Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61603

⸱

5 marca 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Streszczenie

Analiza dynamiki dyfuzyjnej nanocząsteczek na błonie komórkowej odgrywa znaczącą rolę w lepszym zrozumieniu procesu absorpcji komórkowej i dostarcza teoretycznych podstaw do racjonalnego projektowania dostarczania nanoleków. Analiza śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) może zbadać położenie i orientację poszczególnych nanocząstek na błonie komórkowej oraz ujawnić ich stany translacyjne i rotacyjne. W tym artykule pokazujemy, jak wykorzystać tradycyjną mikroskopię ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na żywej błonie komórkowej. Pokazujemy również, jak wyodrębnić lokalizację i orientację AuNR za pomocą ImageJ i MATLAB oraz jak scharakteryzować stany dyfuzyjne AuNR. Analiza statystyczna setek cząstek pokazuje, że pojedyncze AuNR wykonują ruchy Browna na powierzchni błony komórkowej U87 MG. Jednak indywidualna analiza długiej trajektorii pokazuje, że AuNR mają dwa wyraźnie różne typy stanów ruchu na błonie, a mianowicie transport dalekiego zasięgu i uwięzienie na ograniczonym obszarze. Nasze metody SPT mogą być potencjalnie wykorzystane do badania powierzchniowej lub wewnątrzkomórkowej dyfuzji cząstek w różnych komórkach biologicznych i mogą stać się potężnym narzędziem do badania złożonych mechanizmów komórkowych.

Wprowadzenie

Dynamika nanocząsteczek (NPs) na membranie jest ściśle związana z procesem absorpcji komórkowej, co jest niezbędne do zrozumienia funkcji komórek, infekcji wirusowych lub bakteryjnych oraz rozwoju sztucznych nanomedycznych systemów dostarczania1,2. Technika śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) jest solidnym narzędziem do charakteryzowania heterogenicznych zachowań NPs3,4. Ogólnie rzecz biorąc, błona komórkowa jest płynna, co oznacza, że składniki, takie jak białka i lipidy, mogą poruszać się poprzecznie w płaszczyźnie błony plazmatycznej5,6,7. Czasoprzestrzenna złożoność organizacji i struktury błony może prowadzić do czasoprzestrzennej heterogeniczności interakcji między nanocząsteczkami a błoną. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja ruchu nanocząstek na membranie wymaga zarówno wysokiej rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowej.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząstek, która monitoruje lokalizację pojedynczych cząstek w żywych komórkach z rozdzielczością przestrzenną dziesiątek nanometrów i rozdzielczością czasową milisekund, została dobrze opracowana do badania dynamiki nanocząsteczek lub błon komórkowych8,9. Techniki obrazowania mikroskopowego oparte na fluorescencji stały się cennymi narzędziami do obserwacji nanocząsteczek w środowisku żywych komórek9,10,11,12. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem, która obrazuje cienkie warstwy (~100 nm) próbki na granicy substrat/roztwór z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, jest szeroko stosowana w badaniach dynamiki cząsteczek błonowych13,14. Jednak nieodłączne wady pojedynczych fluoroforów, takie jak niska intensywność i szybkie nieodwracalne fotowybielanie, zmniejszają dokładność i czas trwania śledzenia13. Dlatego niefluorescencyjne plazmoniczne nanocząsteczki, które zastępują sondy fluorescencyjne, przyciągają coraz większą uwagę w długoterminowych badaniach obrazowych ze względu na ich unikalne właściwości optyczne15. Opierając się na sygnałach rozpraszania plazmonicznych sond NP, do badania mechanizmu procesów biologicznych wykorzystano kilka rodzajów technologii obrazowania mikroskopem optycznym, takich jak mikroskopia ciemnego pola (DFM)16, mikroskopia rozpraszania interferometrycznego (iSCAT) class<="xref">17 i mikroskopia kontrastowa z interferencją różnicową (DICM)18. Ponadto dynamikę ruchu i obrotu AuNR można uzyskać za pomocą DFM i DICM18,19,20,21,22. Zazwyczaj w eksperymencie SPT ruch obiektu jest rejestrowany przez mikroskop optyczny, a następnie analizowany za pomocą metod analizy SPT3. Trajektorie czasowo-rozdzielcze i kąty orientacji generowane przez poszczególne nanocząstki są zwykle stochastyczne i niejednorodne, dlatego konieczne jest przedstawienie obfitych informacji dynamicznych za pomocą różnych metod analizy.

