenie, wysokość oraz ostrość kamery tak, aby cała arena znajdowała się w centrum pola widzenia i była ostra (Rycina 1B).
      UWAGA: rozdzielczość kamery musi być wystarczająca, aby wyraźnie odróżnić planarię od jednorodnego tła zapewnionego przez panel LED.
    3. Napełnij arenę odpowiednim medium ekspozycyjnym (wodą dla planariów lub roztworem chemicznym) do połowy maksymalnej objętości (będzie to dalej określane jako kąpiel). W przypadku płytki Petriego o średnicy 10 mm odpowiada to objętości około 25 ml. Włącz panel LED i wyłącz wszystkie inne źródła światła, które mogłyby negatywnie wpłynąć na jakość nagrania (np. znajdujące się w pobliżu źródła światła powodujące odblaski na arenie).
      OSTRZEŻENIE: Należy w odpowiedni sposób obchodzić się z niebezpiecznymi roztworami chemicznymi, stosując pełne środki ochrony indywidualnej (ŚOI) i w razie potrzeby przenosząc stanowisko doświadczalne do dygestorium. Należy przestrzegać federalnych i stanowych przepisów dotyczących utylizacji odpadów.
    4. Przenieś planarię za pomocą pipety transferowej w okolice centrum areny. Rozpocznij nagrywanie. Zapisuj dane jako sekwencje obrazów w natywnym formacie Fiji.31 format (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM lub FITS; patrz sekcja 1.2 analiza obrazu).
      UWAGA: Ze względu na to, że zachowania i wrażliwość na bodźce zewnętrzne różnią się między poszczególnymi planariami, ważne jest zebranie danych z odpowiednio dużej liczby powtórzeń biologicznych, oprócz wykonania powtórzeń technicznych. Pracowaliśmy jednocześnie z maksymalnie 10 planariami średniej wielkości (4–7 mm) w jednej czarce Petriego o średnicy 10 mm. Choć jest to rozwiązanie efektywne czasowo, obecność wielu planarii w czarce Petriego jednocześnie utrudnia analizę danych, ponieważ zwierzęta mogą przecinać swoje ścieżki.
      1. W przypadku eksperymentów dotyczących ślizgania należy rejestrować obraz z częstotliwością co najmniej 1 klatki na sekundę (FPS). W przypadku eksperymentów dotyczących kurczenia/perystaltyki należy rejestrować obraz z częstotliwością FPS wynoszącą co najmniej dwukrotność częstotliwości kurczenia/perystaltyki danego gatunku planarii. Jeśli częstotliwość kurczenia/perystaltyki danego gatunku planarii jest nieznana, należy przyjąć 10 FPS jako wartość wyjściową i odpowiednio ją zwiększać lub zmniejszać.
      2. Podczas stosowania roztworu chemicznego należy przenieść planarię, używając jak najmniejszej liczby kropel wody do planarii, aby nie zmienić znacząco stężenia roztworu chemicznego.
    5. W przypadku eksperymentów dotyczących ślizgania należy zarejestrować od 1 do 2 minut zachowania ślizgającego się. W przypadku eksperymentów dotyczących kurczenia się/perystaltyki należy rejestrować obraz wystarczająco długo, aby uchwycić co najmniej 3 kolejne oscylacje występujące w linii prostej. Po zakończeniu eksperymentu należy przerwać nagrywanie.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów dotyczących kurczenia się/perystaltyki, jeśli planaria nie spełni kryterium zakończenia w ustalonym przedziale czasowym, który musi być spójny dla wszystkich powtórzeń i zostanie określony empirycznie na podstawie bodźca, należy przerwać rejestrację i przetestować kolejną planarię.
      1. Jeśli planaria dotrze do krawędzi areny bez spełnienia kryterium zakończenia, należy przenieść ją pipetą z powrotem do centrum areny.
        UWAGA: Należy unikać wielokrotnego pipetowania pojedynczego osobnika w celu rejestracji, ponieważ może to zmienić jego zachowanie.
