Artykuł metodologiczny

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

DOI:

10.3791/61565

⸱

22 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obszerne badania scharakteryzowały rozwój i różnicowanie mysich komórek B w wtórnych narządach limfatycznych. Przeciwciała wydzielane przez limfocyty B zostały wyizolowane i opracowane w celu uzyskania ugruntowanych metod terapeutycznych. Walidacja rozwoju mysich limfocytów B, w kontekście myszy podatnych na autoimmunologię lub myszy ze zmodyfikowanym układem odpornościowym, jest kluczowym elementem opracowywania lub testowania środków terapeutycznych na myszach i jest odpowiednim zastosowaniem cytometrii przepływowej. Dobrze ugruntowane parametry cytometrii przepływowej komórek B można wykorzystać do oceny rozwoju komórek B w mysiej otrzewnej, szpiku kostnym i śledzionie, ale należy przestrzegać szeregu najlepszych praktyk. Ponadto analiza cytometryczna przepływowa przedziałów limfocytów B powinna również uzupełniać dodatkowe odczyty dotyczące rozwoju komórek B. Dane wygenerowane przy użyciu tej techniki mogą pogłębić naszą wiedzę na temat dzikich i autoimmunologicznych modeli myszy, a także humanizowanych myszy, które można wykorzystać do generowania przeciwciał lub cząsteczek podobnych do przeciwciał jako środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała monoklonalne coraz częściej stają się preferowaną terapią dla wielu chorób ludzkich, ponieważ stają się częścią głównego nurtu medycyny1,2. Wcześniej opisaliśmy genetycznie modyfikowane myszy, które efektywnie wytwarzają przeciwciała zawierające w pełni ludzkie zmienne regiony ze stałymi IgH myszy3,4. Ostatnio opisaliśmy genetycznie zmodyfikowane myszy, które wytwarzają cząsteczki podobne do przeciwciał, które mają wyraźne wiązanie antygenu5. Przeciwciała są wydzielane przez limfocyty B i stanowią podstawę adaptacyjnej odporności humoralnej. Istnieją dwa różne typy komórek B, B-1 i B-2. U ssaków komórki B-1 pochodzą z wątroby płodu i są wzbogacone w tkanki błony śluzowej oraz jamy opłucnej i otrzewnej po urodzeniu, podczas gdy komórki B-2 pochodzą z wątroby płodu przed urodzeniem, a następnie ze szpiku kostnego (BM). Komórki B-2 są wzbogacone w wtórne narządy limfoidalne, w tym śledzionę i krew6,7,8. W BM przodkowie układu krwiotwórczego B-2 zaczynają różnicować się w komórki pro-B po zainicjowaniu przegrupowania łańcucha ciężkiego Ig mu9,10. Udana rearanżacja łańcucha ciężkiego Ig i jego złożenie się w receptor komórek pre-B (pre-BCR), wraz z ekspansją sygnalizacyjną i proliferacyjną, prowadzi do różnicowania do komórek pre-B. Po przegrupowaniu łańcuchów lekkich Ig kappa (Igκ) lub jeśli są nieproduktywne, Ig lambda (Igλ), łączą się z μ łańcuchem ciężkim, co powoduje powierzchniową ekspresję IgM BCR. Ważne jest, aby podkreślić, że wiadomo, że ekspresja powierzchniowa IgM jest zmniejszona w warunkach autoreaktywności, przyczyniając się w ten sposób do samotolerancji w funkcjonalnie niereagujących lub anergicznych komórkach B11,12. Niedojrzałe limfocyty B wchodzą następnie w fazę przejściową, w której zaczynają ulegać koekspresji IgD i migrować z BM do śledziony. W śledzionie ekspresja IgD wzrasta dalej, a komórki dojrzewają do drugiego etapu przejściowych limfocytów B, po którym następuje zakończenie ich stanu dojrzewania i rozwój w komórki strefy brzeżnej (MZ) lub komórki pęcherzykowe (Fol)13,14,15. U dorosłych myszy, w warunkach niechorych, liczba dojrzałych komórek B pozostaje stała, mimo że dziennie w BM generowanych jest 10-20 milionów niedojrzałych komórek B. Spośród nich tylko trzy procent wchodzą do puli dojrzałych komórek B. Wielkość obwodowego przedziału komórek B jest ograniczona przez śmierć komórki, częściowo ze względu na kilka czynników, w tym samoreaktywność i niepełne dojrzewanie16,17,18. Analiza cytometrii przepływowej jest szeroko stosowana do scharakteryzowania i wyliczenia wielu podprzedziałów komórek odpornościowych u ludzi i myszy. Chociaż istnieją pewne podobieństwa między przedziałami ludzkich i mysich komórek B, protokół ten ma zastosowanie tylko do analizy mysich komórek B. Protokół ten został opracowany w celu fenotypowania genetycznie zmodyfikowanych myszy, aby ustalić, czy manipulacja genetyczna zmieni rozwój komórek B. Cytometria przepływowa jest również niezwykle popularna w wielu dodatkowych zastosowaniach, w tym w pomiarze aktywacji komórek, funkcji, proliferacji, analizie cyklu, analizie zawartości DNA, apoptozie i sortowaniu komórek 19,20.

