Method Article

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

DOI:

10.3791/61557

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania badały ryzyko związane z mutacjami genu BRCA1 za pomocą różnych metod oceny funkcjonalnej, takich jak fluorescencyjne testy reporterowe, testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych i testy wrażliwości terapeutycznej opartej na lekach. Chociaż wyjaśniono wiele wariantów BRCA1, testy te obejmujące użycie egzogennych wariantów BRCA1 są związane z problemami z nadekspresją i nie mogą być stosowane do regulacji potranskrypcyjnej. Aby rozwiązać te ograniczenia, wcześniej opisaliśmy metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytora zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które indukują ukierunkowaną substytucję nukleotydów w żywych komórkach. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy warianty, których funkcje pozostają niejednoznaczne, w tym c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T i c.4986+5G>A, i potwierdziliśmy, że edytory bazowe za pośrednictwem CRISPR są użytecznymi narzędziami do reklasyfikacji wariantów o niepewnym znaczeniu w BRCA1. W tym miejscu opisujemy protokół analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny opartego na CRISPR. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wyboru miejsc docelowych, analizy funkcjonalnej i oceny wariantów BRCA1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen podatności na raka piersi typu 1 (BRCA1) jest powszechnie znanym genem supresorowym nowotworu. Ponieważ gen BRCA1 jest związany z naprawą uszkodzeń DNA, mutacje w tym genie prowadziłyby do większego ryzyka rozwoju raka u osobnika1. Rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki jest związany z dziedzicznymi mutacjami powodującymi utratę funkcji (LOF) genu BRCA12. Ocena funkcjonalna i identyfikacja wariantów BRCA1 może pomóc w zapobieganiu i diagnozowaniu różnych chorób. Aby określić funkcję wariantów BRCA1, opracowano kilka metod, które są szeroko stosowane do badania patogenności wariantów BRCA1, takich jak testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych, fluorescencyjne testy reporterowe i testy wrażliwości terapeutycznej oparte na lekach3,4,5,6. Chociaż metody te oceniły funkcję wielu wariantów BRCA1, metody obejmujące egzogenne warianty BRCA1 stwarzają ograniczenia pod względem nadekspresji, która może wpływać na dalszą regulację, dawkowanie genów i fałdowanie białek7. Co więcej, testy te nie mogą być wykorzystane do regulacji potranskrypcyjnej, takiej jak splicing mRNA, stabilność transkryptu i wpływ nieulegającego translacji regionu8,9.

System CRISPR-Cas9 umożliwia ukierunkowaną edycję genomu w żywych komórkach i organizmach10. Poprzez pojedynczy przewodnik RNA, Cas9 może indukować pęknięcia dwuniciowe (DSB) w chromosomalnym DNA w określonych loci genomowych w celu aktywacji dwóch ścieżek naprawy DNA: podatnego na błędy szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i wolnego od błędów szlaku naprawy kierowanej homologią (HDR)11. HDR to precyzyjny mechanizm naprawczy; jednak DSB indukowane przez nukleazę Cas9 dla HDR często powodują niepożądaną mutację insercji i delecji (indel). Dodatkowo potrzebuje homologicznych matryc DNA dawcy do naprawy uszkodzeń DNA i ma stosunkowo niską skuteczność. Ostatnio nickaza Cas9 (nCas9) została połączona z domenami deaminazy cytydyny w celu ukierunkowania podstawień C:G do T:A, bez potrzeby stosowania homologicznych matryc DNA i pęknięć podwójnej nici DNA12,13,14,15. Korzystając z edytora bazy cytozyny, opracowaliśmy nową metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA116.

W tym badaniu użyliśmy edytora zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, BE314, który indukuje skuteczne mutacje punktowe C:G do T:A, do wdrożenia oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 i z powodzeniem zidentyfikowaliśmy funkcje kilku wariantów BRCA1 (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy na potrzeby oceny funkcjonalnej. (A) Schemat przedstawiający ocenę funkcjonalną BRCA1. Ponieważ LOF BRCA1 wpływa na żywotność komórek, gdy mutacja BRCA1 jest patogenna, komórki umierają wraz ze wzrostem liczby pasaży. (B) Etapy oceny funkcjonalnej BRCA1. Kropkowane pole jest opcjonalne. Można go zastąpić przez kotransfekcję DNA wykazującego ekspresję gRNA i enzymu BE3 w plazmidach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Metoda 1 (generowanie linii komórkowych HAP1-BE3) jest opcjonalna. Zamiast konstruować linię komórkową z ekspresją BE3, plazmidowe DNA kodujące BE3 może być współtransfekowane z plazmidowym DNA kodującym gRNA. Inne warianty edytorów zasad cytozyny, takie jak BE4max, mogą być również używane do wysoce wydajnej edycji bazy.