    6. Usuń planarię (planarie) z areny i zutylizuj wodę z planariami lub roztwór chemiczny w odpowiednich pojemnikach na odpady. Planarie, które znajdowały się w wodzie z planariami, można przenieść z powrotem do ich macierzystego pojemnika.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy używać różnych aren dla różnych mediów (np. eksperymenty dotyczące ślizgania się w wodzie z planariami nie powinny być przeprowadzane w arenie używanej wcześniej do eksperymentów nad kurczeniem/perystaltyką z ekspozycją chemiczną).
      1. Planaria wystawione na działanie roztworu chemicznego należy płukać seryjnie w 3 czystych szalkach Petriego o średnicy 10 mm, wypełnionych 25 ml wody dla planarii, aby dokładnie usunąć pozostałości substancji chemicznych. Jeśli wystąpiło kurczenie się lub perystaltyka, należy umieścić te planarie w osobnym pojemniku. Planarie mogą wrócić do swojego pierwotnego pojemnika po miesiącu, ponieważ do tego czasu większość komórek uległaby wymianie.1.
        UWAGA: Jeśli dla tej samej populacji planariów wymagane jest przeprowadzenie kilku różnych eksperymentów, np. dla populacji poddanej RNAi, należy pozwolić planariom na regenerację przez 24 godziny przed rozpoczęciem kolejnego eksperymentu. Eksperymenty należy zaplanować w takiej kolejności, aby najmniej inwazyjny eksperyment wykonano jako pierwszy, a najbardziej inwazyjny (np. amputację) jako ostatni.
      2. W przypadku przeprowadzania wielu eksperymentów w tej samej arenie, należy odpowiednio zutylizować roztwór kąpieli i usunąć wszelkie ślady śluzu, przecierając arenę ręcznikiem papierowym pomiędzy kolejnymi próbami.
        UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
  2. Analiza ilościowa zachowania planariów
    1. Przeprowadzić testy behawioralne planariów zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
    2. Otwórz w programie Fiji surową sekwencję obrazów dla eksperymentu (Plik > Import > Sekwencja obrazów) i wybierz pierwszy obraz z sekwencji obrazów. W oknie Opcje sekwencji (Sequence Options) zaznacz pole „Sortuj nazwy numerycznie” (Sort names numerically) i kliknij „OK”. Po załadowaniu sekwencji obrazów przekonwertuj ją na format 8-bitowy (Obraz > Typ > 8-bitowy) i użyj narzędzia strzałki lub suwaka na dole stosu obrazów, aby obejrzeć lub przejrzeć sekwencję obrazów.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów dotyczących ślizgania się można wykorzystać wszystkie dane, pod warunkiem, że planaria jest wyraźnie widoczna przez cały czas trwania nagrania. Zazwyczaj jednak wystarczająca jest analiza swobodnego ruchu w centrum areny poprzez wyodrębnienie odpowiednich fragmentów, zgodnie z poniższym opisem.
    3. Aby wyodrębnić przedział czasowy i obszar zainteresowania, należy za pomocą narzędzia prostokąta narysować obszar zainteresowania obejmujący całą ścieżkę planarii (Rycina 2A, 2B). Kliknij prawym przyciskiem myszy na stos obrazów i wybierz Duplikat..., zaznacz pole wyboru dla Duplikuj stoswprowadź klatki początkową i końcową interesującej sekwencji, a następnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Jeśli obrazowano jednocześnie wiele planariów, powtórz etap wyboru i duplikowania obszaru dla każdego planarium w arenie, tak aby liczba otwartych stosów obrazów odpowiadała liczbie planariów w arenie. Kolejne kroki (kroki 1.2.4-1.2.10) należy wykonać dla każdego stosu obrazów pojedynczo.
      1. W przypadku eksperymentów dotyczących ślizgania należy wyodrębnić okres ślizgania, w którym planaria przemieści się na dystans co najmniej dwukrotności długości swojego ciała.
        UWAGA: Im więcej danych dotyczących poślizgu zostanie pobranych od jednego planarii, tym bardziej wiarygodne będą dane. Planaria nie musi poruszać się w linii prostej w celu przeprowadzenia analizy poślizgu.
