Artykuł metodologiczny

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

DOI:

10.3791/61570

⸱

21 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic Surgery, Otto-von-Guericke-University, 2Department of Mechanical Engineering, Institute for Materials and Joining Technology, Otto-von-Guericke-University, 3Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry, Otto-von-Guericke-University, 4Division of Cardiology and Angiology, Department of Internal Medicine, Otto-von-Guericke-University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu, hemokompatybilność rurek o wewnętrznej średnicy 5 mm wykonanych z polichlorku winylu (PVC) i pokrytych różnymi bioaktywnymi koniugatami została porównana z niepowlekanymi rurkami PVC, rurkami lateksowymi i stentem do stosowania wewnątrznaczyniowego, który został umieszczony wewnątrz rurek PVC. Ocenę hemokompatybilności przeprowadzono przy użyciu modelu pętli hemodynamicznej in vitro, który jest zalecany przez normę ISO 10993-4. Rurki pocięto na segmenty o identycznej długości i zamknięto w celu utworzenia pętli, unikając jakichkolwiek przerw w splocie, a następnie wypełniono ludzką krwią i obrócono w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Następnie pobrano krew wewnątrz probówek do analizy liczby krwinek pełnych, hemolizy (hemoglobiny wolnej osocza), układu dopełniacza (sC5b-9), układu krzepnięcia (fibrynopeptyd A) i aktywacji leukocytów (elastaza wielojądrzasta, czynnik martwicy nowotworu i interleukina-6). Aktywację komórek gospodarza określono pod kątem aktywacji płytek krwi, statusu integryny leukocytów i agregatów płytek krwi monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Efekt niedokładnego zamknięcia pętli badano za pomocą mikrotomografii rentgenowskiej i skaningowej mikroskopii elektronowej, które wykazały tworzenie się skrzepliny w spawie. Rurki lateksowe wykazały najsilniejszą aktywację zarówno osocza, jak i komórkowych składników krwi, co wskazuje na słabą hemokompatybilność, a następnie grupa stentów i niepowlekane rurki PVC. Powlekane rurki PVC nie wykazały znaczącego spadku stanu aktywacji płytek krwi, ale wykazały zwiększoną kaskadę dopełniacza i krzepnięcia w porównaniu z niepowlekanymi rurkami z PVC. Sam model pętli nie prowadził do aktywacji komórek ani czynników rozpuszczalnych, a poziom hemolizy był niski. W związku z tym przedstawiony model pętli hemodynamicznej in vitro pozwala uniknąć nadmiernej aktywacji składników krwi przez siły mechaniczne i służy jako metoda do badania interakcji in vitro między krwią dawcy a naczyniowymi wyrobami medycznymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testowanie zgodności hemokompatybilności urządzeń medycznych jest kluczowym krokiem w rozwoju nowych urządzeń, takich jak stenty naczyniowe czy rurki perfuzyjne do pozaustrojowego natleniania błonowego. Do dziś modele zwierzęce są uważane za standardowe narzędzia do finalizacji procedury testowania wyrobów medycznych przed ich wdrożeniem u ludzi. W związku z tym konieczne jest znalezienie alternatywnych modeli in vitro, które jeszcze bardziej pomogą zminimalizować badania na zwierzętach. W związku z tym w tym badaniu zbadaliśmy miniaturowy model pętli hemodynamicznej in vitro. Celem przedstawionej metody jest zbadanie zgodności wyrobów medycznych z krwią in vitro zgodnie z normą ISO 10993-4.

Standard ISO 10993-4 opisuje standardowe zestawy parametrów klinicznych do zbadania na próbce krwi1. W skrócie są to zakrzepica (agregacja i liczba płytek krwi), krzepnięcie (fibrynopeptyd A, FPA), analiza hematologiczna (liczba krwinek pełnych), wskaźnik hemolizy (hemoglobina w wolnym osoczu) i układ dopełniacza (końcowy kompleks dopełniacza, sC5b9). Jednak do pomiarów można również uwzględnić dodatkowe markery, takie jak elastaza wielojądrzasta neutrofili (PMN), interleukina 6 (IL-6) i czynnik martwicy nowotworu - alfa (TNF) odzwierciedlające stan aktywacji leukocytów. Aby określić i określić ilościowo białka wolne od krążących komórek, które są obecne w osoczu krwi, test immunoenzymatyczny typu sandwich (ELISA) stanowi konwencjonalną i najbardziej wiarygodną metodę2,3. Podobnie, fenotyp i status aktywacji komórek gospodarza (np. leukocytów) można określić ilościowo, wykrywając ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki za pomocą cytometrii przepływowej (FACS), która zapewnia odczyty oparte na zawiesinie pojedynczej komórki, gdzie znakowane fluorescencyjnie specyficzne przeciwciała wiążą się z docelowymi cząsteczkami powierzchni komórki4. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest również zalecana w celu określenia tworzenia się skrzepliny na badanym materiale zgodnie z normą ISO 10993-41. Metoda ta może być uzupełniona o mikrotomografię rentgenowską (μCT), w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej skrzepliny, np. jej grubości, rozmiaru i lokalizacji na renderowanym obrazie 3D5.

Uzasadnieniem dla korzystania z tego modelu hemodynamicznego in vitro jest badanie najlepszych i kompatybilnych urządzeń medycznych poprzez zrozumienie podstawowej dynamiki fizjologicznej składników krwi, takich jak płytki krwi, które są zaangażowane w pierwotną hemostazę lub leukocyty oraz ich interakcji z różnymi typami urządzeń naczyniowych. Takie systemy in vitro są bardzo pożądane, ponieważ zmniejszają potrzebę badań na zwierzętach.

Prezentowany tutaj model pętli spełnia te wymagania. Model ten został po raz pierwszy opisany przez A.B. Chandlera w 1958 roku do produkcji skrzeplin krwi i dlatego jest również nazywany modelem pętli Chandlera6. Do tej pory model ten był wykorzystywany w serii eksperymentów i modyfikacji w celu zbadania biokompatybilności wyrobów medycznych z krwią7,8,9,10,11,12,13,14. Składa się z polimerowych rurek, które są częściowo wypełnione krwią i uformowane w zamykane pętle. Pętle te obracają się w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze, aby symulować warunki przepływu naczyniowego z jego efektami hemorgeologicznymi. Alternatywne metody, takie jak modele napędzane pompą lub modele, które wykorzystują mechaniczne zawory kulowe wewnątrz pętli w celu wywołania przepływu krwi wewnątrz rurek polimerowych, zostały już opisane15,16. Jednak ogólną zaletą przedstawionej tutaj metody jest to, że siła mechaniczna przyłożona do komórek krwi i białek jest niska, co pozwala uniknąć hemolizy i nie ma kontaktu między krwią a łącznikami, co mogłoby prowadzić do turbulencji przepływu i aktywacji składników krwi. Głównymi czynnikami aktywującymi wewnątrz pętli są sam badany materiał i powietrze, które jest w niej uwięzione. Pomaga to zminimalizować źródła błędów pomiarowych i zapewnić wysoką odtwarzalność, nawet jeśli interfejs krew-powietrze może prowadzić do denaturacji białek17. Możliwe jest również badanie różnych materiałów, z których wykonane są rurki i średnice stentów, bez ograniczeń dotyczących długości lub rozmiaru, co pozwala na stosowanie rurek o różnej długości i średnicy wewnętrznej. Co więcej, możliwe jest również zbadanie hemozgodności gospodarza w przypadku niedokładnego zamknięcia pętli i ekspozycji na niepowlekaną powierzchnię rurki. Inne podobne zastosowania medyczne tego modelu pętli hemodynamicznej in vitro polegają na tym, że może on być również wykorzystany do badania interakcji między immunoterapeutykami (lekami) a składnikami krwi podczas rozwoju przedklinicznego lub indywidualnych badań przesiewowych bezpieczeństwa leków przed pierwszym badaniem klinicznym fazy I na ludziach, lub do generowania materiału skrzepliny, który może być wykorzystany w dalszych eksperymentach18, 19,20.

