Artykuł metodologiczny

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61589

⸱

19 stycznia 2021

 ,  , 
1Department of Biology, San Francisco State University, 2Department of Biochemistry & Biophysics, UCSF Mission Bay

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Streszczenie

Nowoczesne podejścia do ilościowego obrazowania żywych komórek stały się podstawowym narzędziem do badania biologii komórki, umożliwiając wykorzystanie statystyk i modelowania komputerowego do klasyfikowania i porównywania procesów biologicznych. Chociaż systemy modelowania kultur komórkowych doskonale nadają się do obrazowania o wysokiej zawartości, wysokoprzepustowe badania morfologii komórek sugerują, że hodowle ex vivo są ograniczone w rekapitulacji złożoności morfologicznej komórek w organizmach żywych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na skalowalny system modelowy o wysokiej przepustowości do obrazowania żywych komórek w nienaruszonym organizmie. Opisano tutaj protokół korzystania z analizatora obrazu o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego pozyskiwania wielu filmów poklatkowych przedstawiających rozwój embrionalny Drosophila melanogaster w stadium blastodermy syncytialnej. Blastoderma syncytialna tradycyjnie służyła jako doskonały model in vivo do obrazowania zdarzeń biologicznych; Jednak uzyskanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych dla podejść ilościowych i wysokoprzepustowych było pracochłonne i ograniczone przez obrazowanie pojedynczego zarodka na powtórzenie eksperymentalne. Przedstawiono tutaj metodę adaptacji metod obrazowania i mikroiniekcji do systemu obrazowania o wysokiej zawartości lub dowolnego mikroskopu odwróconego zdolnego do automatycznej akwizycji wielopunktowej. Takie podejście umożliwia jednoczesne pozyskanie 6-12 zarodków, w zależności od pożądanych czynników akwizycji, w ramach jednej sesji obrazowania.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 30 lat, postęp w technologiach obrazowania i sondach molekularnych do obrazowania żywych komórek poszerzył nasze zrozumienie złożoności i wewnętrznego funkcjonowania komórki. Postępowi technologicznemu towarzyszy większe uzależnienie od modeli hodowli komórkowych ex vivo w celu pozyskiwania danych obrazowych o wysokiej przepustowości. Modele hodowli komórkowych zapewniają szereg korzyści, w tym kontrolę mikrośrodowiska za pomocą systemów mikroprzepływowych oraz możliwość jednoczesnego obrazowania wielu komórek, co umożliwia stosowanie podejść ilościowych niezbędnych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych1,2. Istnieją jednak również istotne wady związane z modelami hodowli komórkowych w kontekście badań morfologicznych, takie jak dwuwymiarowe powierzchnie szklane lub plastikowe powodujące zakłócający wpływ na morfologię komórki i jej regulację3,4,5. Efekty te mogą dostarczyć fałszywych lub wprowadzających w błąd danych w odniesieniu do badania procesów biologicznych regulujących morfologię komórkową.

Chociaż alternatywą było badanie morfologii komórek w kontekście nienaruszonego organizmu6, niewiele odpowiednich nienaruszonych organizmów umożliwia wysokoprzepustowe ilościowe obrazowanie żywych komórek ze względu na trudności w utrzymaniu całych organizmów przy życiu poprzez obrazowanie zewnętrzne oraz wyzwania związane z obrazowaniem wewnątrz dużego organizmu wielokomórkowego. W rezultacie, badania biologiczne komórek w nienaruszonych organizmach na ogół koncentrowały się na obserwacji pojedynczego organizmu w czasie, co znacznie ogranicza wielkość próby. Ponadto to ograniczenie "jedno zwierzę na raz" sprawia, że obrazowanie na żywo w formie ekranu jest trudne i kosztowne, a także ogranicza możliwość zastosowania ilościowych narzędzi analitycznych, ponieważ liczba próbek jest na ogół zbyt mała. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na wielokomórkowy organizm modelowy, który może być wykorzystany do podejść ilościowych opartych na wysokiej zawartości.

Ten protokół dostosowuje zarodek Drosophila do obrazowania na płytkach o wysokiej zawartości, aby wygenerować eksperymentalne rozmiary próbek wystarczająco duże do analizy ilościowej. Drosophila melanogaster jest powszechnie znana jako pierwszy organizm modelowy. Badania z wykorzystaniem Drosophila doprowadziły do przełomowych odkryć w biologii komórkowej i molekularnej, w tym w przekazywaniu informacji genetycznej, identyfikacji szlaków sygnalizacji komórkowej i genetycznych wymaganiach rozwoju embrionalnego7,8,9. Ponadto zarodek Drosophila został wykorzystany do zbadania in vivo dynamiki mikrotubul podczas podziału komórkowego10,11,12. Zastosowanie mikroiniekcji do dostarczania małych cząsteczek i sond molekularnych zapewnia kontrolę czasową, która sprawia, że rozwój embrionalny Drosophila jest szczególnie skuteczny w badaniu procesów komórkowych in vivo13,14. Jednak generowanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych przy użyciu tradycyjnego podejścia do obrazowania jest niezwykle pracochłonne i ma ograniczone zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych i analizach ilościowych. Nasze podejście wykorzystuje analizator o wysokiej zawartości, zwykle zarezerwowany do analizy pojedynczych komórek i dostosowuje analizę obrazowania in vivo w syncytium wczesnego Drosophila embryo.

