Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61581

⸱

28 stycznia 2021

 ,  ,  , 
1The James Franck Institute, The University of Chicago, 2Department of Chemistry, The University of Chicago, 3The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Streszczenie

Miofibroblasty mogą spontanicznie internalizować nanodruty krzemowe (SiNW), co czyni je atrakcyjnym celem dla zastosowań bioelektronicznych. Te hybrydy komórkowo-krzemowe oferują bezołowiowe możliwości modulacji optycznej przy minimalnych zakłóceniach normalnego zachowania komórek. Zdolności optyczne uzyskuje się dzięki właściwościom fototermicznym i fotoelektrycznym SiNW. Hybrydy te można zbierać przy użyciu standardowych technik hodowli tkankowych, a następnie stosować do różnych scenariuszy biologicznych. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób te hybrydy można wykorzystać do badania sprzężenia elektrycznego komórek serca i porównania, w jaki sposób miofibroblasty łączą się ze sobą lub z kardiomiocytami. Proces ten można przeprowadzić bez specjalnego sprzętu poza mikroskopem fluorescencyjnym ze sprzężoną linią laserową. Pokazano również użycie niestandardowej procedury MATLAB, która umożliwia ilościowe określenie propagacji wapnia w różnych komórkach w kulturze i między nimi. Wykazano, że miofibroblasty mają wolniejszą odpowiedź elektryczną niż kardiomiocyty. Co więcej, propagacja międzykomórkowa miofibroblastów wykazuje nieco wolniejsze, choć porównywalne prędkości do ich prędkości wewnątrzkomórkowych, co sugeruje pasywną propagację przez połączenia szczelinowe lub nanorurki. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być łatwo stosowana w innych dziedzinach komórkowych, zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo lub ex vivo.

Wprowadzenie

Wszystkie organizmy biologiczne używają elektryczności w postaci jonów do regulowania zachowania komórek. Błony komórkowe zawierają różne rodzaje specyficznych kanałów jonowych umożliwiających pasywny i aktywny transport jonów. Jony te regulują funkcje komórek pobudliwych, takie jak aktywność neuronów oraz kurczliwość mięśni szkieletowych i sercowych. Jednak bioelektryczność odgrywa również ważną rolę w komórkach niepobudliwych, regulując wiele funkcji komórkowych, takich jak proliferacja komórek1, neuroimmunity2,3,4, oraz różnicowanie komórek macierzystych5.

W ostatnich dziesięcioleciach dziedzina bioelektryczności cieszy się coraz większym zainteresowaniem, co przyczyniło się do rozwoju licznych technologii dla interfejsów bioelektronicznych. Pipety z mikroelektrodami są złotym standardem wewnątrzkomórkowego zapisu i stymulacji6. W tej metodologii szklana pipeta jest ciągnięta w określonych warunkach, aby utworzyć ostrą krawędź o wielkości porów kilku mikronów. Pipeta ta jest wypełniona buforem, a pipeta umożliwia bezpośredni kontakt buforu z objętością wewnątrzkomórkową. Skutkuje to interfejsem bioelektrycznym, który zapewnia niezwykle wysoki stosunek sygnału do szumu, precyzyjną kontrolę nad aktywnością elektryczną komórek i niezwykle wysoką rozdzielczość czasową. Chociaż metodologia ta jest niezwykle potężnym narzędziem, które zostało niedawno zmniejszone do konfiguracji nanopipet7, wiąże się z kilkoma istotnymi ograniczeniami technicznymi. Efekt rozcieńczenia cytozolu8, jak również drgania mechaniczne, ograniczają jego użyteczność do krótkotrwałych przesłuchań i wymagają drogiego specjalistycznego sprzętu i wysokiego poziomu umiejętności technicznych. Co więcej, jego masywność ogranicza liczbę komórek, które mogą być rejestrowane lub stymulowane jednocześnie, a ze względu na jego inwazyjność nie można go rekonfigurować w trakcie eksperymentu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano układy mikroelektrod, ale rozmiar elektrod ogranicza rozdzielczość przestrzenną, a także dostęp wewnątrzkomórkowy. Matryce nanoelektrod umożliwiają wewnątrzkomórkowy zapis i stymulację, ale wymagają elektroporacji ściernej, aby uzyskać dostęp do cytozolu9,10. Ponadto wszystkie te metodologie są związane z substratem, a zatem ograniczają się do hodowli komórkowych in vitro lub do zewnętrznych komórek powierzchownych, bez dostępu do komórek znajdujących się wewnątrz trójwymiarowej (3D) tkanki.

