Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Streszczenie

Nowoczesne podejścia do ilościowego obrazowania żywych komórek stały się podstawowym narzędziem do badania biologii komórki, umożliwiając wykorzystanie statystyk i modelowania komputerowego do klasyfikowania i porównywania procesów biologicznych. Chociaż systemy modelowania kultur komórkowych doskonale nadają się do obrazowania o wysokiej zawartości, wysokoprzepustowe badania morfologii komórek sugerują, że hodowle ex vivo są ograniczone w rekapitulacji złożoności morfologicznej komórek w organizmach żywych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na skalowalny system modelowy o wysokiej przepustowości do obrazowania żywych komórek w nienaruszonym organizmie. Opisano tutaj protokół korzystania z analizatora obrazu o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego pozyskiwania wielu filmów poklatkowych przedstawiających rozwój embrionalny Drosophila melanogaster w stadium blastodermy syncytialnej. Blastoderma syncytialna tradycyjnie służyła jako doskonały model in vivo do obrazowania zdarzeń biologicznych; Jednak uzyskanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych dla podejść ilościowych i wysokoprzepustowych było pracochłonne i ograniczone przez obrazowanie pojedynczego zarodka na powtórzenie eksperymentalne. Przedstawiono tutaj metodę adaptacji metod obrazowania i mikroiniekcji do systemu obrazowania o wysokiej zawartości lub dowolnego mikroskopu odwróconego zdolnego do automatycznej akwizycji wielopunktowej. Takie podejście umożliwia jednoczesne pozyskanie 6-12 zarodków, w zależności od pożądanych czynników akwizycji, w ramach jednej sesji obrazowania.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 30 lat, postęp w technologiach obrazowania i sondach molekularnych do obrazowania żywych komórek poszerzył nasze zrozumienie złożoności i wewnętrznego funkcjonowania komórki. Postępowi technologicznemu towarzyszy większe uzależnienie od modeli hodowli komórkowych ex vivo w celu pozyskiwania danych obrazowych o wysokiej przepustowości. Modele hodowli komórkowych zapewniają szereg korzyści, w tym kontrolę mikrośrodowiska za pomocą systemów mikroprzepływowych oraz możliwość jednoczesnego obrazowania wielu komórek, co umożliwia stosowanie podejść ilościowych niezbędnych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych^1,2. Istnieją jednak również istotne wady związane z modelami hodowli komórkowych w kontekście badań morfologicznych, takie jak dwuwymiarowe powierzchnie szklane lub plastikowe powodujące zakłócający wpływ na morfologię komórki i jej regulację^3,4,5. Efekty te mogą dostarczyć fałszywych lub wprowadzających w błąd danych w odniesieniu do badania procesów biologicznych regulujących morfologię komórkową.

Chociaż alternatywą było badanie morfologii komórek w kontekście nienaruszonego organizmu⁶, niewiele odpowiednich nienaruszonych organizmów umożliwia wysokoprzepustowe ilościowe obrazowanie żywych komórek ze względu na trudności w utrzymaniu całych organizmów przy życiu poprzez obrazowanie zewnętrzne oraz wyzwania związane z obrazowaniem wewnątrz dużego organizmu wielokomórkowego. W rezultacie, badania biologiczne komórek w nienaruszonych organizmach na ogół koncentrowały się na obserwacji pojedynczego organizmu w czasie, co znacznie ogranicza wielkość próby. Ponadto to ograniczenie "jedno zwierzę na raz" sprawia, że obrazowanie na żywo w formie ekranu jest trudne i kosztowne, a także ogranicza możliwość zastosowania ilościowych narzędzi analitycznych, ponieważ liczba próbek jest na ogół zbyt mała. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na wielokomórkowy organizm modelowy, który może być wykorzystany do podejść ilościowych opartych na wysokiej zawartości.

Ten protokół dostosowuje zarodek Drosophila do obrazowania na płytkach o wysokiej zawartości, aby wygenerować eksperymentalne rozmiary próbek wystarczająco duże do analizy ilościowej. Drosophila melanogaster jest powszechnie znana jako pierwszy organizm modelowy. Badania z wykorzystaniem Drosophila doprowadziły do przełomowych odkryć w biologii komórkowej i molekularnej, w tym w przekazywaniu informacji genetycznej, identyfikacji szlaków sygnalizacji komórkowej i genetycznych wymaganiach rozwoju embrionalnego^7,8,9. Ponadto zarodek Drosophila został wykorzystany do zbadania in vivo dynamiki mikrotubul podczas podziału komórkowego^10,11,12. Zastosowanie mikroiniekcji do dostarczania małych cząsteczek i sond molekularnych zapewnia kontrolę czasową, która sprawia, że rozwój embrionalny Drosophila jest szczególnie skuteczny w badaniu procesów komórkowych in vivo^13,14. Jednak generowanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych przy użyciu tradycyjnego podejścia do obrazowania jest niezwykle pracochłonne i ma ograniczone zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych i analizach ilościowych. Nasze podejście wykorzystuje analizator o wysokiej zawartości, zwykle zarezerwowany do analizy pojedynczych komórek i dostosowuje analizę obrazowania in vivo w syncytium wczesnego Drosophila embryo.

