Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja krążącego DNA specyficznego dla świni we krwi w modelu ksenotransplantacji

DOI:

10.3791/61579

⸱

22 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole zaprojektowano startery specyficzne dla świń, skonstruowano fragmenty DNA specyficzne dla świń zawierające plazmidy i ustalono standardowe krzywe do oznaczania ilościowego. Korzystając ze starterów specyficznych dla gatunku, cpsDNA określono ilościowo za pomocą qPCR w modelach przeszczepu komórek od świni do myszy oraz w modelach przeszczepu plam tętniczych od świni do małpy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ksenotransplantacja jest możliwą metodą leczenia niewydolności narządów. Jednak to, jak skutecznie monitorować odrzucenie immunologiczne ksenotransplantacji, stanowi problem dla lekarzy i badaczy. W tym artykule opisano prostą i skuteczną metodę monitorowania odrzucenia immunologicznego w modelach przeszczepu komórek świnia-mysz oraz modelach przeszczepu plamy tętniczej świnia-małpa. Krążące DNA jest potencjalnie nieinwazyjnym biomarkerem uszkodzenia narządów. W tym badaniu krążące DNA specyficzne dla świni (cpsDNA) monitorowano podczas odrzucania ksenoprzeszczepu za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). W tym protokole zaprojektowano startery specyficzne dla świń, skonstruowano fragmenty DNA specyficzne dla świń zawierające plazmidy i ustalono standardowe krzywe do oznaczania ilościowego. Specyficzne dla gatunku startery wykorzystano następnie do ilościowego określenia cpsDNA metodą qPCR w modelach przeszczepu komórek od świni do myszy oraz w modelach przeszczepu plam tętniczych od świni do małpy. Wartość tej metody sugeruje, że może być ona stosowana jako prosta, wygodna, tania i mniej inwazyjna metoda monitorowania odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewydolność narządów jest jedną z głównych przyczyn śmierci1. Przeszczepianie komórek, tkanek i narządów jest skutecznym sposobem leczenia niewydolności narządów2. Niemniej jednak niedobór narządów dawców ogranicza kliniczne zastosowanie tej metody3,4. Badania wykazały, że świnie mogą być wykorzystywane jako potencjalne źródło ludzkich narządów do przeszczepów klinicznych5,6. Jednak przeszczepy narządów między gatunkami spotykają się z niebezpiecznym odrzuceniem immunologicznym. Dlatego tak ważne jest monitorowanie odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji. Obecnie kliniczne monitorowanie odrzucenia układu immunologicznego zależy głównie od objawów przedmiotowych i podmiotowych pacjenta, a także od badań laboratoryjnych (np. biopsji, analizy immunobiochemicznej i ultradźwięków)7,8,9. Jednak te metody monitorowania mają wiele wad. Oznaki i objawy odrzucenia immunologicznego u pacjentów zwykle pojawiają się późno10, co nie sprzyja wczesnemu wykryciu i wczesnej interwencji; Biopsja ma tę wadę, że jest inwazyjna11, co nie jest łatwe do zaakceptowania przez pacjentów; Analiza immunobiochemiczna nie jest czuła ani specyficzna, a ultradźwięki są pomocnicze i drogie. Dlatego pilne jest znalezienie skutecznej i wygodnej metody monitorowania odrzucenia immunologicznego.

Krążące DNA to zewnątrzkomórkowy typ DNA występujący we krwi. Mandel i Metais12 po raz pierwszy poinformowali o obecności krążącego DNA we krwi obwodowej w 1948 roku. W normalnych warunkach fizjologicznych krążące DNA we krwi zdrowych osób jest stosunkowo niskie na początku badania. Jednak w niektórych patologiach, takich jak nowotwory, zawał mięśnia sercowego, choroby autoimmunologiczne i odrzucenie przeszczepu, poziom krążącego DNA we krwi może być znacznie zwiększony13,14 z powodu masowego uwalniania krążącego DNA spowodowanego apoptozą i martwicą. Pochodzenie krążącego DNA jest związane z apoptozą i martwicą15, które są charakterystyczne dla odrzucania ksenoprzeszczepu16.