Tutaj udostępniamy zintegrowany protokół, który monitoruje dynamikę AuNR na błonie komórkowej za pomocą DFM, wyodrębnia lokalizację i orientację AuNR za pomocą ImageJ i MATLAB oraz charakteryzuje dyfuzję AuNR za pomocą metod analizy SPT. W ramach demonstracji pokazujemy tutaj, jak wykorzystać protokół SPT do wizualizacji dynamiki niezmodyfikowanych AuNR (CTAB-AuNRs, syntetyzowanych przez cząsteczkę bromku amonu cetyltrimetyloamoniowego jako środka ochronnego) na błonie komórkowej U87 MG. Wykazano, że CTAB-AuNR mogą adsorbować białka w środowisku biologicznym, przemieszczać się po błonie komórkowej, a następnie wchodzić do komórek2,20,22. Komórka U87 MG jest najczęstszym i najbardziej złośliwym nowotworem ośrodkowego układu nerwowego, a jego receptory błonowe są nieprawidłowo wyrażane. Receptory błonowe mogą wchodzić w interakcje z białkami na AuNR, które wpływają na dynamikę AuNR. Nasz protokół ma ogólne zastosowanie do innych eksperymentów SPT w dziedzinie biologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek

  1. Przygotować pożywkę kompletną dla komórek U87 MG, dodając płodową surowicę bydlęcą (stężenie końcowe 10%) oraz penicylinę-streptomycynę (stężenie końcowe 1%) do minimalnej pożywki niezbędnej (MEM). Do subkultywacji komórek należy używać plastikowych naczyń hodowlanych.
  2. Passażować komórki 2 do 3 razy w tygodniu.
    1. Po osiągnięciu konfluencji (80%~90%) usunąć pożywkę hodowlaną i wypłukać warstwę komórek fosforanem soli Dulbecco (D-PBS) 2~3 razy.
    2. Do naczynia hodowlanego dodać 1,0 do 2,0 mL roztworu Trypsyny-EDTA i obserwować komórki pod mikroskopem odwróconym, aż staną się okrągłe (3~5 min).
    3. Dodać 3,0 mL przygotowanej pożywki kompletnej i zdyspergować komórki, delikatnie pipetując.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową (1 mL) do nowego naczynia hodowlanego zawierającego świeżą pożywkę (3 mL) i resuspendować komórki.
  3. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w atmosferze nawilżonej.

2. Przygotowanie preparatu na szkiełku przedmiotowym

UWAGA: W eksperymentach SPT wykorzystuje się komórki U87 MG od trzeciego do dziesiątego pasażu o wysokiej aktywności.

  1. Zesterylizować szkiełka nakrywki o wymiarach 22 mm × 22 mm, uprzednio oczyszczone roztworem Piranha, poprzez zanurzenie w etanolu (99,9%).
  2. Za pomocą pęsety wyjąć szkiełko nakrywkę z roztworu etanolu (krok 2.1) i wysterylizować poprzez wypalenie etanolu w płomieniu. Po wypaleniu całego etanolu umieścić szkiełka nakrywki w plastikowej płytce do hodowli komórek (35 x 10 mm) wypełnionej 2 mL pożywki komórkowej (bez czerwieni fenolowej).
  3. Nanieść 50 µL zawiesiny komórkowej z kroku 1.2.3 na szkiełko nakrywkę, a następnie delikatnie przesuwać płytkę przód-tył i lewo-prawo, aby równomiernie rozłożyć komórki. Umieścić płytkę w atmosferze z dodatkiem wilgoci.
  4. Gdy komórki U87 MG na szkiełku nakrywce osiągną 20%–40% konfluencji (~12 h), dodać do płytki 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) i wymieszać. Inkubować w atmosferze z dodatkiem wilgoci przez 5 min.
  5. Przenieść 100 μL pożywki hodowlanej (bez czerwieni fenolowej) z płytki z kroku 2.4 do rowka w rowkowanym szkiełku przedmiotowym (Rysunek 1), które zostało uprzednio oczyszczone roztworem Piranha.
  6. Wyjąć szkiełko nakrywkę z płytki i odwrócić je na wierzchu rowka szkiełka przedmiotowego do mikroskopu (Rysunek 1>). Uszczelnić lakierem do paznokci, pozostawić do wyschnięcia i umieścić na stoliku mikroskopu w celu przeprowadzenia eksperymentów SPT.