Ten protokół został użyty do pobrania, etapowania i mikroiniekcji zarodków Drosophila w celu zbadania mechanizmów, które napędzają zmiany morfologiczne w retikulum endoplazmatycznym (ER) podczas mitozy¹⁵. Chociaż wiele badań nakreśliło dynamiczną naturę ER podczas cyklu komórkowego^16,17,18,19, trudno było porównać wpływ wielu zaburzeń w czasie na morfologię ER. Aby zidentyfikować komponenty, które napędzają zmiany w morfologii ER podczas podziału komórki, metody wymienione w tym protokole wykorzystano do zbadania roli mikrotubul i innych czynników cytoszkieletu w mitotycznej reorganizacji ER przy użyciu korowego podziału syncytialnego we wczesnym zarodku Drosophila. Podsumowując, dostępność zaburzeń genetycznych w społeczności Drosophila, możliwość mikroiniekcji leków i sond molekularnych w precyzyjnych momentach rozwoju oraz niedrogie koszty pracy z Drosophila sprawiają, że podejście to jest wysoce podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe oparte na obrazach. Opisane tutaj metody mają zastosowanie do badania szerokiej gamy procesów komórkowych i rozwojowych in vivo przy użyciu klasy Drosophila embryo20. W szczególności protokół ten jest dobrze przystosowany do badania zdarzeń biologicznych, które zachodzą w dłuższym okresie i w promieniu 100 mikronów od kory zarodka Drosophila.

Protokół

UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi pożywek i roztworów.

1. Ustawianie i utrzymywanie klatki do pobierania zarodków do analizy na żywo²¹

1. Wypełnij klatkę do pobierania świeżych zarodków świeżymi muchami.
   UWAGA: Chociaż zalecane są dostępne na rynku klatki do zbierania odpadów, klatki do zbierania można łatwo zbudować z pustych butelek po muchach²¹.
   1. Dorosłe muchy należy wyrzucić lub przenieść z butelek, gdy wiele poczwarek zaczyna ciemnieć w stadium p14; w temperaturze 20 °C następuje to około 14 dni po złożeniu jaj²².
   2. Pozwól poczwarkom się wykluć i zapełnij butelki przez 12-24 godziny.
   3. Przenieś świeże muchy do małej klatki zbiorczej za pomocą małego lejka nad otworem klatki zbiorczej, aby zapobiec ucieczce much. Połącz do 3 butelek, aby stworzyć gęsto zaludnioną klatkę zawierającą od 200 do 500 much.
   4. Przenieś muchy do klatki zbiorczej, kilkakrotnie stukając butelką z muchami o twardą powierzchnię (aby ogłuszyć muchy). Następnie otwórz i odwróć butelkę muchową nad lejkiem klatki zbiorczej. Postukaj kilka razy otwartą butelką o klatkę zbiorczą, aby wrzucić muchy do klatki zbiorczej.
   5. Zamknij otwartą butelkę muchową, szybko odkładając ją na korek. Przenosząc otwartą butelkę muchową z lejka do korka, upewnij się, że otwór butelki jest skierowany w dół, ponieważ muchy mają tendencję do czołgania się w górę z dala od źródła stukania.  
   6. Dociśnij lejek do otworu klatki na muchy i kilkakrotnie postukaj klatką o twardą powierzchnię, aby ogłuszyć muchy w środku. Natychmiast wyjmij lejek i przymocuj świeży talerz winogronowy do otworu klatki na muchy. Użyj taśmy do etykietowania, aby zabezpieczyć talerz z winogronami. Powtórz ten proces, aby połączyć do 3 butelek w celu wytworzenia gęsto wypełnionej klatki zbiorczej.
      UWAGA: Alternatywnie, muchy można znieczulić za pomocą CO₂ lub innych środków nasennych much; Spowoduje to jednak wydłużenie okresu aklimatyzacji w kroku 1.2.
2. Zaaklimatyzuj nową klatkę zbiorczą na 24-48 godzin. W przypadku użycia CO₂ lub jakichkolwiek innych środków nasennych należy zaaklimatyzować klatkę do pobierania przez co najmniej 48 godzin.
   1. Zamień talerz winogronowy w klatce zbiorczej na świeży zawierający pastę drożdżową dwa razy dziennie w odstępie 8-10 godzin.
3. Ustawiaj nową klatkę zbiorczą co 5 dni.