Ten protokół został użyty do pobrania, etapowania i mikroiniekcji zarodków Drosophila w celu zbadania mechanizmów, które napędzają zmiany morfologiczne w retikulum endoplazmatycznym (ER) podczas mitozy15. Chociaż wiele badań nakreśliło dynamiczną naturę ER podczas cyklu komórkowego16,17,18,19, trudno było porównać wpływ wielu zaburzeń w czasie na morfologię ER. Aby zidentyfikować komponenty, które napędzają zmiany w morfologii ER podczas podziału komórki, metody wymienione w tym protokole wykorzystano do zbadania roli mikrotubul i innych czynników cytoszkieletu w mitotycznej reorganizacji ER przy użyciu korowego podziału syncytialnego we wczesnym zarodku Drosophila. Podsumowując, dostępność zaburzeń genetycznych w społeczności Drosophila, możliwość mikroiniekcji leków i sond molekularnych w precyzyjnych momentach rozwoju oraz niedrogie koszty pracy z Drosophila sprawiają, że podejście to jest wysoce podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe oparte na obrazach. Opisane tutaj metody mają zastosowanie do badania szerokiej gamy procesów komórkowych i rozwojowych in vivo przy użyciu klasy Drosophila embryo20. W szczególności protokół ten jest dobrze przystosowany do badania zdarzeń biologicznych, które zachodzą w dłuższym okresie i w promieniu 100 mikronów od kory zarodka Drosophila.

Protokół

UWAGA: Przepisy na pożywki i roztwory znajdują się w Tabeli 1.

1. Przygotowanie i utrzymanie klatki do zbierania embrionów na potrzeby analizy na żywo21

  1. Wprowadź świeże muchy do nowej klatki do zbierania embrionów.
    UWAGA: Choć zaleca się stosowanie komercyjnie dostępnych klatek do zbierania, można je łatwo skonstruować z pustych butelek na muchy21.
    1. Usuń lub przenieś dorosłe muchy z butelek, gdy wiele poczwarek zacznie ciemnieć w stadium p14; w temperaturze 20 °C dzieje się to około 14 dni po złożeniu jaj2.
    2. Pozostaw poczwarki do wyklucia i zasiedlenia butelek przez 12-24 h.  
    3. Przenieś świeże muchy do małej klatki do zbierania, używając małego lejka nad otworem klatki, aby zapobiec ucieczce much. Połącz zawartość do 3 butelek, aby uzyskać gęsto zasiedloną klatkę zawierającą od 200 do 50 much.
    4. Przenieś muchy do klatki do zbierania, wielokrotnie uderzając butelką o twardą powierzchnię (aby ogłuszyć muchy). Następnie otwórz butelkę i odwróć ją nad lejkiem klatki do zbierania. Kilka razy uderz otwartą butelką o klatkę, aby muchy wpadły do środka.
    5. Zamknij otwartą butelkę, szybko stawiając ją na korku. Podczas przenoszenia otwartej butelki z lejka na korek upewnij się, że otwór butelki jest skierowany w dół, ponieważ muchy mają tendencję do pełzania w górę, z dala od źródła uderzeń.  
    6. Dociśnij lejek do otworu klatki z muchami i wielokrotnie uderzaj klatką o twardą powierzchnię, aby ogłuszyć muchy wewnątrz. Natychmiast zdejmij lejek i przymocuj do otworu klatki nową płytkę z winogronem. Do mocowania płytki użyj taśmy etykietowej. Powtórz ten proces, łącząc zawartość do 3 butelek, aby uzyskać gęsto zasiedloną klatkę do zbierania.
      UWAGA: Alternatywnie muchy można znieczulić za pomocą CO2 lub innych środków usypiających dla much; zwiększy to jednak okres aklimatyzacji w kroku 1.2.
  2. Aklimatyzuj nową klatkę do zbierania przez 24-48 h. Jeśli użyto CO2 lub innych środków usypiających, aklimatyzuj klatkę do zbierania przez co najmniej 48 h.
    1. Wymieniaj płytkę z winogronem w klatce do zbierania na nową, zawierającą pastę drożdżową, dwa razy dziennie w odstępach 8-10 h.
  3. Przygotowuj nową klatkę do zbierania co 5 dni.

2. Pobieranie i przygotowywanie embrionów do obrazowania

  1. Pozyskiwanie embrionów o zsynchronizowanym rozwoju
    1. Wymień płytkę z winogronami w klatce zbiorczej na nową, zawierającą w centrum niewielką ilość pasty drożdżowej. Pozostaw muchy na 1 h w celu zniesienia embrionów. Wyrzuć starą płytkę z winogronami.
      UWAGA: Muchy mogą zapłodnić embriony przed ich zniesieniem. Pierwsza płytka zbiorcza będzie zawierać wiele takich wcześniej rozwiniętych embrionów. Pozwolenie muchom na najpierw zniesienie starych embrionów poprawi synchronizację rozwoju pomiędzy embrionami.
    2. Wymień płytkę z winogronami na nową, zawierającą w centrum niewielką ilość pasty drożdżowej, i pozwól muchom znosić embriony przez 10 min. Wyrzuć starą płytkę z winogronami.
      UWAGA: Aby uniknąć spowolnienia rozwoju embrionalnego na zimnych płytkach, przed użyciem ogrzej płytkę z winogronami oraz pastę drożdżową do temperatury pokojowej.
    3. Wymień płytkę z winogronami na nową (bez pasty drożdżowej) i zachowaj starą płytkę z winogronami – znajdują się na niej embriony do obrazowania. W razie potrzeby kontynuuj zbieranie embrionów z tej klatki, powtarzając kroki 2.1.2 i 2.1.3.
  2. Inkubuj zebrane embriony przez 30-45 min, aby obrazować podziały syncytialne23.
    UWAGA: Aby obrazować etap syncytialnego blastodermy w rozwoju embrionalnym, embriony muszą zostać zamontowane i umieszczone pod mikroskopem w ciągu 90 min od momentu zbioru. Przy pierwszej próbie wykonania tego protokołu inkubuj embriony przez 10-20 min w kroku 2.2, aby zapewnić dodatkowy czas na przygotowanie pomiędzy etapami.
  3. Przeprowadź dechorionację embrionów za pomocą 50% wybielacza w wodzie dejonizowanej (DI).
    1. Przenieś inkubowane embriony z kroku 2.2 na sito 140 nm, wypełniając płytkę z winogronami wodą DI, delikatnie odrywając embriony pędzlem i wlewając wodę z embrionami na sito 140 nm (Rysunek 1A).
      UWAGA: Można to wykonać nad zlewem lub zlewkiem o pojemności 1 0 mL.
    2. Intensywnie opłucz embriony wodą DI za pomocą butelki z rozpylaczem. Osusz embriony, przykładając sito do suchego ręcznika papierowego. Osuszaj sito do momentu, aż przestanie ono pozostawiać ślady wody na ręczniku papierowym (Rysunek 1B).
      UWAGA: Usuń całą pastę drożdżową z embrionów, ponieważ może ona sprawić, że obróbka wybielaczem w następnym kroku będzie nieskuteczna.
    3. Wypełnij pustą płytkę 10 cm świeżo przygotowanym 50% wybielaczem rozcieńczonym wodą DI (stosunek wybielacz:woda DI 1:1). Zanurz sito w 50% wybielaczu na 2 min 45 s. Uruchom stoper w momencie, gdy sito dotknie 50% wybielacza. Przez pierwsze 15 s zanurzaj i wyjmuj sito z 50% wybielacza 3-4 razy, aby rozbić skupiska embrionów (Rysunek 1C).
    4. Intensywnie opłucz embriony wodą DI za pomocą butelki z rozpylaczem. Osusz embriony, przykładając sito do suchego ręcznika papierowego. Powtórz proces intensywnego płukania i osuszania 5 razy (Rysunek 1D).
      UWAGA: Jest to najważniejszy krok w celu usunięcia pozostałości chorionu. Użyj pełnej butelki z wodą DI i zużyj połowę jej zawartości w tym kroku.
    5. Przenieś osuszone embriony z sita na płytki z winogronami 10 cm za pomocą pędzla21 (Rysunek 1E).
      UWAGA: Jako alternatywę dla dechorionacji wybielaczem można zastosować ręczną dechorionację24.