1. Generacja linii komórkowych HAP1-BE3

  1. Budowa plazmidowego DNA
    1. Aby skonstruować plazmidowe DNA lentiBE3-blast do produkcji lentiwirusa, amplifikuj sekwencje kodujące BE3 w pCMV-BE3 (tabela materiałów) metodą PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności. Zaprojektuj starter PCR tak, aby zawierał nakładające się na siebie sekwencje strawionego wektora (z kroku 1.1.2) do montażu izotermicznego w następujący sposób17:
      Elementarz F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      Elementarz-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTTCTCTTCTCTTCTTGGG-3'
      UWAGA: Nukleotydy pokazane w podkreśleniu nakładają się na strawiony wektor i te sekwencje będą specyficzne dla wektora docelowego wybranego przez użytkownika.
    2. Trawić plazmidowe DNA lentiCas9-blast (tabela materiałów) z enzymami restrykcyjnymi, XbaI i BamHI (1 jednostka na 1 μg) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Uruchomić strawiony produkt na 0,8% żelu agarozowym i oczyścić pasma o odpowiedniej wielkości (8,6 kb) za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).
    3. Sklonuj amplifikowany produkt BE3 PCR i strawiony wektor lentiCas9-Blast za pomocą zestawu do montażu izotermicznego (tabela materiałów). Użyj łącznie 0,02-0,5 pmol fragmentów DNA i stosunku 1:3 wektor:wstaw. Przekształć produkt montażowy w komórki kompetentne alfa DH518. Dodać transformanty na płytkę agarową zawierającą ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Wybierz kilka kolonii i zaszczep je w 4 ml pożywki LB (bulion lizogeniczny) zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i hoduj kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem przy 180 obr./min.
    5. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA (tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta.
    6. Aby potwierdzić powodzenie klonowania DNA, przeanalizuj sekwencje BE3 każdego oczyszczonego plazmidowego DNA (od kroku 1.1.5) za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu standardowych i specyficznych dla BE3 starterów (Tabela uzupełniająca 1) i wybierz dokładny sklonowany konstrukt blastu lentiBE3.
      UWAGA: Do analizy wyników sekwencjonowania Sangera poleciliśmy kilka narzędzi, takich jak BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) i CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Hodowla komórkowa i wytwarzanie linii komórkowych HAP1-BE3
    1. Utrzymuj komórki w zdrowym stanie i w stanie aktywnego podziału. Hodowla komórek HAP1 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Iscove (tabela materiałów) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodowla HEK293T/17 komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco (tabela materiałów) zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
      UWAGA: Komórka HAP1 jest przydatna do badań genetycznych, ponieważ jest prawie haploidalna. Jednak komórki mogą spontanicznie powrócić do stanu diploidalnego w hodowli komórkowej. Wzbogacenie Hoechst 34580 barwione 1 n-populacją przy użyciu cytometrii przepływowej będzie pomocne w utrzymaniu haploidii komórek HAP119.
    2. Wysiewaj 5 x 106 HEK293T/17 komórek na szalce 100 nm 1 dzień przed transfekcją. W dniu transfekcji należy przetransfekować plazmidowe DNA (15 μg lentiBE3-blast, 9 μg psPAX2 do pakowania wirusa i 6 μg pMD2.G do koperty fiolki systemu pakowania lentiwirusa 2. generacji) przy użyciu komercyjnych odczynników do transfekcji zgodnie z protokołami producenta (Tabela materiałów)20. Zmienić pożywkę po 6 godzinach od transfekcji i zebrać pożywkę zawierającą wirusa po 48 godzinach lub 72 godzinach po transfekcji. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm.
    3. Transdukuj cząsteczki lentiwirusa BE3 do komórek HAP1 przy MOI (wielokrotności infekcji) 0,1. Aby dostosować się do odpowiedniego MOI, należy użyć seryjnie rozcieńczonych stężeń wirusa. Usuń pożywkę i zastąp ją dostosowanym supernatantem wirusowym i świeżą pożywką hodowlaną.
    4. Jednego dnia po transdukcji zmień pożywkę na 10 μg/ml pożywki zawierającej blasticydynę (tabela materiałów) i wybierz transdukowane komórki przez 3 dni za pomocą blasticydyny. Po selekcji blasticydyny wybierz studzienkę z ~10% komórek, które przeżyły, do następnego kroku.
    5. Po selekcji blasticydyny wysiewać transdukowane komórki na 96-dołkowych płytkach o gęstości 0,5 komórki/dołek w celu wyizolowania pojedynczych klonów (np. rozcieńczyć 50 komórek w 20 ml (0,5 komórki na 200 μl) pożywki hodowlanej i podwielokrotności 200 μl na basenik w płytce 96-dołkowej). Inkubuj 96-dołkowe płytki przez 2 tygodnie i wybierz pojedyncze kolonie, aby potwierdzić aktywność BE3.
    6. Podziel pojedyncze kolonie na dwa zestawy, jeden zestaw do badania aktywności BE3, a drugi do utrzymania. Transdukuj lentiwirusowe cząstki gRNA do jednego z zestawów, aby potwierdzić aktywność BE3. Przeanalizuj częstość mutacji każdej kolonii za pomocą testu endonukleazy T7 I (T7E1, tabela materiałów) lub wykonując ukierunkowaną technikę głębokiego sekwencjonowania (krok 4)21. Wybierz odpowiednie pojedyncze klony, które są zdrowe i mają wysoce aktywny BE3.
      UWAGA: Aby zweryfikować dokładne częstości mutacji, zalecamy celowane głębokie sekwencjonowanie niż test T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) jest dobrze zwalidowanym miejscem docelowym dla BE3.