      2. W przypadku eksperymentów dotyczących kurczenia się/perystaltyki należy wyodrębnić fragment, w którym planaria wykonuje minimum trzy następujące po sobie (idealnie więcej) oscylacje ciała w linii prostej, upewniając się, że każda oscylacja stanowi pełny cykl wydłużania i skracania się, ponieważ pełne oscylacje są niezbędne do dokładnego określenia częstotliwości.
        UWAGA: Im więcej oscylacji uda się wyodrębnić, tym bardziej wiarygodne będą dane. Nie należy używać sekwencji, w których planaria wykonuje zwroty, ponieważ spowoduje to uzyskanie niedokładnych pomiarów długości.
    4. Zastosuj próg do powielonego stosu obrazów (Obraz > Dostosuj > Próg) w celu binaryzacji obrazu i wyodrębnienia planarii z tła. Dostosuj suwaki w taki sposób, aby cała planaria została zaznaczona na czerwono. Dokładne wartości zależą od jakości obrazowania. Pozostaw pola dla Ciemne tło, Histereogram skumulowanyoraz Nie resetuj zakresu niezaznaczone. Przewiń stos obrazów, aby upewnić się, że zakres progowy jest odpowiedni (tj. planaria jest wyraźnie oddzielona od tła w całym stosie), a następnie kliknij Zastosuj.
    5. W Konwersja stosu na postać binarną okno, ustawić Metodę na Domyślny or wprowadzenie do ŚwiatłoOdznacz wszystkie pola w tym oknie, a następnie kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Pojawi się zbinaryzowany obraz przedstawiający czarnego planarię na białym tle (Rysunek 2C). Należy upewnić się, że cały planaria jest widoczny we wszystkich klatkach sekwencji obrazów.
      UWAGA: Niepożądane obiekty w binarnej sekwencji obrazów, które są mniejsze lub większe od planarii, mogą zostać odfiltrowane w dalszej analizie przy użyciu filtra wielkości (Rycina 2Ciii).
    6. Ustaw pomiary poprzez kliknięcie Analiza > Ustawienia pomiarówZaznacz pola dla Obszar, Środek masy, Pozycja stosui Dopasowanie elipsy i kliknij OK.
      UWAGA: Parametry te należy ustawić tylko raz podczas jednej sesji programu Fiji.
    7. Wybierz otwarty stos obrazów, a następnie zaznacz Analizuj > Analiza cząstek.
    8. W Analiza cząstek okno, wybierz Pokaż > Maski aby otworzyć nowy stos obrazów wyświetlający wszystkie obiekty wykryte przy użyciu wybranych parametrów. Można tego użyć do wizualnej weryfikacji, czy pomiary są wykonywane wyłącznie dla planarii. Na tym etapie można ustawić filtr rozmiaru w celu usunięcia niepożądanego szumu, wprowadzając przybliżoną powierzchnię planarii (w pikselach2 jednostki) w wyznaczonym miejscu. Zaznacz pola dla Wyświetl wyniki i Wyraźne wyniki i kliknij OK.
      UWAGA: W Wyniki okno, jeśli indeks (pierwsza kolumna) nie jest równy numerowi przekroju dla wszystkich wierszy, oznacza to, że śledzono zbyt wiele lub zbyt mało obiektów. Jedną z możliwych przyczyn tej rozbieżności jest obecność innych obiektów poza planarią lub fakt, że planaria nie została wyśledzona w konkretnych klatkach.
    9. Przesuń kadr przez stos obrazów maski, korzystając z suwaka znajdującego się na dole panelu. Jeśli występuje szum lub znajdują się klatki, na których nie ma planarii, zamknij Wyniki okno oraz stos obrazów maski. Powtórz kroki 1.2.7–1.2.8, dostosowując filtr obszaru tak, aby usunąć wyłącznie obiekty inne niż planaria.
      UWAGA: Jeśli planaria nie jest widoczna w kadrze maski, sugeruje to, że dolna granica filtra obszaru została ustawiona zbyt wysoko.
