Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61557

⸱

28 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Streszczenie

Ostatnie badania badały ryzyko związane z mutacjami genu BRCA1 za pomocą różnych metod oceny funkcjonalnej, takich jak fluorescencyjne testy reporterowe, testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych i testy wrażliwości terapeutycznej opartej na lekach. Chociaż wyjaśniono wiele wariantów BRCA1, testy te obejmujące użycie egzogennych wariantów BRCA1 są związane z problemami z nadekspresją i nie mogą być stosowane do regulacji potranskrypcyjnej. Aby rozwiązać te ograniczenia, wcześniej opisaliśmy metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytora zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które indukują ukierunkowaną substytucję nukleotydów w żywych komórkach. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy warianty, których funkcje pozostają niejednoznaczne, w tym c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T i c.4986+5G>A, i potwierdziliśmy, że edytory bazowe za pośrednictwem CRISPR są użytecznymi narzędziami do reklasyfikacji wariantów o niepewnym znaczeniu w BRCA1. W tym miejscu opisujemy protokół analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny opartego na CRISPR. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wyboru miejsc docelowych, analizy funkcjonalnej i oceny wariantów BRCA1.

Wprowadzenie

Gen podatności na raka piersi typu 1 (BRCA1) jest powszechnie znanym genem supresorowym. Ponieważ gen BRCA1 odpowiada za naprawę uszkodzeń DNA, mutacje w tym genie prowadzą do zwiększonego ryzyka rozwoju nowotworów u danej osoby1. Rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki są powiązane z dziedzicznymi mutacjami utraty funkcji (LOF) genu BRCA12. Ocena funkcjonalna i identyfikacja wariantów BRCA1 mogą pomóc w zapobieganiu i diagnozowaniu różnych chorób. W celu zbadania funkcji wariantów BRCA1 opracowano i szeroko stosowano kilka metod badania patogenności wariantów BRCA1, takich jak testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych, testy z reporterem fluorescencyjnym oraz testy wrażliwości na leki terapeutyczne3,4,5,6. Choć metody te pozwoliły ocenić funkcję wielu wariantów BRCA1, podejścia oparte na egzogennej ekspresji wariantów BRCA1 niosą ze sobą ograniczenia związane z nadekspresją, która może wpływać na regulację downstream, dawkę genu oraz fałdowanie białek7. Ponadto testy te nie mogą być wykorzystywane do badania regulacji posttranskrypcyjnej, takiej jak splicing mRNA, stabilność transkryptu oraz wpływ regionów niekodujących8,9.

System CRISPR-Cas9 umożliwia ukierunkowaną edycję genomu w żywych komórkach i organizmach10. Poprzez pojedyncze przewodniące RNA, Cas9 może indukować pęknięcia obu nici (DSBs) w DNA chromosomowym w specyficznych loci genomowych, aby aktywować dwie ścieżki naprawy DNA: podatną na błędy ścieżkę niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) oraz bezbłędną ścieżkę naprawy kierowanej homologią (HDR)11. HDR jest precyzyjnym mechanizmem naprawczym; jednakże DSBs indukowane przez nukleazę Cas9 w celu HDR często prowadzą do niepożądanych mutacji w postaci insercji i delecji (indel). Dodatkowo, proces ten wymaga homologicznych matryc donorowych DNA do naprawy uszkodzeń DNA i charakteryzuje się stosunkowo niską wydajnością. Niedawno nickaza Cas9 (nCas9) została połączona z domenami cytydynodeaminazy w celu wprowadzania substytucji C:G na T:A, bez konieczności stosowania homologicznych matryc DNA i indukowania pęknięć obu nici DNA12,13,14,15. Wykorzystując edytor zasad cytozyny, opracowaliśmy nową metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA116.

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy edytor zasad cytozynowych BE314, oparty na systemie CRISPR, który indukuje efektywne mutacje punktowe C:G na T:A, w celu przeprowadzenia oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, co pozwoliło na pomyślną identyfikację funkcji kilku wariantów BRCA1 (Rycina 1).