Udowodniono, że krążące DNA jest minimalnie inwazyjnym biomarkerem do wykrywania nowotworów17,18,19. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie krążącego DNA pochodzącego od dawcy jest niezawodne w wykrywaniu odrzucenia po przeszczepieniu narządu20,21. Metoda ta wymaga jednak wysokiego stężenia i jakości wyekstrahowanego DNA. Wymagania dotyczące DNA, a także wysokie koszty i czasochłonność sprawiają, że metoda ta nie kwalifikuje się do rutynowego stosowania klinicznego. Krążące DNA pochodzące od dawcy można precyzyjnie określić ilościowo za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), który jest zarówno specyficzny, jak i wrażliwy. W związku z tym ilościowe określenie krążącego DNA świń za pomocą qPCR jest wykonalną metodą monitorowania odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji. Jest to mniej inwazyjne, bardzo czułe i specyficzne, tanie i oszczędzające czas. Świnie i ludzie są genetycznie oddzieleni z dość różnymi sekwencjami genomowymi (Rysunek 1). W związku z tym krążące DNA świni może zostać uwolnione do krwi biorcy po ksenotransplantacji z powodu odrzucenia ksenoprzeszczepu. CpsDNA można precyzyjnie określić ilościowo za pomocą qPCR z specyficznymi dla gatunku starterami we krwi biorcy. Wcześniej wykazaliśmy zasadność i wykonalność cpsDNA jako biomarkera dla ksenotransplantacji22,23. Tutaj ujawniamy więcej eksperymentalnych wskazówek i szczegółów. Eksperyment składa się z następujących kroków. Po pierwsze, zaprojektowano startery specyficzne dla świń i wyizolowano genomowe DNA, które wykorzystano do weryfikacji specyficzności starterów za pomocą zwykłego PCR. Po drugie, skonstruowanie krzywej wzorcowej cpsDNA i wyizolowanie cpsDNA z próbki krwi. Na koniec krążące DNA specyficzne dla świni oznaczono ilościowo za pomocą qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen, Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu w Shenzhen.

1. Zaprojektuj podkłady specyficzne dla świń

  1. Wykonaj analizę całego genomu BLAST w celu zidentyfikowania genów specyficznych dla świń, które różniły się od genów u ludzi, małp lub myszy, za pomocą oprogramowania NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Zaprojektuj startery zgodnie z 19 genami specyficznymi dla świń (Tabela 1) przy użyciu oprogramowania Primer 5.

2. Izolowanie genomowego DNA

UWAGA: Genomowe DNA (w tym krew świń, małp, ochotników, małp z przeszczepami świń i myszy z komórkami świni) zostało wyekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA (Tabela materiałów).

  1. Umieścić 500 μl krwi pełnej z powyższych próbek odpowiednio w różnych probówkach do mikrowirówek.
  2. Dodać 20 μl proteazy K i 500 μl buforu do lizy do powyższych probówek do mikrowirówek, a następnie dokładnie wstrząsnąć i wymieszać.
  3. Umieść te probówki do mikrowirówek w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 10 minut i wstrząsaj 2-3 razy podczas tego procesu, aż roztwór stanie się klarowny.
  4. Odwirować na krótko, aby usunąć kulki płynu z wewnętrznej ścianki pokryw probówek. Dodać 500 μl bezwodnego alkoholu etylowego i dokładnie wstrząsnąć.
  5. Przenieść mieszaninę do kolumny adsorpcyjnej, odwirować z prędkością 12 000 obr./min (~13 400 x g) przez 2 min.
  6. Dodać 800 μl roztworu płuczącego do każdej kolumny adsorpcyjnej; wirować przez 1 minutę przy 12 000 obr./min (~13 400 x g). Umieść kolumny w temperaturze pokojowej na kilka minut, aby wysuszyć pozostały roztwór do płukania.
    UWAGA: Roztwór do płukania jest dostarczany przez producenta.
  7. Przenieść kolumny adsorpcyjne do innej czystej rurki odśrodkowej, dodać 50 μl buforu elucyjnego do środka folii adsorpcyjnych i umieścić je w temperaturze pokojowej na 2-5 minut. Odwirować 6 200 x g przez 1 min 12 000 obr./min (~13 400 x g).
    UWAGA: Bufor elucyjny jest dostarczany przez producenta, ale bufor TE, zawierający 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 0,1 mM EDTA, może również eluować DNA.
  8. Przechowywać roztwór DNA w temperaturze -20 °C.