    10. Na Wyniki okno, zapisać dane za pomocą Plik>Zapisz jakoDodaj rozszerzenie .csv do nazwy pliku, aby zapisać dane jako wartości rozdzielone przecinkami. Po zapisaniu danych dla stosu obrazów zamknij odpowiedni stos obrazów i Wyniki i Maska okna
    11. Zaimportuj dane i przeprowadź dalszą analizę, korzystając z dowolnego oprogramowania arkuszowego lub darmowego programu. Aby obliczyć prędkość ślizgania, zapoznaj się z sekcją 1.3. Aby obliczyć pełny zestaw parametrów kurczenia/perystaltyki, zapoznaj się z sekcją 1.4.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać procedurę.
    12. Aby wyznaczyć przelicznik pikseli na rzeczywistą długość, otwórz w programie Fiji obraz zawierający długość referencyjną (np. średnicę areny). Wybierz narzędzie linii i narysuj linię na znanym odcinku.
    13. Przelicz jednostki pikseli na standardową jednostkę długości poprzez kliknięcie Analizuj > Ustawienie skaliWprowadź długość odpowiadającą linii narysowanej na obrazie w Znana odległość pudełko i zmiana Jednostka długości z piksel do wybranej standardowej jednostki długości. Współczynnik konwersji jest zapisany obok Skala.
      UWAGA: Wartość konwersji pikseli nie jest wymagana dla analiz poślizgu lub kurczenia się/perystaltyki w sekcjach 1.3 i 1.4.
  3. Obliczanie prędkości ślizgu
    1. Korzystając z pliku danych zapisanego w sekcji 1.2, należy wczytać współrzędne x i y środka masy (COM) oraz dane dotyczące osi głównej. Jeśli dane zostały zapisane w pliku wartości rozdzielanych przecinkami, listy te odpowiadają odpowiednio kolumnom „XM”, „YM” oraz „Major”.
    2. Oblicz przemieszczenie (d) środka masy planarii w pikselach dla każdej klatki w stosunku do następnej klatki, korzystając z kolumn danych „XM” i „YM”. Przesunięcie (d) wyraża się wzorem:
      Wzór na odległość; schemat obliczania odległości między dwoma punktami, edukacyjny koncept matematyczny.
      gdzie x1 i y1 odnieś się do współrzędnych COM (XM, YM) jednej klatki oraz x2 oraz y2 należy odnieść się do współrzędnych środka masy (XM, YM) następnej klatki.
    3. Przyjmij długość ciała planarii jako 95th percentyl kolumny „Major”. Ponieważ planarie wykazują zachowanie polegające na preferencji ścian32zapewnia to, że obliczona długość ciała planarii jest reprezentatywna dla stanu, w którym planaria jest wydłużona24.
    4. Znormalizuj przemieszczenie w stosunku do długości ciała planarii, dzieląc przemieszczenia wyrażone w pikselach na klatkę przez długość ciała planarii (l)Znormalizowane przemieszczenie (dn) wynosi:
      Równanie dyfrakcji, \( d_n = \frac{d}{l} \), ilustrujące analizę dyfrakcyjną.
    5. Wygeneruj listę znormalizowanych prędkości, dzieląc znormalizowane przemieszczenia przez czas upływający między klatkami (odwrotność zarejestrowanej liczby klatek na sekundę, FPS). Znormalizowana prędkość ślizgu (sn) jest określony przez:
      Równanie równowagi statycznej, Sn=dn/(FPS)^-1, wzór matematyczny, zastosowanie edukacyjne.
    6. Oblicz znormalizowaną prędkość ślizgania planarii, wyciągając średnią z listy znormalizowanych prędkości. (sn)Odchylenie standardowe może być wykorzystane jako miara niepewności dla planarii.
    7. Powtórz kroki 1.3.1–1.3.6 dla każdego planarii przeznaczonego do analizy. Oblicz średnią oraz odchylenie standardowe prędkości ślizgania dla wszystkich planarii, aby uzyskać odpowiednio prędkość ślizgania i powiązaną z nią niepewność dla populacji planarii.