Optogenetics11 jest powszechnie używany do rozwiązywania tych ograniczeń 3D i in vivo. Jednak metody optogenetyczne opierają się na zaburzeniach kanałów jonowych błony plazmatycznej aktywowanych światłem, które są rozprowadzane na błonie plazmatycznej, ograniczając rozdzielczość przestrzenną 3D12 i możliwości wewnątrzkomórkowe.

Niedawno pokazaliśmy, że nanodruty krzemowe (SiNW) mogą być używane do przeprowadzania wewnątrzkomórkowych badań bioelektrycznych z submikronową rozdzielczością przestrzenną z różnymi niepobudliwymi komórkami, a mianowicie miofibroblastami serca i oligodendrocytami13. Co więcej, użyliśmy tych SiNW do przeprowadzenia specyficznego dla komórek ex-vivo przesłuchania w tkance serca 3D, aby zbadać, w jaki sposób komórki serca łączą się elektrycznie in vivo14. Dużą zaletą tej metodologii jest jej prostota; Nie wymaga żadnych modyfikacji genetycznych ani nieporęcznego oprzyrządowania. Wiele komórek spontanicznie internalizuje światłoczułe SiNW bez potrzeby sonikacji czy elektroporacji15. Ponadto spontanicznie uciekną z enkapsulacji endosomalnej i utworzą bezproblemową integrację z cytozolem i organellami wewnątrzkomórkowymi13,15. Te kompozyty komórka-SiNW, zwane hybrydami komórka-krzem, posiadają dynamiczną, miękką i wszechstronną naturę oryginalnego ogniwa, a także możliwości optoelektryczne SiNW. Po hybrydyzacji hybryda komórka-SiNW może być zbierana przy użyciu standardowych technik hodowli tkankowych i wykorzystywana do różnych zastosowań, takich jak wewnątrzkomórkowa stymulacja bioelektryczna; badanie międzykomórkowego sprzężenia bioelektrycznego in vitro; oraz do przesłuchań in vivo specyficznych dla komórek. Ponieważ skuteczna stymulacja wymaga kolokalizacji o wysokich gęstościach mocy optycznej i SiNW, można osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną zarówno w 2D, jak i 3D. W tym protokole szczegółowo opisujemy metodologię, a także sposób, w jaki można analizować wyniki. Nacisk kładziony jest na badania wewnątrz- i międzykomórkowe in vitro, ale implementacja tej metodologii in vivo może być bezpośrednio wykorzystana w wielu innych scenariuszach biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Aby zapewnić zgodność ze standardami etycznymi, wszystkie procedury na zwierzętach związane z izolacją kardiomiocytów z serc gryzoni zostały najpierw zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago (IACUC). Ponadto wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w pełnej zgodności z wytycznymi IACUC Uniwersytetu w Chicago.