3. Sprawdź specyfikę starterów

UWAGA: Specyficzność gatunkowa powyższych 19 starterów została potwierdzona przez PCR, który został przeprowadzony przy użyciu polimerazy (Tabela materiałów) i starterów przedstawionych w Tabeli 1.

  1. Przygotować wstępnie zmieszany roztwór składający się z 12,5 μl 2x premiksu PCR (tabela materiałów), 1 μl startera 5' (10 μM), 1 μl startera 3' (10 μM) i 8,5 μl ddH2O. Przygotować mieszaninę wraz z 2 dodatkowymi próbkami.
  2. Podziel 23 μl wstępnie zmieszanego roztworu na probówki mikrowirówkowe o pojemności 0,2 ml, dodaj 2 μl genomowego DNA i ostrożnie zakryj probówki. Następnie wymieszaj i lekko odwiruj.
  3. Umieścić probówki mikrowirówkowe o pojemności 0,2 ml w cyklerze PCR i wykonać następujące czynności: Denaturacja: 95 °C przez 5 s; Wyżarzanie: 60 °C przez 30 s; przedłużenie: 72 °C przez 30 s.
  4. Wykonaj elektroforezę agarozową w następujący sposób:
    1. Odważyć 1,2 g agarozy do kolby zawierającej 100 ml 1x TAE i gotować przez 5 minut w kuchence mikrofalowej. Dodać 5 μl barwnika kwasu nukleinowego (tabela materiałów) do kolby po ostygnięciu do temperatury około 70 °C. Wlać ją powoli do płytki wzdłuż krawędzi i umieścić w temperaturze pokojowej, aż zestali się w żel.
    2. Dodać 5 μl próbki i drabinkę DNA 2-log (0,1–10,0 kb) lub marker I (0,1–0,6 kb), które zawierają 1 μl 6-krotnego buforu ładującego DNA, do żelu agarozowego. Następnie elektroforezę pod ciśnieniem 120 mA, aż pasma zostaną rozdzielone.
    3. Wizualizuj żel agarowy zawierający fragmenty DNA za pomocą obrazowania ultrafioletowego.
  5. Wykonaj elektroforezę agarozową, aby wyizolować amplifikowane fragmenty DNA z powyższych próbek, które zostały zwizualizowane w obrazie ultrafioletowym. Za pomocą PCR najpierw zidentyfikowano startery specyficzne dla amplifikowanego genomowego DNA świni (Figura 2A). Co więcej, potwierdzono pewne specyficzne cechy gatunkowe tych starterów, które specyficznie amplifikowały DNA świni w kohorcie genomu małpy/człowieka lub w kohorcie genomowego DNA myszy (Rysunek 2B). Wreszcie, udowodniono, że dwa startery specyficzne gatunkowo wzmacniają DNA świni odpowiednio w łacie tętnicy świni i/lub modelach przeszczepu komórek świni na mysz (Figura 2C)