Cytometria przepływowa jest narzędziem z wyboru do charakteryzowania różnych przedziałów limfocytów u myszy i ludzi, w tym w złożonych narządach, takich jak śledziona, BM i krew. Ze względu na powszechnie dostępne odczynniki przeciwciał specyficznych dla myszy do cytometrii przepływowej, technika ta może być stosowana nie tylko do badania białek powierzchniowych komórek, ale także wewnątrzkomórkowych fosfoprotein i cytokin, a także do odczytów funkcjonalnych21. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób odczynniki cytometrii przepływowej mogą być używane do identyfikacji podzbiorów komórek B w miarę ich dojrzewania i różnicowania w wtórnych narządach limfatycznych. Po optymalizacji warunków barwienia, obchodzeniu się z próbką, prawidłowym ustawieniu przyrządu i akwizycji danych, a na końcu analizie danych, można zastosować protokół kompleksowej analizy cytometrii przepływowej przedziału komórek B u myszy. Taka kompleksowa analiza opiera się na wieloletniej nomenklaturze opracowanej przez Hardy'ego i współpracowników, w której rozwijające się komórki BM B-2 można podzielić na różne frakcje (frakcje) w zależności od ich ekspresji B220, CD43, BP-1, CD24, IgM i IgD22. Hardy i wsp., wykazali, że komórki B B220 + CD43 BM można podzielić na cztery podzbiory (frakcja A-C ') na podstawie ekspresji BP-1 i CD24 (30F1), podczas gdy B220 + CD43- (od dim do neg) komórki BM B można podzielić na trzy podzbiory (frakcja D-F) w oparciu o różnicową ekspresję IgD i powierzchniową IgM23. Frakcja A (komórki pre-pro-B) definiuje się jako BP-1-CD24 (30F1)-, frakcja B (wczesne komórki pro-B) definiuje się jako BP-1-CD24 (30F1) +, frakcja C (późne komórki pro-B) definiuje się jako BP-1 + CD24 (30F1) +, a frakcja C' (wczesne komórki pre-B) definiuje się jakowysokie BP-1 + i CD24. Ponadto frakcja D (komórki pre-B) definiuje się jako komórki B220 + CD43- IgM- B, a frakcja E (nowo wygenerowane komórki B, połączenie niedojrzałych i przejściowych) definiuje się jako komórki B B220 + CD43-IgM+, a frakcja F (dojrzałe, recyrkulacyjne komórki B) definiuje się jako komórki BB220 o wysokiej zawartości CD43-IgM+. Natomiast większość naiwnych limfocytów B znajdujących się w śledzionie można podzielić na dojrzałe (B220 + CD93-) komórki B i komórki przejściowe (T1, T2, T3) w zależności od ekspresji CD93, CD23 i IgM. Dojrzałe komórki B można podzielić na strefy brzeżne i podzbiory pęcherzykowe w oparciu o ekspresję IgM i CD21 / CD35, a podzbiory pęcherzykowe można dalej podzielić na podzbiory dojrzałych komórek pęcherzykowych typu I i pęcherzykowego typu II w zależności od poziomu ich ekspresji powierzchniowej IgM i IgD24. Te populacje komórek B śledziony wyrażają głównie łańcuch lekki Igκ. Wreszcie, w literaturze opisano populacje komórek B B-1, które pochodzą z wątroby płodu i znajdują się głównie w jamach otrzewnej i opłucnej dorosłych myszy. Te limfocyty B otrzewnej można odróżnić od wcześniej opisanych komórek B B-2 po braku ekspresji CD23. Następnie są one dalej dzielone na populacje B-1a lub B-1b, przy czym pierwsza z nich jest definiowana przez obecność CD5, a druga przez jego brak25. Komórki progenitorowe komórek B-1 występują licznie w wątrobie płodu, ale nie występują u dorosłych BM. Podczas gdy komórki B-1a i B-1b pochodzą od różnych komórek progenitorowych, oba zasiewają jamy otrzewnej i opłucnej24. W przeciwieństwie do komórek B-2, komórki B-1 są wyjątkowo zdolne do samoodnawiania i są odpowiedzialne za produkcję naturalnych przeciwciał IgM.