Równowaga statyczna w sterylizacji hodowli komórkowych; schemat; nawadnianie wodą DI, traktowanie wybielaczem.
Rycina 1: Dechorionizacja zarodka. (AZarodki zebrano za pomocą butelki zraszającej z wodą DI H2O, pędzla oraz sita o oczkach 140 nm.BZarodki energicznie płukano za pomocą butelki z atomizerem z wodą dejonizowaną (DI H2O), a następnie osuszano, przykładając do ręcznika papierowego.CDechorionizację zarodków przeprowadzono w 50% roztworze wybielacza przez 2 min i 45 s.DZarodki płukano intensywnie za pomocą butelki z wodą destylowaną (DI H20), a następnie osuszano poprzez dotykanie ręcznika papierowego. Czynność tę powtórzono 4 razy, aby usunąć nadmiar trofoblastu.ENastępnie zarodki przeniesiono pędzlem na szalkę Petriego o średnicy 10 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Montowanie zarodków na szkiełkach nakrywkach

  1. Pod stereomikroskopem wyposażonym w górne oświetlenie typu „gęsia szyja”, ułóż dwa rzędy po 15-20 embrionów na czystym fragmencie płytki grape, używając narzędzia do pobierania jaj (egg picker). Ustaw embriony stroną brzuszną do dołu, w tej samej orientacji w odniesieniu do końców przedniego i tylnego. Aby wykonać narzędzie do pobierania jaj, zegnij precyzyjne pęsety ze stali nierdzewnej pod kątem 45°. W celu sprawdzenia orientacji grzbietowej/brzusznej (D/V) embrionów zapoznaj się z publikacją Campos-Ortega et al.20.
    UWAGA: Ważne jest, aby powierzchnia brzuszna opierała się o płytkę grape, ponieważ w kroku 3.5 embriony zostaną dociśnięte do szkiełka nakrywki, co odsłoni powierzchnię grzbietową do obrazowania. Ponieważ powierzchnia grzbietowa jest znacznie bardziej płaska niż brzuszna, obrazowanie strony grzbietowej zwiększa liczbę jąder obecnych w pojedynczej płaszczyźnie Z.
  2. Przygotuj szkiełko nakrywkowe z przekładką silikonową 75 mm x 25 mm.
    UWAGA: Można to przygotować wcześniej. Przygotuj kilka szkiełek nakrywkowych i przechowuj je w pudełku na preparaty, aby pozostały czyste.
    1. Odrysuj kontur szkiełka nakrywkowego 75 mm x 25 mm na arkuszu przekładki silikonowej o grubości 1.6 mm i wytnij przekładkę silikonową za pomocą nożyczek (Rycina 2A).
    2. Za pomocą żyletki wytnij w przekładce wkład o wymiarach 40 mm x 15 mm (Rycina 2A).
    3. Przymocuj przekładkę do szkiełka nakrywkowego i nałóż pasmo 10 µL kleju heptanowego na odsłonięty szklany wkład szkiełka nakrywkowego (Rycina 2A).
      UWAGA: Nałożenie równomiernego pasma zapewni obrazowanie embrionów w tej samej płaszczyźnie z.
  3. Podczas schnięcia kleju heptanowego z kroku 3.2.3, wytnij prostokątny fragment płytki grape zawierający embriony z kroku 3.1.
    1. Użyj żyletki, aby wyciąć prostokąt (mniejszy niż 40 mm x 15 mm) wokół dwóch rzędów embrionów. Nie usuwaj jeszcze prostokąta.
    2. Wytnij drugi prostokąt obok pierwszego. Usuń drugi prostokąt, używając prostej krawędzi szpatułki ze stali nierdzewnej.
    3. Ostrożnie wsuń prostą krawędź szpatułki ze stali nierdzewnej pod pierwszy prostokąt i usuń go (Rycina 2B).
  4. Umieść wycięty fragment płytki grape z embrionami na zewnętrznej stronie naczynia o średnicy 3.5 cm (Rycina 2C).
  5. Pod stereomikroskopem opuść przygotowane szkiełko nakrywkowe na embriony i delikatnie dociśnij dwa rzędy embrionów do kleju (Rycina 2D).
  6. Jeśli wykonujesz mikroiniekcje embrionów, przejdź do kroku 4.1. Jeśli nie wykonujesz mikroiniekcji, przejdź do kroku 3.7.
  7. Przykryj embriony, wypełniając przekładkę silikonową (do połowy wysokości) mieszanką 1:1 – halocarbon oil 70: halocarbon oil 27.
  8. Wyklej dolne krawędzie adaptera do płytek 4-slajdkowych taśmą dwustronną, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że taśma nie znajduje się na drodze obiektywu. Taśma ta jest kluczowa; jeśli szkiełko nakrywkowe będzie jedynie spoczywać na adapterze, będzie się przemieszczać podczas akwizycji. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na adapterze do płytek 4-slajdkowych.