4. Krzywa standardowa cpsDNA

  1. Przekształć plazmid pMD19-T zawierający fragment DNA świni w DH5a, który może być specyficznie amplifikowany przez starter #4 lub starter #11 (Tabela 1). Badanie przesiewowe na obecność bakterii dodatnich przy użyciu 50 μg/ml ampicyliny.
    Elementarz #4 w kohorcie człowiek/małpa (naprzód: 5′-TTCAATCCCA CTTCTTCCACCTAA-3′, odwrotnie: 5′-CTTCATTCCATCTTCATAATAAC CCTGT-3′)
    Podkład #11 dla modelu myszy (do przodu: 5′-TGCCGTGGTTTCC GTTGCTTG-3′, do tyłu: 5′-TCACATTTGATGGTCGTCTTGTCGTCGTCGT′)
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wszystkich podkładów znajdują się w Tabeli 1.
  2. Zbierz powyższe plazmidy zgodnie z poniższym protokołem.
    1. Wyizolować pojedynczą kolonię ze świeżo pokrytej selektywnej płytki i zaszczepić kulturę 1-5 ml pożywki LB zawierającej odpowiedni selektywny antybiotyk. Inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając (300 obr./min).
    2. Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zdekantować lub odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną.
    3. Dodaj 250 μl roztworu I/RNazy A. Wiruj lub pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Całkowite ponowne zawieszenie osadu komórkowego jest niezbędne do uzyskania dobrych plonów.
      UWAGA: RNaza A musi być dodana do roztworu I przed użyciem.
    4. Przenieść zawiesinę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 250 μl roztworu II. Odwróć i delikatnie obróć probówkę kilka razy, aby uzyskać klarowny lizat. Może być konieczna inkubacja trwająca 2-3 minuty.
      UWAGA: Unikaj energicznego mieszania, ponieważ spowoduje to ścinanie chromosomalnego DNA i niższą czystość plazmidu. Nie pozwól, aby reakcja lizy trwała dłużej niż 5 minut.
    5. Dodać 350 μl roztworu III. Natychmiast kilkakrotnie odwrócić, aż utworzy się kłaczkowaty biały osad.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby roztwór dokładnie wymieszać i natychmiast po dodaniu roztworu III, aby uniknąć miejscowego wytrącania się.
    6. Wirować z maksymalną prędkością (≥13 000 x g) przez 10 minut. Utworzy się zwarta biała granulka. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
    7. Włożyć mini kolumnę DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
    8. Przenieść oczyszczony supernatant z ppkt 4.2.7, ostrożnie zasysając go do minikolumny DNA. Uważaj, aby nie naruszyć osadu i aby żadne zanieczyszczenia komórkowe nie zostały przeniesione do mini kolumny DNA.
    9. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
    10. Dodać 500 μl buforu HBC. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
      UWAGA: Bufor HBC przed użyciem należy rozcieńczyć 100% izopropanolem.
    11. Dodać 700 μl buforu do płukania DNA. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
      UWAGA: Przed użyciem DNA Wash Buffer należy rozcieńczyć 100% etanolem.
      1. Opcjonalnie: Powtórz dla drugiego etapu płukania buforem DNA.