Defekty w rozwoju komórek B mogą wystąpić w wielu przypadkach, w tym braki w komponentach klasy BCR26,27, perturbacje cząsteczek sygnałowych, które wpływają na siłę sygnalizacji BCR14,28,29, lub zakłócenie cytokin modulujących przeżycie komórek B30,31. Analiza cytometrii przepływowej przedziałów limfoidalnych przyczyniła się do scharakteryzowania bloków rozwoju limfocytów B u tych myszy i wielu innych. Jedną z zalet analizy cytometrii przepływowej przedziałów limfatycznych jest to, że oferuje ona możliwość wykonywania pomiarów na pojedynczych komórkach uzyskanych z żywej zdysocjowanej tkanki. Dostępność odczynników w coraz szerszej gamie fluoroforów pozwala na jednoczesną analizę wielu parametrów i umożliwia ocenę niejednorodności limfocytów B. Ponadto wyliczanie komórek B za pomocą analizy cytometrii przepływowej uzupełnia inne testy immunologiczne, takie jak metody immunohistochemiczne, które wizualizują lokalizację komórek w narządach limfatycznych, wykrywanie poziomów krążących przeciwciał jako miara odporności humoralnej, a także mikroskopia dwufotonowa do pomiaru odpowiedzi komórek B w rzeczywistej przestrzeni i czasie32.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na myszach były nadzorowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) firmy Regeneron. Eksperyment przeprowadzono na tkankach trzech samic myszy C57BL/6J (w wieku 17 tygodni) z Jackson Laboratories. Miareczkować wszystkie przeciwciała przed rozpoczęciem eksperymentu, aby określić idealne stężenie. Używając koralików kompensacyjnych do kompensacji jednokolorowej, upewnij się, że barwią się tak samo jasno lub jaśniej niż twoje próbki. Przechowywać wszystkie, przeciwciała i komórki na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Po dodaniu barwnika żywotności należy wykonać wszystkie etapy i inkubacje w temperaturze 4°C przy słabym oświetleniu lub w ciemności.