Schemat układu eksperymentalnego dla przygotowania preparatu do mikroskopii z użyciem arkusza silikonowego i szkiełka nakrywkowe.
Rysunek 2: Przygotowanie i montaż szkiełek nakrywkowych. (A) Kontur szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 25 mm odrysowano na arkuszu silikonu o grubości 1,6 mm. Kontur wycięto nożyczkami. Z przekładki silikonowej wycięto wstawkę o wymiarach 40 mm x 15 mm, a następnie zamocowano ją do szkiełka nakrywkowego. Naniesiono pasy. 15 µL na środku wstawki. (BDwa rzędy od 15 do 20 embrionów ułożono na płytce z agaru w obszarze o wymiarach mniejszych niż 40 mm x 15 mm, a następnie obszar ten wycięto za pomocą żyletki i szpachelki ze stali nierdzewnej.CWycięte fragmenty płytek z winogron umieszczono na wierzchu pustej szalki o średnicy 3,5 cm.D) Pod mikroskopem stereoskopowym opuszczono szkiełko cover-slip z etapu (A), a embriony przywarły do paska kleju. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Osuszanie i mikroiniekcja embrionów

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe z zarodkami na szkiełku przedmiotowym, aby zapobiec zabrudzeniu spodu szkiełka nakrywkowego podczas wysuszania i mikroiniekcji.
    UWAGA: Obrazowanie szkiełka nakrywkowego będzie odbywać się bez przymocowanego do niego szkiełka przedmiotowego. W związku z tym do obrazowania niezbędny jest mikroskop odwrócony.
  2. Wysuszaj zarodki przez 5-10 min, w zależności od temperatury w pomieszczeniu. Zarodki użyte do obrazowania w reprezentatywnych wynikach były wysuszane przez 7 min w temperaturze 20 °C w komorze zawierającej warstwę kulek żelu krzemianowego w stosunku 1:1 nad środkiem osuszającym (Rysunek 3A).
  3. Natychmiast po wysuszeniu pokryj zarodki mieszaniną oleju halocarbonowego 70 i oleju halocarbonowego 27 w stosunku 1:1. Wypełnij przekładkę silikonową do połowy wysokości.
    UWAGA: Ważne jest zmieszanie oleju halocarbonowego o wysokiej lepkości z olejem halocarbonowym o niskiej lepkości. Czysty olej halocarbonowy 70 (wysoka lepkość) spowalnia postęp cykli komórkowych 30 min po aplikacji. Mieszanina oleju halocarbonowego 700 i oleju halocarbonowego 27 w stosunku 1:1 eliminuje ten artefakt.
  4. Napełnij igły do mikroiniekcji substancją wstrzykiwaną, następnie zamontuj jedną z nich w mikroinjektorze i otwórz jej końcówkę pod ciśnieniem.
    UWAGA: Przećwicz krok 4.4 kilka razy przed przeprowadzeniem pełnego badania z użyciem cennych odczynników. Jest to najtrudniejszy etap procesu mikroiniekcji.
    1. Napełnij igły do mikroiniekcji 2 μL substancji wstrzykiwanej, używając przedłużonej końcówki do ładowania. Wymagana jest tylko jedna igła do mikroiniekcji, ale warto mieć w pobliżu zapasowe napełnione igły, dlatego przygotuj 2 lub 3 igły.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przedłużonych końcówek do ładowania znajdują się w Tabeli materiałów. Igieł do mikroiniekcji nie można napełnić bez przedłużonych końcówek do ładowania ze względu na specyfikę naszej techniki mikroiniekcji, która polega na wytworzeniu ciśnienia powietrza wewnątrz zamkniętej i napełnionej igły przed otwarciem jej końcówki.
    2. Zamontuj igłę w mikroinjektorze i wciśnij tłok w połowie drogi do końcówki. Celem jest zwiększenie ciśnienia powietrza wewnątrz szklanej kapilary (Rysunek 4A).  
      UWAGA: Używaj mikroinjektora tłokowego opartego na oleju mineralnym bez oleju mineralnego. Zamiast wytwarzać ciśnienie za pomocą oleju mineralnego, użyj tłoka do wytworzenia ciśnienia powietrza.
    3. Opuść szklaną igłę na szkiełko przedmiotowe i utnij końcówkę igły, używając nowej żyletki nr 9. Utnij igłę pod kątem 45°, aby uzyskać ostrą, otwartą końcówkę. Substancja wstrzykiwana powinna spłynąć na dno końcówki, nie wypływając z igły. Ostrożnie dodaj 20 μL oleju halocarbonowego na końcówkę igły i ponownie utnij ją pod kątem 45°. Substancja wstrzykiwana powinna zacząć szybko wypływać.
    4. Natychmiast obniż ciśnienie powietrza, cofając tłok, ale pamiętaj o zachowaniu ciągłego szybkości przepływu, aby zapobiec zapchaniu igły błoną zarodkową pomiędzy iniekcjami (Rysunek 4B).
      UWAGA: Jeśli substancja wstrzykiwana jest przezroczysta, obserwuj szybkość jej przepływu, podnosząc i opuszczając igłę do mikroiniekcji w oleju halocarbonowym i obserwując tempo tworzenia się kropli substancji wstrzykiwanej pod stereomikroskopem. Dostosuj ciśnienie powietrza, wciskając tłok o kilka kliknięć naraz, a następnie zanurzaj końcówkę do mikroiniekcji w oleju halocarbonowym i wyjmuj ją, aby sprawdzić tempo tworzenia się nowych kropli po korekcie.
    5. Użyj mikromanipulatora, aby ustawić igłę w centrum pola widzenia, następnie unieś igłę za pomocą mikromanipulatora i usuń szkiełko przedmiotowe spod niej. Igła jest teraz skalibrowana do iniekcji.