To badanie opisuje szczegółowy protokół testowania hemokompatybilności probówek perfuzyjnych i/lub stentów. Tutaj porównanie między niepowlekanymi i powlekanymi rurami PVC (hepPVC: powłoka heparynowa, poliPVC: powłoka z bioaktywnym polimerem). Zmniejszona aktywacja płytek krwi, ale wyższa aktywacja układu krzepnięcia (FPA) stwierdzono dla obu probówek powlekanych w porównaniu z probówkami niepowlekanymi. Zastosowane tutaj rurki hepPVC są modyfikowane kowalencyjnie związaną heparyną, aby były tromboodporne21 i zostały już wykorzystane w modelu pętli w celu optymalizacji i scharakteryzowania różnych parametrów22. Rurki z poliPVC użyte w tym badaniu są dostępnymi na rynku probówkami stosowanymi w warunkach klinicznych pozaustrojowej perfuzji krwi i są pokryte polimerem heparyny w celu zmniejszenia ich trombogenności23. Czasami w zastosowaniach klinicznych stosuje się nawet niepowlekane rury PVC. Dlatego włączyliśmy rurki lateksowe jako pozytywną grupę kontrolną, która wykazywała nadmierną aktywację płytek krwi, układu krzepnięcia i rozpuszczalnych czynników, takich jak IL-6, TNF i elastaza PMN. Powstawanie skrzepliny zauważono, gdy symulowano niedokładne zamknięcie pętli. Doprowadziło to do aktywacji układu krzepnięcia i dopełniacza, a także leukocytów i płytek krwi w porównaniu z warunkami wyjściowymi. Co więcej, kontakt krwi z zastosowanym tu materiałem stentu (stent nitinolowy z gołego metalu, pokryty impregnowanym węglem spienionym politetrafluoroetylenem) doprowadził do większej aktywacji płytek krwi i leukocytów w zakresie elastazy PMN. Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany model nie indukował hemolizy w żadnym z badanych urządzeń naczyniowych, ponieważ były one porównywalne z warunkami wyjściowymi lub statycznymi, z wyjątkiem rurek lateksowych, w których hemoliza krwinek czerwonych (RBC) była oczywista. Co więcej, te rurki perfuzyjne można badać za pomocą obrazowania lub histologii. Chociaż oceny histologiczne mogą być wykonalne, skupiliśmy się głównie na ELISA i cytometrii przepływowej, aby przeprowadzić te eksperymenty, a tym samym umożliwić przeprowadzenie eksperymentów w oparciu o przedstawiony tutaj model dla wielu laboratoriów. W związku z tym metoda ta stanowi wykonalną metodę badania biokompatybilności naczyniowych wyrobów medycznych we krwi zgodnie z zaleceniami normy ISO 10993-4. Co więcej, metoda ta może być stosowana wszędzie tam, gdzie interakcja między krwią a materiałami powinna być badana w warunkach przepływu, naśladując warunki in vivo.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki wydziału medycznego Szpitala Uniwersyteckiego w Magdeburgu (numer wniosku 88/18), a badani wyrazili pisemną świadomą zgodę przed procedurą pobrania krwi.

1. Przygotowanie zapasów heparyny i pobieranie próbek krwi

  1. Oblicz ilość krwi potrzebną do całego eksperymentu.
    UWAGA: Prawie 5 ml heparynizowanej krwi jest wymagane dla każdego urządzenia naczyniowego w duplikatach (pętlach). Podobnie, 5 ml krwi jest wymagane dla każdego stanu wyjściowego i statycznego, który jest odkładany na bok w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować podstawowy roztwór heparyny o stężeniu 100 j.m./ml, rozcieńczając niefrakcjonowaną heparynę (np. Rotexmedia) w wodzie dejonizowanej. Użyć 150 μl tego roztworu do heparynizacji 10 ml świeżej krwi.
  3. Oblicz ilość krwi i osocza, które są potrzebne do podmiany krwi pełnej, testów ELISA i FACS.
    UWAGA: Pomiary przedstawione w tym badaniu uzyskano z dwóch pętli biegnących równolegle (jedna jako duplikat) o całkowitej objętości krwi 10 ml.
  4. W zależności od wymaganej ilości krwi napełnij 10 ml strzykawek 150 μl roztworu podstawowego heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi o końcowym stężeniu heparyny 1,5 j.m./ml krwi.
  5. Pobrać krew za pomocą motyla (rozmiar: 21 g). Strzykawki należy napełniać bardzo delikatnie, aby uniknąć hemolizy lub aktywacji komórek z powodu nadmiernego podciśnienia.
    UWAGA: Zgoda lokalnej komisji etycznej powinna zostać uzyskana przed rozpoczęciem eksperymentów. Należy uzyskać świadomą zgodę od każdego dawcy krwi. Upewnij się, że dawca krwi jest zdrowy i nie przyjmuje żadnych leków, zwłaszcza leków przeciwpłytkowych lub niesteroidowych leków przeciwzapalnych przez co najmniej 10 dni przed eksperymentami. Warto zauważyć, że ten sam dawca jest preferowany przy porównywaniu różnych typów urządzeń naczyniowych po raz pierwszy, jak przedstawiono w tym manuskrypcie. Aby dokładniej ocenić różnice międzyosobnicze, protokół można powtórzyć z różnymi dawcami.
  6. Zbierz krew do szklanej zlewki, unikaj nadmiernego pobudzenia.