  4. Rozróżnienie sposobów poruszania się typu scrunching i perystaltycznego z wykorzystaniem pełnego zestawu parametrów
    1. Wczytaj listę danych osi głównej z pliku danych zapisanego w sekcji 1.2. Jeśli dane zostały zapisane w pliku wartości rozdzielonych przecinkami, odpowiada to Główny kolumna
    2. Utwórz listę, w której każdy punkt danych jest ponumerowany w Główny kolumna, zaczynając od 0Przelicz tę listę na czas upływający między klatkami, dzieląc wartości przez zarejestrowaną liczbę klatek na sekundę (FPS).
    3. Wykreśl Główny dane z kolumny w odniesieniu do upływu czasu w celu wygenerowania wykresu oscylacji kurczenia się/perystaltyki (Rycina 3A). Korzystając z wykresu oscylacji, przytnij dane tak, aby obejmowały co najmniej trzy kolejne oscylacje o przebiegu liniowym (Rycina 3Bi). Przytnąć dane tak, aby zaczynały się i kończyły na lokalnych szczytach (maksymalne wydłużenie oscylacji) lub dolinach (minimalne wydłużenie oscylacji).
      UWAGA: Jeśli ekstrema lokalne nie są w przybliżeniu równe (szczyty i doliny różnią się znacząco pod względem wysokości), sugeruje to, że oscylacje nie są liniowe (Rysunek 3Bii). Wyodrębnij kolejną sekwencję co najmniej trzech następujących po sobie oscylacji w linii prostej. Należy odnieść się do sekcji 1.2.
    4. Potwierdź, czy interesująca sekwencja oscylacji została prawidłowo wyekstrahowana i przycięta, ponownie nanosząc przycięte dane na wykres Główny dane w odniesieniu do czasu. Należy użyć tej przyciętej listy danych do wszystkich kolejnych obliczeń.
    5. Obliczanie częstotliwości oscylacji (νm), podzielić liczbę oscylacji (On) przez całkowitą liczbę punktów danych w przyciętym zbiorze danych dla głównej osi (N)Pomnóż wartość FPS przez tę liczbę, aby otrzymać częstotliwość wyrażoną w oscylacjach na sekundę.
      Równanie vm=FPS*(On/N), reprezentujące obliczenia szybkości; schemat do celów edukacyjnych.
    6. Aby obliczyć maksymalne wydłużenie (|Δε|maks.)odejmij absolutną minimalną długość ciała (lmin) od absolutnej maksymalnej długości ciała (lmaksymalnie)Znormalizuj do długości ciała w pozycji wydłużonej, dzieląc przez absolutną maksymalną długość ciała.
      Równanie równowagi statycznej |Δε|max=(lmax−lmin)/lmax; wzór do analizy maksymalnego odkształcenia.
    7. Aby obliczyć prędkość w przeliczeniu na długość ciała (v*m), pomnożyć obliczoną maksymalną wydłużenie przez częstotliwość oscylacji.
      Równanie prędkości w analizie systemów dynamicznych opisujące maksymalną zmianę w danych eksperymentalnych.
      UWAGA: Sama prędkość może być wykorzystana do rozróżnienia między chodem typu scrunching a perystaltycznym7.
    8. Aby obliczyć ułamek czasu spędzonego na elongacji (fwydłużenie)oblicz pochodną listy danych głównej osi po przycięciu względem czasu. Podziel liczbę dodatnich punktów danych (tj. gdy pochodna jest >0 (np), przez całkowitą liczbę punktów danych na liście danych dla osi głównej (nT)).
      Równanie dla frakcji wydłużenia polimeru, f_elon = n_p/n_t, wzór, analiza naukowa.
      UWAGA: Planarie wykazujące ruch kurczowy (scrunching) przeznaczają asymetryczną część czasu na wydłużanie, podczas gdy planarie wykonujące perystaltykę spędzają równą ilość czasu na wydłużaniu i kurczeniu się7.
    9. Powtórzyć kroki 1.4.1–1.4.8 dla każdego analizowanego planarii. Obliczyć zestaw parametrów populacji planarii, wyznaczając średnią oraz odchylenie standardowe dla każdego parametru.