2. Pobieranie i przygotowanie zarodków do obrazowania

1. Pozyskiwanie zarodków o zsynchronizowanym rozwoju
   1. Wymień talerz winogronowy na klatce zbiorczej na świeży z odrobiną pasty drożdżowej na środku. Pozwól muchom złożyć zarodki przez 1 godzinę. Wyrzuć stary talerz winogronowy.
      UWAGA: Muchy mogą zapładniać zarodki przed ich złożeniem. Pierwsza płytka pobraniowa będzie zawierała wiele z tych wstępnie rozwiniętych zarodków. Umożliwienie muchom pozbywania się starych zarodków w pierwszej kolejności poprawi synchronizację rozwojową między zarodkami.
   2. Wymień talerz winogronowy na świeży z odrobiną pasty drożdżowej w środku i pozwól muchom złożyć zarodki przez 10 minut. Wyrzuć stary talerz winogronowy.
      UWAGA: Aby uniknąć spowolnienia rozwoju embrionalnego na zimnych talerzach, przed użyciem podgrzej talerz winogronowy i pastę drożdżową do temperatury pokojowej.
   3. Wymień talerz winogronowy na świeży (bez pasty drożdżowej) i zachowaj stary talerz winogronowy, ma zarodki do obrazowania. W razie potrzeby należy kontynuować pobieranie zarodków z klatki, powtarzając kroki 2.1.2 i 2.1.3.
2. Wiek: zbieraj zarodki przez 30-45 minut, aby zobrazować podziały syncytialne²³.
   UWAGA: Aby zobrazować stadium blastodermy syncytialnej w rozwoju embrionalnym, zarodki muszą zostać zamontowane i umieszczone pod mikroskopem w ciągu 90 minut od pobrania. Próbując zastosować ten protokół po raz pierwszy, należy postarzyć zarodki o 10-20 minut w kroku 2.2, aby zapewnić dodatkowy czas na przygotowanie się między krokami.
3. Dekorionate zarodki za pomocą 50% wybielacza w wodzie DI.
   1. Przenieś starzejące się zarodki z kroku 2.2 na sito 140 nm, wypełniając talerz winogronowy wodą DI, delikatnie usuwając zarodki pędzlem i wlewając wodę z zarodkami do sita 140 nm (Rysunek 1A).
      UWAGA: Można to zrobić nad zlewem lub zlewką o pojemności 1,000 ml.
   2. Energicznie spłucz zarodki wodą DI za pomocą butelki ze spryskiwaczem. Wysuszyć zarodki, osuszając sito na suchym ręczniku papierowym. Osusz sitko, aż przestanie pozostawiać ślady wody na ręczniku papierowym (Rysunek 1B).
      UWAGA: Usuń całą pastę drożdżową z zarodków, ponieważ może to sprawić, że wybielanie będzie nieskuteczne w następnym kroku.
   3. Napełnij pusty 10-centymetrowy talerz świeżo przygotowanym 50% wybielaczem rozcieńczonym wodą DI (wybielacz 1:1: woda DI). Zanurz sitko w 50% wybielaczu na 2 min 45 s. Uruchom stoper, gdy tylko sito dotknie 50% wybielacza. Osusz sitko i wyjmij je z 50% wybielacza 3-4 razy w ciągu pierwszych 15 sekund, aby rozbić grudki zarodków (Rysunek 1C).
   4. Energicznie spłucz zarodki wodą demineralizowaną za pomocą butelki ze spryskiwaczem. Osusz zarodki, osuszając sito na suchym ręczniku papierowym. Powtórz energiczny proces suszenia płukania i suszenia blot przez 5x (Rysunek 1D).
      UWAGA: Jest to najważniejszy krok do usunięcia resztek kosmówki. Użyj pełnej butelki do spryskiwania DI i użyj połowy butelki na tym etapie.
   5. Przenieś wysuszone zarodki z sita na 10 cm talerze winogronowe za pomocą pędzla²¹ (Rysunek 1E)
      UWAGA: Ręczne chlorowanie może być stosowane jako alternatywa dla dekoracji wybielaczem²⁴.

Rycina 1: Dechorionacja zarodka. (A) Zarodki zebrano za pomocą butelki do zraszania DI H20, pędzla i sita o długości fali 140 nm. (B) Zarodki energicznie przepłukano za pomocą butelki z płynem do spryskiwania DI H20 i osuszono na ręczniku papierowym. (C) Dechorionację zarodków przeprowadzono w 50% wybielaczu przez 2 minuty i 45 s. (D) Zarodki energicznie przepłukano za pomocą butelki do spryskiwania DI H20 i osuszono na ręczniku papierowym. Powtórzono to 4 razy, aby usunąć nadmiar kosmówki. (E) Zarodki następnie przeniesiono na 10-centymetrowy talerz winogronowy za pomocą pędzla. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Mocowanie zarodków do szkiełek nakrywkowych

1. Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlenie na gęsiej szyi ułóż dwa rzędy po 15-20 zarodków na czystej części talerza winogronowego za pomocą narzędzia do zbierania jaj. Ustaw zarodki po ich brzusznej stronie w tej samej orientacji w stosunku do przedniego i tylnego końca. Aby zbieracze jaj zginali pęsetę ze stali nierdzewnej z cienką końcówką pod kątem 45°. Aby sprawdzić orientację zarodków D/V, zobacz Campos-Ortega et al.²⁰.
   UWAGA: Ważne jest, aby powierzchnia brzuszna znajdowała się na talerzu winogronowym, ponieważ zarodki zostaną przyciśnięte do szkiełka nakrywkowego w kroku 3.5, odsłaniając powierzchnię grzbietową do obrazowania. Ponieważ powierzchnia grzbietowa jest znacznie bardziej płaska niż powierzchnia brzuszna, obrazowanie powierzchni strony grzbietowej zwiększa liczbę jąder obecnych w pojedynczej płaszczyźnie Z.
2. Przygotować silikonowe szkiełko nakrywkowe dystansowe o wymiarach 75 mm x 25 mm.
   UWAGA: Można to przygotować z wyprzedzeniem. Przygotuj kilka szkiełek nakrywkowych i przechowuj je w pudełku na szkiełka, aby utrzymać je w czystości.
   1. Odrysuj kontur szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 25 mm na silikonowym arkuszu dystansowym o grubości 1,6 mm i wytnij silikonową przekładkę za pomocą nożyczek (Rysunek 2A).
   2. Za pomocą żyletki wytnij wstawkę o wymiarach 40 mm x 15 mm z przekładki (Rysunek 2A).
   3. Przyklej przekładkę do szkiełka nakrywkowego i rozprowadź 10 μl kleju heptanowego po odsłoniętej wstawce szkła nakrywkowego (Rysunek 2A).
      UWAGA: Odłożenie i wyrównanie smugi zapewni obrazowanie zarodków na tej samej płaszczyźnie z.
3. Podczas gdy klej heptanowy z kroku 3.2.3 wyschnie, wytnij prostokątny fragment talerza winogronowego zawierającego zarodki z kroku 3.1.
   1. Użyj żyletki, aby wyciąć prostokąt (mniejszy niż 40 mm x 15 mm) wokół dwóch rzędów zarodków. Nie usuwaj jeszcze prostokąta.
   2. Wytnij drugi prostokąt obok pierwszego. Usuń drugi prostokąt za pomocą prostej krawędzi szpatułki ze stali nierdzewnej.
   3. Ostrożnie wsuń prostą krawędź szpatułki ze stali nierdzewnej pod pierwszy prostokąt i wyjmij ją (Rysunek 2B).
4. Umieść wycięty talerz winogronowy z zarodkami na zewnętrznej stronie naczynia o średnicy 3,5 cm (Rysunek 2C).
5. Pod mikroskopem stereoskopowym opuść przygotowane szkiełko nakrywkowe na zarodki i delikatnie dociśnij dwa rzędy zarodków do kleju (Ryc. 2D).
6. W przypadku mikroiniekcji zarodków należy przejść do kroku 4.1. Jeśli mikroiniekcja nie jest wykonywana, przejdź do kroku 3.7.
7. Przykryj zarodki, wypełniając silikonową przekładkę (w połowie wysokości do góry) olejem halowęglowym 1:1 700: olejem halowęglowym 27.
8. Wyłóż dolne krawędzie 4-suwakowego adaptera płyty taśmą dwustronną, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego, ale upewnij się, że nie umieszczasz taśmy na ścieżce soczewki obiektywu. Ta taśma jest krytyczna. Jeśli szkiełko nakrywkowe znajduje się tylko na adapterze, będzie się przesuwać przez cały czas akwizycji. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na adapterze z 4 płytami ślizgowymi.