Schemat układu do suszenia z kuletkami żelu krzemionkowego; proces suszenia płytki do chromatografii, licznik 2min 45s.
Rysunek 3: Schemat komory do wysuszania. (A) Jest to schemat komory desykacyjnej. Komora składa się z warstwy kulek żelu krzemianowego i warstwy drierite w stosunku 1:1. W celu przeprowadzenia desykacji zarodki umieszczono na pokrywce płytki wielodołkowej. Komorę desykacyjną zamknięto na 7 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Mikroiniekcja zarodków
    1. Umieść zarodki na stole stereomikroskopu pod igłą do mikroiniekcji, ale nie obniżaj igły.
    2. Ustaw ostrość na zarodkach przy powiększeniu 50x.
    3. Obniżaj igłę, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ostrości co zarodki. Przesuwając preparat jedną ręką i obsługując mikroinjektor drugą, wykonaj iniekcję w jednym rzędzie zarodków.
    4. Podnieś igłę i obróć preparat o 180°, aby drugi rząd zarodków znalazł się pod igłą do mikroiniekcji. Obniż igłę i wykonaj iniekcję w drugim rzędzie zarodków.
      UWAGA: Staraj się przeprowadzić tę procedurę w czasie poniżej 10 min. Pozostaw kilka nieiniekcyjnych zarodków do wykorzystania jako kontrole.

Schemat mikroskopowy przedstawiający wpływ ciśnienia powietrza w układzie do mikroiniekcji; porównanie wysokiego i niskiego ciśnienia.
Rycina 4: Przygotowanie igły do mikroiniekcji. (A) Na tej ilustracji, Intensywność koloru magenta w igle reprezentuje ciśnienie powietrza. Załadowaną igłę zamontowano w mikroinżektorze, a tłok wysunięto o 50%, aby zwiększyć ciśnienie powietrza wewnątrz igły. Przed montażem należy upewnić się, że tłok jest maksymalnie cofnięty.BKońcówkę igły odcięto pod ciśnieniem, a tłok cofnięto w celu zmniejszenia ciśnienia powietrza i szybkości przepływu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Obrazowanie na analizatorze wysokoprzepustowym (HCA)

  1. Przed przeprowadzeniem tego testu należy utworzyć mapę płytki dla adaptera do szkiełek. Użyj edytora uchwytu płytek w menu Plate Map Manager, aby wprowadzić wymiary dla niestandardowego adaptera płytek.
    UWAGA: Utworzono niestandardową mapę płytek dla dostępnego w sprzedaży adaptera płytek (patrz Table of Materials). Mapa płytek zawiera następujące ustawienia: grubość szkiełka: 10 µm, wysokość dna: 1.607 mm, zmienność wysokości dna: 10 µm, materiał podłoża: szkło, grubość szkiełka cover slip: 150 µm, pozycja szkiełka cover slip: dół – rzędy: 1 – odstęp: 56.987 mm, kolumny: 4 – odstęp 28.391, rozmiar i kształt: prostokąt, szerokość 23.00 mm, wysokość: 73.0 mm, offset do A1 21.29 mm – 42.74 mm)
  2. Zamontuj adapter do szkiełek w mikroskopie i użyj funkcji Preview, aby stworzyć mozaikowy obraz w jasnym polu 10x szkiełka cover slip.
  3. Wybierz embrion z góry lub z dołu rzędu, następnie wybierz Objective i przełącz na obiektyw 60x (NA 0.95). Dobierz odpowiedni czas ekspozycji dla żądanego kanału fluorescencji.
    UWAGA: Podczas obrazowania żywych komórek należy utrzymywać intensywność lasera poniżej 25%.
  4. Na głównym panelu sterowania użyj funkcji Preview, aby stworzyć mozaikowy obraz fluorescencyjny 60x zawierający oba rzędy embrionów.
  5. Na głównym panelu sterowania wybierz rozwijane menu Binning i ustaw binning na 1 x 1 dla uzyskania optymalnej rozdzielczości.
  6. Użyj karty z Stack Setup, aby zdefiniować parametry stosów z (z-stacks).
    1. W karcie z Stack Setup użyj strzałek w górę i w dół, aby znaleźć, a następnie zdefiniować górną i dolną granicę stosu z. Po zdefiniowaniu granic górnej i dolnej wybierz zieloną ikonę ołówka, aby zapisać pozycję stosu z. Zanotuj pozycję stosu z, ponieważ zostanie ona wykorzystana w kroku 5.6.5.
    2. W karcie z Stack Setup użyj pola wprowadzania z Step, aby zdefiniować odstępy między przekrojami z.
      UWAGA: Całkowita liczba przekrojów jest określana poprzez modyfikację kroków 5.6.1 i 5.6.2.
    3. Na głównym panelu sterowania kliknij prawym przyciskiem myszy na Fluorescent Channel i użyj rozwijanego menu Image Mode , aby ustawić tryb obrazowania na 3D.
    4. Na głównym panelu sterowania zaznacz pole Laser Autofocus Box , aby wyłączyć autofokus.
    5. Na głównym panelu sterowania zdefiniuj Initial Focus, korzystając z pozycji stosu z kroku 5.6.1, a następnie zaznacz pole Initial Focus Box, aby wyłączyć funkcję „Refocus at each Time Point” (ponowne ustawianie ostrości w każdym punkcie czasowym).
  7. W karcie Fields użyj rozwijanego menu Field placement, aby włączyć Custom Points, a następnie użyj strzałek do wyboru punktów do obrazowania.
    UWAGA: Interwał czasowy między akwizycjami (krok 5.8) określi, ile niestandardowych punktów można obrazować jednocześnie.
  8. W karcie Time Series zaznacz pole Acquire Time Series, aby włączyć funkcję serii czasowych, a następnie zdefiniuj całkowitą liczbę punktów czasowych.
    UWAGA: 6 niestandardowych punktów x 5 przekrojów z x 80 stosów = 2 40 obrazów, 2 400 obrazów x 8.2 MB na obraz = 19.68 GB miejsca na dysku.
  9. Na głównym panelu sterowania użyj pola wprowadzania nazwy, aby nazwać ustawienia akwizycji, a następnie wybierz File i Save , aby zapisać ustawienia akwizycji.
  10. Na głównym panelu sterowania wybierz przycisk Scan, aby uruchomić akwizycję.

