Artykuł metodologiczny

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

DOI:

10.3791/61562

⸱

12 listopada 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aplikacja egzosomów to nowe narzędzie do opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. Ustanawiamy protokół izolacji egzosomów o wysokiej czystości, aby wyizolować egzosomy z nowo zidentyfikowanych komórek macierzystych zwanych CB-SC do badań mechanistycznych. Zajmujemy się również wspólną hodowlą egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami, co prowadzi do ich różnicowania w fenotypowo odrębne makrofagi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia Edukatora Komórek Macierzystych (SCE) jest nowatorskim podejściem klinicznym do leczenia cukrzycy typu 1 i innych chorób autoimmunologicznych. Terapia SCE polega na krążeniu komórek jednojądrzastych krwi izolowanego pacjenta (np. limfocytów i monocytów) przez maszynę do aferezy, kohodowli komórek jednojądrzastych krwi pacjenta z przylegającymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z krwi pępowinowej (CB-SC) w urządzeniu SCE, a następnie zwraca te "wykształcone" komórki odpornościowe do krwi pacjenta. Egzosomy to nano-rozmiarowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o długości fali od 30 do 150 nm występujące we wszystkich płynach biologicznych i pożywkach do hodowli komórkowych. Aby dokładniej zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw terapii SCE i określić działanie egzosomów uwalnianych z CB-SC, badamy, które komórki fagocytują te egzosomy podczas leczenia CB-SC. Poprzez wspólną hodowlę egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych Dio z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC), stwierdziliśmy, że egzosomy pochodzące z CB-SC były głównie pobierane przez ludzkie monocyty CD14-dodatnie, co prowadzi do różnicowania monocytów w makrofagi typu 2 (M2), o wrzecionowatej morfologii i ekspresji powierzchniowych markerów molekularnych związanych z M2. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i charakterystyki egzosomów pochodzących z CB-SC oraz protokół kohodowli egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami i monitorowania różnicowania M2.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste krwi pępowinowej (CB-SC) są unikalnym typem komórek macierzystych zidentyfikowanych na podstawie ludzkiej krwi pępowinowej i różnią się od innych znanych typów komórek macierzystych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC)1. Opierając się na ich unikalnych właściwościach modulacji immunologicznej i zdolności do ścisłego przylegania do powierzchni szalek Petriego, opracowaliśmy nową technologię oznaczoną jako terapia Stem Cell Educator (SCE) w badaniach klinicznych2,3. Podczas terapii SCE komórki jednojądrzaste krwi obwodowej pacjenta (PBMC) są pobierane i krążą przez separator komórkowy i są hodowane wspólnie z przylegającym CB-SC in vitro. Te "wykształcone" komórki (PBMC traktowane CB-SC) są następnie zwracane do krążenia pacjenta w systemie zamkniętej pętli. Badania kliniczne wykazały już kliniczne bezpieczeństwo i skuteczność terapii SCE w leczeniu chorób autoimmunologicznych, w tym cukrzycy typu 1 (T1D)2,4 i łysienie plackowate (AA)5.

Egzosomy to rodzina nanocząstek o średnicach 30\u2012150 nm i występująca we wszystkich pożywkach do hodowli biopłynów i komórek6. Egzosomy są wzbogacone wieloma bioaktywnymi cząsteczkami, w tym lipidami, mRNA, białkami i mikroRNA (miRNA), i odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej. Ostatnio egzosomy stały się bardziej atrakcyjne dla badaczy i firm farmaceutycznych ze względu na ich potencjał terapeutyczny w klinikach7,8,9. Ostatnio nasze badania mechanistyczne wykazały, że egzosomy uwalniane przez CB-SC przyczyniają się do modulacji immunologicznej terapii SCE10.