2. Montaż pętli hemodynamicznej in vitro

  1. Napełnij łaźnię wodną, aż poziom wody osiągnie środek jednostki obrotowej. Ustaw temperaturę wody na 37 °C.
  2. Zespół pętli do testowania różnych materiałów rurek (poliPVC, hepPVC, PVC i lateks)
    1. Wytnij dwa kawałki o długości 50 cm z każdego materiału rurki (średnica wewnętrzna 5 mm) za pomocą obcinaka do rur. Upewnij się, że powierzchnia cięcia jest płaska, ponieważ jest to szczególnie ważne dla idealnego zamknięcia pętli o małych średnicach, tak aby krew przepływała bez zniekształceń na krawędzi mocowania.
      UWAGA: W całym tym protokole wykorzystuje się rurki o średnicy wewnętrznej 5 mm.
    2. Aby ułatwić obsługę i uniknąć opóźnień w przetwarzaniu próbki po obróceniu, uruchom równolegle tylko cztery pętle (2 materiały w dwóch egzemplarzach).
    3. Aby wygenerować kształt pętli, podłącz otwarte końce rurek do krótkiego kawałka silikonowej rurki pasującej do zewnętrznej średnicy rurki śledczej.
    4. Użyj poliwęglanowych taśm napinających, aby zapewnić prawidłowe zamknięcie pętli. Przy pierwszym użyciu dostosuj długość taśm tak, aby pasowała do zewnętrznej średnicy pętli, przecinając taśmę napinającą nożyczkami na wymagane długości i zabezpieczając ją kluczem dynamometrycznym 3 mm.
    5. Ostrożnie dokręć blokującą łącznika taśmy napinającej pod kontrolą końcówek rurek. Dostosuj siłę zamykania tak, aby między końcami rurki nie pozostała żadna szczelina. Jeśli śruba blokująca jest całkowicie dokręcona, a napięcie taśmy poliwęglanowej wydaje się zbyt niskie, aby zamknąć szczelinę między końcami rury, otwórz system blokujący i odetnij kilka mm taśmy napinającej. Powtarzaj to, aż zostanie osiągnięte dokładne zamknięcie pętli (Rysunek 1A).
    6. Jeśli materiał rurki jest bardzo miękki i ma tendencję do wślizgiwania się do taśm napinających, przymocuj pętlę taśmą izolacyjną do taśmy napinającej (Rysunek 1B,C).
    7. Przygotuj dodatkową pętlę z PVC do kontroli temperatury o takich samych wymiarach jak pętle testowe.
    8. Zabezpiecz pętle w uchwycie pętli jednostki obrotowej na zewnątrz łaźni wodnej. Następnie przymocuj kołyskę pętli do jednostki obrotowej wewnątrz łaźni wodnej (Rysunek 1E).
    9. Zdemontuj taśmę napinającą częściowo z pętli i odłącz jeden koniec każdej rurki, aby otworzyć pętlę.
    10. Delikatnie napełnij każdą pętlę 5 ml krwi za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Delikatnie wymieszaj krew dwukrotnie w szklanej zlewce, powoli pipetując w górę i w dół przed załadowaniem do pętli.
    11. Weź jednorazowy termometr i umieść go w pętli kontroli temperatury. Jeśli termometr jest zbyt duży, przytnij go nożyczkami, aby pasował do mniejszych rurek. Napełnij pętlę 5 ml dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej.
    12. Zamknij pętle i upewnij się, że pętle, taśmy napinające i stojak są prawidłowo zamontowane.
    13. Ustaw prędkość obrotową na 30 rund na minutę (rpm) i obracaj przez 3 godziny.
  3. Zespół pętli do badania wpływu nieprawidłowego zamknięcia pętli (przerwy)
    1. Przygotować cztery pętle (poliPVC) zgodnie z opisem w ppkt 2.2.
    2. Prawidłowo zamknij dwie pętle za pomocą taśm napinających i unikaj szczelin między końcami rurek.
    3. W przypadku pozostałych dwóch pętli należy podłączyć otwarte końce do większej rury, jak opisano w ppkt 2.2.3, ale pozostawić odstęp 1-2 mm między końcami pętli. Nie używaj taśm napinających do tych pętli (Rysunek 1D).
    4. Przygotować jedną pętlę regulacji temperatury, jak opisano w ppkt 2.2.7 i 2.2.11.
    5. Napełnij wszystkie pętle krwią, jak opisano w 2.2.10.
    6. Ustaw prędkość obrotową na 30 obr./min i obracaj przez 3 godziny.
  4. Zespół pętli do testowania stentów
    1. Przygotuj cztery pętle zgodnie z opisem w 2.2 i następnych.
      UWAGA: Aby ocenić biokompatybilność stentów we krwi, sam materiał rurki powinien zostać przetestowany pod kątem biokompatybilności, aby zapobiec maskowaniu aktywacji komórek. Jeżeli nie ma żadnych danych, sam materiał rurki można przetestować zgodnie z opisem w ppkt 2.2. Ponadto można zastosować zakres średnic w stencie (patrz instrukcje producenta) i powinien on pasować do wewnętrznej średnicy materiału rurki.
    2. Otwórz dwie pętle i wyjmij rurkę z systemu taśmy napinającej.
    3. Wprowadzić stent do środka rurki zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Użyj pozostałych dwóch pętli bez stentu jako elementu sterującego. Napełnij wszystkie pętle krwią, jak opisano w 2.2.10.
    5. Ustaw prędkość obrotową na 30 obr./min i obracaj przez 3 godziny.
  5. Regulacja temperatury
    1. W dowolnym momencie w czasie trwania i gdy obrót jest zatrzymany, temperatura krwi wewnątrz pętli jest wskazywana przez termometr wewnątrz pętli kontroli temperatury. Aby odczytać temperaturę, zatrzymaj obrót i natychmiast odczytaj temperaturę wskazywaną przez termometr.

3. Przetwarzanie próbek krwi

  1. Po obróceniu pozostaw pętle w stojaku na 2 minuty w pozycji do góry, aby krew mogła gromadzić się na dnie pętli, unikając rozlania podczas otwierania pętli.
  2. Sprawdź pozostałą krew pod kątem stanów statycznych: Jeśli ta krew jest skrzepnięta, ostatecznie podejrzewa się niewłaściwą heparynizację. W takim przypadku należy powtórzyć eksperyment najlepiej również z innym dawcą krwi.
  3. Ostrożnie wyjmij pętle z stojaka. Otwórz złącza i pozwól krwi spłynąć do szklanej zlewki o pojemności 10 ml.
  4. Zbierz krew z probówek, które są prowadzone w dwóch egzemplarzach.
  5. Pobrać świeżą krew do analizy wyjściowej od tego samego dawcy, jak opisano w ppkt 1.5 i 1.6.
  6. Pobieranie cytrynianu sodu we krwi
    1. W celu pobrania cytrynianu sodu we krwi należy napełnić cztery probówki o pojemności 1,5 ml każda, ze 111 μl roztworu cytrynianu sodu pobranego z probówek z cytrynianem sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 3,2% cytrynianu sodu.
    2. Napełnić każdą probówkę 1 ml krwi ze szklanych zlewek, jak opisano w ppkt 1.6 i 3.3.
    3. Utrzymuj krew w temperaturze pokojowej i używaj tej krwi do analiz FACS zgodnie z opisem w 12.
      UWAGA: Aby zmienić długość pętli dla różnych konfiguracji eksperymentalnych, należy odpowiednio zaplanować porcje w oparciu o ilość pomiarów, które mają zostać wykonane. Może być konieczne ustalenie wszystkich wymaganych pomiarów ze świeżą krwią przed prawdziwymi eksperymentami, aby upewnić się, że objętość krwi w pętlach jest wystarczająca do wszystkich pomiarów.
  7. Pobieranie próbek krwi i osocza kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
    1. Z każdej szklanej zlewki z krwią (patrz 1.6 i 3.3) przenieść 4,5 ml krwi do jednej probówki EDTA o pojemności 5 ml. Napełnij dwie probówki EDTA z każdej szklanej zlewki o pojemności 10 ml krwią.
    2. Delikatnie wymieszaj krew i trzymaj ją na lodzie.
    3. Przenieść 2 ml krwi do zamykanej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml i użyć tej krwi do zliczania krwinek i pomiaru wolnej hemoglobiny, jak opisano w 5. oraz 6.
    4. Odwirować pozostałą krew o stężeniu 3 500 x g przez 20 minut.
    5. Ostrożnie zebrać osocze w supernatantze w podwielokrotnościach 500 μl i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C.