1. Przygotowanie hybryd komórkowo-SiNW

  1. Wyizoluj pierwotne kardiomiocyty (CM) za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Przygotuj kompletny DMEM do pierwotnej izolacji komórek uzupełniony 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% L-glutaminą.
  3. Aby wyizolować miofibroblasty (MFs) z zawiesiny MFs-CMs, należy wstępnie poszczepić wyizolowane komórki na szalce do hodowli tkankowej (komórki wyizolowane z 2 serc z kroku 1.1. na 100 mm szalka) przez 1 godzinę. Ponieważ CM potrzebują do przylegania powierzchni poddanej fibronektynie lub kolagenowi, tylko MF przyczepią się do powierzchni kultury tkankowej.
  4. Odessać wzbogaconą zawiesinę komórek CMs. Te CM mogą być używane do eksperymentów ze sprzężeniem heterokomórkowym, jak opisano w sekcji 3. Opłucz MF za pomocą DMEM, aby usunąć wszelkie pozostałe CM z naczynia MFs.
  5. Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną do MF i pozwól im się rozmnażać, aż osiągną ~80% zlewania się (2-4 dni). Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
  6. Gdy komórki są gotowe (80% zlewania się), przygotuj SiNW do poniższego kroku hybrydyzacji (krok 1.7).
    UWAGA: Można do tego celu użyć wielu rodzajów SiNW. W tym eksperymencie użyto SiNW, które zostały wyhodowane przez chemiczne osadzanie z fazy gazowej (CVD) z konfiguracją złącza p-i-n rdzeń-powłoka, jak opisano wcześniej16. Podczas wzrostu CVD SiNW są hodowane na podłożu z płytki krzemowej i ostatecznie są utrzymywane jako chipy krzemowe pokryte SiNW.
  7. Wytnij wiór o wymiarach 3 mm x 3 mm z wafla z SiNW wyhodowanymi w CVD za pomocą rysika diamentowego. Używaj ostrych kleszczy do obchodzenia się z waflem i zminimalizuj powierzchnię, której dotykają kleszcze, ponieważ może to spowodować pęknięcie SiNW.
  8. Wysterylizuj chip, płucząc go 70% etanolem i pozostawiając etanol do wyschnięcia przez 30 minut w świetle UV w okapie z przepływem laminarnym bezpieczeństwa biologicznego.
  9. Przenieś chip do sterylnej probówki mikrowirówkowej i przepłucz nadmiar etanolu za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej.
  10. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej i sonikować chip w kąpieli sonikacyjnej przez 1-10 min. Podłoże powinno stać się mętne, gdy SiNW są uwalniane do nośnika.
    UWAGA: Czas i moc sonikacji powinny być zoptymalizowane dla różnych sonikatorów lub różnych komórek, ponieważ krótszy czas trwania i niższe moce dadzą dłuższe SiNW.
  11. Dodać zawiesinę SiNW do 5 ml pożywki hodowlanej i wysiać ją na 100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej z MF. Pozwól SiNW na internalizację przez 4 godziny i spłucz nadmiar SiNW 5x pożywką. Pozwól częściowo zinternalizowanym SiNW na zakończenie internalizacji, pozwalając im siedzieć przez kolejne 1 godzinę przed użyciem.
    UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych stężeń SiNW i/lub czasów internalizacji.
  12. Przygotować roztwór do powlekania kolagenu, rozcieńczając podstawowy roztwór kolagenu (3 mg/ml) sterylnym 20 mM kwasem octowym w stosunku 1:50. Dodać 0,5 ml roztworu powlekającego do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór i spłukać naczynie sterylnym PBS.
  13. Zebrać hybrydy komórkowo-SiNW, traktując je 3 ml trypsyny przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej i energicznie przepłukać hybrydy pipetowaniem. Delikatnie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, aby uniknąć uszkodzenia komórek przez zinternalizowane SiNW. Usuń nadmiar pożywki, zawieś komórki za pomocą 1 ml pożywki i umieść je na naczyniu ze szkła nasączonego kolagenem.
    UWAGA: Hybrydy mogą być wysiewane samodzielnie, w celu zbadania sprzężenia wewnątrzkomórkowego lub międzykomórkowego lub z CM, w celu zbadania sprzężenia heterokomórkowego in vitro.
  14. Przeprowadzić końcową weryfikację internalizacji SiNW poprzez znakowanie cytozolu (kalceina-AM, 4 μM) i błony komórkowej (marker błonowy, 2 μM) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i obrazowanie komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponieważ SiNW są wysoce odblaskowe, do ich wizualizacji można użyć światła odbitego zamiast fluorescencji.