Tutaj opisujemy protokół badania mechanizmu terapii SCE ukierunkowanej na monocyty przez egzosomy uwalniane przez CB-SC. Po pierwsze, egzosomy uwolnione przez CB-SC wyizolowano z kondycjonowanych pożywek pochodzących z CB-SC przy użyciu metod ultrawirowania i zwalidowano za pomocą cytometrii przepływowej, western blot (WB) i dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Po drugie, egzosomy pochodzące z CB-SC zostały oznaczone zielonym fluorescencyjnym barwnikiem lipofilowym: Dio. Po trzecie, hodowano je wspólnie z PBMC w celu zbadania dodatniego odsetka egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych Dio w różnych subpopulacjach PBMC za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten zawiera wskazówki do badania działania egzosomów leżących u podstaw modulacji immunologicznej komórek macierzystych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki badań klinicznych w Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Jednostki krwi w ludzkim kożuchie zostały zakupione w New York Blood Center (Nowy Jork, NY). Ludzkie jednostki krwi pępowinowej pobrano od zdrowych dawców i zakupiono w banku krwi Cryo-Cell International (Oldsmar, Floryda). Zarówno New York Blood Center, jak i Cryo-Cell otrzymały wszystkie akredytacje na pobieranie i dystrybucję krwi, z aprobatą IRB i podpisanymi formularzami zgody od dawców.

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie kondycjonowanej pożywki pochodzącej z CB-SC

  1. Przenieść 25 ml krwi pępowinowej (tabela materiałów) przez 20 ml pożywki o gradiencie gęstości (γ = 1,077) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Wirować przy 1 690 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C w wirniku z wahliwym łyżkiem bez hamulca.
  3. Ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych (kożuszek) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Napełnij stożkową probówkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 40 ml. Wymieszać i odwirować do granulek w temperaturze 751 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Odrzucić supernatant i dodać 15 ml buforu do lizy ACK (tabela materiałów) do osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki poprzez pipetowanie. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ten krok usuwa czerwone krwinki.
  5. Napełnij stożkową probówkę 25 ml PBS. Wirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant w celu uzyskania granulowanych komórek jednojądrzastych.
  6. Przemyć 2x 40 ml PBS, aby usunąć pozostały bufor do lizy.
  7. Wirować przy 751 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jednojądrzaste komórki krwi pępowinowej w 10 ml chemicznie zdefiniowanej pożywki wolnej od surowicy (tabela materiałów) na probówkę.
  9. Połącz komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej w jednej probówce.
  10. Weź 20 μl zawiesiny komórek i wymieszaj z 20 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego (tabela materiałów) w probówce o pojemności 1,5 ml.
  11. Załaduj do szkiełka komory i określ ilościowo liczbę komórek i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Zawiesinę komórek rozcieńcza się w stosunku 1:10, jeśli stężenie komórek przekracza 1 x 107 komórek/ml.
  12. Nasiona komórek jednojądrzastych na szalkach Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm w ilości 1 x 106 komórek/ml, 25 ml / szalkę w chemicznie zdefiniowanej pożywce do hodowli komórkowych bez surowicy.
  13. Inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach 8% CO2 przez 10–14 dni, aż CB-SC osiągnie więcej niż 80% konfluencji.
  14. Odrzucić supernatant i przemyć 15 ml PBS na szalkę Petriego, a następnie usunąć PBS.
    UWAGA: CB-SC są mocno przymocowane do szalek Petriego.
  15. Powtórz krok 1.14 dwa razy.
  16. Dodać 25 ml chemicznie zdefiniowanej pożywki wolnej od surowicy na szalkę Petriego.
  17. Inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach 8% CO2 przez 3–4 dni.
  18. Zebrać kondycjonowaną pożywkę pochodzącą z CB-SC do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.

2. Charakterystyka CB-SC

  1. Odłącz CB-SC, pipetując 10 ml buforu dysocjacji komórek na bazie PBS w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 5 ml (tabela materiałów).
  2. Wirować przy 1 690 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek i ponownego zawieszenia w 200 μl PBS.
  3. Utrwal i przepuszczalność komórek do barwienia wewnątrzkomórkowego za pomocą zestawu do przygotowania do barwienia (tabela materiałów).
  4. Dodać 5 μl blokera Fc (tabela materiałów) na próbkę i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Bloker Fc hamuje niespecyficzne wiązanie podczas barwienia przeciwciałami.
  5. Dodaj sprzężone fluorescencyjnie mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludziom, w tym CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 i Galectin 9 w stężeniu 25 μg/ml (tabela materiałów) do objętości 100 μl komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lekką ochroną.
  6. Po zabarwieniu przemyć komórki 1 ml PBS i odwirować przy 751 x g przez 10 minut do osadzania komórek.
  7. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl PBS i przenieść do probówki o pojemności 5 ml.
  8. Wykonaj cytometrię przepływową, aby zweryfikować ekspresję CB-SC związaną z określonymi markerami.