2. Projektowanie i budowa BRCA1 ukierunkowanego na gRNA

figure-protocol-1
Rysunek 2: Przykład plazmidowego DNA gRNA. (A) Aby skutecznie edytować sekwencję docelową za pomocą BE3, wymagany jest NGG PAM (CCN PAM), który umieszcza cel C (cel G) w oknie pięciu nukleotydów. NGG PAM jest pokazany na czerwono, a podstawowe okno edycji jest reprezentowane przez szare pole. (B) Sekwencja gRNA do edycji zasad c.8047C>T (H1283Y) jest wskazana, a docelowe pary C:G są pokazane na czerwono, podczas gdy aktywne okno jest podświetlone szarym polem. W przypadku klonowania gRNA sekwencje zwisów zaznaczone pogrubioną czcionką są dodawane na obu końcach 5ʹ. Matryce dla gRNA zostały wygenerowane przez wyżarzanie dwóch komplementarnych oligonukleotydów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Pozytywne i negatywne kontrole wariantów BRCA1 są niezbędne. W tym badaniu c.5252G>A (R1751Q) i c.4527C>T (Y1509Y) są używane jako łagodne kontrole. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A i c.3598C>T (Q1200*) są stosowane jako kontrole patogenów. Sekwencje docelowe każdego gRNA są wymienione w tabeli uzupełniającej 1.