6. Przetwarzanie obrazów po akwizycji

  1. Przeciągnij i upuść plik xdce do programu Fiji, aby otworzyć serię obrazów jako wielowymiarowy hiperstos (hyperstack).
  2. Zapisz hiperstos jako plik tif.
  3. Utwórz projekcje maksymalnej intensywności i zapisz je jako pliki tif.
  4. Zbuduj bibliotekę projekcji maksymalnej intensywności oraz opracuj potok (pipeline) do ekstrakcji i analizy danych.

Wyniki

Podejście przedstawione w niniejszym protokole zostało wykorzystane do zbadania roli mikrotubul w reorganizacji siateczki śródplazmatycznej (ER) podczas mitozy w zarodku Drosophila15. Podczas mitozy struktura ER ulega gwałtownej reorganizacji, jednak siły napędzające te zmiany nie są dobrze poznane. Niedawno wykazano, że rodzina białek kształtujących ER promuje tworzenie się cewek ER25,26,27,28, które charakteryzują się bliskim sąsiedztwem mikrotubul28. Aby zbadać wpływ mikrotubul na morfologię ER, metody opisane w protokole posłużyły do wygenerowania danych pozwalających na ilościowe porównanie efektów kilku kuracji lekami wprowadzonymi drogą mikroiniekcji na reorganizację ER podczas mitozy. Stwierdzono, że kolchicyna, która zapobiega polimeryzacji nowych mikrotubul, drastycznie ogranicza reorganizację ER podczas mitozy, co przedstawiono na Rysunku 5 i Rysunku 6. Ponadto opisane tutaj podejście umożliwiło uzyskanie danych z obrazowania poklatkowego dla 32 zarodków. Pomiary średniej i maksymalnej intensywności wykonano dla 12 80 obszarów zainteresowania (ROI) przy użyciu specjalnego skryptu MATLAB, który wygenerował również statystyki opisowe i wnioskowanie statystyczne niezbędne do porównania efektów poszczególnych leków. Dzięki dostępności sond molekularnych i łatwości przeprowadzania mikroiniekcji, opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania różnych procesów biologicznych poprzez ilościowe oznaczanie intensywności fluorescencji.

Proces mikroskopii fluorescencyjnej, Rtn1-GFP, ReepB-GFP, analiza intensywności, eksperyment obrazowania komórkowego.
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP w biegunach wrzeciona podczas mitozy. (A) pole widzenia 60x dla ReepB-GFP podczas mitozy w 10. cyklu komórkowym. Niebieski kwadrat reprezentuje pole widzenia wykorzystane w panelach B-E. Panel A został przetworzony za pomocą binarnego filtra progowego. Filtr ten nie został zastosowany w panelach B-E, ponieważ wyklucza on dane z pikseli znajdujących się poniżej ustawionego progu. (B,D) ReepB-GFP w grupie kontrolnej oraz w grupie z kolchicyną. (C,E) Rtnl1-GFP w grupie kontrolnej oraz po zastosowaniu kolchicyny. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Diaz i wsp.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Intensywność fluorescencji Rtn1-GFP vs. ReepB-GFP; wykres liniowy; traktowanie 10 µM DMSO, 5 µM kolchicyną.
Rysunek 6: Ilościowe oznaczenie wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP w biegunach wrzeciona podczas mitozy. W przypadku 32 embrionów w następujących warunkach przeanalizowano po 20 ROI wrzecion i 20 ROI cytoplazmy w obrębie 10 klatek. (A) wstrzyknięcia kontrolne 10% DMSO dla Rtnl1-GFP. Zarodki kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p<0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami niepoddanymi iniekcji (p < 0,01 dla wszystkich próbek przy T210). (B) embriony ReepB-GFP wstrzyknięte z 10% DMSO w celu posłużenia jako grupa kontrolna. Embriony kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p<0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami niepoddanymi wtryskowi (Rysunek 1E; p < 0,01 dla wszystkich próbek w T210). (C) zarodki Rtnl1-GFP wstrzyknięte z 5 μM Kolchicyna. W tym przypadku zmierzono spadek wzbogacenia Rtnl1-GFP w wrzecionach (p < 0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z kontrolami (A) (p < 0,01 dla wszystkich próbek przy T210). (D) embriony ReepB-GFP po wstrzyknięciu 5 μM Kolchicyna. Odnotowaliśmy zmniejszenie wzbogacenia ReepB-GFP w wrzecionach (p<0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z grupami kontrolnymi (B) (p<0,01 dla wszystkich próbek w T210). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Diaz i wsp.15. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

1. Pasta drożdżowa212. Płytki z winogron213. Klej heptanowy24
1.1 Do probówki stożkowej o pojemności 50 ml dodać 7 gramów aktywnych suchych drożdży. Dodać 9 mililitrów wody dejonizowanej i wymieszać metalną szpatułką do uzyskania jednorodnej konsystencji.2.1 Przygotowanie roztworu a: Do kolby o pojemności 250 ml należy dodać 6 g agaru do 140 ml wody dejonizowanej (DI), a następnie poddać autoklawowaniu.3.1 Wypełnić szklaną fiolkę scyntylacyjną 50 calami taśmy dwustronnej.
1.1 Do probówki stożkowej o pojemności 50 ml należy dodać 7 g aktywnych suchych drożdży. Dodać 9 ml wody dejonizowanej (DI) i wymieszać metalną szpatułką do uzyskania jednorodnej konsystencji.2.2 Przygotowanie roztworu b: Wymieszać 0,1 g metyloparabenu w 2 ml etanolu, a następnie dodać ten roztwór do 60 ml koncentratu soku z grejpfruta.3.2 Dodać 20 ml heptanu i zamknąć szklaną fiolkę scyntylacyjną za pomocą parafilmu. Inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze pokojowej.
2.3 Bezpośrednio po autoklawowaniu roztworu a, dodać roztwór b i wlać mieszaninę do szalek Petriego o średnicy 10 x 35 mm. (pozwala to na przygotowanie 35 płytek z winogronem)3.3 Usunąć resztki plastikowej taśmy, przenosząc klej do dwóch probówek stożkowych o pojemności 15 ml i wirując przy 300 obr./min przez 15 minut.
2.4 Pozostaw płytki z agarosem z winogronami w temperaturze pokojowej na całą noc z otwartymi pokrywkami, aby stężały. Przykryj płytki pokrywkami i przechowuj w temperaturze 4°C.° po ich zastygnięciu.3.4 Przenieść nadsącz z kleju do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania.