3. Izolacja egzosomów pochodzących z CB-SC

  1. Odwirować kondycjonowaną pożywkę zebraną z etapu 1.18 przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  2. Odwirować supernatant zebrany z etapu 3.1 przy 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  3. Odwirować supernatant zebrany z etapu 3.2 przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Wirnik o stałym kącie jest używany tak, aby granulki komórek były wytrącane z boku rury. Zaznacz bok nasadki i narysuj okrąg po stronie tuby, w którym spodziewany jest granulek.
  4. Przefiltrować supernatanty zebrane z kroku 3.3 za pomocą filtra 0,22 μm (tabela materiałów).
  5. Przenieś 15 ml pożywki do każdej jednostki filtra odśrodkowego o sile 10 kDa (tabela materiałów).
  6. Wirować przy 4,000 x g przez 30 minut, aby wyizolować skoncentrowane podłoże egzosomowe.
  7. Przenieś skoncentrowane egzosomy do probówki ultrawirówkowej. Następnie osadzaj egzosomy w ilości 100 000 x g przez 80 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesić egzosomy osadów w 10 ml PBS.
  9. Wirować przy 100 000 x g przez 80 minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać osady egzosomów.
  10. Ponownie zawiesić osad egzosomów w 200 μl PBS, pipetując w górę iw dół.