1. Pobieranie komórek otrzewnej i izolacja pojedynczych komórek

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 lub zgodnie z zatwierdzonym protokołem.
  2. Połóż mysz na plecach, spryskaj 70% etanolem i przetnij zewnętrzną skórę brzucha nożyczkami, uważając, aby nie przeciąć otrzewnej.
  3. Wstrzyknąć 3 ml lodowatego buforu do przemywania (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS [obj./obj.]) do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 25G.
  4. Delikatnie masuj otrzewną opuszkami palców.
  5. Powtórz kroki 1.3 i 1.4.
  6. Wprowadzić przez otrzewną strzykawkę o pojemności 3 ml wyposażoną w igłę 18 G, uważając, aby uniknąć narządów i tłuszczu.
  7. Usunąć bufor do płukania, zawierający teraz komórki otrzewnej, i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
  8. Powtórz kroki 1.3 i 1.4.
  9. Wytnij mały otwór w otrzewnej, trzymając pęsetą.
  10. Włóż jednorazową pipetę transferową do otworu i zbierz pozostały bufor do płukania, ponownie unikając tłuszczu i narządów.
  11. Przenieś zebrane pozostałe komórki otrzewnej do stożkowej rurki o pojemności 15 ml na lodzie.
    UWAGA: Wyrzuć próbkę, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwi.
  12. Inkubuj komórki na lodzie, aż do zakończenia ekstrakcji śledziony i kości.
  13. Odwirować komórki przy ciśnieniu 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  14. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do przemywania wody.
  15. Przefiltruj komórki przez sitko o pojemności 70 μM do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
  16. Określ stężenie komórek za pomocą przyrządu do liczenia komórek lub hemocytometru.

2. Pobieranie śledziony i izolacja pojedynczych komórek

  1. Połóż mysz na brzuchu i przetnij otrzewną po lewej stronie z tyłu za pomocą czystych nożyczek. Wytnij śledzionę, usuwając tłuszcz i tkankę łączną.
  2. Przenieść śledzionę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu do przemywania na lodzie.
  3. Inkubuj śledzionę na lodzie, aż do zakończenia ekstrakcji kości.
  4. Przenieś śledzionę do automatycznej probówki dysocjacyjnej z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Umieść rurkę na instrumencie do dysocjacji tkanek i dysocjuj przez 60 sekund, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.
    UWAGA: Dopuszczalne jest również stosowanie innych rutynowych metod otrzymywania jednokomórkowych zawiesin śledziony, takich jak rozbijanie między szkiełkami z matowego szkła w buforze do płukania. Jeśli stosowana jest inna metoda dysocjacji, po dysocjacji należy odwirować, zasysać, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przed kontynuowaniem kroku 2.5.
  5. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  6. Dodać 10 ml buforu do przemywania o temperaturze 4 °C zawierającego 2 mM EDTA.
  7. Przenieść do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  8. Odwirować komórki przy ciśnieniu 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do przemywania o temperaturze 4 °C.
  10. Przefiltruj komórki przez sitko o pojemności 70 μM do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
  11. Określ stężenie komórek za pomocą przyrządu do liczenia komórek lub hemocytometru.

3. Zbiór BM i izolacja pojedynczej komórki

  1. Usuń skórę z dolnej połowy korpusu myszy. Przytnij nadmiar mięśni z nogi. Usuń całą nogę nożyczkami, uważając, aby nie przeciąć kości udowej. Oczyść kość udową i piszczelową, usuwając pozostałe mięśnie, tłuszcz i stopy.
  2. Przenieść kości do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu do przemywania na lodzie.
  3. Przedziurawić dno probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml, pozostawiając otwór na tyle mały, aby kości nóg nie wystawały. Włóż probówkę o pojemności 0,5 ml do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odetnij koniec kości udowej i piszczelowej proksymalnie do kolana i umieść odcięte końce skierowane w dół do probówki o pojemności 0,5 ml.
  4. Odwirować komórki przy 6,780 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej dodatkowe 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  7. Dodać 10 ml buforu do przemywania o temperaturze 4 °C zawierającego 2 mM EDTA.
  8. Odwirować komórki przy ciśnieniu 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do przemywania o temperaturze 4 °C.
  10. Przefiltruj komórki przez sitko o pojemności 70 μM do czystej stożkowej rurki o pojemności 15 ml na lodzie.
  11. Określ stężenie komórek za pomocą przyrządu do liczenia komórek lub hemocytometru.