    12. Odwirować pustą mini kolumnę DNA przez 2 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć matrycę kolumny.
      UWAGA: Ważne jest, aby wysuszyć matrycę mini kolumny DNA przed elucją. Resztki etanolu mogą zakłócać dalsze zastosowania.
    13. Przenieś mini kolumnę DNA do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    14. Dodaj 30-100 μl buforu elucyjnego lub sterylnej wody dejonizowanej bezpośrednio do środka membrany kolumny.
      UWAGA: Skuteczność elucji DNA z kolumny DNA Mini zależy od pH. Jeśli używasz sterylnej wody dejonizowanej, upewnij się, że pH wynosi około 8,5.
    15. Odstawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę.
    16. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
      UWAGA: Stanowi to około 70% związanego DNA. Opcjonalna druga elucja da wszelkie szczątkowe DNA, choć w niższym stężeniu.
  3. Sprawdź powyższe plazmidy za pomocą podwójnie restrykcyjnego trawienia enzymatycznego przy użyciu EcoR I (15 U/μL) i Bam H1(15 U/μL)22.
    1. Wykonaj kroki makijażu na lodzie. Przygotować układ reakcyjny składający się z 1 μL EcoR I (15 U), 1 μL Bam H1 (15 U), 2 μL 10x buforu, 1 μg plazmidu; dodać ddH2O do 20 μl całkowitej objętości, dokładnie wymieszać. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Oddziel strawione produkty przez 1% agarozy, a następnie poddaj elektroforezie i wystawij na działanie światła UV, tak jak poprzednio.
  4. Rozcieńczyć skoncentrowany plazmid do 2 x 1011 kopii/ml dla wyjściowego roztworu wzorcowego przy użyciu ddH2O. Weźmy plazmid (P2) zawierający fragment DNA świni, na przykład kopie, obliczając:
    1. Obliczyć liczbę plazmidów w 1 ml wyjściowego roztworu wzorcowego: N = (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol.
    2. Obliczyć masę cząsteczkową P2: M = 2810 pz x 650 D/bp = 2810 x 650 D (g/mol).
    3. Obliczyć masę P2: m=N*M= (2 x 1011)/ (6,02 x 1023) mol x 2810 x 650 g/mol.
    4. Obliczyć objętość P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6,02 x 1023) x 2810 x 650] g/C. (C to stężenie P2 (ng/μL), które mierzy się za pomocą spektrofotometru).
  5. Rozcieńczyć początkowy roztwór wzorcowy szeregowo 10-krotnie na 2 x10 10 kopii/ml, 2 x 109 kopii/ml, 2 x 108 kopii/ml, 2 x 107 kopii/ml..., i 2 x 100 kopii/ml dla roztworu wzorcowego przy użyciu ddH2O. Podczas rozcieńczania dokładnie przetrząsać.
  6. Ustal krzywą standardową.
    1. Przygotować układ reakcyjny qPCR (wszystkie etapy są chronione przed światłem): Dodać wstępnie zmieszany roztwór, który zawiera 325 μl qPCR Mix (tabela materiałów), 13 μl startera 5', 13 μl startera 3' i 169 μL ddH2O do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, którą następnie dokładnie wymieszano i lekko odwirowano.
    2. Podzielić 40 μl powyżej wstępnie zmieszanego roztworu na 8-probówkowy pasek i dodać 10 μl wzorcowego DNA o różnych stężeniach. Ostrożnie zakryć, wymieszać i lekko odwirować.
    3. Umieść pasek z 8 probówkami w maszynie qPCR zgodnie z procedurą pokazaną na Rysunek 3.