4. Skaningowa mikroskopia elektronowa i obrazy μCT

  1. Po przetworzeniu próbki krwi przepłukać opróżnione pętle, przygotowane zgodnie z opisem w ppkt 2.3, po 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) każda.
  2. Ostrożnie odciąć skalpelem próbkę o długości 1 cm z każdego końca każdej probówki.
  3. Próbkę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w 2% roztworze aldehydu glutarowego.
    UWAGA: Wdychanie oparów aldehydu może powodować objawy ze strony nosa, takie jak katar, uporczywy zaduch i podrażnienie dróg oddechowych, a kontakt ze skórą powoduje zapalenie skóry. Z aldehydami należy obchodzić się w dygestorii w rękawicach, fartuchu ochronnym i okularach ochronnych.
  4. Przepłukać próbkę (3 razy) PBS.
  5. Przygotować 1% roztwór tetratlenku osmu (OsO4) w wodzie dejonizowanej i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: OsO4 jest silnym utleniaczem, można go zredukować pod wpływem światła. Aby uniknąć redukcji podczas przygotowania, należy przechowywać OsO4 w brązowej szklanej butelce. OsO4 jest niezwykle lotny, jego opary są toksyczne dla oczu, nosa i gardła. Zawsze pracuj pod wyciągiem i używaj rękawic i odzieży ochronnej, upewniając się, że żadna część ciała nie jest narażona na działanie OsO4. Skontaktuj się z wytycznymi swojej instytucji dotyczącymi postępowania z usuwaniem i magazynowaniem odpadów. Ogólnie rzecz biorąc, OsO4 można przechowywać przez kilka miesięcy, ale wymaga specjalnych szklanych butelek z wkładką teflonową i eksykatora, ponieważ OsO4 może odbarwić wewnętrzne powierzchnie i zawartość lodówki w obecności wyciekających oparów.
  6. Pobrać próbki, przenieść je do nowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i przepłukać próbki 3 razy za pomocą PBS.
  7. Przygotuj serię etanolu o różnych stężeniach (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
  8. Odwodnić próbki w etanolu: inkubować przez 20 minut każda w 25%, 50%, 75% i 90% oraz 30 minut w 100%.
  9. Weź próbki ze 100% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
  10. Badać próbki w skaningowym mikroskopie elektronowym przy napięciu przyspieszenia 5 kV i za pomocą skanera rentgenowskiego μCT.

5. Liczba krwinek

  1. Pobrać 2 ml krwi EDTA uzyskanej w sposób opisany w ppkt 3.7.3
  2. Włóż rurkę do automatycznego analizatora hematologicznego i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Pomiar wolnej hemoglobiny (fHb) w osoczu

  1. Rozmrozić jedną próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5. Po rozmrożeniu przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Zamrożone próbki osocza należy zawsze rozmrażać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i natychmiast przenieść do lodu zawierającego trochę wody, aby obniżyć temperaturę. Jest to ważne, aby uniknąć aktywacji składników krwi podczas rozmrażania.
  2. Użyj odczynnika fHb i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Unikać zanieczyszczenia po otwarciu i chronić odczynnik przed bezpośrednim światłem (słońce, promieniowanie UV).
  3. Należy użyć schematu pipetowania (patrz instrukcje producenta) z rozcieńczeniem 1:5.
  4. Dodaj 1000 μl odczynnika hemoglobiny do 1,6 ml półmikrokuwety. Użyj tej kuwety, aby określić wartość ślepej próby.
  5. Dodać 1000 μl odczynnika hemoglobiny i 250 μl próbki osocza do innej półmikrokuwety.
  6. Wymieszać zawartość w obu kuwetach, dokładnie przepłukując pipetę, wielokrotnie napełniając ją mieszaniną reakcyjną i inkubować przez co najmniej 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Oznaczyć wartość ekstynkcji (E) próbki w stosunku do odczynnika fHb jako odczynnika próby ślepej. Obliczyć stężenie fHb (mmol/l) w próbce: E540-E 680 x 0,452.

7. Pomiar FPA

  1. Rozmrozić próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5 i po rozmrożeniu przechowywać na lodzie.
  2. Użyj zestawu FPA Elisa i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

8. Pomiar sC5b9

  1. Rozmrozić próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5 i po rozmrożeniu przechowywać na lodzie.
  2. Użyj zestawu sC5b-9 ELISA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

9. Pomiar PMN

  1. Rozmrozić próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5 i po rozmrożeniu przechowywać na lodzie.
  2. Użyj zestawu PMN-Elastase ELISA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

10. Pomiar TNF

  1. Mikropłytki muszą być pokryte powłoką na jeden dzień przed testem ELISA. W celu powlekania dodać 100 μl roztworu przeciwciała wychwytującego do wszystkich studzienek, uszczelnić płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 2 °C-8 °C.
  2. Rozmrozić jedną próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5. Przechowywać na lodzie po rozmrożeniu.
  3. Użyj zestawu TNF ELISA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

11. Pomiar IL-6

  1. Mikropłytki muszą być pokryte przeciwciałami wychwytującymi na jeden dzień przed eksperymentem. W celu pokrycia powłoką dodać 100 μl roztworu przeciwciała wychwytującego do wszystkich studzienek mikropłytki dostarczonej z zestawem, uszczelnić płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C
  2. Rozmrozić próbkę osocza z każdego stanu otrzymanego w sposób opisany w ppkt 3.7.5 i po rozmrożeniu przechowywać na lodzie.
  3. Użyj zestawu IL-6 ELISA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

