Method Article

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

DOI:

10.3791/61557

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania badały ryzyko związane z mutacjami genu BRCA1 za pomocą różnych metod oceny funkcjonalnej, takich jak fluorescencyjne testy reporterowe, testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych i testy wrażliwości terapeutycznej opartej na lekach. Chociaż wyjaśniono wiele wariantów BRCA1, testy te obejmujące użycie egzogennych wariantów BRCA1 są związane z problemami z nadekspresją i nie mogą być stosowane do regulacji potranskrypcyjnej. Aby rozwiązać te ograniczenia, wcześniej opisaliśmy metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytora zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które indukują ukierunkowaną substytucję nukleotydów w żywych komórkach. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy warianty, których funkcje pozostają niejednoznaczne, w tym c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T i c.4986+5G>A, i potwierdziliśmy, że edytory bazowe za pośrednictwem CRISPR są użytecznymi narzędziami do reklasyfikacji wariantów o niepewnym znaczeniu w BRCA1. W tym miejscu opisujemy protokół analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny opartego na CRISPR. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wyboru miejsc docelowych, analizy funkcjonalnej i oceny wariantów BRCA1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen podatności na raka piersi typu 1 (BRCA1) jest powszechnie znanym genem supresorowym nowotworu. Ponieważ gen BRCA1 jest związany z naprawą uszkodzeń DNA, mutacje w tym genie prowadziłyby do większego ryzyka rozwoju raka u osobnika1. Rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki jest związany z dziedzicznymi mutacjami powodującymi utratę funkcji (LOF) genu BRCA12. Ocena funkcjonalna i identyfikacja wariantów BRCA1 może pomóc w zapobieganiu i diagnozowaniu różnych chorób. Aby określić funkcję wariantów BRCA1, opracowano kilka metod, które są szeroko stosowane do badania patogenności warian....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Metoda 1 (generowanie linii komórkowych HAP1-BE3) jest opcjonalna. Zamiast konstruować linię komórkową z ekspresją BE3, plazmidowe DNA kodujące BE3 może być współtransfekowane z plazmidowym DNA kodującym gRNA. Inne warianty edytorów zasad cytozyny, takie jak BE4max, mogą być również używane do wysoce wydajnej edycji bazy.

1. Generacja linii komórkowych HAP1-BE3

  1. Budowa plazmidowego DNA
    1. Aby skonstruować plazmidowe DNA lentiBE3-blast do produkcji lentiwirusa, amplifikuj sekwencje kodujące BE3 w pCMV-BE3 (tabela materiałów) metodą PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności. Zaprojektuj starte....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne podejścia opisane w tym protokole umożliwiają funkcjonalną ocenę endogennych wariantów BRCA1 generowanych przez edytory bazy cytozynowej oparte na CRISPR. Aby wybrać odpowiednie linie komórkowe do oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, naukowcy powinni potwierdzić, że BRCA1 jest niezbędnym genem w docelowych liniach komórkowych. Na przykład najpierw transfekowaliśmy Cas9 i gRNA do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1 i przeanalizowaliśmy częstość mutacji za pomo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje prostą metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny medytowanego przez CRISPR. W protokole opisano metody projektowania gRNA w docelowym locus i budowy plazmidowych DNA, z których ulegają one ekspresji. Edytory zasad cytozyny indukują konwersję nukleotydów w oknie aktywnym (w przypadku BE3 nukleotydy 4–8 w PAM-dystalnym końcu sekwencji docelowych gRNA). Badacz powinien starannie dobierać sekwencje docelowe, ponieważ wszystkie cytozyny w oknie aktywnym mogą by.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą Korei (granty 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 i 2018R1A5A2020732 dla Y.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINEBR3136Enzym restrykcyjny
BlasticidinThermo Fisher ScientificA1113903Lek do selekcji transdukowanych komórek
BsaINEBR0535Enzym restrykcyjny
DNeasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504Zestaw do przygotowania genomowego DNA
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumGibco11965092Pożywka do komórek HEK293T/17
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000036Supplemetal do hodowli komórkowych
Odczynnik do transfekcji FuGENE HDPromegaE2311Odczynnik do transfekcji
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LZestaw montażowy Gibson
Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s mediumGibco12440046Pożywka dla komórek HAP1
lentiCas9-BlastAddgene52962Plazmidy DNA do klonowania lentiBE3
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027Odczynnik do transfekcji
Opti-MEMGibco31985070Materiały do transfekcji
pCMV-BE3Addgene73021Plazmidy DNA dla lentiBE3 klonowanie
Penicylina-StreptomycynaGibco15140Elastyczny metal do hodowli komórkowych
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530SQPolimeraza o wysokiej wierności
pMD2.GAddgene12259Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
pRG2Addgene104174wektor klonowania gRNA
psPAX2Addgene12260Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.
Zestaw QIAprep Spin MiniprepQiagen27106Zestaw do przygotowania plazmidowego DNA
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704Zestaw do ekstrakcji żelu
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania Qiagen28104PCR Zestaw do
szybkiego ligowania NEBM2200Ligaza do klonowania gRNA
Endonukleaza T7 INEBM0302Materiały do oznaczania T7E1
XbaINEBR0145Enzym restrykcyjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Bre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BRCA1 VariantsCRISPR Base EditorCytosine Base EditorFunctional AssessmentEndogenous MutationHAP1 CellsGuide RNA DesignNGS AnalysisBase Editing EfficiencyVariant Classification

Related Articles