5. Wyizoluj krążące DNA z próbek krwi

  1. Za pomocą probówek EDTA zbierz próbki krwi w różnych punktach czasowych w modelach łat tętniczych świnia-małpa i modelach przeszczepu komórek świnia-mysz.
  2. Pobrać próbki krwi o objętości około 400 μl (z modeli plastrów tętniczych od świni do małpy) lub 100 μl (z modeli przeszczepu komórek od świni do myszy) i przenieść do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Usunąć komórki krwi z próbek krwi przez odwirowanie w niskiej temperaturze i z dużą prędkością (3 000 x g, 4 °C, 5 min).
  3. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 10 minut.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Ekstrahować krążące DNA z powyższego supernatantu przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji surowicy/krążącego DNA zgodnie z protokołem 2 protokołu producentów izolującego genomowego DNA.
  5. Skondensować objętość krążącego DNA do 40 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Kwantyfikacja krążącego DNA specyficznego dla świni

  1. Przygotować wstępnie zmieszany roztwór składający się z 25 μl qPCR Mix (tabela materiałów), 1 μl startera 5', 1 μl startera 3', 10 μl próbki DNA i 13 μl ddH2O. Przygotować mieszaninę wraz z 2 dodatkowymi próbkami.
  2. Podzielić 40 μl wstępnie zmieszanego roztworu na pasek z 8 probówkami i dodać 10 μl próbki DNA, a następnie ostrożnie zamknąć. Przygotuj dwie reakcje więcej niż jest to potrzebne.
  3. Umieść pasek z 8 probówkami w maszynie qPCR, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co krzywa wzorcowa. Lepiej jest najpierw uruchomić wzorzec, aby upewnić się, że reakcja jest krytyczna dla kwantyfikacji z wyprzedzeniem. Procedura systemu reakcji qPCR została pokazana w Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole zaprojektowano startery specyficzne dla świń, skonstruowano fragmenty DNA specyficzne dla świń zawierające plazmidy i ustalono standardowe krzywe do oznaczania ilościowego (Rysunek 4). Specyficzność gatunkowa 19 starterów została potwierdzona metodą PCR. Specyficzne dla gatunku startery (starter #4 i starter #11) zostały następnie wykorzystane do ilościowego określenia cpsDNA za pomocą qPCR w modelach przeszczepu komórek od świni do myszy i modelach przeszczepu plamy tętnicy świnia-mał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowe określenie krążącego DNA świń stanowi wykonalne podejście do monitorowania odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji. Gadi i wsp.24 stwierdzili, że zawartość krążącego DNA pochodzącego od dawcy (ddcfDNA) we krwi pacjentów z ostrym odrzuceniem była znacznie wyższa niż u pacjentów bez odrzucenia. Badania te sugerują, że ddcfDNA może być powszechnym biomarkerem do monitorowania uszkodzeń przeszczepów narządowych. W ostatnich latach qPCR jest coraz częściej stosowany do analizy kwasów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine w Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021, SZXJ2018059).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseBiowest, Barcelona, Hiszpania111860
BamHI-HFNew England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USAR3136S
1,5 mL probówka do mikrowirówkiAxygen  Nauki biologiczne, Union City, Kalifornia, USAMCT-150-C
0,2 ml probówka PCRAxygen  Nauki biologiczne, Union City, Kalifornia, USAPCR-02-C
C57BL/6 MyszyCentrum Zwierząt Medycznych w prowincji Guangdong,  Chiny8 ~ 10 tygodni
WirówkaThermo  Rybacy  Naukowy, Walt- ham, MA, USAMicro 21R
2-log DNA LadderNew England Biolabs, Ipswich, Mass, USAN3200S0.1– 10.0 kb
Znacznik I Tiangen, Pekin, ChinyMD101-020.1– 0,6 kb
Mini kolumna DNA (mini kolumny DNA HiBind)Omega Bio-tek, Norcross, GA, USADNACOL-01
Bufor ładujący DNASolarbio, Pekin, ChinyD1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I i E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IIOmega Bio-tek, Norcross, GA, USAD6942
D6943
EcoR ITakara  Bio, Shiga, Japonia  1040S
Samica Bama mini świnieBGI Ark Biotechnology, Shenzhen, Chiny2 ~ 4 miesiące
Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA?Tiangen, Pekin, ChinyDP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master MixToyobo, Osaka, JaponiaQPK-201
Gel Doc XRBio-Rad, Hercules, USA
Samiec małpy cynomolgusGuangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, Chiny8 lat
Barwnik kwasu nukleinowego (Gelred)Biotium, Fremont, USA42003
polimeraza (Premiks Taq)Takara  Bio, Shiga, JaponiaPlazmid RR901A
pMD19-TTakara  Bio, Shiga, JaponiaMaszyna D102A
qPCRApplied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Zestaw do ekstrakcji surowicy/krążącego DNA Tiangen, Pekin, ChinyDP339
TAEsangon Biotech, Szanghaj, ChinyB548101

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
  3. Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
  4. Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298(2019).
  5. Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
  6. Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908(2018).
  7. Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562(2020).
  8. Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515(2019).
  9. Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
  10. Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
  11. Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
  12. Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
  13. Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196(2011).
  14. Wagner, J. Free DNA--new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138(2016).
  17. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).
  18. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  19. Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
  20. Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
  21. De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
  22. Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522(2019).
  23. Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444(2019).
  24. Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wolnokr ce DNAilo ciowe PCR qPCRprzetwarzanie pr bek krwielektroforeza w elu agarozowymprzygotowanie krzywej wzorcowejstartery specyficzne dla gatunkumonitorowanie odrzucenia immunologicznegozestaw do izolacji DNA

Powiązane artykuły