Tabela 1: Składy pożywek i roztworów.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest bardzo wszechstronny i łatwy do dostosowania do badania zdarzeń biologicznych na różnych etapach rozwoju embrionalnego Drosophila. Protokół ten doskonale nadaje się do badania procesów biologicznych, które zachodzą w długich okresach czasu. Na przykład badania nad cellularyzacją29,30 lub tworzeniem domen heterochromatyny u Drosophila 31,32 mogą skorzystać z wykorzystania metod opisanych w tym protokole, ponieważ procesy te zachodzą przez dłuższy czas. Ponadto wielkość próby można zwiększyć poprzez zmniejszenie powiększenia w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości optycznej, takich jak czas między podziałami syncytialnymi33 lub czas trwania gastrulacji34. Podobnie, obiektyw 20x pozwala na zobrazowanie dwóch zarodków w jednej płaszczyźnie obrazowania. Metody zawarte w tym protokole stanowią dynamiczną platformę do zadawania pytań biologicznych przy użyciu rozwoju embrionalnego jako systemu modelowego do analizy ilościowej.

W tym protokole są 3 krytyczne kroki. Po dechorionacji w 50% wybielaczu konieczne jest energiczne przepłukanie i wysuszenie zarodków 5 razy (2.3.4). Ten krok usuwa wszelkie resztki małych kawałków kosmówki. Resztki kosmówki będą zasłaniać pole widzenia podczas obrazowania zarodka. Podczas umieszczania zarodków na szklanym szkiełku nakrywkowym (3.5) ważne jest, aby dociskać zarodki do kleju z równomiernym naciskiem. Spowoduje to umieszczenie zarodków na tej samej płaszczyźnie z. Podczas rozcinania igły do mikroiniekcji ważne jest, aby natychmiast wycofać tłok w celu wyregulowania natężenia przepływu igły, w przeciwnym razie pacjent straci cały wstrzykiwany płyn.

Nasze badanie było ograniczone przez dwa czynniki. Pierwszym czynnikiem był brak zautomatyzowanego procesu segmentacji. Zaprojektowaliśmy jednak skrypt do ręcznej segmentacji przy użyciu MATLAB; Dzięki genetycznie kodowanemu markerowi wrzeciona proces ten można zautomatyzować. W przyszłości chcielibyśmy produkować CNN-RFP21, Rtln1-GFP i CNN-RFP; Linie transgeniczne ReepB-GFP umożliwiające automatyczną segmentację wrzeciona. Aby uzyskać więcej informacji na temat naszego skryptu MATLAB i potoku analizy, zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi Diaz et al.15. Po drugie, byliśmy również ograniczeni przez nasz interwał akwizycji wynoszący 35 sekund, który pozwolił nam obrazować tylko 6 zarodków jednocześnie. Dłuższy odstęp między akwizycjami pozwoliłby nam na obrazowanie większej liczby zarodków jednocześnie. Chociaż wydajność dostarczania leków można zwiększyć, zastępując mikroiniekcję etapem przenikania, stwierdziliśmy, że jest to niepotrzebne, ponieważ wielkość naszej próby była już ograniczona przez interwał akwizycji.

Chociaż protokół ten został wykorzystany do zobrazowania rozwoju embrionalnego Drosophila , ogólne podejście można dostosować do badania rozwoju embrionalnego w innych wielokomórkowych systemach modelowych, takich jak C. elegans, jeżowce i Xenopus. Zarodki są niezwykle przydatne do analizy ilościowej, ponieważ można je łatwo zsynchronizować poprzez pobranie lub zapłodnienie. Ponadto zarodki nie poruszają się ani nie odpływają poza pole widzenia, co umożliwia wykorzystanie prostego oprogramowania do akwizycji wielopunktowej do tworzenia wielu filmów poklatkowych do analizy ilościowej. Chociaż w naszym badaniu użyliśmy analizatora o wysokiej zawartości, każdy system odwróconego mikroskopu zdolny do akwizycji wielopunktowej można sparować z metodami, o których mowa w niniejszym dokumencie.

Podobne wyniki można uzyskać przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z możliwością akwizycji wielopunktowej; Jednak zalety analizatora o wysokiej zawartości pojawiają się, gdy zwiększa się wielkość próby w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości w czasie. Oczywistą zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest możliwość jednoczesnego obrazowania 4 oddzielnych slajdów w porównaniu z 1 slajdem w tradycyjnych systemach. Dzięki pełnemu zestawowi 4 szkiełek i 40 zarodków na każdym szkiełku, 160 zarodków można obrazować w ciągu kilku godzin, o ile odstęp między klatkami wynosi co najmniej 15 minut. Kolejną ważną zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest to, że próbki są całkowicie odizolowane od wszelkich zewnętrznych źródeł światła, co jest niezbędne do pomiarów opartych na intensywności fluorescencji. Wreszcie, analizator o wysokiej zawartości zastosowany w naszym badaniu ma 5,5-megapikselową kamerę CMOS, która zapewnia duże pole widzenia 221,87 μm przy 60-krotnym powiększeniu. To większe pole widzenia umożliwiło nam zobrazowanie połowy zarodka w każdym punkcie akwizycji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