Schemat procesu mutagenezy CRISPR w komórkach z podziałem na ścieżki patogenne i łagodne oraz etapy przepływu pracy.
Rycina 1: Przegląd schematu oceny funkcjonalnej.(A) Schemat przedstawiający ocenę funkcjonalną BRCA1. Ponieważ utrata funkcji (LOF) BRCA1 wpływa na żywotność komórek, w przypadku patogennej mutacji BRCA1 komórki giną wraz ze wzrostem liczby pasaży. (B) Etapy oceny funkcjonalnej BRCA1. Ramka przerywana jest opcjonalna. Można ją zastąpić kotransfekcją DNA plazmidów eksprymujących gRNA oraz BE3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Metoda 1 (generowanie linii komórkowych HAP1-BE3) jest opcjonalna. Zamiast konstruować linię komórkową wykazującą ekspresję BE3, plazmidowe DNA kodujące BE3 można kotransfekować wraz z plazmidowym DNA kodującym gRNA. Do wysoce wydajnej edycji zasad można również wykorzystać inne warianty edytorów zasad cytozyny, takie jak BE4max.

1. Generowanie linii komórkowych HAP1-BE3

  1. Konstrukcja plazmidowego DNA
    1. Aby skonstruować plazmidową DNA lentiBE3-blast do produkcji lentiwirusów, należy namnożyć sekwencje kodujące BE3 w pCMV-BE3 (Tabela materiałów) metodą PCR z użyciem polimerazy o wysokiej wierności. Zaprojektuj primery do PCR tak, aby zawierały sekwencje nakładające się z pociętym wektorem (z kroku 1.1.2) w celu przeprowadzenia atermicznej metody składania (isothermal assembly) w następujący sposób17:
      starter-F: 5’-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3’,
      starter-R: 5’-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3’
      UWAGA: Nukleotydy podkreślone nakładają się na trawiony wektor; sekwencje te będą specyficzne dla wektora docelowego wybranego przez użytkownika.
    2. Trawienie lentiCas9-blast (Tabela materiałów) plazmidowe DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych XbaI i BamHI (1 jednostka na 1 μg) przez 1 h w temperaturze 37 °CProdukty trawienia poddaj elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym, a następnie oczyść prążki o odpowiedniej wielkości (8,6 kb), korzystając z komercyjnego zestawu do izolacji DNA z żelu (Tabela materiałów).
    3. Klonowanie amplifikowanego produktu PCR BE3 oraz trawionego wektora lentiCas9-Blast z wykorzystaniem zestawu do montażu izotermicznego (Tabela materiałów). Należy użyć łącznie od 0,02 do 0,5 pmol fragmentów DNA, zachowując stosunek wektora do insertu 1:3. Produkt ligacji należy wprowadzić do kompetentnych komórek DH5 alpha.18Wysiej transformanty na płytkę z agarem zawierającym ampicylinę (100 µg/mL) i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Wybrać kilka kolonii i zaszczepić je w 4 ml pożywki LB (lysogeny broth) zawierającej ampicylinę (100 μg/mL) i inkubować hodowlę w inkubatorze z wytrząsaniem przy prędkości 180 rpm.
    5. Oczyść plazmidowe DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA (Tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta.
    6. Aby potwierdzić powodzenie klonowania DNA, należy przeanalizować sekwencje BE3 każdego oczyszczonego plazmidowego DNA (z etapu 1.1.5) metodą sekwencjonowania Sangera, wykorzystując startery standardowe oraz specyficzne dla BE3 (Tabela uzupełniająca 1) i wybrać dokładnie sklonowany konstrukt lentiBE3-blast.