      UWAGA: Zestaw parametrów można wykorzystać do określenia, czy charakter oscylacji odpowiada kurczeniu się (scrunching), perystaltyce czy innej formie lokomocji ze zmianami kształtu ciała o charakterze okresowym. Zarówno kurczenie się, jak i perystaltyka charakteryzują się stałymi parametrami dla danego gatunku.7, przy czym parametry ściskania są zazwyczaj większe niż parametry perystaltyki7Choć możliwe jest, że jeden z parametrów może wykraczać poza zakres specyficzny dla danego gatunku, co obserwowaliśmy wcześniej w przypadku indukcji chemicznej28obserwowane zachowanie musi być zgodne z co najmniej 3 z 4 opublikowanych parametrów, aby zostać zaklasyfikowane jako perystaltyka lub kurczenie (scrunching).

2. Indukcja scrunchingu

  1. Bodźce fizyczne (szkodliwa temperatura, światło UV, amputacja)
    1. W przypadku wszystkich eksperymentów z bodźcami fizycznymi należy zapoznać się z konfiguracją doświadczalną w sekcji 1.1.
      UWAGA: Do eksperymentów z bodźcami fizycznymi najlepiej używać dużej areny, takiej jak szalka Petriego o średnicy 10 mm, aby zapewnić więcej wolnej przestrzeni do manewrowania pipetą i/lub żyletką.
    2. Aby wywołać kurczenie się (tzw. scrunching) za pomocą szkodliwej temperatury, podgrzać wodę dla planariów w szklanej zlewce (co najmniej 10 µL na każde badane planarium) do 65 °C na płycie grzejnej.
      1. Umieścić planarium w centrum areny. Odczekać, aż planarium ustawi się pionowo i zacznie szybować. Rozpocząć rejestrację.
      2. Za pomocą pipety P-200 powoli nanieść 10 µL wody dla planariów o temperaturze 65 °C za gardło, na koniec ogona planarium, aby wywołać kurczenie się.
        UWAGA: Należy upewnić się, że podgrzana woda dla planariów utrzymuje temperaturę 65°C. W razie potrzeby ponownie podgrzać wodę do 65°C przed rozpoczęciem kolejnego eksperymentu. Ponieważ ciśnienie również może wywołać kurczenie się, konieczne jest powolne pipetowanie. Pipetowanie wody o temperaturze pokojowej w ten sam sposób co w eksperymencie może służyć jako kontrola i opcja treningowa.
      3. Zatrzymać rejestrację, gdy kurczenie się ustanie. Umieścić planarium w pojemniku do regeneracji i wymienić medium w szalce Petriego na świeżą wodę dla planariów o temperaturze pokojowej, jeśli planowane są kolejne eksperymenty.
    3. Aby wywołać kurczenie się poprzez amputację, przenieść planarium do centrum areny i odczekać, aż planarium ustawi się pionowo i zacznie szybować. Rozpocząć rejestrację.
      1. Przeprowadzić amputację planarium za pomocą czystej żyletki. Amputacje można wykonywać w dowolnym miejscu ciała planarium, pod warunkiem, że miejsce cięcia jest spójne we wszystkich eksperymentach.
        UWAGA: Parametry kurczenia się są pobierane z fragmentu przedniego. Należy zatem unikać zasłaniania widoku kamery na tę część planarium podczas wykonywania cięcia, podchodząc od strony końca tylnego. Do cięcia dobrze nadają się również plastikowe zakrycia szalek, które są bezpieczniejszą opcją, zwłaszcza w warunkach dydaktycznych.
      2. Zatrzymać rejestrację, gdy przedni fragment przestanie się kurczyć. Wyjąć oba fragmenty, umieścić je w osobnym pojemniku i pozostawić do regeneracji na 7 dni. Po regeneracji amputowane planaria można ponownie przenieść do pojemnika macierzystego.
    4. Aby wywołać kurczenie się przy użyciu światła bliskiego UV, należy założyć odpowiednie filtry (np. filtry Roscolux) na obiektyw kamery, aby zmniejszyć ilość odbitego światła bliskiego UV zbieranego przez kamerę, które mogłoby zakłócać obrazowanie reakcji planarium. Zamiast używać panelu LED do oświetlania areny od dołu, należy zastosować otoczeniowe czerwone oświetlenie, na które planaria są niewrażliwe3.