3. Przeprowadzanie eksperymentów śledzenia pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii w ciemnym polu (Rysunek 1).

  1. Na kondensator ciemnopolowy z imersją olejową (NA 1,43-1,20) nanieść kroplę oleju, a następnie obrócić pokrętło tak, aby kondensator stykał się z szkiełkiem przedmiotowym.
  2. Nanieś kroplę oleju na górną powierzchnię szkiełka nakrywki i obracaj pokrętłem ostrości, aż obiektyw imersyjny 60x (NA 0,7–1,25) zetknie się z olejem.
  3. Włącz źródło światła i delikatnie obróć pokrętło ostrości, aby ustawić płaszczyznę obrazowania.
    UWAGA: W polu widzenia tło jest czarne, komórki są jasne, a CTAB-AuNRs (stosunek szerokości do długości ~2:1, Rycina 2) to małe, kolorowe (czerwone, żółte lub zielone) plamki rozproszenia.
  4. Rejestrację światła rozproszonego próbki należy przeprowadzić za pomocą kolorowej kamery CMOS. Kliknij „Ikona aparatuw oprogramowaniu w celu zarejestrowania i wyeksportowania obrazów w formacie TIFF.

4. Pozyskiwanie danych

  1. Ekstrakcja pojedynczej trajektorii długoterminowej
    1. Postępuj zgodnie z opisem na Rysunku 3, aby przekonwertować obrazy z serii czasowej w ciemnym polu z trybu „RGB color” na tryb „8 bit”. W programie Image J kliknij Image | Type | 8 bit. Aby dostosować kontrast, kliknij Image | Adjust | Brightness | Contrast.
    2. Wybierz docelkową cząstkę i usuń tło z serii czasowej, zaznaczając je ramką i usuwając za pomocą kombinacji klawiszy „Ctrl+X”.
    3. Otwórz okno detekcji i łączenia cząstek, klikając „Plugins | Particle Tracker Classic | Particle Tracker”.
    4. Ustaw Radius na 6, Cutoff na 0 oraz Percentile na 0,01%.
      UWAGA: Aby wykryć cząstkę, dostosuj powyższe trzy parametry, korzystając z funkcji Preview. Upewnij się, że promień (radius) jest nieco większy niż docelowa cząstka i mniejszy niż najmniejsza odległość między cząstkami. Percentile to dolna granica rozkładu intensywności dla kandydujących cząstek.
    5. Ustaw Link Range na 5 oraz Displacement na 10.
      UWAGA: Aby połączyć cząstkę pomiędzy kolejnymi sąsiednimi klatkami, dostosuj powyższe dwa parametry. Displacement to maksymalna liczba pikseli, o jaką cząstka może się przemieścić między dwiema następującymi po sobie klatkami, a Link Range to liczba kolejnych klatek branych pod uwagę przy określaniu najlepszego dopasowania.
    6. Kliknij „OK”, aby otworzyć okno wyników ParticleTracker i zapoznać się z rezultatami.
    7. Kliknij „Visualize All Trajectories”, aby sprawdzić wygenerowane trajektorie.
    8. Kliknij menu „Relink Particles” u góry, aby ponownie połączyć wykryte cząstki z innymi parametrami link range i percentile, jeśli wygenerowana przez oprogramowanie trajektoria nie odpowiada rzeczywistej trajektorii ruchu AuNR.
    9. Kliknij „Save Full Report”, aby zapisać wyniki, jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie jest zgodna z trajektorią ruchu AuNR.
      UWAGA: Przykład ekstrakcji pojedynczej trajektorii długoterminowej za pomocą Image J przedstawiono na Rysunku 4.
  2. Ekstrakcja wielu trajektorii
    UWAGA: Przykład ekstrakcji wielu trajektorii za pomocą Fiji przedstawiono na Rysunku 5. Proces składa się z kilku etapów, z których każdy stanowi krok w procesie śledzenia. Wynik każdego kroku jest wyświetlany natychmiast, co pozwala użytkownikowi wrócić i skorygować ustawienia, gdy wynik jest niezadowalający.