4. Charakterystyka egzosomów pochodzących z CB-SC

  1. Kwantyfikacja całkowitego stężenia białka w preparacie egzosomów za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA)
    1. Odpipetować 10 μl każdej albuminy, wzorcowej i wyizolowanej próbki egzosomu przygotowanej w kroku 3.10 na 96-dołkową płytkę w dwóch egzemplarzach.
    2. Do każdej studzienki dodać 200 μl odczynnika roboczego z zestawu BCA. Zawartość płytki dokładnie wymieszać na wytrząsarce przez 10 s.
      UWAGA: Odczynnik roboczy (WR): 50-częściowy odczynnik A z 1-częściowym odczynnikiem B.
    3. Przykryć płytki folią i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Schłodzić talerze do temperatury pokojowej (RT).
    5. Zmierzyć absorbancję próbki przy długości fali 562 nm za pomocą czytnika płytek.
  2. Przygotowanie i barwienie egzosomów do cytometrii przepływowej
    1. Wychwyć egzosomy, dodając 20 μl anty-ludzkich kulek magnetycznych CD63 (rozmiar 4,5 μm) (tabela materiałów) do 25 μg egzosomów pochodzących z CB-SC przygotowanych w kroku 3.10 w łącznej objętości 100 μl PBS.
    2. Inkubować probówkę przez noc (18\u201222 h) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 800 obr./min.
    3. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 30 s, aby pobrać próbkę z dna probówki.
    4. Dodać 300 μl buforu izolacyjnego (0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) i delikatnie wymieszać pipetując.
      UWAGA: Ten krok myje egzosomy związane z koralikami.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę (tabela materiałów) i wyrzuć supernatant.
    6. Powtórz kroki 4.2.4\u20124.2.5.
    7. Ponownie zawiesić egzosomy związane z kulkami za pomocą 400 μl buforu izolacyjnego.
    8. Podwielokrotność 100 μl egzosomów związanych z koralikami do każdej probówki.
    9. Dodaj przeciwciała sprzężone z fluorescencją (CD9-FITC, CD81-PE i CD63-FITC odpowiednio w stężeniu 25 μg/ml) do każdej probówki przepływowej z egzosomami wychwyconymi przez kulki CD63.
      UWAGA: IgG dopasowane izotypowo służą jako kontrola negatywna.
    10. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej z lekką ochroną na wytrząsarce przy 800 obr./min.
    11. Powtórz kroki 4.2.4\u20124.2.5.
    12. Ponownie zawiesić egzosomy związane z kulkami w 200 μl buforu izolacyjnego i przenieść do probówek przepływowych o pojemności 5 ml.
    13. Umieścić probówki w karuzeli próbek cytometru przepływowego.
    14. Otwórz protokół do testowania egzosomów.
    15. Uruchom próbkę automatycznie za pomocą cytometru przepływowego.
  3. Wykrywanie egzosomów za pomocą western blot
    UWAGA: Western blot jest dobrze znaną metodą i nie będziemy wchodzić w szczegóły samej metody.
    1. Granulki egzosomów pochodzących z CB-SC z kroku 3.10 poddać lizie za pomocą 100 μl buforu RIPA, pipetować 20x, a następnie umieścić na lodzie na 5 minut.
    2. Określ ilościowo stężenie białka w lizacie egzosomów za pomocą zestawu BCA i załaduj 25 μg białka na dołek.
    3. Oddzielić białka za pomocą elektroforezy żelowej przez 40 minut przy napięciu 150 V.
    4. Przenieś białko do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą metody transferu półsuchego11.
    5. Zatkaj membranę 5% mlekiem beztłuszczowym na 30 minut.
    6. Inkubować z 2 μg/ml przeciwciał anty-ludzkich Alix (tabela materiałów) i 1 μg/ml przeciwciał anty-ludzkich Calnexin (tabela materiałów).
    7. Wykrywanie białka za pomocą chemiluminescencji za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.
  4. Walidacja egzosomów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    1. Rozcieńczyć 10 μg próbek egzosomów pochodzących z CB-SC w 1 ml PBS.
    2. Przenieść 1 ml rozcieńczonej próbki do jednorazowej półmikrokuwety (tabela materiałów).
    3. Umieść kuwetę w instrumencie DLS. Ustaw współczynnik załamania światła (RI) na 1,39 dla wszystkich monitorów próbek.
    4. Badaj próbki w temperaturze 25 °C i wykonaj trzy pomiary na frakcję, aby uzyskać średni rozkład wielkości.
  5. Walidacja egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    1. Płaszcz formvar na siatkach miedzianych o siatce 30012 (Tabela materiałów).
    2. Wzmocnij formvar dodatkową warstwą odparowanego węgla na miedzianych siatkach12.
      UWAGA: Takie podejście do powlekania doskonale nadaje się do podparcia próbki.
    3. Załaduj 10 μl próbek egzosomów na siatki i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Próbki należy barwić ujemnie octanem uranylu przez 5 minut.
    5. Umyj trzy razy wodą DI i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    6. Obserwować i fotografować próbki w ramach TEM. Ustaw napięcie przyspieszające na 200 kV i rozmiar plamki na 2.