      UWAGA: Do analizy wyników sekwencjonowania metodą Sangera zalecamy kilka narzędzi, takich jak BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) i CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Hodowla komórek i generowanie linii komórkowych HAP1-BE3
    1. Utrzymuj komórki w dobrym stanie i w fazie aktywnego podziału. Hoduj komórki HAP1 w zmodyfikowanym podłożu Dulbecco (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) (Tabela materiałów) zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki HEK293T/17 w pożywce Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Tabela materiałów) zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
      UWAGA: Linia komórkowa HAP1 jest użyteczna w badaniach genetycznych ze względu na niemal haploidalny charakter komórek. Komórki te mogą jednak w hodowli spontanicznie powracać do stanu diploidalnego. Wzbogacenie po barwieniu Hoechst 34580 1n-analiza populacji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej będzie pomocna w utrzymaniu haploidalności komórek HAP119.
    2. Wysiać 5 x 106 komórki HEK293T/17 w szalce 100 mm na jeden dzień przed transfekcją. W dniu transfekcji przeprowadzić transfekcję plazmidowego DNA (15 µg lentiBE3-blast, 9 µg psPAX2 do pakowania wirusów i 6 µg pMD2.G do fiolki nr 2nd system pakowania lentiwirusowego) przy użyciu komercyjnych odczynników do transfekcji zgodnie z protokołami producenta (Tabela materiałów)20Wymień pożywkę w 6. godzinie po transfekcji, a pożywkę zawierającą wirusy zbierz w 48. lub 72. godzinie po transfekcji. Przesącz nadsącz za pomocą 0.45 µm filtr
    3. Przeprowadzić transdukcję komórek HAP1 cząsteczkami lentiwirusowymi BE3 przy MOI (wielokrotności zakażenia) wynoszącej 0,1. W celu dostosowania MOI należy zastosować seryjne rozcieńczenia wirusa. Usunąć medium i zastąpić je odpowiednio przygotowanym nadsączem wirusowym oraz świeżym medium hodowlanym.
    4. Jeden dzień po transdukcji należy wymienić medium na 10 µg/mL blastycydyny (Tabela materiałówpożywką zawierającą [substancję] i selekcjonować przetransdukowane komórki przez 3 dni przy użyciu blastycydyny. Po selekcji blastycydyną wybrać do kolejnego etapu studzienkę, w której przeżyło ok. 10% komórek.
    5. Po selekcji blastycydyną wysiać transdukowane komórki na płytki 96-dołkowe z gęstością 0,5 komórki na dołek w celu izolacji pojedynczych klonów (np. rozcieńczyć 50 komórek w 20 ml (0,5 komórki na 200 µLpożywka hodowlana i alikwot 200 µL na dołek w płytce 96-dołkowej). Płytki 96-dołkowe inkubować przez 2 tygodnie, a następnie wyizolować pojedyncze kolonie w celu potwierdzenia aktywności BE3.
    6. Podziel pojedyncze kolonie na dwa zestawy: jeden do testowania aktywności BE3, a drugi do podtrzymania hodowli. Przetransdukuj jeden z zestawów cząsteczkami lentiwirusowymi gRNA w celu potwierdzenia aktywności BE3. Przeanalizuj częstotliwość mutacji w każdej kolonii z użyciem endonukleazy T7 I (T7E1, Tabela materiałówtestem lub poprzez zastosowanie techniki ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania (krok 4)21Wybierz odpowiednie pojedyncze klony, które są zdrowe i wykazują wysoką aktywność BE3.
      UWAGA: W celu walidacji dokładnych częstotliwości mutacji zalecamy zastosowanie ukierunkowanego sekwencjonowania głębokiego zamiast testu T7E1. HEK2 (5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-‘3) jest dobrze zwalidowanym miejscem docelowym dla BE3.