12. Analizy FACS

  1. Przygotuj 500 ml buforu FACS, dodając 10 ml płodu surowicy cielęcej i 2 ml roztworu EDTA (0,5 M) do 488 ml 1x PBS. Bufor FACS może być przechowywany przez 4 tygodnie w temperaturze 4°C.
  2. Użyć 100 μl cytrynianu sodu we krwi (patrz 3.6.3) do każdej procedury barwienia (agregaty płytek krwi monocytów (MPA), aktywacja płytek krwi (PA), integryny leukocytów (LI)).
  3. Pobrać pipetę 100 μl krwi z każdej próbki do probówki FACS o pojemności 5 ml. Z każdej próbki przygotuj 3 probówki do barwienia przeciwciał i oznacz panelem MPA (agregaty płytek krwi), panelem PA (agregaty płytek krwi) i panelem LI (integryna leukocytów).
  4. Wymieszaj pozostałe 4 próbki w jednej probówce FACS o pojemności 5 ml. Użyj tej mieszanki do kontroli niebarwionych i fluorescencyjnych minus jeden (FMO).
  5. Przygotować 6 probówek FACS, pipetując 100 μl zmieszanej próbki krwi do każdej probówki. Oznacz 3 probówki jako niebarwione i 3 probówki jako FMO-CD41, FMO-CD62P i FMO-CD162.
  6. Dodać 100 μl 4% roztworu paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny dla skóry i oczu. Może powodować poważne podrażnienie płuc w następstwie wdychania i może prowadzić do uszkodzenia płuc po długotrwałym narażeniu. Ponadto jest klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy i toksyna reprodukcyjna. Zawsze noś rękawice i okulary ochronne oraz pracuj pod wyciągiem.
  7. Dodać 1 ml buforu do przemywania do każdej probówki i odwirowywać przy 287 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i powtórzyć etap płukania dwa razy.
  8. W przypadku lizy krwinek czerwonych (RBC) dodać 1 ml 1x buforu buforowego do lizy RBC (rozcieńczyć 10x bufor do lizy RBC w wodzie dejonizowanej), wymieszać powoli pipetując w górę iw dół i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Przygotuj koraliki kompensacyjne na pojedyncze plamy. Do 1 ml buforu FACS dodaj 4 krople każdego dodatniego i ujemnego koralika. Dokładnie przemieszać i dodać 100 μl roztworu kulek do jednej probówki FACS o pojemności 5 ml.
  10. Przygotuj 4 probówki z koralikami i oznacz jako CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC i CD62P-PE. Dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki i odwirować przy 287 x g przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad i przechowywać na lodzie.
  11. Po lizie RBC dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki i przemyć zgodnie z opisem w 12.7. Odrzucić supernatant.
  12. Przygotuj koktajle przeciwciał:
    1. Panel MPA: Dodaj 4 μl CD45-APC, 4 μl CD14-FITC i 4 μl CD41-BV421 do 388 μl buforu FACS.
    2. Panel PA: Dodaj 1,6 μl CD41-BV421 i 12 μl CD62P-PE do 386,4 μl buforu FACS.
    3. Panel LI: Dodaj 4 μl CD45-APC i 8 μl CD162-BV421 do 388 μl buforu FACS. Trzymaj na lodzie.
  13. Przygotuj pojedyncze barwienia: Dodaj po 0,5 μl do 499,5 μl buforu FACS dla CD14-FITC, CD41-BV421 i CD45-APC. W przypadku CD62P-PE dodać 0,3 μl do 499,7 μl buforu FACS. Trzymaj na lodzie.
  14. Przygotuj kontrole FMO: (i) panel MPA (FMO-CD41): Dodaj 1 μl przeciwciała CD14-FITC i 1 μl przeciwciała CD45-APC do 98 μl buforu FACS. (ii) Panel PA (FMO-CD62P): Dodaj 0,4 μl CD41-BV421 do 99,6 μl buforu FACS. (iii) Panel LI (FMO-CD162): Dodaj 1 μl CD45-APC do 99 μl buforu FACS. Trzymaj kontrolki FMO na lodzie.
  15. Zmieszać koktajle przeciwciał i dodać 100 μl każdego koktajlu przeciwciał przygotowanych w 12.12 do każdej z odpowiednich oznakowanych probówek (panel MPA, PA i Li) zgodnie z opisem w 12.3 i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Trzymaj RT w ciemności.
  16. Odwirować rozcieńczenia przeciwciał z pojedynczym barwnikiem i dodać 100 μl rozcieńczeń przeciwciał z pojedynczym barwnikiem, przygotowanych w 12.13, do każdej z odpowiednich oznakowanych probówek z kulkami, jak opisano w 12.7 i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Trzymaj RT w ciemności.
  17. Spłukać koktajle przeciwciał FMO i dodać 100 μl każdego koktajlu przeciwciał FMO-1, przygotowanych w 12.14, do każdej z odpowiednich oznakowanych probówek (kontrole FMO), jak opisano w 12.5, i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Trzymaj się RT w ciemności.
  18. Inkubować wszystkie probówki z barwieniem przeciwciałami przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  19. Pobrać trzy probówki do niezabarwionej kontroli (patrz 12.4) i ponownie zawiesić osad w 250 μl buforu FACS. Trzymaj na lodzie.
  20. Po czasie inkubacji przemyć wszystkie probówki, z wyjątkiem niebarwionych kontroli, jednorazowo buforem FACS, jak opisano w ppkt 12.7. Zawiesić osad w 250 μl buforu FACS i uzyskać dane z cytometru przepływowego.
  21. Użyj niebarwionych komórek dla ustawień ujemnych i koralików myszy kompensacyjnych dla ustawień dodatnich w oprogramowaniu FACS. Ponadto użyj FMO do sterowania strategią bramkowania, gdzie FMO-CD41 jest używany w panelu MPA, FMO-CD62P jest używany w panelu PA, a FMO-CD162 jest używany w panelu Li.
  22. Zdobądź prawie 0,5 x 106 - 0,25 x 106 zdarzeń na probówkę dla FACS. Zapisuj dane i analizuj je za pomocą oprogramowania analitycznego (wersja 9.9.6).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prezentowane dane, z wyjątkiem wykresów FACS, zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego. Wykresy FACS analizowano za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

Analiza liczby krwinek pełnych nie wykazała żadnych istotnych różnic w odniesieniu do erytrocytów między wszystkimi badanymi warunkami (Rysunek 2). Jednak liczba płytek krwi i leukocytów została drastycznie zmniejszona w grupie lateksu, co wskazuje na bardzo słabą biokompatybilność lateksu. Jest to dodatkowo podkreślone przez zwiększony poziom wolnej hemoglobiny w grupie lateksowej, co wskazuje na fakt, że z wyjątkiem grupy lateksowej, żadne z innych urządzeń lub stanów naczyniowych nie doprowadziło do rozległej hemolizy (Rysunek 2). Ponadto powlekane rurki PVC, poliPVC i hepPVC, a także badany stent nie prowadziły do zakrzepicy poprzez utratę płytek krwi i leukocytów, podczas gdy lateks wykazywał największą utratę płytek krwi i leukocytów, a następnie niepowlekane rurki PVC, które wykazywały tendencję spadkową.

Podczas gdy wszystkie testowane urządzenia naczyniowe doprowadziły do zwiększonej aktywacji układu krzepnięcia (FPA) i składnika dopełniacza (sC5b-9), pętle hepPVC wykazywały tendencję do obniżania poziomów FPA i sC5b-9 w porównaniu do pętli z poliPVC (Rysunek 3). Co ciekawe, niepowlekane pętle PVC i Gap wykazywały niższe poziomy FPA w porównaniu z poliPVC, choć nie osiągnęły poziomu istotności statystycznej. Niemniej jednak pętle lateksowe wykazywały znacznie wyższe poziomy FPA w porównaniu z warunkami wyjściowymi i statycznymi.

Zgodnie z morfologią krwinek pełnych, pętle lateksowe wykazywały najwyższe poziomy elastazy TNF, IL-6 i PMN (Rysunek 4), osiągając poziom istotności statystycznej w porównaniu z resztą grup pod względem TNF i IL-6 (Rysunek 4A,B), podczas gdy do warunków statycznych i wyjściowych pod względem elastazy PMN (Rysunek 4C). Wyniki te wskazują na silną aktywację leukocytów przez lateks. Wyjściowe poziomy markerów aktywacji były zawsze porównywalne z warunkami statycznymi, co wskazuje na prawidłową heparynizację krwi.

Interesujące, wykazano, że liczba płytek krwi i leukocytów w pętlach wywołanych luką była tylko nieznacznie zmniejszona przy umiarkowanej aktywacji układu krzepnięcia (FPA) i leukocytów (elastazy PMN), chociaż niewłaściwe zamknięcie pętli z wynikającymi z tego turbulencjami przepływu i kontaktem krwi z niepokrytą, szorstką powierzchnią cięcia doprowadziło do makroskopowo widocznych skrzepów na spawie (Rysunek 1F). Skrzepy i ich rozkład na całej powierzchni spawu były widoczne na obrazach μCT i SEM, podczas gdy nie znaleziono skrzepu, gdy pętle zostały zamknięte zewnętrznym urządzeniem zamykającym, nie pozostawiając przerwy między końcami pętli (Rysunek 5).