4. Barwienie komórek i przygotowanie kompensacji

  1. Podwielokrotność 106 komórek każdego typu komórek od każdego zwierzęcia do 96-dołkowej płytki dolnej U.
    1. Upewnij się, że zawiera wystarczającą ilość studzienek dla wszystkich próbek i kontroli, w tym pełnego barwienia, fluorescencji minus jeden (FMO), niebarwionej i wreszcie opcjonalnej kompensacji jednokolorowej dla każdego użytego fluoroforu.
    2. W przypadku panelu dojrzewania BM i panelu dojrzewania śledziony, podwielokrotne komórki do 2 dołków, po 106 komórek na studzienkę, dla każdej pełnej próbki barwienia. W przypadku kontroli żywotności kompensacji jednokolorowej dodaj 2 x 106 komórek każdego typu komórek do indywidualnych studzienek.
  2. Odwirować szalkę o stężeniu 845 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant poprzez szybkie odwrócenie i przesunięcie płytki nad zlewem, uważając, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl DPBS (bez BSA lub FBS). Ten krok jest ważny, aby usunąć białko przed barwieniem barwnikiem żywotności reagującym z aminami.
  4. Powtórz kroki 4.2 i 4.3.
  5. Powtórz krok 4.2.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl barwniku żywotności rozcieńczonym w stosunku 1:1,000 w DPBS.
    UWAGA: Jeśli używasz ogniw do kompensacji jednego koloru, nie dodawaj barwnika żywotności do tych studzienek.
    1. Dla każdego zestawu plam pozostaw kilka niezabarwionych studzienek na całkowicie niezabarwioną próbkę i wszelkie inne kontrole, których możesz potrzebować.
    2. Dla każdego zestawu bejc należy pozostawić dodatkową niezabarwioną studzienkę do kontroli żywotności FMO.
    3. W przypadku jednokolorowych kontroli kompensacji żywotności: Ponownie zawiesić 2 x 106 komórek, poddanych w kroku 4.1, w 200 μl rozcieńczonego barwnika żywotności. Przenieść 100 μl komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, ogrzewać komórki przez 5 minut w temperaturze 65 °C i przenieść 100 μl komórek zabitych termicznie z powrotem do pierwotnej studzienki z pozostałymi 100 μl żywymi komórkami.
  7. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.
  8. Odwirować szalkę o stężeniu 845 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant poprzez szybkie odwrócenie i przesunięcie płytki nad zlewem, uważając, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl DPBS (bez BSA lub FBS).
  10. Powtórz kroki 4.8 i 4.9.
  11. Powtórz krok 4.8.
  12. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl bloku Fc rozcieńczonego w stosunku 1:50 (stężenie końcowe = 10 μg/ml) w buforze barwiącym (0,5% BSA w DPBS [vol/vol]).
    1. W przypadku komórek otrzewnej - dodaj również 5 μl blokera monocytów, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienie.
  13. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez 15 minut.