    1. Postępuj zgodnie z opisem na Rysunku 3, aby przekonwertować obrazy z serii czasowej w ciemnym polu z trybu „RGB color” na tryb „8 bit”. W ścieżce Image J kliknij „Image | Type | 8 bit”. Aby dostosować kontrast, kliknij „Image | Adjust | Brightness | Contrast”.
    2. Otwórz panel startowy, klikając „Plugins | Tracking | TrackMate”. Kliknij „Next”.
    3. Wybierz „LoG detector” z menu rozwijanego i kliknij „Next”.
    4. Dostosuj parametry w panelu konfiguracji detektora. Ustaw Estimated blob diameter na 10, Threshold na 0 i zaznacz „Do Sub-pixel Localization”.
    5. Kliknij „Next”, aby otworzyć panel wstępnego filtrowania punktów.
      UWAGA: Można dostosować kilka parametrów, aby dodatkowo zoptymalizować punkty docelowe. W tym przykładzie nie zmieniano żadnych innych parametrów.
    6. Kliknij „Next” i wybierz „HyperStack displayer” z menu rozwijanego.
    7. Kliknij „Next”, aby otworzyć panel filtrowania punktów. Ustaw Quality powyżej 1,88, X powyżej 38,86 oraz Y powyżej 56,54.
    8. Kliknij „Next” i wybierz „Simple LAP tracker” z menu rozwijanego. Skonfiguruj prosty tracker LAP, dostosowując trzy parametry: Linking max distance = 15, Gap-closing max distance = 15 oraz Gap-closing max frame gap = 5.
      UWAGA: Linking-max distance to maksymalne przesunięcie punktu między dwiema klatkami. Gap-closing max distance to maksymalne przesunięcie dwóch segmentów. Gap-closing max frame gap to maksymalna liczba klatek między dwoma punktami, która może zostać pomostowana.
    9. Kliknij „Next”, aby rozpocząć śledzenie. Po zakończeniu ponownie kliknij „Next”.
    10. Ustaw filtry na trajektoriach, np. ustaw Number of spots in track powyżej 300.
    11. Klikaj „Next”, aż otworzy się końcowy panel zapisu. Wybierz „Export tracks to XML file” z menu rozwijanego, a następnie kliknij „Execute”, aby zapisać plik w formacie csv.
  3. Wartości R/G
    UWAGA: Intensywności rozproszenia docelowych AuNR w kanałach R i G są pozyskiwane z kolorowych obrazów w ciemnym polu za pomocą kodu napisanego w MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), a zasada ekstrakcji jest przedstawiona na Rysunku 6.
    1. Użyj funkcji xycoordination.m, aby znaleźć współrzędną piksela środkowego AuNR w każdej klatce zgodnie z współrzędnymi x-y (wyekstrahowanymi przez ImageJ/Fiji).
    2. Użyj funkcji RGextraction.m, aby wyznaczyć macierz 3 x 3 piksele, wyekstrahować 9 wartości intensywności rozproszenia kanałów R lub G i obliczyć wartość średnią (μ, definiowaną jako R lub G).
      UWAGA: Macierz 3 x 3 piksele jest wycentrowana na współrzędnych pikseli uzyskanych w kroku 4.3.1.
  4. Kąt polarny
    UWAGA: Kąt polarny to kąt między osią podłużną AuNR a osią optyczną (jak pokazano na Rysunku 1), który może odzwierciedlać dynamikę rotacji przestrzennej (oś Z) AuNR.
    1. Użyj funkcji polarangle.m, aby obliczyć kąty polarne (θ) metodą różnicową dwukanałową22, Równanie ilustrujące spektralną absorpcję światła z formułą \( f(R-G) \propto \sin^2 \theta \)..

5. Analiza danych

UWAGA: Systematyczne i solidne ramy analizy danych są niezbędne dla wydajności i efektywności metod analizy SPT. Wykorzystano dedykowane oprogramowanie napisane w języku MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). Do sporządzania wykresów wykorzystano oprogramowanie do analizy i tworzenia grafiki (patrz Tabela materiałów).