Rysunek 2: Przygotowanie i montaż szkiełek nakrywkowych. (A) Na arkuszu silikonu o grubości 1,6 mm narysowano kontur szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 25 mm. Użyj nożyczek, aby wyciąć kontur. Wkładki o wymiarach 40 mm x 15 mm zostały wycięte z silikonowej przekładki, a następnie zamontowane na szkiełku nakrywkowym. Smugi 15 μl wzdłuż środka wstawki. (B) Dwa rzędy po 15-20 zarodków zostały zorganizowane na talerzu winogronowym na obszarze mniejszym niż 40 mm x 15 mm, a następnie obszar ten został wycięty za pomocą brzytwy i szpatułki ze stali nierdzewnej. (C) Wycięty talerz winogronowy kładziony był na wierzchu pustego naczynia o średnicy 3.5 cm. (D) Pod mikroskopem stereoskopowym szkiełko nakrywkowe z (A) zostało opuszczone, a zarodki przyklejono do smugi kleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Wysuszanie i mikroiniekcja zarodków

1. Umieść szkiełko nakrywkowe z zarodkami na szkiełku podstawowym, aby zapobiec zabrudzeniu dolnej części szkiełka nakrywkowego podczas suszenia i mikroiniekcji.
   UWAGA: Szkiełko nakrywkowe zostanie zobrazowane bez dołączonego do niego slajdu. Dlatego do obrazowania niezbędny jest mikroskop odwrócony.
2. Wysuszać zarodki przez 5-10 minut, w zależności od temperatury w pomieszczeniu. Zarodki użyte do obrazowania w reprezentatywnych wynikach suszono przez 7 minut w temperaturze 20 °C w komorze zawierającej warstwę kulek żelu krzemionkowego w proporcji 1:1 nałożoną na środek suszący (Rysunek 3A).
3. Natychmiast po wysuszeniu przykryj zarodki olejem halowęglowym 1:1 700: olejem halowęglowym 27. Napełnij silikonową przekładkę do połowy.
   UWAGA: Ważne jest, aby mieszać olej halowęglowy o wysokiej lepkości z olejem halowęglowym o niskiej lepkości. Czysty olej halowęglowy 700 (o wysokiej lepkości) spowalnia postęp cykli komórkowych 30 minut po aplikacji. Mieszanina oleju halowęglowego 700 i oleju halowęglowego 27 w stosunku 1:1 utrwaliła ten artefakt.
4. Załaduj igły do mikroiniekcji środkiem do wstrzykiwań, a następnie zamontuj jedną z nich na mikrowtryskiwaczu i rozetnij ją pod ciśnieniem.
   UWAGA: Przećwicz krok 4.4 kilka razy przed wykonaniem pełnego testu z jakimikolwiek cennymi odczynnikami. Jest to najtrudniejszy etap w procesie mikroiniekcji.
   1. Załadować igły do mikroiniekcji 2 μl środka do wstrzykiwań za pomocą przedłużonej końcówki ładującej. Wymagana jest tylko jedna igła do mikroiniekcji, ale dobrze jest mieć pod ręką zapasowe załadowane igły, więc przygotuj 2 lub 3 igły.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami dotyczącymi przedłużonych końcówek ładowania. Igły do mikroiniekcji nie mogą być ładowane bez przedłużonych końcówek ładujących ze względu na unikalny charakter naszej techniki mikroiniekcji, która polega na wytwarzaniu ciśnienia powietrza wewnątrz szczelnie zamkniętej i obciążonej igły przed otwarciem jej końcówki.
   2. Zamontuj igłę na mikrowstrzykiwaczu i wciśnij tłok do połowy końcówki. Celem jest zwiększenie ciśnienia powietrza wewnątrz szklanej kapilary (Rysunek 4A).
      UWAGA: Użyj mikrowtryskiwacza na bazie oleju mineralnego bez oleju mineralnego. Zamiast zwiększać ciśnienie za pomocą oleju mineralnego, użyj tłoka, aby wytworzyć ciśnienie powietrza.
   3. Opuść szklaną igłę na szklane szkiełko i rozetnij końcówkę igły za pomocą nowej maszynki do golenia #9. Przeciąć igłę pod kątem 45°, aby uzyskać ostrą, otwartą końcówkę. Wstrzykiwacz powinien spływać na dno końcówki, nie wypływając z igły. Ostrożnie dodaj 20 μl oleju halowęglowego na końcówkę igły i ponownie rozetnij ją pod kątem 45°. Wstrzykiwacz powinien zacząć szybko płynąć.
   4. Natychmiast obniżyć ciśnienie powietrza poprzez cofnięcie tłoka, ale upewnić się, że utrzymuje się ciągłe natężenie przepływu, aby zapobiec zatkaniu igły błoną zarodkową między wstrzyknięciami. (Rysunek 4B).
      UWAGA: Jeśli wstrzykiwacz jest czysty, view natężenie przepływu wstrzykiwacza, podnosząc igłę do mikroiniekcji i wyjmując ją z oleju halowęglowego i obserwując szybkość tworzenia się kropelek wstrzykiwacza pod mikroskopem stereoskopowym. Wyreguluj ciśnienie powietrza, naciskając tłok po kilka kliknięć na raz, a następnie zanurzaj końcówkę mikrowtrysku w oleju halowęglowym, aby wyświetlić szybkość tworzenia się nowych kropel po regulacji.
   5. Za pomocą mikromanipulatora ustaw igłę w środku pola widzenia, a następnie podnieś igłę za pomocą mikromanipulatora i wyjmij spod niej szkiełko. Igła jest teraz skalibrowana do wstrzykiwań.