Analiza cytometryczna przepływu komórek krwi gospodarza, które zostały zabarwione markerami specyficznymi dla płytek krwi, CD41 i markerem aktywacji płytek krwi CD62P, są pokazane w Rysunek 6A,B. W tym przypadku rurki lateksowe wykazywały niezwykle wysoką medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla CD62P na płytkach krwi, a następnie stentu, podczas gdy rurki z poliPVC powlekane heparyną wykazywały minimalną aktywację płytek krwi, co wskazuje na właściwości przeciwzakrzepowe rurek z poliPVC. Ponadto leukocyty sklasyfikowano na podstawie ziarnistości opartej na CD45 i SSC (rozproszenie boczne) na (i) granulocyty; (ii) monocyty i (iii) limfocyty (Ryc. 7), a ekspresję integryny CD162 + wykryto w każdej subpopulacji leukocytów, o których wiadomo, że wchodzą w interakcje z CD62P na płytkach krwi24. Zauważono, że ekspresja integryn została drastycznie zmniejszona na granulocytach i limfocytach w pętlach lateksowych. Wynik ten był zgodny z obniżonymi poziomami całkowitych częstości leukocytów w pętlach lateksowych (Rysunek 2). Ogólnie rzecz biorąc, poziomy integryny były wyższe wśród monocytów w porównaniu z granulocytami i limfocytami, co wskazuje na prawdopodobieństwo interakcji monocytów z aktywowanymi płytkami krwi. W związku z tym agregaty płytek krwi monocytów oceniano również poprzez barwienie komórek krwi za pomocą CD14 (jako marker monocytów) i CD41 (jako marker płytek krwi) i ostatecznie w celu identyfikacji komórek podwójnie dodatnich, tj. CD14 + CD41 + MPA (Figura 8). Tutaj zauważyliśmy, że grupa ze stentem wykazywała najwyższy poziom ekspresji CD41 na MPA, a następnie grupa lateksowa, co wskazuje na zwiększoną tendencję do tworzenia MPA, pomimo zmniejszonej częstości monocytów (<1%) w pętlach lateksowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd modelu pętli hemodynamicznej in vitro i jego modyfikacji. (A) Pętla do eksperymentu z przerwą z zewnętrznym systemem zamykania pętli, bez przerwy na spawie. (B) Pętla wykonana z rurki PVC pokrytej poliPVC i stentu wewnątrz (strzałka). (C) Pętla wykonana z rurki lateksowej. (D) Pętla do eksperymentu ze szczeliną bez zewnętrznego systemu zamykania pętli pozostawiającego przerwę między końcami rurki (strzałka). (E) Pętle umieszczone w kołysce pętli we wnętrzu łaźni wodnej i wypełnione krwią. (F) Skrzeplina powodująca przerwę w spawie (strzałka) po obróceniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Wyniki dla liczby krwinek i hemoglobiny w osoczu. (A) Liczba erytrocytów. (B) Liczba płytek krwi. (F) Liczba leukocytów. (D) Wolna hemoglobina osocza. Wyniki wskazują na słabą biokompatybilność lateksu, prowadzącą do nadmiernej hemolizy. Dane prezentowane są jako wartość średnia; słupki błędów wskazują SEM. n=1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki aktywacji układu krzepnięcia i dopełniacza. (A) Aktywacja układu krzepnięcia, mierzona poziomami fibrynopeptydu A (FPA) (B) Aktywacja układu dopełniacza, mierzona poziomami sC5b-9. Podczas gdy rurki lateksowe wywoływały znacznie podwyższone poziomy FPA, aktywacja dopełniacza była silna we wszystkich badanych materiałach. Dane prezentowane są jako wartość średnia, słupki błędów wskazują SEM. *p<0,05, n=1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Markery aktywacji leukocytów. (A) Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF). b) Interleukina 6 (IL-6) (C) Elastaza PMN. Wyniki wskazują na zwiększoną aktywację leukocytów z powodu podwyższonego poziomu analizowanych markerów, a następnie pętli stentowych, co doprowadziło tylko do zwiększenia poziomu elastazy PMN, ale nie TNF lub IL-6. Dane prezentowane są jako wartość średnia, słupki błędów wskazują SEM. *p<0,5; **p<0,01, n=1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obrazowanie splotu pętli. (A) μ-tomografia komputerowa (μCT) pętli z nieprawidłowym zamknięciem (przerwą). Czerwone obszary wskazują materiał skrzepliny. (B) Renderowanie strony luminalnej tubusu. Prostokątne zaznaczenie wskazuje obszar skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (C). (D) μCT pętli z zewnętrznym urządzeniem zamykającym pętlę i bez przerwy na spawie, oraz (E) renderowanie i widok powierzchni światła. Nie znaleziono materiału skrzepliny. (F) Obraz SEM prostokątnego zaznaczenia w (E). Na powierzchni cięcia nie znaleziono materiału skrzeplinowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Wykres FACS dla aktywacji płytek krwi (CD62P). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunek podstawowy) przedstawiający płytki krwi CD41+. (B) Wykres przedstawiający stan aktywacji płytek krwi odzwierciedlony przez średnią intensywność fluorescencji (MFI) różnych typów urządzeń naczyniowych w porównaniu ze statycznym RT i warunkami wyjściowymi. Paski danych prezentują dane z pojedynczych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Wykres FACS dla integryny leukocytów (CD162). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunek podstawowy) przedstawiający leukocyty CD45 + we krwi i podgrupy (B) Wykres przedstawiający średnią intensywność fluorescencji (MFI) integryny CD162 + leukocytów różnych typów urządzeń naczyniowych w porównaniu z warunkami statycznymi i wyjściowymi. Paski danych prezentują dane z pojedynczych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Wykres FACS dla agregatów monocytów płytek krwi (CD41/CD14). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunek podstawowy) przedstawiający bramkowanie dla monocytów krwi (CD45+/CD14+), płytek krwi (CD41+) i agregatów płytek krwi monocytów (CD41+/CD14+) (B) Wykres przedstawiający CD41+ średnia intensywność fluorescencji (MFI) na agregatach płytek krwi monocytów dla różnych urządzeń naczyniowych w porównaniu z warunkami statycznymi i wyjściowymi. Paski danych prezentują dane z pojedynczych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wykazało, że przedstawiony model pętli hemodynamicznej in vitro oferuje wiarygodną metodę badania kompatybilności wyrobów medycznych z krwią in vitro zgodnie z normą ISO 10993-4.

Krytyczne kroki w protokole obejmują pobranie krwi i napełnienie probówek krwią, przy czym należy unikać nadmiernego podciśnienia lub mieszania, aby zapobiec aktywacji składników krwi przez procedurę obchodzenia się z nimi. Ponadto bardzo ważne jest, aby natychmiast zamrozić próbki osocza i przechowywać je na lodzie po rozmrożeniu, ponieważ aktywacja dopełniacza i układu krzepnięcia może zostać zakłócona poprzez utrzymywanie próbek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas.

Ponieważ model ten ma zarówno zalety, jak i wady w porównaniu z innymi modelami in vitro, podczas projektowania eksperymentów należy wziąć pod uwagę kilka czynników.