2. Projektowanie i konstrukcja gRNA celujących w BRCA1

Edycja genu BRCA1, schemat sekwencji DNA z mapą plazmidu CRISPR do badania mutacji.
Rycina 2: Przykład plazmidowego DNA gRNA. (A) Aby skutecznie edytować sekwencję docelową za pomocą BE3, wymagana jest sekwencja NGG PAM (CCN PAM), która umieszcza docelową cytyzynę C (docelową guaninę G) w pięcionukleotydowym oknie. NGG PAM zaznaczono na czerwono, a okno edycji zasad przedstawiono w postaci szarego pola. (B) Wskazano sekwencję gRNA dla edycji zasad c.8047C>T (H1283Y); docelowe pary C:G zaznaczono na czerwono, natomiast aktywne okno wyróżniono szarym polem. W celu klonowania gRNA na obu końcach 5ʹ dodano sekwencje nadwieszone zaznaczone pogrubieniem. Matryce gRNA wygenerowano poprzez hybrydyzację dwóch komplementarnych oligonukleotydów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Niezbędne jest zastosowanie kontroli pozytywnych i negatywnych dla wariantów BRCA1. W niniejszym badaniu jako kontrole łagodne wykorzystano c.5252G>A (R1751Q) oraz c.4527C>T (Y1509Y). Jako kontrole patogenne wykorzystano c.191G>A (C64Y), 81-1G>A oraz c.3598C>T (Q1200*). Sekwencje docelowe każdego gRNA wymieniono w Tabeli uzupełniającej 1.

  1. Pobierz sekwencję genomową BRCA1 z bazy GenBank w NCBI22.
  2. Wyszukaj 20-pz miejsca docelowe z sekwencją Protospacer Adjacent Motif (PAM) „NGG” i „CCN” wokół interesującej mutacji. Interesująca mutacja powinna znajdować się w pozycji 4–8 nukleotydów od końca dystalnego względem PAM w sekwencjach docelowych gRNA, ponieważ okno aktywności BE3 obejmuje 4–8 nukleotydów na końcu dystalnym względem PAM sekwencji docelowych gRNA14. W przypadku gRNA celujących w c.8047C>T (H1283Y) oraz c.5252G>A (R1751Q), będących to sekwencje 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ oraz 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, sekwencje pogrubione stanowią okna aktywności. Konwersje C na T i G na A zachodzą odpowiednio przy PAM NGG i CCN (Rycina 2A).
    UWAGA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 to przydatne narzędzie internetowe do projektowania gRNA.
  3. Zamów dwa komplementarne oligonukleotydy na każde gRNA; dla oligonukleotydów sensownych (forward) dodaj sekwencję „CACCG” na koniec 5ʹ sekwencji naprowadzającej, a dla oligonukleotydów antysensownych (reverse) dodaj „AAAC” na koniec 5’ oraz „C” na koniec 3’. Te dodatkowe sekwencje są specyficzne dla docelowego wektora ekspresyjnego gRNA (z kroku 2.5) używanego w tym protokole; w przypadku stosowania alternatywnych wektorów ekspresyjnych gRNA użytkownik powinien je odpowiednio dostosować (Rycina 2B).
  4. Rozpuść oligonukleotyd w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 100 µM. Wymieszaj dwa komplementarne oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 µM w buforze do ligacji T4 (Tabela materiałów), podgrzej w temperaturze 95 °C przez 5 min, a następnie studź w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia hybrydyzacji (annealing).
  5. Przetraw pRG2 za pomocą enzymu restrykcyjnego BsaI (1 jednostka na 1 μg) przez 1 h w 37 °C (Tabela materiałów). Rozdziel produkt trawienia w 1% żelu agarozowym i oczyść prążek o odpowiedniej wielkości (2,5 kb).
    UWAGA: Zamiast klasycznej metody trawienia i ligacji można zastosować inne metody klonowania, takie jak klonowanie Golden Gate.
  6. Przeprowadź ligację zhybrydyzowanego dupleksu oligonukleotydowego z DNA wektora, używając zakupionej ligazy DNA (Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta, a następnie transformuj do kompetentnych komórek DH5 alpha (można również użyć innych szczepów E. coli powszechnie stosowanych do subklonowania).
  7. Wysiej transformanty na płytkę z agarem zawierającą ampicylinę (100 μg/mL) i inkubuj płytkę przez noc w 37 °C. Oczyść DNA plazmidowe z kilku transformantów i przeanalizuj sekwencje gRNA za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, używając starterów wiążących się z promotorem U6 (Tabela materiałów).