Rysunek 3: Schemat komory osuszania. (A) To jest schemat komory osuszającej. Komora składa się z warstwy kulek żelu krzemionkowego w proporcji 1:1 na warstwie dryrytu. Aby przeprowadzić suszenie, zarodki umieszczono na pokrywie płytki z jednym dołkiem. Komora osuszania została zamknięta na 7 minut. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Zarodki do mikroiniekcji
   1. Umieścić zarodki na stoliku mikroskopu stereoskopowego pod igłą do mikroiniekcji, ale nie opuszczać igły.
   2. Skoncentruj się na zarodkach w 50-krotnym powiększeniu.
   3. Opuścić igłę, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ostrości co zarodki. Przesuwając szkiełko jedną ręką i obsługując mikrowstrzykiwacz drugą wstrzyknąć jeden rząd zarodków.
   4. Podnieś igłę i obróć suwak o 180°, aby wystawić drugi rząd zarodków na działanie igły do mikroiniekcji. Opuścić igłę i wstrzyknąć drugi rząd zarodków.
      UWAGA: Spróbuj to zrobić w mniej niż 10 minut. Pozostawić kilka niewstrzykniętych zarodków do wykorzystania jako kontrola.

Rycina 4: Przygotowanie igły do mikroiniekcji. (A) Na tej ilustracji intensywność magenty w igle jest reprezentatywna dla ciśnienia powietrza. Załadowana igła została zamontowana na mikrowtryskiwaczu, a tłok został wysunięty o 50%, aby zwiększyć ciśnienie powietrza wewnątrz igły. Przed montażem upewnij się, że tłok jest maksymalnie cofnięty. (B) Końcówka igły została przecięta pod ciśnieniem, a tłok został cofnięty w celu zmniejszenia ciśnienia powietrza i natężenia przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Obrazowanie na analizatorze o wysokiej zawartości

1. Przed uruchomieniem tego testu należy utworzyć mapę płyt dla adaptera suwaka. Użyj edytora uchwytów blach znajdującego się w menu Menedżer mapy blachy, aby wprowadzić wymiar dla niestandardowego adaptera blachy.
   UWAGA: Dla dostępnego na rynku adaptera do płyt wykonano niestandardową mapę tablic rejestracyjnych (patrz Tabela materiałów). Mapa tablic zawiera następujące ustawienia; Grubość szkiełka: 1000 μm, Wysokość dna: 1.607 mm, zmienność wysokości dna: 100 μm, materiał podłoża: szkło, grubość szkiełka nakrywkowego: 150 μm, pozycja szkiełka nakrywkowego: dół – rzędy: 1 – rozstaw: 56.987 mm, kolumny: 4 – rozstaw 28.391, rozmiar i kształt: prostokąt, szerokość 23.00 mm, wysokość: 73.00 mm, przesunięcie do A1 21.29 mm – 42.74 mm)
2. Załaduj adapter szkiełka do mikroskopu i użyj funkcji Podgląd, aby ułożyć kafelkowanie 10-krotnego obrazu szkiełka nakrywkowego w jasnym polu.
3. Wybierz zarodek z góry lub z dołu rzędu, a następnie wybierz Obiektyw i przełącz na 60x (NA 0,95). Określ odpowiednią ekspozycję dla żądanego kanału fluorescencji.
   UWAGA: Utrzymuj intensywność lasera poniżej 25% w przypadku obrazowania żywych komórek.
4. Na głównym pulpicie nawigacyjnym użyj funkcji Podgląd, aby podzielić na kafelki fluorescencyjny obraz 60x zawierający oba rzędy zarodków.
5. Na głównym pulpicie nawigacyjnym wybierz menu rozwijane Binning (Kwantowanie) i ustaw kategoryzację na 1 x 1, aby uzyskać optymalną rozdzielczość.
6. Zakładka Z, Stack Setup (Ustawienia stosu z), służy do definiowania parametrów dla stosów z.
   1. Na karcie Konfiguracja stosu z użyj strzałek w górę i w dół, aby znaleźć, a następnie zdefiniować górne i dolne limity stosu z. Po zdefiniowaniu górnych i dolnych limitów wybierz ikonę zielonego ołówka, aby zapisać pozycję stosu z. Zwróć uwagę na pozycję stosu z, która będzie używana w kroku 5.6.5.
   2. Na karcie Ustawienie stosu z użyj pola wprowadzania kroku z, aby zdefiniować odstępy między plasterkami z.
      UWAGA: Całkowita liczba plasterków jest określana przez modulację kroku 5.6.1 i 5.6.2.
   3. Na głównym pulpicie nawigacyjnym kliknij prawym przyciskiem myszy kanał fluorescencyjny i użyj menu rozwijanego Tryb obrazu, aby ustawić tryb obrazowania na 3D.
   4. Na głównej desce rozdzielczej wybierz pole Autofokus laserowy, aby wyłączyć autofokus.
   5. Na głównym pulpicie nawigacyjnym zdefiniuj początkowy fokus z pozycją z-stack z kroku 5.6.1, a następnie zaznacz pole początkowego fokusu, aby wyłączyć funkcję "Ponowne skupienie w każdym punkcie czasowym".
7. Na karcie Pola użyj menu rozwijanego Położenie pola, aby włączyć opcję Punkty niestandardowe, a następnie użyj strzałek, aby wybrać punkty do obrazowania.
   UWAGA: Odstęp czasu między akwizycjami (krok 5.8) określi, ile niestandardowych punktów można obrazować jednocześnie.
8. Na karcie Szeregi czasowe zaznacz pole wyboru Uzyskaj szeregi czasowe, aby włączyć funkcję szeregów czasowych, a następnie zdefiniuj łączną liczbę punktów czasowych.
   UWAGA: 6 niestandardowych punktów x 5 plasterków z x 80 stosów = 2 400 obrazów, 2 400 obrazów x 8,2 MB na obraz = 19,68 GB miejsca na dysku.
9. Na głównym pulpicie nawigacyjnym użyj pola wprowadzania nazwy, aby nazwać ustawienia pozyskiwania, a następnie wybierz pozycję Plik i Zapisz, aby zapisać ustawienia pozyskiwania.
10. Na głównym pulpicie nawigacyjnym wybierz przycisk Skanuj, aby uruchomić akwizycję.

