Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Summary

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Abstract

Analiza dynamiki dyfuzyjnej nanocząsteczek na błonie komórkowej odgrywa znaczącą rolę w lepszym zrozumieniu procesu absorpcji komórkowej i dostarcza teoretycznych podstaw do racjonalnego projektowania dostarczania nanoleków. Analiza śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) może zbadać położenie i orientację poszczególnych nanocząstek na błonie komórkowej oraz ujawnić ich stany translacyjne i rotacyjne. W tym artykule pokazujemy, jak wykorzystać tradycyjną mikroskopię ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na żywej błonie komórkowej. Pokazujemy również, jak wyodrębnić lokalizację i orientację AuNR za pomocą ImageJ i MATLAB oraz jak scharakteryzować stany dyfuzyjne AuNR. Analiza statystyczna setek cząstek pokazuje, że pojedyncze AuNR wykonują ruchy Browna na powierzchni błony komórkowej U87 MG. Jednak indywidualna analiza długiej trajektorii pokazuje, że AuNR mają dwa wyraźnie różne typy stanów ruchu na błonie, a mianowicie transport dalekiego zasięgu i uwięzienie na ograniczonym obszarze. Nasze metody SPT mogą być potencjalnie wykorzystane do badania powierzchniowej lub wewnątrzkomórkowej dyfuzji cząstek w różnych komórkach biologicznych i mogą stać się potężnym narzędziem do badania złożonych mechanizmów komórkowych.

Introduction

Dynamika nanocząsteczek (NPs) na membranie jest ściśle związana z procesem absorpcji komórkowej, co jest niezbędne do zrozumienia funkcji komórek, infekcji wirusowych lub bakteryjnych oraz rozwoju sztucznych nanomedycznych systemów dostarczania^1,2. Technika śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) jest solidnym narzędziem do charakteryzowania heterogenicznych zachowań NPs^3,4. Ogólnie rzecz biorąc, błona komórkowa jest płynna, co oznacza, że składniki, takie jak białka i lipidy, mogą poruszać się poprzecznie w płaszczyźnie błony plazmatycznej

Protocol

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotować kompletną pożywkę dla komórek U87 MG, dodając płodową surowicę bydlęcą (stężenie końcowe 10%) i penicylinę-streptomycynę (stężenie końcowe 1%) do minimalnej pożywki niezbędnej (MEM). Użyj plastikowego naczynia do hodowli komórkowej do subkultury komórek.
2. Pasaż komórek 2 do 3 razy w tygodniu.
   1. Usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz warstwę komórkową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco (D-PBS) 2 ~ 3 razy po konfluencji (80% ~ 90%).
   2. Dodaj 1,0 do 2,0 ml roztworu trypsyny-EDTA do naczynia do hodowli komórkowej i obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aż komórki staną się okrągłe (....

Results

W protokole użyto niezmodyfikowanych CTAB-AuNRs 40 x 85 nm. Jak pokazano na Rysunek 2B, jego podłużne maksimum plazmoniczne wynosi ~650 nm (obszar czerwony), a rezonans poprzeczny wynosi 520 nm (obszar zielony). Wcześniejsza literatura wykazała, że właściwości optyczne (takie jak intensywność LSPR) plazmonicznych AuNR będą się znacząco zmieniać wraz z ich średnicą^20,22. W Rysunek 2C, intensywność rozpras.......

Discussion

Przedstawiony protokół służy do badania dynamiki AuNR na błonie komórkowej. Protokół składa się z czterech części, w tym obrazowania mikroskopowego, ekstrakcji danych, obliczania parametrów dynamicznych i metod analizy danych, a każda część jest elastyczna i uniwersalna. W związku z tym istnieje wiele możliwych przyszłych zastosowań, na przykład badanie ruchu cząsteczek błonowych połączonych z NP na błonie, dynamika endocytozy receptorów znakowanych NP, dynamiczna analiza wewnątrzkomórkowych NP i transport NP pokrytych p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Złote nanopręty powlekane CTAB (CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Kolorowa kamera CMOS	Olympus	DP74	Japonia
Szkiełka nakrywkowe	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Mikroskopia ciemnego pola	Mikroskop pionowy	Nikon	80i
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Gibco	10099141
Fidżi	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	dystrybucja ImageJ
Rowkowana szklana prowadnica	Marka żagla	7103	Pojedyncza wklęsła
Obraz J	National Institutes of Health	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
Kod			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimalna ilość pożywki niezbędnej (MEM)	Gibco	10-010-CVR	z czerwienią fenolową
Minimalna pożywka niezbędna (MEM)	Gibco	51200038	bez czerwieni fenolowej
Pochodzenie	OriginLab	Origin Pro 2018C
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15140122
Plastikowe naczynia do hodowli komórkowych	Falcon	353002
Plastikowa hodowla komórkowa naczynia	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG	komórka American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	ludzka pierwotna linia komórkowa glejaka