5. Zmierz egzosomy pochodzące z CB-SC znakowane Dio, pobrane przez różne subpopulacje PBMC

  1. Oznacz egzosomy pochodzące z CB-SC zielonym fluorescencyjnym barwnikiem lipofilowym Dio
    1. Przenieść 100 μg egzosomów pochodzących z CB-SC (przygotowanych w kroku 3.10) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Rozcieńczyć próbkę PBS do objętości 5 ml.
    3. Dodawać zielony fluorescencyjny barwnik lipofilowy Dio (tabela materiałów), aż stężenie robocze osiągnie 5 μM.
    4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    5. Przenieść próbkę do probówki ultrawirówkowej.
    6. Wirować przy 100 000 x g przez 80 minut, aby osadzać egzosomy pochodzące z CB-SC znakowane Dio.
    7. Ponownie zawiesić znakowane egzosomy w 200 μl PBS.
  2. Przygotowanie ludzkiego PBMC
    1. Przenieś 25 ml ludzkiego kożucha (tabela materiałów) na 20 ml podłoża o gradiencie gęstości (γ = 1,077) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Powtórz kroki od 1.2 do 1.11.
    3. Przenieść 1 x 106 PBMC do hydrofobowej 24-dołkowej płytki niepoddanej działaniu tkanek (1 ml/dołek).
      UWAGA: Użyto płytki niepoddanej obróbce tkankowej, aby uniknąć przylegania monocytów.
  3. Wspólna hodowla egzosomów znakowanych dio z PBMC
    1. Przenieść 40 μl egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych dio, przygotowanych w kroku 5.1.7, do każdej studzienki zawierającej PBMC na płytce 24-dołkowej za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Dodaj tę samą objętość PBS do studzienek kontrolnych.
    2. Mieszać pipetując 10 razy. Inkubować przez 4 godziny.
    3. Zebrać 200 μl PBMC poddanego działaniu egzosomu i oznaczyć Hoechst 33342 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 100 μl PBS.
    5. Zamontuj komórki na szkiełkach mikroskopowych.
    6. Obserwuj i fotografuj interakcję egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych Dio z PBMC znakowanym Hoechst 33342 za pomocą mikroskopu.
    7. Przenieść pozostałe komórki z kroku 5.3.3 do probówki o pojemności 1,5 ml.
    8. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS.
    9. Dodać 5 μl blokera Fc na próbkę. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Dodać przeciwciała (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 i CD56 w stężeniu 25 μg/ml) (tabela materiałów) do barwienia PBMC.
      UWAGA: IgG dopasowane izotypowo służą jako kontrola negatywna.
    11. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lekką ochroną.
    12. Dodać 1 ml PBS i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    13. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl PBS. Dodać 5 μl jodku propydyny.
    14. Użyj cytometrii przepływowej, aby ocenić poziom wychwytu egzosomu znakowanego Dio w różnych subpopulacjach PBMC.