6. Przetwarzanie obrazu po

1. Przeciągnij i upuść plik xdce na Fidżi, aby otworzyć serię obrazów jako wielowymiarowy hyperstack.
2. Zapisz hyperstack jako plik tif.
3. Twórz projekcje maksymalnej intensywności i zapisuj je jako pliki tif.
4. Zbierz bibliotekę projekcji maksymalnej intensywności i zbuduj potok do ekstrakcji i analizy danych.

Wyniki

Podejście przedstawione w tym protokole zostało wykorzystane do zbadania roli mikrotubul w reorganizacji retikulum endoplazmatycznego (ER) podczas mitozy u zarodka Drosophila¹⁵. Podczas mitozy struktura ER wykazuje dramatyczną reorganizację, jednak siły, które napędzają te zmiany, są słabo poznane. Niedawno wykazano, że rodzina białek kształtujących ER sprzyja tworzeniu kanalików ER^25,26,27,28, które są znane ze swojego bliskiego sąsiedztwa z mikrotubulami²⁸. Aby zbadać rolowanie mikrotubul na morfologię ER, metody przedstawione w protokole wykorzystano do wygenerowania danych do ilościowego porównania wpływu kilku terapii mikroiniekcjami leków na reorganizację ER podczas mitozy. Stwierdzono, że kolchicyna, która zapobiega polimeryzacji nowych mikrotubul, drastycznie zmniejsza reorganizację ER podczas mitozy, jak pokazano na Rysunek 5 i Rysunek 6. Co więcej, opisane tutaj podejście umożliwiło uzyskanie danych obrazowania poklatkowego dla 32 zarodków. Pomiary średniej i maksymalnej intensywności zostały wykonane z 12 800 obszarów zainteresowania przy użyciu niestandardowego skryptu MATLAB, który wygenerował również statystyki opisowe i wnioskowania niezbędne do porównań między terapiami farmakologicznymi. Ze względu na dostępność sond molekularnych i łatwość mikroiniekcji, opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania różnych procesów biologicznych poprzez kwantyfikację intensywności fluorescencji.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP na biegunach wrzeciona podczas mitozy. (A) 60-krotne pole widzenia ReepB-GFP podczas mitozy w cyklu komórkowym 10. Niebieski kwadrat reprezentuje pole widzenia używane dla paneli B-E. Panel A jest przetwarzany za pomocą progowego filtru binarnego. Ten filtr nie został zastosowany do paneli B-E, ponieważ wyklucza dane z pikseli poniżej ustawionego progu. (B,D) ReepB-GFP w kontroli i w kolchicynie. (C,E) Rtnl1-GFP w kontroli i w kolchicynie. Ten rysunek został zmodyfikowany z Diaz et al.¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Kwantyfikacja wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP na biegunach wrzeciona podczas mitozy. Przeanalizowano 20 wrzecion i 20 zwrotów ROI cytoplazmy w 10 klatkach dla 32 zarodków w następujących warunkach. (A) 10% wstrzyknięcia kontrolne DMSO dla Rtnl1-GFP. Zarodki kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p<0,001 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami bez wstrzyknięć (p < 0,001 dla wszystkich próbek w T210). (B) Zarodki ReepB-GFP, którym wstrzyknięto 10% DMSO w celu służenia jako kontrola. Zarodki kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p<0,001 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami bez wstrzyknięć (Rysunek 1E; p < 0,001 dla wszystkich próbek w T210). (C) Zarodki Rtnl1-GFP, którym wstrzyknięto 5 μM kolchicyny. Tutaj zmierzyliśmy zmniejszenie wzbogacenia Rtnl1-GFP do wrzecion (p < 0,001 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z kontrolami (A) (p < 0,001 dla wszystkich próbek w T210). (D) Zarodki ReepB-GFP, którym wstrzyknięto 5 μM kolchicyny. Zmierzyliśmy zmniejszenie wzbogacenia ReepB-GFP do wrzecion (p<0,001 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z kontrolami (B) (p<0,001 dla wszystkich próbek w T210). Ten rysunek został zmodyfikowany z Diaz et al.¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Pasta drożdżowa 21	2. Talerze winogronowe21	3. Klej heptanowy 24
1.1 Dodaj 7 gramów aktywnych suchych drożdży do 50 ml stożkowego. Dodaj 9 mililitrów wody DI i wymieszaj do wyrównania metalową szpatułką.	2.1 Przygotuj roztwór a: Dodaj 6 gramów agaru do 140 ml wody DI w kolbie o pojemności 250 ml i autoklawuj go.	3.1 Napełnij szklaną fiolkę scyntylacyjną 50 calami dwustronnej taśmy.
1.1 Dodaj 7 gramów aktywnych suchych drożdży do 50 ml stożkowego. Dodaj 9 mililitrów wody DI i wymieszaj do wyrównania metalową szpatułką.	2.2 Przygotuj roztwór b: Wymieszaj 0,1 grama metyloparabena z 2 ml etanolu, a następnie dodaj ten roztwór do 60 ml koncentratu soku grejpfrutowego.	3.2 Dodać 20 ml heptanu i zamknąć szklaną fiolkę scyntylacyjną parafilmem. Obracaj przez noc w temperaturze pokojowej.
	2.3 Bezpośrednio po autoklawowaniu roztworu a wymieszać z roztworem b i wlać mieszaninę do naczyń perti o średnicy 10 x 35 mm. (na 35 talerzy winogron)	3.3 Usuń resztki plastikowej taśmy, przenosząc klej do 2 stożkowych probówek o pojemności 15 ml i wirując z prędkością 3000 obr./min przez 15 minut.
	2.4 Pozostaw talerze winogronowe do ustawienia w temperaturze pokojowej przez noc ze zdjętymi pokrywkami talerzy. Przykryj talerze pokrywkami i przechowuj w temperaturze 4°C po zastygnięciu.	3.4 Przenieść sklarent kleju do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania.