      1. Wypełnić arenę w postaci szalki Petriego o średnicy 100 mm wodą dla planariów i umieścić pojedyncze planarium (5-9 mm) w centrum areny. Rozpocząć rejestrację w 10 FPS.
      2. Trzymać wskaźnik laserowy UV klasy II (405 ± 10 nm, moc wyjściowa <5 mW) w odległości około 30 cm od areny. Ustawić wskaźnik laserowy pod kątem 45° względem szybującego planarium, a następnie naświetlać przez 5-10 sekund w połowie drogi między końcem tylnym gardła a końcówką ogona, aby wywołać kurczenie się.
        UWAGA: Moc wskaźnika laserowego można zmierzyć za pomocą miernika mocy czułego na bliskie UV.
      3. Odczekać, aż planarium ponownie zacznie szybować, przed próbą dwóch kolejnych stymulacji tego samego osobnika w celu sprawdzenia powtarzalności reakcji. Jeśli planarium nadal wykazuje to samo zachowanie, zatrzymać rejestrację i umieścić planarium z powrotem w pojemniku. Jeśli zachowanie zmienia się między stymulacjami, dodatkowe testy wykażą, która reakcja jest najbardziej dominująca.
        UWAGA: Planaria mogą stać się odczulone na światło bliskie UV i przestaną reagować. Kolejne stymulacje wymagają okresu odpoczynku trwającego 8-10 sekund.
  2. Bodziec chemiczny (AITC)
    1. Aby wywołać kurczenie się za pomocą substancji chemicznej, np. agonisty TRPA1 AITC28, planaria najlepiej zanurzyć w kąpieli z tej substancji. W razie potrzeby można zastosować pipetowanie, jak opisano w sekcji 2.1.2.3.
      OSTRZEŻENIE: AITC jest łatwopalne, silnie toksyczne, może powodować podrażnienie skóry i oczu, uczulenie dróg oddechowych i skóry oraz jest niebezpieczne dla organizmów wodnych. Olej AITC należy obsługiwać w wyciągu (dygestorze). Przed przygotowaniem roztworów stokowych AITC należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (nitrylowe rękawiczki i fartuch laboratoryjny) oraz przygotować odpowiednie pojemniki do utylizacji stałych i ciekłych odpadów niebezpiecznych.
    2. W wyciągu przygotować 10 mM roztwór stokowy AITC w wodzie dla planariów w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Ten roztwór stokowy można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4°C.
      1. Z tego roztworu przygotować 25 mL roztworu roboczego 10 µM AITC w wodzie dla planariów w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Ten roztwór 10 µM AITC będzie używany do wywoływania kurczenia się u planariów.
        UWAGA: 10 µM AITC wywołuje spójne kurczenie się u planariów D. japonica i S. mediterranea28. W przypadku innych wodnych planariów 100 µM może służyć jako stężenie wyjściowe i może być odpowiednio dostosowane.
      2. Przygotować konfigurację eksperymentalną (patrz sekcja 1.1). Wypełnić arenę roztworem roboczym AITC i umieścić ją w dodatkowym pojemniku. Pojemnik pomocniczy powinien pomieścić co najmniej dwukrotność objętości areny.
        UWAGA: Dla zwiększenia bezpieczeństwa eksperymenty można przeprowadzać w wyciągu.
      3. Przenieść do 10 planariów do centrum areny i rozpocząć rejestrację.
      4. Gdy planaria staną się odczulone i przestaną się kurczyć, zatrzymać rejestrację. Wyjąć planaria z roztworu AITC i opłukać (patrz sekcja 1.1). Utylizować stałe i ciekłe odpady AITC w odpowiednich pojemnikach na odpady.