  1. Uzyskaj sekwencję genomu BRCA1 z GenBank pod adresem NCBI22.
  2. Przeszukaj miejsca docelowe 20-pz z sekwencją "NGG" i "CCN" Protospacer Adjacent Motif (PAM) wokół interesującej nas mutacji. Mutacja będąca przedmiotem zainteresowania powinna być zlokalizowana w 4-8 nukleotydach w PAM-dystalnym końcu sekwencji docelowych gRNA, ponieważ aktywne okno BE3 wynosi 4-8 nukleotydów w PAM-dystalnym końcu docelowych sekwencji gRNA14. W przypadku c.8047C>T (H1283Y)- i c.5252G>A (R1751Q) ukierunkowanych na gRNA, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ i 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, sekwencje pogrubione są oknami aktywnymi. Konwersje C do T i G do A zachodzą odpowiednio z NGG i CCN PAM (Rysunek 2A).
    UWAGA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 to przydatne narzędzia internetowe do projektowania gRNA.
  3. Uporządkuj dwa komplementarne oligonukleotydy na gRNA; dla oligonukleotydów czołowych dodaj "CACCG" do końca 5ʹ sekwencji prowadzącej, a dla odwrotnych oligonukleotydów dodaj "AAAC" do końca 5' i "C" do końca 3'. Te dodatkowe sekwencje są specyficzne dla docelowego wektora ekspresji gRNA (z kroku 2.5) używanego w tym protokole, a użytkownicy powinni być dostosowani do alternatywnych wektorów ekspresji gRNA (Rysunek 2B).
  4. Zawiesić oligonukleotyd w wodzie destylowanej o końcowym stężeniu 100 μM. Wymieszać dwa komplementarne oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 μM z buforem ligacyjnym T4 (tabela materiałów) i ogrzewać je w temperaturze 95 °C przez 5 minut i schłodzić w temperaturze pokojowej do wyżarzania.
  5. Trawić pRG2 przy użyciu enzymu restrykcyjnego BsaI (1 jednostka na 1 μg) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (tabela materiałów). Nałożyć strawiony produkt na 1% żel agarozowy i oczyścić opaskę o odpowiedniej wielkości (2,5 kb).
    UWAGA: Zamiast klasycznej metody trawienia i ligacji, można zastosować inną metodę klonowania, taką jak klonowanie Golden Gate.
  6. Związać wyżarzony dupleks oligonukleotydowy do wektora DNA za pomocą zakupionej ligazy DNA (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta i przekształcić je w komórki DH5 alfa-kompetentne (można również użyć innych szczepów E. coli, które są szeroko stosowane do subklonowania).
  7. Dodać transformanty do płytki agarowej zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Oczyść plazmidowe DNA z kilku transformantów i przeanalizować ich sekwencje gRNA przez sekwencjonowanie Sangera przy użyciu starterów, które przygotowują promotor U6 (tabela materiałów).

3. Tworzenie wariantów BRCA1 za pomocą narzędzi do edycji bazy za pośrednictwem CRISPR

UWAGA: Jeśli linie komórkowe HAP1-BE3 nie są używane, plazmidowe DNA kodujące BE3 może być transfekowane z gRNA ukierunkowanym na BRCA1. W porównaniu do kotransfekcji plazmidów BE3 i gRNA, transfekcja plazmidu gRNA do komórek HAP-BE3 indukuje wydajną edycję zasad do 3-krotnie w docelowym locus w naszych rękach.

  1. Zasiew: 5 x 105 komórek HAP1-BE3 (lub komórek HAP1 w przypadku metod kotransfekcji) na basenik na płytkach 24-dołkowych na 1 dzień przed transfekcją. W czasie transfekcji hoduje się komórki, aby osiągnęły odpowiednią gęstość (konfluencja 70%–80%).
  2. Transfekcja gRNA ukierunkowana na BRCA1 przy użyciu zakupionych odczynników do transfekcji (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Użyj 1 μg gRNA ukierunkowanego na BRCA1 (z 1 μg plazmidowego DNA kodującego BE3 w przypadku metod kotransfekcji) do indukcji konwersji C:G do T:A w miejscach docelowych BRCA1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i hodować subkultury co 3–4 dni.
  3. Zbierz granulki komórek 3, 10 i 24 dni po transfekcji, aby przeanalizować wydajność edycji bazy (próbki z 3 dni po transfekcji są analizowane ponownie jako próbki dnia 0).
  4. Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA (tabela materiałów).
    UWAGA: Zalecamy optymalizację warunków transfekcji ze zmiennym stosunkiem odczynnika do DNA. Optymalnym warunkiem do transfekcji HAP1 jest stosunek odczynnika do DNA w proporcji 4:1 w naszych rękach.