Tabela 1: Przepisy na media i roztwory.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest bardzo wszechstronny i łatwy do dostosowania do badania zdarzeń biologicznych na różnych etapach rozwoju embrionalnego Drosophila. Protokół ten doskonale nadaje się do badania procesów biologicznych, które zachodzą w długich okresach czasu. Na przykład badania nad cellularyzacją^29,30 lub tworzeniem domen heterochromatyny u Drosophila ^31,32 mogą skorzystać z wykorzystania metod opisanych w tym protokole, ponieważ procesy te zachodzą przez dłuższy czas. Ponadto wielkość próby można zwiększyć poprzez zmniejszenie powiększenia w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości optycznej, takich jak czas między podziałami syncytialnymi³³ lub czas trwania gastrulacji³⁴. Podobnie, obiektyw 20x pozwala na zobrazowanie dwóch zarodków w jednej płaszczyźnie obrazowania. Metody zawarte w tym protokole stanowią dynamiczną platformę do zadawania pytań biologicznych przy użyciu rozwoju embrionalnego jako systemu modelowego do analizy ilościowej.

W tym protokole są 3 krytyczne kroki. Po dechorionacji w 50% wybielaczu konieczne jest energiczne przepłukanie i wysuszenie zarodków 5 razy (2.3.4). Ten krok usuwa wszelkie resztki małych kawałków kosmówki. Resztki kosmówki będą zasłaniać pole widzenia podczas obrazowania zarodka. Podczas umieszczania zarodków na szklanym szkiełku nakrywkowym (3.5) ważne jest, aby dociskać zarodki do kleju z równomiernym naciskiem. Spowoduje to umieszczenie zarodków na tej samej płaszczyźnie z. Podczas rozcinania igły do mikroiniekcji ważne jest, aby natychmiast wycofać tłok w celu wyregulowania natężenia przepływu igły, w przeciwnym razie pacjent straci cały wstrzykiwany płyn.

Nasze badanie było ograniczone przez dwa czynniki. Pierwszym czynnikiem był brak zautomatyzowanego procesu segmentacji. Zaprojektowaliśmy jednak skrypt do ręcznej segmentacji przy użyciu MATLAB; Dzięki genetycznie kodowanemu markerowi wrzeciona proces ten można zautomatyzować. W przyszłości chcielibyśmy produkować CNN-RFP²¹, Rtln1-GFP i CNN-RFP; Linie transgeniczne ReepB-GFP umożliwiające automatyczną segmentację wrzeciona. Aby uzyskać więcej informacji na temat naszego skryptu MATLAB i potoku analizy, zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi Diaz et ^al.15. Po drugie, byliśmy również ograniczeni przez nasz interwał akwizycji wynoszący 35 sekund, który pozwolił nam obrazować tylko 6 zarodków jednocześnie. Dłuższy odstęp między akwizycjami pozwoliłby nam na obrazowanie większej liczby zarodków jednocześnie. Chociaż wydajność dostarczania leków można zwiększyć, zastępując mikroiniekcję etapem przenikania, stwierdziliśmy, że jest to niepotrzebne, ponieważ wielkość naszej próby była już ograniczona przez interwał akwizycji.

Chociaż protokół ten został wykorzystany do zobrazowania rozwoju embrionalnego Drosophila , ogólne podejście można dostosować do badania rozwoju embrionalnego w innych wielokomórkowych systemach modelowych, takich jak C. elegans, jeżowce i Xenopus. Zarodki są niezwykle przydatne do analizy ilościowej, ponieważ można je łatwo zsynchronizować poprzez pobranie lub zapłodnienie. Ponadto zarodki nie poruszają się ani nie odpływają poza pole widzenia, co umożliwia wykorzystanie prostego oprogramowania do akwizycji wielopunktowej do tworzenia wielu filmów poklatkowych do analizy ilościowej. Chociaż w naszym badaniu użyliśmy analizatora o wysokiej zawartości, każdy system odwróconego mikroskopu zdolny do akwizycji wielopunktowej można sparować z metodami, o których mowa w niniejszym dokumencie.