      5. Zweryfikować specyficzność odpowiedzi na AITC, stosując RNAi przeciwko TRPA128 zgodnie ze standardowymi protokołami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pozawzrokowa percepcja bliskiego zakresu UV u planariów S. mediterranea zależy od kanału TRPA1 i według hipotez jest powiązana z uwalnianiem H2O217. Ponieważ ekspozycja na H2O2 indukuje zależne od TRPA1 kurczenie się (tzw. scrunching) u planariów S. mediterranea oraz D. japonica28, kroki opisane w sekcji 2.1.4 mogą zostać wykorzystane do sprawdzenia, czy ekspozycja na światło bliskiego zakresu UV indukuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystając z tego protokołu, można ilościowo badać wpływ bodźców fizycznych i chemicznych 7,28,29 lub manipulacji genetycznej (RNAi)28,29 na lokomocję wypławków. Aby zmaksymalizować rozdzielczość przestrzenną, najlepiej jest przesunąć kamerę jak najbliżej areny, upewniając się, że cała arena znajduje się w polu widzenia. Aby zwiększyć przepustowość, zachowanie wielu wyp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Tapan Goelowi za komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana ze środków NSF CAREER Grant 1555109.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izotiocyjanian allilu, 95% (AITC)Sigma-Aldrich377430-5GUWAGA:  Łatwopalny i silnie toksyczny; w dygestorium z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
Obiektyw aparatu, 2/3 25mm F/1.4 Tamron23FM25SP
Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe, poddane hodowli tkankowejGenesee Scientific 25-105
Probówki wirówkowe, 50 ml polipropylenu, sterylneMedSupply Partners62-1019-2
Aldehyd cynamonowy, >95%Sigma-AldrichW228613-100G-K
Ściemnialna kaseton świetlny A4 LED TracerAmazonB07HD631RP
Flea3 Kamera USB3FLIRFL3-U3-13E4M
Rękawice żaroodporneFisher Scientific11-394-298
Płyta grzejnaFisher ScientificHP88854200
Instant Ocean Sea Salt, przygotowana w wodzie dejonizowanejInstant OceanSS15-10Przygotować w wodzie dejonizowanej w stężeniu 0,5 g/L.
Montjü sole krzemowe, przygotowane w wodzie Milli-QSigma-AldrichróżnePrzygotować w wodzie mili-Q o stężeniu 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3 dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl.
szalki Petriego, 100 mm x 20 mm, sterylny polistyrenPipeta SimportD210-7
, 20-200 μ Seria LZlewka Rainin
PYREX 150 mlSigma-AldrichCLS1000150
Żyletka, 0,22 mmVWR55411-050
Roscolux:  Golden AmberRoscoR21Alternatywnie kup selektor kolorów Roscolux Designer (produkt Musson Theatrical #SBLUX0306), który zawiera wszystkie 3 filtry kolorów razem.
Filtr kolorów Roscolux:  Średni czerwonyRoscoR27
Roscolux:  Storaro RedRoscoR2001
Pipeta transferowa Samco, 62 i mikro; L StojakThermo Fisher691TS
 Termometr Fisher Scientific12-947-976
VWR89095-600
Wskaźnik laserowy UVAmazonB082DGS86RJest to laser klasy II (405nm ± 10nm) o mocy wyjściowej < 5 mW.
17008652 Filtr barwny filtr barwny pomocniczy o dużej aperturze

Bibliografia

  1. Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
  2. Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
  3. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
  4. Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
  5. Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
  6. Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
  7. Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001(2015).
  8. Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
  9. Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
  10. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  11. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
  12. Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266(2017).
  13. Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
  14. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
  15. Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
  16. Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
  17. Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
  18. Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
  19. Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
  20. Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
  21. Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
  22. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
  23. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
  24. Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
  25. Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
  26. Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
  27. Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
  28. Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244(2019).
  29. Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
  30. Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  32. Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214(2015).
  33. Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708(2014).
  34. Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40(2007).
  35. Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
  36. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
  37. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilościowa analiza behawioralnaswobodnie poruszające się planarieanaliza w oprogramowaniu Fijikurczenie wywołane temperaturąodpowiedź na bodziec chemicznykurczenie wywołane amputacjąDugesia japonicaSchmidtea mediterranea
Zgniatanie wypławków jako ilościowy odczyt behawioralny dla wyczuwania szkodliwych bodźców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.