2. Przygotowanie komórek do badań wewnątrz- i międzykomórkowych

  1. Przygotować roztwór do powlekania kolagenem jak w ppkt 1.12
  2. Do wewnątrzkomórkowej stymulacji elektrycznej hybrydy hodowlane o niskiej gęstości wysiewu. Użyj standardowego hemocytometru, aby policzyć komórki z sekcji 1.11. i wysiewać 50 000 komórek na szklanym naczyniu o dnie o średnicy 35 mm w pożywkach hodowlanych. Do badań międzykomórkowych należy stosować komórki o większej gęstości (500 000 komórek na miskę). W celu sprzężenia międzykomórkowego między CM i MF należy wspólnie hodować hybrydy ze świeżo wyizolowanymi CM.
  3. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc przed wykonaniem eksperymentów ze stymulacją optyczną. W przypadku badań międzykomórkowych należy odczekać 48 godzin w temperaturze 37 °C, aby komórki uzyskały ekspresję połączeń szczelinowych międzykomórkowych przed przeprowadzeniem eksperymentu.
  4. Przygotować wrażliwy na wapń roztwór podstawowy barwnika (może być przechowywany w temperaturze -20 °C), dodając 50 μl DMSO do 50 μg Fluo-4 AM. Przygotować roztwór barwiący, rozcieńczając 1 μl barwnika w 1 ml DMEM.
  5. Odessać pożywkę hodowlaną z komórek i dodać 1 ml roztworu barwiącego. Pozostawić barwnik do internalizacji w komórkach przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać barwnik i dwukrotnie spłukać sterylnym PBS.
  6. Na koniec dodać 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM wolnego od czerwieni fenolowej i pozostawić wewnątrzkomórkowy Fluo-4 do deestryfikacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Przenieś komórki do mikroskopu w celu obrazowania i stymulacji.

3. Obrazowanie optyczne i stymulacja

  1. Podgrzej wstępnie nawilżony mikroinkubator do temperatury 37 °C i mieszaniny powietrza bąbelkowego i CO2 (95:5).
  2. Użyj mikroskopu ze skolimowaną linią laserową sprzężoną ze ścieżką światła do obrazowania wapnia i stymulacji optycznej.
    UWAGA: Skaningowy mikroskop konfokalny jest najprostszą opcją ze względu na jego możliwości stymulacji punktowej. Jednak procedurę tę można wykonać przy użyciu dowolnego standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, sprzęgając skolimowaną wiązkę laserową z nieskończoną przestrzenią ścieżki światła za pomocą rozdzielacza wiązki. Każdy obiektyw mikroskopowy jest zaprojektowany w taki sposób, że skolimowany laser, przez który przechodzi, będzie skupiony na plamce lasera o ograniczonej dyfrakcji w płaszczyźnie ogniskowej. Długość fali lasera powinna być zbliżona do światła wzbudzenia, więc zostanie odbita przez zwierciadło dichroiczne i przepuszczona przez filtr wzbudzenia.
  3. Wizualizuj SiNW i określ miejsce stymulacji za pomocą mikroskopii jasnego pola, światła przechodzącego lub światła odbitego. Następnie należy przekonfigurować ścieżkę światła do trybu fluorescencji, zachowując punkt stymulacji w predefiniowanym miejscu SiNW.
  4. Zweryfikuj optymalną moc stymulacji i długość impulsu dla każdego rozmiaru SiNW i typu komórki, aby zminimalizować uszkodzenia fototermiczne stymulowanych komórek. W przypadku typowego protokołu stymulacji należy wykonać 2-10-sekundowy podstawowy zapis wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia. Następnie należy zastosować pojedynczy impuls laserowy o mocy 1-10 mW i czasie trwania 1-10 ms (co odpowiada 30-300 kW/mm2) w celu stymulacji SiNW i zarejestrować powstałą falę wapniową przez kolejne 2-10 s.
    UWAGA: Niezbędna jest optymalizacja mocy optycznej i długości impulsu dla każdego rozmiaru SiNW i ogniw. Jest to konieczne, aby zminimalizować uszkodzenia fototermiczne stymulowanych komórek.
  5. W razie potrzeby prześlij nagrane filmy ze stymulacji optycznej do dalszej analizy.