6. Zbadaj działanie egzosomów pochodzących z CB-SC na monocyty

  1. Izolacja ludzkich monocytów CD14-dodatnich
    1. Przenieś 3 x 107 ludzkich PBMC do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Umieść kolumnę separacyjną (Tabela materiałów) w separatorze magnetycznym (Tabela materiałów).
    4. Trzykrotnie przemyć kolumny separacyjne 2 ml buforu do pracy na zimno (tabela materiałów).
    5. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl zimnego PBS. Dodać 60 μl mikrogranulek CD14. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
    6. Dodaj 6 ml zimnego PBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 500 μl buforu do pracy na zimno.
    8. Przenieść komórki do kolumny rozdzielającej (przygotowanej w kroku 6.14) i przepuścić je przez nią.
    9. Przemyć kolumnę separacyjną trzykrotnie 2 ml bieżącego buforu na przemycie. Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Probówkę o pojemności 15 ml należy umieścić na lodzie ze względu na przyleganie monocytów CD14-dodatnich do probówki w temperaturze pokojowej.
    10. Przenieść 2 ml buforu pracującego na zimno na górę kolumny i wyizolować komórki CD14-dodatnie do probówki o pojemności 15 ml.
    11. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek CD14-dodatnich.
    12. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml zimnej, chemicznej pożywki wolnej od surowicy (tabela materiałów).
    13. Przenieś 50 μl komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
    14. Barwieć 10 μl anty-ludzkiego mAb CD14 sprzężonego z Krome Orange (tabela materiałów) przez 20 min.
      UWAGA: IgG dopasowane izotypowo służą jako kontrola negatywna.
    15. Dodaj 1 ml PBS do komórek. Wirować przy 300 x g przez 10 minut do osadzania komórek.
    16. Ponownie zawieś komórki w 200 μl PBS i przenieś je do probówki o pojemności 5 ml. Określić czystość monocytów CD14-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Leczenie monocytów egzosomami pochodzącymi z CB-SC
    1. Nasiona 1 x 106 oczyszczonych monocytów z chemicznie zdefiniowaną pożywką hodowlaną bez surowicy (tabela materiałów) na 6-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej (2 ml / dołek).
    2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
    3. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Delikatnie dodać 2 ml wstępnie podgrzanej, chemicznie zdefiniowanej, pozbawionej surowicy pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C (tabela materiałów).
      UWAGA: Monocyty przyklejono do płytki w ciągu 2 godzin. Pływające komórki zostały zidentyfikowane jako martwe lub inne zanieczyszczenia komórkowe.
    4. Dodać 80 μg egzosomów pochodzących z CB-SC wyizolowanych z kroku 3.10 do kultur monocytów na 6-dołkowej płytce o całkowitej objętości 2 ml.
      UWAGA: Ta sama objętość PBS została dodana do studzienek kontrolnych.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 3–4 dni.
    6. Sfotografuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu w powiększeniu 200× (tabela materiałów).
    7. Odłącz komórki, pipetując w górę i w dół w 1 ml buforu dysocjacyjnego komórkowego na bazie PBS z końcówką do pipety o pojemności 1 ml.
    8. Zbierz pozostałe przyczepione komórki za pomocą skrobaka do komórek.
      UWAGA: Ponieważ pierwotne monocyty lub zróżnicowane makrofagi ściśle się przylegają, niektóre komórki pozostają przylegające do dna po potraktowaniu buforem dysocjacyjnym. Dlatego komórki te są zbierane za pomocą skrobaka do komórek.
    9. Zbieraj komórki w ilości 1 690 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w 200 μl PBS.
    10. Dodaj 5 μl blokera Fc (25 μg/ml), aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
    11. Dodaj przeciwciała (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 i CD209 w stężeniu 25 μg/ml, tabela materiałów) do komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: IgG dopasowane izotypowo służą jako kontrola negatywna
    12. Dodać 1 ml PBS do komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl PBS.
    13. Dodać 5 μl jodku propidyny na próbkę (200 μl) i przenieść komórki do nowej probówki przepływowej o pojemności 5 ml.
    14. Wykonaj cytometrię przepływową i oceń poziomy ekspresji CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 i CD209.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowo fenotyp i czystość CB-SC były badane za pomocą cytometrii przepływowej z markerami związanymi z CB-SC, takimi jak wspólny antygen leukocytów CD45, czynniki transkrypcyjne specyficzne dla komórek ES OCT3/4 i SOX2. CB-SC wykazują wysoki poziom ekspresji CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 i galektyny 9, ale brak ekspresji CD34 (Rysunek 1A). Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła, że ekspresja markerów specyficznych dla egzosomów, w tym CD9, CD81 i CD63, znajdowała się na egzosomach pochodzących z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie egzosomów to rozwijająca się dziedzina diagnostyki klinicznej, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół dotyczący przygotowania egzosomów pochodzących z CB-SC oraz badania funkcjonalnego egzosomów na różnicowanie ludzkich monocytów. Obecny protokół wykazał, że funkcjonalne egzosomy pochodzące z CB-SC są izolowane przez sekwencyjne wirowanie i ultrawirowanie o wysokiej czystości i wykazujące modulację immunologiczną na monocytach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Zhao jest założycielem Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr Zhao jest wynalazcą technologii Stem Cell Educator. Wszyscy pozostali autorzy nie mają żadnych interesów finansowych, które mogą mieć związek ze zgłoszoną pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Panu Poddarowi i Panu Ludwigowi za hojne wsparcie finansowe za pośrednictwem Fundacji Hackensack UMC. Doceniamy Laurę Zhao za redakcję w języku angielskim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Probówka stożkowa 15 mlFalcon352196