UD, WFM i BR są wspierane przez Center for Cellular Construction, Centrum Nauki i Technologii Narodowej Fundacji Nauki (NSF), na podstawie umowy o grant DBI-1548297. BR jest również wspierany przez nagrodę NSF CAREER, 1553695.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 x 35 mm Micro DishVWRCat #: 10799-192N/A
100% koncentrat soku winogronowegoWelch's, 100% koncentrat soku winogronowegoNie dotyczyKup w sklepie spożywczym
Kolby Erlenmeyera 250 ml, wąskie ustaVWRNr kat. #: 10536-914dotyczy
3-calowe niemetalowe sito nr 140Gilson CompanySV-165 #140Nie dotyczy
4 slajdów Obrazowanie TacaGrace BiolabsSKU: 400104N/A
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, do spektroskopiiFisher ScientificCat #: AC411255000N/A
Acros Organics, Etanol, 99.5%, Odczynnik ACS, bezwzględny, 200 proofFisher Scientific Cat# : AC615095000N/A
Acros Organics, 4-hydroksybenzoesan metylu, 99% . (metyloparaben )Fisher ScientificCat#: AC126961000N/A
Szkiełko nakrywkowe, prostokątne, 25 x 75mm, #1 Szkło floatFisher ScientificCat #: 50-143-782dotyczy
Materiał silikonowy Culture Well - grubość 1,6 mmGrace BiolabsSKU: 664273Nie dotyczy
DWK Life Sciences Wheaton 20 ml Fiolki scyntylacyjne z płynem PETFisher ScientificCat #: 03-341-71A Niedotyczy
Klatka do pobierania zarodków-MiniGenesee ScientificCat #: 59-105N/A
Końcówki do pipet Eppendorf MicroloaderFisherScientific Kod produktu: 10289651Nie dotyczy
Wirówka stożkowa Falcon 15 mlFisher ScientificCat #: 05-527-90dotyczy
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher ScientificCat #: 14-432-22Nie dotyczy
Fleischmann's, Aktywne suche drożdżeFleischmann'sN/AZakup w sklepie spożywczym
Talerze winogronoweODNIESIENIE DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURYNIEDOTYCZY NIE DOTYCZY
Olej Halocarbon 27 GeneseeScientificCat #: 59-133Nie dotyczy
Olej Halocarbon 700Genesee ScientificCat #: 59-131Nie dotyczy
Klej heptanowyODNOSI SIĘ DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURYNIEDOTYCZY NIE DOTYCZY
Przemysłowe żyletki (chirurgiczna stal węglowa) Jednosieczne nr 9VWR#: 55411-050Nie
Parafilm M Laboratoryjna folia uszczelniająca, rolka 4 cale x 250 stópFisher ScientificCat #: 50-998-944/A
Taśma dwustronna szkocka z dyspenserem, wąska szerokość, zaprojektowana do klejenia, 1/2" x 7 jardów, 3 w opakowaniu CaddyFisher ScientificCat #: NC0879005Nie dotyczy
Kulki żelu krzemionkowego, środek osuszający ~ 2 - 5 mmMillipore SigmaSKU: 1077351000dotyczy
łyżki/szpatułki ze stali nierdzewnejVWRNr kat. #: 470149-044Nie dotyczy
WA Hammond Drierite Wskazujące absorbentyFisher ScientificCat #: 23-116582dotyczy
Pasta drożdżowaREFFER TO PRZYGOTOWANIE RECEPTURYNIEDOTYCZY NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY
NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY < STRONG>EQUIPMENT
Allegra X-12 Wirówka, WirówkaBeckman CoulterN/APotrzebny będzie dostęp do stożkowych wkładów wirówkowych o pojemności 15 ml.
AutoklawNIE DOTYCZYNIE DOTYCZY Każdy autoklaw poradzi sobie dobrze.
Mikrowtryskiwacz Drummond Nanoject II.Drummond ScientificN/AJest to system wtryskowy na bazie oleju mineralnego.
Analizator komórek GE Healthcare IN 6000.GE healthcareN/AMożna zastąpić go szybkim mikroskopem konfokalnym zdolnym do akwizycji wielopunktowej.
Lodówka (4C°)N/AN/DPożywka przeciw muchom i pasta drożdżowa muszą być przechowywane w temperaturze (4C°).
Mikroskop stereoskopowy Zies Stemi 508 z podstawą transillumination 300 i górnym oświetleniem na gęsiej szyi.Zeiss MicroscopyN/ANiezbędna jest podstawa transillumination i oświetlenie na gęsiej szyi.
Nie Nie Nie Nr kat. dotyczy N Nie Nie

Bibliografia

  1. Zanella, F., Lorens, J., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Jennings, B. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  3. Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7 (5), 38147(2010).
  4. Bickle, M. The beautiful cell: high-content screening in drug discovery. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).
  5. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy based high content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  6. Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144(2018).
  7. Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  8. Letsou, A., Bohmann, D. Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).
  9. Sullivan, W., Theurkauf, W. The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo. Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).
  10. Schejter, E., Wieschaus, E. Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo. Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).
  11. Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos. Development. 103 (4), 675-686 (1988).
  12. Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development. Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).
  13. Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).
  14. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  15. Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis. PLoS One. 14 (12), 0226327(2019).
  16. Shibata, Y., et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).
  17. Bergman, Z., et al. Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo. PloS One. 10 (2), 0117859(2015).
  18. Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  19. Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells. The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).
  21. Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).
  22. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  23. Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).
  24. Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. Methods in Cell Biology. 67, Academic Press. 113-123 (2001).
  25. Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  26. Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules. Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).
  27. Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).
  28. Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network. The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).
  29. Loncar, D., Singer, S. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  30. Mazumdar, A., Mazumdar, M. How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster. Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).
  31. Yuan, K., O'Farrell, P. TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos. Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).
  32. Walther, M., et al. Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis. Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).
  33. McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos. Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).
  34. Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protokół mikroiniekcjiblastoderm syncytyalnyobrazowanie embrionówzautomatyzowana akwizycja wielopunktowaolej halocarbonowyigły do mikroiniekcjiobrazowanie time-lapse
Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.