  14. Przygotować pełne mieszanki wzorcowe barwienia i FMO w buforze do barwienia na końcową objętość 100 μl na10-6 komórek. Patrz Tabela 1-Tabela 4 dla list przeciwciał.
    UWAGA: FMO tworzy się poprzez włączenie wszystkich przeciwciał do zestawu barwników z wyjątkiem jednego. Przygotuj FMO dla każdego przeciwciała w zestawie barwień. Gdy zestaw barwników zawiera wiele barwników brylantowych, należy zastąpić bufor do barwienia 50 μl buforu do barwienia brylantowego na próbkę
  15. Nie usuwając bloku Fc, do wybranych dołków dodać 100 μl pełnych mieszanek barwiących i FMO.
  16. Przygotuj jednobarwne kontrolki kompensacji dla każdego przeciwciała w zestawie barwienia.
    1. W przypadku korzystania z koralików kompensacyjnych postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta.
    2. W przypadku korzystania z komórek, dodać miareczkowane przeciwciało do 106 komórek, zarezerwowanych wcześniej w kroku 4.6.1 bez barwnika żywotności, w 100 μl buforu barwiącym. Jeśli wszystkie komórki w próbce są dodatnie dla określonego markera, należy odłożyć na bok niebarwione komórki, które mają być użyte podczas uzyskiwania danych kompensacyjnych na cytometrze przepływowym.
  17. Inkubować komórki i kulki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.
  18. Odwirować szalkę o stężeniu 845 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant poprzez szybkie odwrócenie i przesunięcie płytki nad zlewem, uważając, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.
  19. Ponownie zawiesić komórki i kulki w 200 μl buforu do barwienia.
  20. Powtórz kroki 4.18 i 4.19 dwa razy.
  21. Powtórz krok 4.18.
  22. Aby utrwalić próbki do analizy w ciągu 48 godzin, ponownie zawieś komórki i kulki w 200 μl 2% paraformaldehydu w DPBS.
    UWAGA: Parafomaldehyd stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia i jest łatwopalny. Przed użyciem zapoznaj się z arkuszem danych Safty.
  23. Inkubować komórki i kulki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.
  24. Powtórz kroki 4.18 i 4.19 dwa razy.
  25. Umieść płytę filtracyjną na czystej 96-dołkowej płycie dolnej w kształcie litery U. Za pomocą pipety wielopipetowej przenieś każdą próbkę do dołka na płycie filtracyjnej.
  26. Odwirować płytkę filtracyjną 96 dołka z dnem w kształcie litery U przy 845 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zdjąć płytkę filtracyjną i zdekantować supernatant, szybko odwracając i przesuwając płytkę nad zlewem, uważając, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.
  27. W przypadku paneli dojrzewania BM i śledziony ponownie zawiesić całkowicie wybarwione komórki w 100 μl buforu barwiącego. Połącz 2 dołki dla każdego zwierzęcia w 1 studzienkę. Zawiesić pozostałe panele, FMO i kontrole w 200 μl bufora do barwienia.
  28. Inkubować utrwalone komórki i kulki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez noc.