  1. Parametry analizy
    1. Użyć skryptów csv_data_extract_dis_vel_ss.m oraz csv_data_MSD.m w celu obliczenia parametrów dynamicznych zgodnie z formułami przedstawionymi w Tabeli 1.
      UWAGA: Parametry te są wykorzystywane do analizy dynamiki AuNR i składają się z trzech części. (1) Parametry związane z trajektorią: przemieszczenie, długość kroku, prędkość, promień żyracji (Rg) oraz kąt skrętu (Ta); (2) parametry MSD: współczynnik dyfuzji (Dt) i wykładnik dyfuzji anomalnej (α); oraz (3) parametry związane z rotacją: kąt polarny i labilność rotacyjna (σ).
PomiaryDefinicjaZnaczenie fizyczne
PrzemieszczenieWzór na odległość, d=√((xᵢ−x₁)²+(yᵢ−y₁)²), schemat obliczania odległości w przestrzeni.Zmiany pozycji obiektów
Długość krokuRównania: Obliczanie odległości przy użyciu wzoru na odległość, S=√((xi-xi-1)²+(yi-yi-1)²).Odległość między dwoma sąsiednimi punktami
PrędkośćRównanie prędkości v=s/τ, wzór fizyczny, ilustruje obliczanie prędkości.Prędkość ruchu obiektów
RgWzór na promień żyroskopowy; równanie Σ; kluczowe pojęcie w analizie fizyki polimerów.Zakres ruchu obiektów w określonym przedziale czasowym
Tawzór na podobieństwo cosinusowe, równanie matematyczne, iloczyn skalarny wektorów, obliczanie modułuKierunek ruchu obiektów między dwoma sąsiednimi punktami
MSDWzór na średni kwadrat przemieszczenia, równanie MSD dla analizy ruchu cząstek w mechanice statystycznej.Średnia odległość przemieszczenia obiektów w określonym przedziale czasowym
DtRównanie średniego kwadratu przemieszczenia, MSD=4Dt*t^α, stosowane w analizie dyfuzji do śledzenia cząstek.Zdolność dyfuzyjna obiektów
αRównanie średniego kwadratu przemieszczenia, MSD=4Dt*t^α, stosowane w analizie dyfuzji do śledzenia cząstek.Dyfuzja normalna (α~1)
Kąt polarnyRównanie stanu równowagi statycznej: sin²θ=(R-G)-(R-G)min/(R-G)max-(R-G)min; schemat edukacyjny.Informacje o orientacji 3D obiektów
σWzór na odchylenie standardowe, równanie analizy statystycznej do obliczania wariancji i rozkładu.Stopień rozproszenia zbioru danych kąta polarnego

Tabela 1: Trzy rodzaje parametrów wykorzystanych do analizy. Obejmują one parametry związane z trajektorią (przemieszczenie, wielkość kroku, prędkość, Rg oraz Ta), parametry MSD (MSD, Dt oraz α) i parametry związane z rotacją (kąt polarny oraz labilność rotacyjna).