4. Przetwarzanie wideo

  1. Wizualizacja zmian we fluorescencji Fluo-4 za pomocą makro "dF over F" class17 dostępnego dla ImageJ18, który oblicza zmianę liczby fluorescencji dla każdego piksela i normalizuje się przez średnią wartość spoczynkowej linii bazowej. Przekonwertuj dane wyjściowe (format zmiennoprzecinkowy) na 8 bitów w celu dalszego przetwarzania.
  2. Kontynuuj przetwarzanie filmu dF/F za pomocą selektywnego filtra mediany "Usuń wartości odstające" dostępnego w ImageJ. Zdefiniuj parametry, aby usunąć piksele, których wartość jest większa niż 10 powyżej wartości mediany w promieniu 2 pikseli, i zastąp tę wartość piksela medianą.
  3. Oblicz przepływ optyczny w każdej klatce za pomocą algorytmu Lucasa-Kanade'a, zaimplementowanego w zestawie narzędzi Matlab Computer Vision. Wynikiem tej funkcji było pole wektorowe zawierające składowe x i y przepływu optycznego w każdym punkcie każdego obrazu (kod jest dostępny w pliku uzupełniającym 1).
    UWAGA: Średni przepływ optyczny w komórce, <ν>, odpowiada rozwojowi strumienia wapnia w komórce. Różnica przepływu optycznego, Δ<ν> zapewnia punkt czasowy, w którym aktywowano sygnalizację wapniową, identyfikując miejsce, w którym sygnał został zmaksymalizowany. Dodatkowo wielkość Δ<ν> w maksimum jest skorelowana z szybkością, z jaką front falowania wapnia przechodzi przez komórkę.
  4. Oblicz prędkość międzykomórkową przekaźnictwa wapnia zgodnie z następującym równaniem.
    vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
    gdzie tmax,j i tmax,i są czasami aktywacji odpowiednio dla komórek j i i, a rij jest odległością między centroidami komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zdolność tej metodologii do zapewnienia bezpośredniego dostępu do cytozolu wewnątrzkomórkowego zależy od spontanicznej internalizacji SiNW do wnętrza komórek. Chociaż SiNW ulegają spontanicznej internalizacji w wielu typach komórek15, niektóre komórki, takie jak kardiomiocyty i neurony, wymagają odpowiedniego przygotowania SiNW, aby umożliwić ich internalizację19. W niniejszym protokole opisujemy proces internalizacji p-i-n SiNW o średnicy 200-300 nm i długości ~1-3 µm do k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pokazaliśmy tutaj prosty sposób na wykonanie wewnątrzkomórkowej stymulacji elektrycznej komórek. W tej demonstracji użyliśmy MF, które zostały wstępnie zhybrydyzowane z SiNW, a następnie współhodowane z CM. Ogólnie rzecz biorąc, większość proliferujących komórek ma tendencję do internalizacji SiNW, co pozwala na zastosowanie tej metodologii z wieloma innymi typami komórek. Co więcej, chociaż wykazaliśmy wewnątrzkomórkową stymulację komórek, te same zasady można zastosować do zewnątrzkomórkowej stymulacji komórek. Można t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 mm Naczynia ze szklanym dnemCellvisD35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal3i
Calcein-AMInvitrogenC1430
CellMask Pomarańczowa Barwnik z membraną plazmatycznąInvitrogenC10045
Kolagen I, ogon szczuraGibcoA1048301
Deluxe Diamentowe pisak do rysowaniaTed Pella54468
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminyGibco10313039
DMSO, bezwodnyInvitrogenD12345
Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych Falcon08-772E
Surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie,Gibco10082147
Fibronectin Białko ludzkie, osoczeGibco33016015
Zaawansowana myjka ultradźwiękowa z serii Fisherbrand 112xxFisher ScientificFB11201
Fluo-4, AM, przepuszczalna komórkaInvitrogenF14201
FluoroBrite DMEM MediaGibcoA1896701
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
OKO pełna komora kontroli środowiska (stała temperatura, wilgotność i CO2)OKO
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
Pierce Zestaw do izolacji kardiomiocytów pierwotnychThermo Scientific88281
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200056

Bibliografia

  1. Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
  2. Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
  3. Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).
  4. Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).
  5. Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
  6. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  7. Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  9. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  10. Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
  11. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  12. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  13. Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
  14. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  15. Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).
  16. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).
  17. Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
  18. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).
  19. Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
  20. Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
  21. Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).
  22. Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
  23. Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
  24. He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
  25. Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
  26. Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja miofibroblastówobrazowanie wapniamikroskopia konfokalnastymulacja laserowaanaliza złączy szczelinowychko-kultura komórekzastosowania bioelektroniczne
Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.