5. Akwizycja danych cytometrycznych przepływowych

  1. Zainicjuj i sprawdź jakość cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Załaduj szablon specyficzny dla każdego panelu.
  3. Przed zarejestrowaniem danych upewnij się, że wszystkie zdarzenia dla każdej próbki są w skali i widoczne na wykresach punktowych.
  4. Rejestruj kontrole kompensacji dla każdego panelu barwie za pomocą pojedynczych kompensacji plam przygotowanych w kroku 4.16. Ustaw bramki dodatnie i ujemne dla każdej próbki. Poproś oprogramowanie o obliczenie macierzy wynagrodzeń.
  5. Rozpocznij pobieranie pierwszej próbki i upewnij się, że bramki są odpowiednio ustawione.
  6. Ustaw maszynę tak, aby rejestrowała co najmniej 50 000 zdarzeń limfocytów B dla panelu komórek B otrzewnej i panelu Igκ i Igλ śledziony; 150 000 zdarzeń komórek B dla panelu dojrzewania BM; i 300 000 zdarzeń komórek B dla panelu dojrzewania śledziony.
  7. Dla każdego panelu barwiącego należy uruchomić i zapisać w pełni wybarwione próbki dla każdego zwierzęcia, próbkę niebarwioną oraz FMO.

6. Analizuj dane

  1. Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie ze strategiami bramkowania opisanymi w Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy strategię bramkowania dla charakteryzowania rozwoju limfocytów B w otrzewnej myszy, BM i śledzionie. Podstawa analizy opiera się na koncepcji barwienia barwnikiem żywotności, następnie bramkowania dubletów w oparciu o obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) i wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H), a na końcu bramkowanie zanieczyszczeń poprzez selekcję komórek zgodnie z ich charakterystyką FSC-A i obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A), określaną tutaj jako bramka wielko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza cytometryczna przepływowa tkanek limfatycznych i nielimfoidalnych umożliwia jednoczesną identyfikację i zliczanie subpopulacji komórek B u myszy i ludzi od 1980 roku. Jest stosowany jako miara odporności humoralnej i może być dalej stosowany do oceny funkcjonalności komórek B. Metoda ta wykorzystuje dostępność odczynników do oceny różnych etapów dojrzewania limfocytów B u myszy i ludzi, poprzez jednoczesną analizę wielu parametrów umożliwiających ocenę heterogeniczności limfocytów B, nawet w rzadkich populacjach....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami i udziałowcami firmy Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Matthew Sleemanowi za krytyczną lekturę rękopisu. Dziękujemy również działom Operacji Wiwarium i Cytometrii Przepływowej w firmie Regeneron za wsparcie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki Eppendorf 0,5 ml z bezpiecznym zamkiemEppendorf 223636110,5 ml probówka do mikrowirówek
1,5 ml probówki Eppendorfa Eppendorf 223641111,5 ml probówka do mikrowirówek
15 ml do sokola Probówki Falcon Corning 352097Rurka stożkowa 15 ml
IgłaBD305196
Igła 25 BD 
Strzykawka 3 mlBD309657
70 mM MACS SmartStrainer Miltenyi Biotec Numer katalogowy: 130-110-916 Sitko komórkowe 70 mM
96-dołkowa płyta dolna U Bufor10861-564
ACK GIBCO A1049201Bufor do lizy czerwonych krwinek
Acroprep Advance 96 Well Filter PlatePall Corporation8027filtracyjna
B220eBiosciences17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κKoraliki kompensacyjneBD552843
BD CompBead Anti-Rat Ig/κKoraliki kompensacyjne552844 BD
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich A8577BSA
BP-1BD740882
Brilliant Stain BufferBD566349brylantowy bufor do plam
C-KitBD564011
CD11bBD563168
BioLegend CD19BD560143
CD21/35BD
CD23 BD740216
CD24 (HSA)BioLegend138504
CD3BD561388
CD3BioLegend100214
CD43BD553270
CD43 Płyta121206BioLegend
CD5BD563194
CD93BD740750
CD93BioLegend136504
DPBS (1x)ThermoFisher14190-144DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506ThermoFisher65-0866-14barwnik żywotności
Przedłużona pipeta transferowa z cienką końcówką Jednorazowapipeta transferowaSamco233
Cytometr przepływowy A3 FACSymphony A3BDna zamówienie niestandardowecytometr przepływowy
Blok FC, CD16/CD32 (2.4G2)BD553142blok Fc
FlowJoOprogramowanie do analizy cytometru przepływowegoFlowjo
Probówki gentleMACS C Miltenyi Biotec 130-096-334Automatyczna rurka dysocjacyjna 
Dysocjator GentleMACS Octo z grzałkami Miltenyi Biotec 130-095-937Przyrząd do dysocjacji tkanek
GR1 (Ly6C/6G)BioLegend108422
IgDBioLegend405710
IgMeBiosciences25-5790-82
KappaBD550003
LambdaBioLegend407308
paraformaldehyd, 32% roztwórelektronowy Mikroskopia Nauki15714
Ter119BioLegend116220
Bloker monocytów True-StainBioLegend426103bloker monocytów
UltraPure EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575038EDTA
Vi-CELL XRBeckman Coulter731050przyrząd do liczenia komórek 
305124 do lizy VWR płyta CD11b 101222 562756

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77(2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389(2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150(2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584(2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21(2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowamysie limfocyty Bszpik kostnyledzionaotrzewnakontrole kompensacjibufor do barwieniabarwnik ywotno ciFC Block

Powiązane artykuły