24-dołkowa płytkaFalcon351147Kultura nietkankowa
płytka
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanina(Dio)Millipore sigmaD4292-20MGPrzechowywać w temperaturze 4 & st.;
C 300 Mesh GridsTed Pella1GC300
Probówka stożkowa 50 mlFalcon352070
Płytka 6-dołkowaFalcon353046Płytka do hodowli tkankowej
96-dołkowaFalcon353072Płytka do hodowli tkankowej
ACK Liza BufferLonza10-548E100 ml
Amicon-15 10kDa Wirówka FliterMillipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501sklep w 4 > C, RRID: AB_2268110
Anti-Human CalnexinBiolegend699401sklepie w temperaturze 4 & C, RRID: AB_2728519
Przeciwciało anty-ludzkie CD11c, Pe-Cy7BD Bioscience561356przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, RRID: AB_10611859
Przeciwciało anty-ludzkie CD14, Karma OrangeBeckman CoulterB36294przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_2728099
Przeciwciało anty-ludzkie CD163, PEBD Bioscience556018przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_396296
Przeciwciało anty-ludzkie CD19, PC5Beckman CoulterIM2643Uprzechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_131160
Przeciwciało anty-ludzkie CD206, FITCBD Bioscience551135przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_394065
Przeciwciało anty-ludzkie CD209, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2738610
Przeciwciało anty-ludzkie CD270, PEBiolegend318806przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2203703
Przeciwciało anty-ludzkie CD3, Pacfic BlueBiolegend300431przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_1595437
Przeciwciało anty-ludzkie CD34, APCBeckman CoulterIM2427Uprzechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało
anty-ludzkie CD4, APCBD Bioscience555349przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_398593
Przeciwciało anty-ludzkie CD45, Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Uprzechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_1575969
Przeciwciało anty-ludzkie CD56, PEBeckman CoulterIM2073Uprzechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_131195
Przeciwciało anty-ludzkie CD63, PEBD Bioscience561925przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_10896821
Przeciwciało anty-ludzkie CD8, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało
anty-ludzkie CD80, APCBeckman CoulterB30642przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało
anty-ludzkie CD81, FITCBD Bioscience561956przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_394049
Przeciwciało anty-ludzkie CD86, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646przechowywać w 4 & stopniach; C, RRID: N/A Przeciwciało
anty-ludzkie CD9, FITCThermoScienticMA5-16860przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_2538339
Przeciwciało anty-ludzkiej galektyny 9, Brilliant Violet 421Biolegend348919przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2716134
Przeciwciało anty-ludzkie OCT3/4, eFluor660ThermoScientic50-5841-82przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_11218882
Przeciwciało anty-ludzkie SOX2, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82przechowywać w 4 & stopni; C, RRID: AB_2574479
Zestaw do oznaczania białek BCAThermoFisher Scientific23227
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA1933
Płaszcz BuffyNew York Blood Center40-60 ml / jednostkę
Skrobak do komórekFalcon353085
Jednorazowa półmikrokuwetaVWR97000590
Bufor dysocjacyjnyGibco131510014100 ml
Preparaty do liczenia komórek Dual-1450015Chanber Odczynnik do
egzosomów i ludzkich CD63Bio-Rad Scientific10606Dprzechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Ficoll-Paque PLUS gęstość wspaniała pożywkaGE Health17-1440-03500 ml
Rotor o stałym kącie nachylenia (25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24 700 x g
Cytometr przepływowy GalliosBeckman Coulter3 lasery
10 Color Max
Ludzka krew pępowinowaCryo-Cell International40-100 ml / jednostkę
Ludzki blok Fc BDBioscience564220przechowywać pod adresem 4 & st.; C
Membrana PVDF Immun-BlotBio-Rad1620177
Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; mMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 UltracentrówkaBeckman Coulter
Wytrząsarka orbitalna MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 ml
Jodek propidiumBD Bioscience56-66211Eprzechowywać w 4 & stopni; C
Mikroskop Nikon Eclipse Ti2Instrumenty Nikon IncEclipse Ti2Wersja oprogramowania NIS-Elements 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
Revert microsopyFisher scientific12563518
Rotor 41 TiBeckman Coulter331362Maxium 41 000 obr./min
Wirówka Sorvall St 16R Thermo Scientifc75004381
Wahadłowy wirnik kubełkowyThermo Scientifc75003655
TC-20 licznik komórekBio-Rad
Inkubator CO2 ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle ThermoFisherScientific
Transmisyjna mikroskopia elektronowaJEOLJEM-2100 PLUS
Probówka ultrawirówkowaBeckman Coulter331372
X'VIVO 15 Pożywka bez surowicyLonzaBEBP04-744Q1000 ml Pożywka hodowlana, przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z
wykrywania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160(2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87(2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763(2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie monocyt wizolacja egzosom wmonocyty CD14 dodatniemarkery makrofag w M2analiza cytometrycznaprotok ultrawirowanialudzkie macierzyste kom rki krwi p powinowejmononuklearne kom rki krwi obwodowejterapia Stem Cell Educator

Powiązane artykuły