3. Tworzenie wariantów BRCA1 przy użyciu narzędzi do edycji zasad opartych na CRISPR

UWAGA: Jeśli nie są używane linie komórkowe HAP1-BE3, plazmidowe DNA kodujące BE3 można kotransfekować z gRNA celującym w BRCA1. W naszych badaniach stwierdzono, że w porównaniu do kotransfekcji plazmidów BE3 i gRNA, transfekcja plazmidu gRNA do komórek HAP-BE3 indukuje do 3-krotnie wydajniejszą edycję zasad w locus docelowym.

  1. Wysiać 5 x 105 komórek HAP1-BE3 (lub komórek HAP1 w przypadku metod kotransfekcji) na dołek w płytkach 24-dołkowych na 1 dzień przed transfekcją. W momencie transfekcji hodować komórki do osiągnięcia odpowiedniej gęstości (70%–80% konfluencji).
  2. Przeprowadzić transfekcję gRNA ukierunkowanych na BRCA1 przy użyciu zakupionych odczynników do transfekcji (Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Użyć 1 µg gRNA ukierunkowanych na BRCA1 (wraz z 1 µg plazmidowego DNA kodującego BE3 w przypadku metod kotransfekcji), aby wywołać konwersję C:G na T:A w miejscach docelowych BRCA1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i pasażować co 3–4 dni.
  3. Zebrać osady komórkowe 3, 10 i 24 dni po transfekcji w celu analizy wydajności edycji zasad (próbki z 3. dnia po transfekcji analizuje się jako próbki z dnia 0).
  4. Wyekstrahować DNA genomowe za pomocą zestawu do oczyszczania DNA genomowego (Tabela materiałów).
    UWAGA: Zalecamy optymalizację warunków transfekcji poprzez zmianę stosunku odczynnika do DNA. W naszych doświadczeniach optymalnym warunkiem dla transfekcji HAP1 jest stosunek odczynnika do DNA wynoszący 4:1.

4. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) firmy Illumina

Schemat edycji genu BRCA1 z wykorzystaniem starterów PCR i biblioteki NGS do analizy sekwencjonowania.
Rycina 3: Przygotowanie do sekwencjonowania nowej generacji. 1To jest początek tekstu do przetłumaczenia. Proszę o dostarczenie pełnej treści źródłowej. Startery PCR zostały zaprojektowane w celu amplifikacji BRCA1 miejsce docelowe w genomowym DNA. 2nd Starter PCR został zaprojektowany w taki sposób, aby jego sekwencje znajdowały się głębiej niż 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Sekwencje starterów PCR. Dodatkowe sekwencje, zaznaczone żółtym paskiem, zostały dodane na obu końcach 2nd Starter PCR służący do dołączenia sekwencji niezbędnych do przeprowadzenia sekwencjonowania nowej generacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Projekt 1Przesuń Startery PCR do amplifikacji BRCA1 miejsca docelowe. Choć nie ma ograniczeń co do wielkości 1st produkt PCR, rozmiar produktu wynoszący Rycina 3).
  2. Projekt 2nd Startery PCR zlokalizowane wewnątrz 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Produkt PCR. Należy uwzględnić wielkość amplikonu w stosunku do długości odczytu NGS (na przykład w przypadku sekwencjonowania par końców 2 × 150 bp wielkość produktu amplikonowego powinna być mniejsza niż 300 bp, aby umożliwić scalenie odczytów). W celu dołączenia sekwencji niezbędnych do analizy NGS, należy dodać dodatkowe sekwencje do końca 5’ 2nd Startery PCR według następującego schematu: do końców 5’ starterów forward dodaje się sekwencje 5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’, a do końców 5’ starterów reverse sekwencje 5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3’.
    UWAGA: Zastosowano zagnieżdżoną reakcję PCR (nested PCR), aby zredukować ilość amplikonów powstałych w wyniku nieswoistego wiązania, zapobiegając przyłączaniu się starterów do sekwencji pozatargetowych.
  3. Amplifikuj BRCA1 miejsca docelowe w DNA genomicznym uzyskanym z trzech punktów czasowych. W celu zminimalizowania błędów PCR należy zastosować polimerazę o wysokiej wierności zgodnie z protokołem producenta. Dla 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. reakcja PCR, do amplifikacji przez 15 cykli należy użyć 100 ng DNA genomowego. Dla 2nd reakcja PCR, zastosowanie 1 µL z 1st Produkt PCR do amplifikacji przez 20 cykli. Elektroforeza 5 µL z 2nd Produkt PCR w 2% żelu agarozowym i potwierdzenie wielkości.
  4. Aby dołączyć sekwencje niezbędne do analizy NGS, przeprowadź amplifikację 2nd produkt PCR z użyciem wymienionych poniżej starterów. W reakcji PCR, 1 µL z 2nd Produkt PCR jest wykorzystywany do amplifikacji przez maksymalnie 30 cykli z użyciem polimerazy o wysokiej wierności.
    1. W celu przeprowadzenia sekwencjonowania multipleksowego dla dużej liczby bibliotek, które mają zostać połączone i zsekwencjonowane jednocześnie, należy zastosować primery forward (D501 – D508) oraz reverse (D701 – D712), które posiadają unikalne sekwencje indeksujące (Tabela uzupełniająca 1). Przeskaluj każdą próbkę, używając różnych zestawów starterów, aby przeprowadzić unikalną strategię podwójnego indeksowania.
    2. Uruchom 5 µL produktu PCR w żelu agarozowym o stężeniu 2%, aby potwierdzić jego wielkość, a następnie oczyścić amplikon za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania produktów PCR (Tabela materiałów). Wymieszaj każdą próbkę w równych ilościach w celu przygotowania biblioteki NGS.
  5. Ilościowo oznacz bibliotekę NGS przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometrów, a następnie rozcieńcz bibliotekę NGS do stężenia 1 nM, używając buforu do resuspensji lub 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Przygotuj 100 µL biblioteki rozcieńczonej do odpowiedniego stężenia załadunkowego, w zależności od rodzaju biblioteki (na przykład przygotuj bibliotekę o stężeniu 200 pM dla Nextera DNA Flex).
    1. W ramach kontroli należy połączyć phiX z rozcieńczoną próbką odpowiednią dla danego rodzaju zestawu.
    2. Załaduj bibliotekę na kartridż i przeprowadź sekwencjonowanie NGS zgodnie z protokołem producenta. Systemy Illumina iSeq 100 lub MiSeq umożliwiają sekwencjonowanie amplikonów o różnych długościach do 300 bp w trybie odczytu pojedynczego (single-read) lub parzystego (paired-end). W celu szczegółowej analizy wydajności edycji zasad zalecamy uzyskanie ponad 10 000 odczytów na docelowy amplikon.