4. Przygotowanie próbki do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) firmy Illumina.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Przygotowanie do sekwencjonowania nowej generacji. Starter 1stPCR został zaprojektowany do amplifikacji miejsca docelowego BRCA1 na genomowym DNA. Starter 2nd PCR został zaprojektowany w taki sposób, że jego sekwencje znajdują się bardziej wewnątrz niż sekwencje startera 1st PCR. Dodatkowe sekwencje pokazane jako żółty pasek zostały dodane na obu końcach startera2nd PCR, aby dołączyć sekwencje niezbędne do przeprowadzenia sekwencjonowania nowej generacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zaprojektuj startery1st PCR, aby amplifikować miejsca docelowe BRCA1. Chociaż nie ma ograniczeń co do rozmiaru produktu 1st PCR, zaleca się rozmiar produktu <1 kb, aby skutecznie amplifikować określony region (Rysunek 3).
  2. Zaprojektuj 2 startery PCR znajdujące się wewnątrz 1. produktu PCR. Rozważ rozmiar amplikonu zgodnie z długością odczytu NGS (na przykład rozmiar iloczynu amplikonu powinien być mniejszy niż 300 bp dla 2 × 150 bp sparowanego końca w celu scalenia każdego odczytu). W celu dołączenia niezbędnych sekwencji do analizy NGS, dodaj dodatkowe sekwencje do końca 5' 2nd starterów PCR w następujący sposób: dla starterów do przodu dodać sekwencje 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' do końca 5', a dla starterów odwrotnych dodać sekwencje 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCG ATCT-3' do końca 5'.
    UWAGA: Użyliśmy zagnieżdżonego PCR, aby zmniejszyć amplikon niespecyficznego wiązania, zapobiegając przyłączaniu się starterów do sekwencji niedocelowej.
  3. Amplifikacja miejsc docelowych BRCA1 na genomowym DNA uzyskanym z trzech punktów czasowych. Używaj polimerazy o wysokiej wierności zgodnie z protokołem producenta, aby zminimalizować błędy PCR. W przypadku 1.reakcji PCR użyj 100 ng genomowego DNA do amplifikacji w ciągu 15 cykli. W przypadku 2.reakcji PCR należy użyć 1 μl produktu 1. reakcji PCR do amplifikacji w ciągu 20 cykli. Uruchom 5 μl produktu 2nd PCR na 2% żelu agarozowym i potwierdź rozmiar.
  4. W celu dołączenia sekwencji niezbędnych do analizy NGS, należy amplifikować 2. produkt PCR za pomocą starterów wymienionych poniżej. W przypadku reakcji PCR 1 μl produktu 2ndPCR stosuje się do amplifikacji do 30 cykli przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.
    1. Aby wykonać sekwencjonowanie multipleksowe dla dużej liczby bibliotek, które mają być jednocześnie łączone i sekwencjonowane, należy użyć starterów do przodu (D501 – D508) i do tyłu (D701 – D712), które mają unikalną sekwencję indeksów (Tabela uzupełniająca 1). Amplifikuj każdą próbkę za pomocą różnych zestawów starterów, aby przeprowadzić unikalną strategię podwójnego indeksowania.
    2. Uruchom 5 μl produktu PCR na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić rozmiar i oczyść amplikon za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia PCR (tabela materiałów). Wymieszaj każdą próbkę w równych ilościach, aby utworzyć bibliotekę NGS.
  5. Określić ilościowo bibliotekę NGS przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometrów i rozcieńczyć bibliotekę NGS do stężenia 1 nM za pomocą buforu do resuspensji lub 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Przygotuj 100 μl biblioteki rozcieńczonej do odpowiedniego stężenia wsadowego w zależności od typu biblioteki (na przykład przygotuj 200 pM biblioteki dla Nextera DNA Flex).
    1. Jako kontrolę połączyć phiX z rozcieńczoną próbką odpowiednią dla typu zestawu.
    2. Załaduj bibliotekę na kartridżę i uruchom NGS zgodnie z protokołem producenta. Systemy Illumina iSeq 100 lub Miseq mogą sekwencjonować amplikony o różnej długości do 300 bp dla pojedynczego odczytu lub sparowanego końca. Zaleciliśmy ponad 10 000 odczytów na docelowy amplikon w celu dogłębnej analizy podstawowej wydajności edycji.