Po pierwsze, pętle mogą być różnie dopasowane do różnych konfiguracji eksperymentalnych. W przypadku, gdy konfiguracja obejmuje kontrastujące rurki o różnych średnicach wewnętrznych, należy pamiętać, że różnice w średnicy spowodują różne siły ścinające, wpływając w ten sposób na krzepnięcie i kaskadę dopełniacza7. Po drugie, w tym eksperymencie prędkość obrotowa została ustawiona na 30 obr./min. Spowoduje to przepływ krwi o prędkości około 25 cm/s, co jest porównywalne z prędkością przepływu krwi w ludzkich pomostowaniach aortalno-wieńcowych25. Szybkość odkształcania, generowana przez rotację pętli, jest głównym parametrem, który zainicjuje biochemiczne kaskady składników krwi, w tym komórek i białek bezkomórkowych. Ale ponieważ krew jest płynem nienewtonowskim, na szybkość odkształcania będzie miała również wpływ krzywizna rurki, odpowiednio długość rurek, które są zamknięte w pętlach10. Za każdym razem, gdy zmienia się prędkość obrotowa lub rozmiar pętli, należy wziąć pod uwagę, że korelacja między szybkością odkształcania a prędkością obrotową nie jest liniowa. Korelacja między prędkością obrotową a szybkością odkształcania nie jest do dziś wystarczająco zbadana i konieczne są dalsze badania w celu zbadania tych konkretnych parametrów 10,26,27. Jednak w oparciu o model laminarnej warstwy granicznej, przy danej średnicy rurki 5 mm i prędkości obrotowej 25 cm/s, przybliżone oszacowanie naprężenia ścinającego ścianki (WSS) wskazywałoby wartości między 2,20-22,00 paskali dla odległości 1,00-0,01 mm do ścianki rurki, gdy gęstość krwi szacuje się na 1060 kg*m-3, a lepkość kinetyczną ustawiono na 0,0025 paskal*s28, Lokal mieszkalny 29. Co ciekawe, również bardziej szczegółowa analiza obliczeniowa dynamiki przepływu w krzywiźnie ludzkich tętnic wieńcowych wykazała wartości WSS w zakresie od 11,33 do 16,77 paskala przy mniej więcej porównywalnych parametrach prędkości, gęstości i lepkości krwi30.

Poza tym ograniczeniem, prezentowany model pętli jest systemem bezciśnieniowym, który nie naśladuje wewnątrznaczyniowych stosunków ciśnienia krwi w ludzkim układzie naczyniowym.

Kolejnym ważnym ograniczeniem jest to, że krew ma kontakt z powietrzem wewnątrz pętli, co powoduje dodatkowe zakłócenia. Na taki kontakt krew-powietrze mają wpływ dwa parametry, do których należą przepuszczalność gazów w rurkach oraz zatrzymywanie powietrza wewnątrz pętli podczas napełniania ich krwią. Każdy materiał rury ma pewną przepuszczalność gazów, która może prowadzić do znacznych zmian stężeń gazów wewnątrz rur. Podczas gdy niektórzy autorzy twierdzą, że wynikowy wpływ przepuszczalności gazów na aktywację składników krwi pozostaje niejasny31, wiadomo, że funkcja koagulatorów krwi jest bardzo wrażliwa na zmianę pH, która może być spowodowana dyfuzją CO2 32,33,34. W tym miejscu przetestowaliśmy biokompatybilność rurek perfuzyjnych krwi w warunkach powietrza w pomieszczeniach, porównywalną ze scenariuszami klinicznymi pozaustrojowej perfuzji krwi. W celu przyszłych ulepszeń prezentowanego modelu, inkubacja całego modelu w inkubatorze CO2 i przeprowadzenie walidacji pH krwi przed i po inkubacji może być przydatne w celu dalszej standaryzacji tego modelu.

Ponadto interfejs krew-powietrze wewnątrz pętli może prowadzić do aktywacji białek osocza i frakcji komórkowych krwi35,36. Urządzenia napędzane pompą rolkową bez powietrza wewnątrz rurek mogą uniknąć problemu granicy faz krew-powietrze, ale z pewnością wywołują uszkodzenia komórek krwi ze znacznie podwyższonym poziomem hemoglobiny w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem pętlowym, a hemoglobina w osoczu może zakłócać czułość badanych analitów w teście ELISA16. W tym badaniu wykazaliśmy, że efekt hemolityczny samego modelu pętli pozostaje minimalny przy użyciu materiałów biokompatybilnych, takich jak rurki PVC powlekane heparyną. W ten sposób model z jednej strony nie powoduje nadmiernego uszkodzenia komórek w porównaniu z modelami napędzanymi pompą, ale z drugiej strony indukuje białka osocza w wyniku kontaktu krwi z powietrzem. Warto zauważyć, że van Oeveren i in. opracowali model pętli oparty na zaworze kulowym, unikający powietrza wewnątrz pętli16. Ta obiecująca alternatywa dla przedstawionego tutaj modelu pętli może przezwyciężyć problem granicy faz krew-powietrze, jednak w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem, adhezja płytek krwi jest nadal wyższa w przypadku modelu pętli opartej na zaworze kulowym.

Jeśli chodzi o kontrolę statyczną, należy zauważyć, że wykazano, iż szkło samo w sobie jest silnym aktywatorem układu krzepnięcia37. Jednak w prezentowanym układzie inkubacja w szklanej zlewce (kontrola statyczna) nie doprowadziła do nadmiernej aktywacji komórek gospodarza lub aktywacji układu krzepnięcia w porównaniu z poziomami wyjściowymi bezpośrednio po pobraniu krwi. Podsumowując, pomocne może być użycie na przykład rurek polipropylenowych, jeśli kontrola statyczna wykazuje wysoki poziom aktywacji.

Niezależnie od tego, czy jest to model oparty na pętli, czy napędzany pompą, te modele in vitro całkowicie pozbawione są autentycznych interakcji biologicznych, do których przyczynia się głównie nienaruszony śródbłonek, który jest idealną powierzchnią stykającą się z krwią. Uzasadnienie tego problemu jest bardziej oczywiste, gdy testowany jest wyrób medyczny, taki jak stent, który może dawać różne wyniki, pod względem aktywacji i białek osocza, podczas interakcji ze składnikami krwi w obecności śródbłonka. Okazuje się, że jest to główna wada wszystkich omawianych systemów in vitro naśladujących układ krążenia. Stąd, aby przezwyciężyć ten problem, nowe systemy mikroprzepływowe, które są całkowicie pokryte śródbłonkiem, zyskują ogromne zainteresowanie, niemniej jednak w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem pętlowym, nadal są ograniczone, aby pomieścić mniejsze objętości krwi i minimalne natężenia przepływu38,39