5. Analiza wydajności edycji zasad w celu oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1

  1. Przeanalizuj wydajność edycji zasad za pomocą narzędzia MAUND24. Wydajność edycji zasad oblicza się zgodnie z poniższym opisem.
    Równanie wydajności edycji zasad; ukierunkowana konwersja C na T; zastosowanie w badaniach nad edycją genów.
    Jeśli w oknie aktywności BE3 znajduje się kilka cytozyn, do oceny wariantu BRCA1 bierze się pod uwagę wyłącznie konwersję C na T w miejscu docelowym. Na przykład, jeśli sekwencje w oknie aktywności BE3 to „C4A5T6C7T8,”, możliwymi sekwencjami powstałymi w wyniku edycji zasad są „T4A5T6C7T8”, „C4A5T6T7T8” oraz „T4A5T6T7T8”. W takim przypadku, jeśli pozycja 4 jest pozycją docelową dla pożądanego wariantu BRCA1, to do obliczenia wydajności edycji zasad uwzględnia się tylko sekwencję „T4A5T6C7T8”.
    UWAGA: Rekomendujemy również inne narzędzia internetowe do analizy aktywności edycji zasad, takie jak CRISPResso225 oraz BE-analyzer23.
  2. Zweryfikuj wyniki, korzystając z kontroli pozytywnej i negatywnej wariantów BRCA1. Wydajność edycji zasad w przypadku kontroli łagodnej powinna pozostać bez zmian, natomiast w przypadku kontroli patogennej powinna z czasem spadać.
  3. Oblicz względną wydajność edycji zasad wariantów BRCA1 i określ ich patogenność. Istotne różnice między próbkami z dnia 0 a dnia 21 analizuje się za pomocą odpowiednich testów statystycznych, takich jak test t.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podejścia eksperymentalne opisane w niniejszym protokole umożliwiają funkcjonalną ocenę endogennych wariantów BRCA1 generowanych za pomocą edytorów zasad cytozynowych opartych na systemie CRISPR. Aby dobrać odpowiednie linie komórkowe do oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, badacze powinni potwierdzić, że BRCA1 jest genem niezbędnym w wybranych liniach komórkowych. Na przykład, w pierwszej kolejności dokonaliśmy transfekcji Cas9 i gRNA do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje prostą metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny medytowanego przez CRISPR. W protokole opisano metody projektowania gRNA w docelowym locus i budowy plazmidowych DNA, z których ulegają one ekspresji. Edytory zasad cytozyny indukują konwersję nukleotydów w oknie aktywnym (w przypadku BE3 nukleotydy 4–8 w PAM-dystalnym końcu sekwencji docelowych gRNA). Badacz powinien starannie dobierać sekwencje docelowe, ponieważ wszystkie cytozyny w oknie aktywnym mogą by...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą Korei (granty 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 i 2018R1A5A2020732 dla Y.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BamHINEBR3136Enzym restrykcyjny
BlasticidinThermo Fisher ScientificA1113903Lek do selekcji transdukowanych komórek
BsaINEBR0535Enzym restrykcyjny
DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504Zestaw do przygotowania genomowego DNA
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumGibco11965092Pożywka do komórek HEK293T/17
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000036Supplemetal do hodowli komórkowych
Odczynnik do transfekcji FuGENE HDPromegaE2311Odczynnik do transfekcji
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LZestaw montażowy Gibson
Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s mediumGibco12440046Pożywka dla komórek HAP1
lentiCas9-BlastAddgene52962Plazmidy DNA do klonowania lentiBE3
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027Odczynnik do transfekcji
Opti-MEMGibco31985070Materiały do transfekcji
pCMV-BE3Addgene73021Plazmidy DNA dla lentiBE3 klonowanie
Penicylina-StreptomycynaGibco15140Elastyczny metal do hodowli komórkowych
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530SQPolimeraza o wysokiej wierności
pMD2.GAddgene12259Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
pRG2Addgene104174wektor klonowania gRNA
psPAX2Addgene12260Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
Zestaw QIAprep Spin MiniprepQiagen27106Zestaw do przygotowania plazmidowego DNA
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704Zestaw do ekstrakcji żelu
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania Qiagen28104PCR Zestaw do
szybkiego ligowania NEBM2200Ligaza do klonowania gRNA
Endonukleaza T7 INEBM0302Materiały do oznaczania T7E1
XbaINEBR0145Enzym restrykcyjny

Bibliografia

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242(2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edytor zasad CRISPRedytor zasad cytozynymutacja endogennakomórki HAP1projektowanie gRNAanaliza NGSwydajność edycji zasadklasyfikacja wariantów
Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.