5. Analiza podstawowej efektywności edycji dla oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1

  1. Przeanalizuj podstawową wydajność edycji za pomocą MAUND24. Podstawowa wydajność edycji jest obliczana w sposób opisany poniżej.
    figure-protocol-3
    Jeśli w oknie aktywnym BE3 występuje wiele cytozyn, brana jest pod uwagę tylko konwersja C do T, która jest ukierunkowana na ocenę wariantu BRCA1. Na przykład, jeśli sekwencje aktywnego okna BE3 to "C4A5T6C7T8", możliwe sekwencje wygenerowane przez edycję podstawową to "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8" i "T4A5T6T7T8”. W tym momencie, jeśli pozycja 4 jest pozycją docelową dla pożądanego wariantu BRCA1, do obliczenia >4A5T6C7T8". UWAGA: Polecamy również inne narzędzia internetowe do analizy podstawowej aktywności edycyjnej, takie jak CRISPResso225 i BE-analyzer23.
  2. Zweryfikuj wyniki za pomocą kontroli dodatniej i ujemnej wariantów BRCA1. Podstawowa skuteczność edycji łagodnej kontroli powinna pozostać taka sama, podczas gdy skuteczność kontroli patogennej powinna zmniejszać się z czasem.
  3. Oblicz względną skuteczność edycji bazy wariantów BRCA1 i określ ich patogenność. Istotne różnice między próbkami z dnia 0 i dnia 21 są analizowane za pomocą odpowiedniej analizy statystycznej, takiej jak test t.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne podejścia opisane w tym protokole umożliwiają funkcjonalną ocenę endogennych wariantów BRCA1 generowanych przez edytory bazy cytozynowej oparte na CRISPR. Aby wybrać odpowiednie linie komórkowe do oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, naukowcy powinni potwierdzić, że BRCA1 jest niezbędnym genem w docelowych liniach komórkowych. Na przykład najpierw transfekowaliśmy Cas9 i gRNA do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1 i przeanalizowaliśmy częstość mutacji za pomo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje prostą metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny medytowanego przez CRISPR. W protokole opisano metody projektowania gRNA w docelowym locus i budowy plazmidowych DNA, z których ulegają one ekspresji. Edytory zasad cytozyny indukują konwersję nukleotydów w oknie aktywnym (w przypadku BE3 nukleotydy 4–8 w PAM-dystalnym końcu sekwencji docelowych gRNA). Badacz powinien starannie dobierać sekwencje docelowe, ponieważ wszystkie cytozyny w oknie aktywnym mogą by...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą Korei (granty 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 i 2018R1A5A2020732 dla Y.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINEBR3136Enzym restrykcyjny
BlasticidinThermo Fisher ScientificA1113903Lek do selekcji transdukowanych komórek
BsaINEBR0535Enzym restrykcyjny
DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504Zestaw do przygotowania genomowego DNA
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumGibco11965092Pożywka do komórek HEK293T/17
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000036Supplemetal do hodowli komórkowych
Odczynnik do transfekcji FuGENE HDPromegaE2311Odczynnik do transfekcji
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LZestaw montażowy Gibson
Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s mediumGibco12440046Pożywka dla komórek HAP1
lentiCas9-BlastAddgene52962Plazmidy DNA do klonowania lentiBE3
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027Odczynnik do transfekcji
Opti-MEMGibco31985070Materiały do transfekcji
pCMV-BE3Addgene73021Plazmidy DNA dla lentiBE3 klonowanie
Penicylina-StreptomycynaGibco15140Elastyczny metal do hodowli komórkowych
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530SQPolimeraza o wysokiej wierności
pMD2.GAddgene12259Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
pRG2Addgene104174wektor klonowania gRNA
psPAX2Addgene12260Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
Zestaw QIAprep Spin MiniprepQiagen27106Zestaw do przygotowania plazmidowego DNA
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704Zestaw do ekstrakcji żelu
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania Qiagen28104PCR Zestaw do
szybkiego ligowania NEBM2200Ligaza do klonowania gRNA
Endonukleaza T7 INEBM0302Materiały do oznaczania T7E1
XbaINEBR0145Enzym restrykcyjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242(2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BRCA1 VariantsCRISPR Base EditorCytosine Base EditorFunctional AssessmentEndogenous MutationHAP1 CellsGuide RNA DesignNGS AnalysisBase Editing EfficiencyVariant Classification

Related Articles