Podobne wyniki można uzyskać przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z możliwością akwizycji wielopunktowej; Jednak zalety analizatora o wysokiej zawartości pojawiają się, gdy zwiększa się wielkość próby w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości w czasie. Oczywistą zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest możliwość jednoczesnego obrazowania 4 oddzielnych slajdów w porównaniu z 1 slajdem w tradycyjnych systemach. Dzięki pełnemu zestawowi 4 szkiełek i 40 zarodków na każdym szkiełku, 160 zarodków można obrazować w ciągu kilku godzin, o ile odstęp między klatkami wynosi co najmniej 15 minut. Kolejną ważną zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest to, że próbki są całkowicie odizolowane od wszelkich zewnętrznych źródeł światła, co jest niezbędne do pomiarów opartych na intensywności fluorescencji. Wreszcie, analizator o wysokiej zawartości zastosowany w naszym badaniu ma 5,5-megapikselową kamerę CMOS, która zapewnia duże pole widzenia 221,87 μm przy 60-krotnym powiększeniu. To większe pole widzenia umożliwiło nam zobrazowanie połowy zarodka w każdym punkcie akwizycji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 x 35 mm Micro Dish	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% koncentrat soku winogronowego	Welch's, 100% koncentrat soku winogronowego	Nie dotyczy	Kup w sklepie spożywczym
Kolby Erlenmeyera 250 ml, wąskie usta	VWR	Nr kat. #: 10536-914	dotyczy
3-calowe niemetalowe sito nr 140	Gilson Company	SV-165 #140	Nie dotyczy
4 slajdów Obrazowanie Taca	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/A
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, do spektroskopii	Fisher Scientific	Cat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Etanol, 99.5%, Odczynnik ACS, bezwzględny, 200 proof	Fisher Scientific Cat	# : AC615095000	N/A
Acros Organics, 4-hydroksybenzoesan metylu, 99% . (metyloparaben )	Fisher Scientific	Cat#: AC126961000	N/A
Szkiełko nakrywkowe, prostokątne, 25 x 75mm, #1 Szkło float	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	dotyczy
Materiał silikonowy Culture Well - grubość 1,6 mm	Grace Biolabs	SKU: 664273	Nie dotyczy
DWK Life Sciences Wheaton 20 ml Fiolki scyntylacyjne z płynem PET	Fisher Scientific	Cat #: 03-341-71A Nie	dotyczy
Klatka do pobierania zarodków-Mini	Genesee Scientific	Cat #: 59-105	N/A
Końcówki do pipet Eppendorf Microloader	Fisher	Scientific Kod produktu: 10289651	Nie dotyczy
Wirówka stożkowa Falcon 15 ml	Fisher Scientific	Cat #: 05-527-90	dotyczy
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Fisher Scientific	Cat #: 14-432-22	Nie dotyczy
Fleischmann's, Aktywne suche drożdże	Fleischmann's	N/A	Zakup w sklepie spożywczym
Talerze winogronowe	ODNIESIENIE DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURY	NIE	DOTYCZY NIE DOTYCZY
Olej Halocarbon 27 Genesee	Scientific	Cat #: 59-133	Nie dotyczy
Olej Halocarbon 700	Genesee Scientific	Cat #: 59-131	Nie dotyczy
Klej heptanowy	ODNOSI SIĘ DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURY	NIE	DOTYCZY NIE DOTYCZY
Przemysłowe żyletki (chirurgiczna stal węglowa) Jednosieczne nr 9	VWR	#: 55411-050	Nie
Parafilm M Laboratoryjna folia uszczelniająca, rolka 4 cale x 250 stóp	Fisher Scientific	Cat #: 50-998-944	/A
Taśma dwustronna szkocka z dyspenserem, wąska szerokość, zaprojektowana do klejenia, 1/2" x 7 jardów, 3 w opakowaniu Caddy	Fisher Scientific	Cat #: NC0879005	Nie dotyczy
Kulki żelu krzemionkowego, środek osuszający ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU: 1077351000	dotyczy
łyżki/szpatułki ze stali nierdzewnej	VWR	Nr kat. #: 470149-044	Nie dotyczy
WA Hammond Drierite Wskazujące absorbenty	Fisher Scientific	Cat #: 23-116582	dotyczy
Pasta drożdżowa	REFFER TO PRZYGOTOWANIE RECEPTURY	NIE	DOTYCZY NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY
NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY < STRONG>EQUIPMENT
Allegra X-12 Wirówka, Wirówka	Beckman Coulter	N/A	Potrzebny będzie dostęp do stożkowych wkładów wirówkowych o pojemności 15 ml.
Autoklaw	NIE DOTYCZY		NIE DOTYCZY Każdy autoklaw poradzi sobie dobrze.
Mikrowtryskiwacz Drummond Nanoject II.	Drummond Scientific	N/A	Jest to system wtryskowy na bazie oleju mineralnego.
Analizator komórek GE Healthcare IN 6000.	GE healthcare	N/A	Można zastąpić go szybkim mikroskopem konfokalnym zdolnym do akwizycji wielopunktowej.
Lodówka (4C°)	N/A	N/D	Pożywka przeciw muchom i pasta drożdżowa muszą być przechowywane w temperaturze (4C°).
Mikroskop stereoskopowy Zies Stemi 508 z podstawą transillumination 300 i górnym oświetleniem na gęsiej szyi.	Zeiss Microscopy	N/A	Niezbędna jest podstawa transillumination i oświetlenie na gęsiej szyi.