W związku z tym dochodzimy do wniosku, że model pętli Chandlera pozostaje solidnym modelem do przeprowadzania standaryzowanych testów biokompatybilności naczyniowych wyrobów medycznych we krwi w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundator [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Niemcy] udzielił autorowi tego manuskryptu [Maxowi Wackerowi] wsparcia finansowego w postaci materiałów eksploatacyjnych i opłat za publikację. Fundatorzy nie odgrywali żadnej dodatkowej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Pani Elenie Denks za jej pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 5 ml, K3 EDTASarstedt32332
Anti-Mouse Ig, κ/Zestaw cząstek kompensacji kontroli negatywnejBecton Dickinson BioSciences552843
APC anty-ludzkie przeciwciało CD45BioLegend368512
Analizator komórek BD LSR Fortessa IIBecton Dickinson647465
BD Vacutainer Probówki cytrynianoweJednorazowy uchwyt Becton Dickinson369714
BD Vacutainer Safety-Lok kaniula motylkowa 21 GBecton Dickinson367282
Szklanka do zlewki ROTILABO krótka 10 mlCarl Roth GmbH + Co. KGX686.1
Szklanka do zlewki ROTILABO krótka 50 mlCarl Roth GmbH + Co. KGX688.1
Fiolet brylantowy 421 przeciwciało anty-ludzkie CD162BioLegend328808
Brilliant Violet 421 przeciwciało antyludzkie CD41BioLegend303730
Wirówka ROTINA 420 | 420 RHettich Zentrifugen4701 | 4706
Probówki wirówkowe, 50 mlGreiner Bio-One GmbH227261
CHC Super modyfikowany, rurka PVC 5 mmCorline Szwecja1807-148Określany jako rura hepPVC
Okrągły precyzyjny nóżebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 007-20
Jednostka zamykająca (w komplecie z taśmami napinającymi)ebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 008-20
Taśma elektryczna Scotch Super 33+VWRMMMA331933
ELISA MAX Deluxe Set Człowiek IL-6BioLegend430504
Zestaw ELISA MAX Deluxe Human TNF-aBioLegend430204
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µ L, szaryEppendorf AG3123000012
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µ L, szaryEppendorf AG3123000020
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 10 – 100 µ L, żółtyEppendorf AG3123000047
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 100 – 1 000 µ L, niebieskiEppendorf AG3123000063
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 20 – 200 µ L, żółtyEppendorf AG3123000055
Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z workiem na próbki epT.I.P.S., 0,5 – 5 mL, fioletowyEppendorf AG3123000071
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowegoSigma-Aldrich03690-100ML
Probówki FACS polistyren 5,0 ml okrągłe dnoCorning BV352052
Bydło płodowe surowica Gold PlusBio-SellFBS. GP.0500
FITC przeciwciało anty-ludzkie CD14BioLegend367116
Fluency plus stent 13,5 x 60 mmAngiomed GmbH & CoFVM14060
Free Hemoglobina fHb OdczynnikBioanalytics GmbH004001-0250
Tabletki Gibco PBS Rękawice18912014Thermo Fisher Scientific
Rękawice Vasco Nitril białe LB. Braun Deutschland GmbH & Co.KG9208437
Rękawice Vasco Nitril białe MB. Braun Deutschland GmbH & Co.KG9208429
Aldehyd glutarowy 25% roztwór ekwiwalentnySigma AldrichG6257-100ML
Heparyna, 25.000 IE w 5 mlRotexmedica, Trittau, NiemcyPZN 3862340
Zestaw ELISA dla ludzkiego fibrynopeptydu A (FPA)Hö lzel Diagnostikaabx253234
Kodan nalewka forte bezbarwnySchü lke & Mayr GmbH104012
Rurka lateksowa, ID 5 mmLaborhandel24 GmbH305 0507
Stojak napętlę ebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 009-20
Opaska uciskowa żylna Medimex klasycznaROESER Medical GmbH310005
Czytnik mikropłytek Infinite 200 Pro M PlexTecanTEC006418I
Wytrząsarka do mikropłytek PMS-1000iVWR444-0041
Nalgene Metryczne rurki PVC bez ftalanów, średnica wewnętrzna 5 mmVWRNALG8703-0508Określane jako rura PVC
Jednorazowy termometr kliniczny NexTemp (standard)Wskaźniki medyczne2112-20
Płytki ELISA Nunc MaxiSorp, niepowlekaneBioLegend423501
Roztwór tetratlenku osmuFisher Scientific
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBSThermo Fisher ScientificAAJ19943K2
PE anty-ludzki CD16PrzeciwciałoBioLegend302008
PE anty-ludzkie przeciwciało CD62P (P-Selectin)BioLegend304906
Kontroler pipet, pipetaVWR612-1874
Końcówki do pipet epT.I.P.S. 0,2 - 5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5186480
Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&mikro; lTh. Geyer GmbH & Co. KG9409410
Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 2 - 200µ lTh. Geyer GmbH & Co. KG0030 000.870
Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 50 - 1000µ l niebieskiTh. Geyer GmbH & Co. KG0030 000.919
PMN (neutrofile) Elastaza ludzka Zestaw ELISAFisher ScientificBMS269
Statyw sondy ROTILABO combiCARL ROTHK082.1
Stojak na jednostkę obrotową (12 gniazd 3/8 '' o zmiennej szerokości szczeliny)ebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 011-20
Bufor do lizy RBC (10X)Zbiorniki420301
VWR613-1184
Jednostka rotacyjnaebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 010-20
Mikroprobówki Safe-Lock 0,5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5409320
Mikroprobówki Safe-Lock 1,5 mlOMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG5409331
sc5b9 Ludzki zestaw ELISATECOmedicalGroupA029
Skalpel nr 10Fisher ScientificNC9999403
Skaningowy mikroskop elektronowy XL30 ESEM-FEGPhilipsn.a.Butelka
z zakrętką ROTILABO Szkło bezbarwne, 1000 ml, GL 45Carl Roth GmbH + Co. KGX715.1
Butelka zakręcana ROTILABO Szkło bezbarwne, 500 ml, GL 45Carl Roth GmbH + Co. KGX714.1
Kuweta półmikro 1,6 mlSarstedt67.746
Pipeta serologiczna 10,0 mlCorning BV4488
Pipeta serologiczna, 25,0 mlCorning BV4489
Pipeta serologiczna, 5,0 mlCorning BV4487
Rurka silikonowa, średnica wewnętrzna 8 mm, średnica zewnętrzna 12 mmVWRBURK8803-0812
Mini wirówka do kiełkówBiozym552034
Stop Roztwór do podłoża TMBBioLegend77316
Waciki, sterylneFuhrmann GmbH32055
Strzykawka, 10 mlBecton Dickinson300296
Umywalka na wodę z kontrolowaną temperaturąebo kunze industriedesign, Neuffen, NiemcyCLS 020-20
tert-butanol, 99,5%, ekstra czysty, ACROS OrganicsFisher Scientific 10000730
Zestaw podłoży TMB
Trillium, 5 mm IDMedtronic161100107100103Określany jako rura z poliPVC
Tween 20AppliChemA4974,0250
UV-Vis Spektrometer Lambda 2Perkin Elmer33539
Vornado Mini VortexerBiozym55BV101-B-E
XN-3000 stacja robocza analizator krwiSysmex Europen.a.
μ-CT Phoenix Nanotom SGE Sensing & Inspekcja, Wunstorf, Niemcyn.d.
BD Vacutainer Becton Dickinson 364815 do 10256970 na odczynniki BioLegend Rurka PVC BioLegend 421101

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
  2. Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
  3. Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
  4. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  5. Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
  6. Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
  7. Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
  8. Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
  9. Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
  10. Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
  11. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).
  12. Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
  13. Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355(2017).
  14. Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
  15. Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610(2020).
  16. van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163(2012).
  17. Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
  18. Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
  19. Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
  20. Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
  21. Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
  22. Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
  23. Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
  24. Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
  25. Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
  26. Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
  27. Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
  28. Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
  29. Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
  30. Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
  31. Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
  32. Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
  33. Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
  34. Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
  35. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
  36. Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
  37. Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
  38. Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18(2019).
  39. Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badanie hemokompatybilno cianaliza cytometrycznaskaningowa mikroskopia elektronowamikrotomografia komputerowaaktywacja p ytek krwiintegralno leukocyt wuk ad dope niaczakaskada krzepni cia

Powiązane artykuły