  1. Wizualna analiza trajektorii
    UWAGA: Wizualizacja trajektorii pozwala w sposób intuicyjny przedstawić czasoprzestrzenną heterogeniczność ruchu cząstek oraz rozkład (współrzędne) parametrów dynamicznych na trajektorii, takich jak trajektoria mapowania czasu, trajektoria mapowania Rg i Dt oraz trajektoria mapowania kąta polarnego. Trajektorie mapowania zostały narysowane przy użyciu oprogramowania do wykresów i analizy.
    1. Ustaw współrzędną x jako X, współrzędną y jako Y oraz czas (Rg, Dt, kąt polarny) jako Z.
    2. Kliknij „Plot | Scatter plot | Color-mapping Plot”.
    3. Dodaj pasek kolorów.
  2. Analiza MSD
    UWAGA: Aktywność i tryb ruchu cząstek można uzyskać poprzez analizę MSD23. Im większa wartość Dt, tym bardziej aktywny jest ruch dyfuzyjny cząstek. Gdy α~1, cząstki wykonują normalny ruch dyfuzyjny, w przeciwnym razie wykonują anormalny ruch dyfuzyjny.
    1. Wykresy MSD-τ
      1. Ustaw przedział czasowy (τ) jako X, a dane MSD jako Y.
      2. Kliknij „Plot | Scatter plot”.
      3. Dopasuj dane, klikając „Analyze | Fitting | Nonlinear curve fitting (Function: Allometricl”.
    2. Podwójnie logarytmiczny wykres MSD-τ
      UWAGA: Podwójnie logarytmiczny wykres MSD-τ, w którym nachylenie wynosi α, a punkt przecięcia Dt, może w intuicyjny sposób przedstawić ruch cząstek.
      1. Ustaw logarytmiczny przedział czasowy jako X oraz logarytmiczne MSD jako Y.
      2. Kliknij „Plot | Scatter plot”.
      3. Dopasuj dane, klikając „Analyze | Fitting | Linear curve fitting”.
    3. Wykres D-τ (MSD/4t)
      UWAGA: D=MSD/4τ jest funkcją czasu τ i czynnika anomalii α, a wykres D-τ bezpośrednio pokazuje zmianę współczynnika dyfuzji w czasie. Gdy D rośnie wraz z czasem, α jest większe niż 1 i cząstki wykonują ruch superdyfuzyjny.
      1. Ustaw logarytmiczny przedział czasowy (τ) jako X oraz logarytmiczne D jako Y.
      2. Kliknij „Plot | Scatter plot”.
      3. Dopasuj dane, klikając „Analyze | Fitting | Nonlinear curve fitting (Function: „Allometricl”)”.
        UWAGA: Im krótsze trajektorie, tym większa niepewność szacunków dyfuzji. Zazwyczaj Dt i α uzyskiwano poprzez analizę MSD-τ dla długiego przedziału czasowego (> 30 τ). Jednak proste i przybliżone dopasowanie wygładzi szczegóły ruchu. Dlatego w celu analizy zachowania ruchu cząstek w krótkim czasie należy przeprowadzić analizę MSD-τ dla krótkiego przedziału czasowego (< 10 τ).
  3. Analiza statystyczna
    1. Analiza statystyczna wielu cząstek
      UWAGA: Analiza statystyczna wielu cząstek może odzwierciedlać stan ruchu cząstek w obszarze przestrzennym, co pośrednio wskazuje na heterogeniczność środowiska przestrzennego. Na przykład, jeśli histogram Dt wykazuje rozkład w szerokim zakresie lub rozkład wielomodalny, oznacza to, że aktywność ruchowa cząstek jest heterogeniczna.
      1. Ustaw parametry dynamiczne (takie jak Dt, Rg, maksymalne przemieszczenie) jako Y.
      2. Kliknij „Plot | Histogram”.
      3. Kliknij dwukrotnie histogram i ustaw rozmiar podziału lub liczbę podziałów. Kliknij „Apply”.
    2. Analiza statystyczna pojedynczej cząstki
      UWAGA: Analiza statystyczna pojedynczych cząstek może wykazać zachowanie ruchowe poszczególnych cząstek, co również pośrednio odzwierciedla czasoprzestrzenną heterogeniczność otaczającego środowiska.
      1. Wiele klatek
        1. Oblicz parametry dynamiczne (takie jak Ta, wielkość kroku, kąt polarny) dla wszystkich klatek pojedynczej długiej trajektorii, skopiuj do tabeli Origin i ustaw jako Y.
        2. Kliknij „Plot | Histogram”.
        3. Kliknij dwukrotnie histogram i ustaw rozmiar podziału lub liczbę podziałów. Kliknij „Apply”.
          UWAGA: Jeśli zarówno Ta, jak i wielkość kroku wykazują rozkład o małych wartościach, cząstki wykonują małokrokowy ruch superdyfuzyjny.
      2. Przesuwne okna
        1. Oblicz parametry dynamiczne (takie jak Rg, Dt) dla wszystkich klatek pojedynczej długiej trajektorii za pomocą metody przesuwnego okna (11 klatek), skopiuj do tabeli Origin i ustaw jako Y.
        2. Kliknij „Plot | Histogram”.
        3. Kliknij dwukrotnie histogram i ustaw rozmiar podziału lub liczbę podziałów. Kliknij „Apply”.
  4. Analiza szeregów czasowych
    UWAGA: Analiza statystyczna może ujawnić stan ruchu NP, a analiza szeregów czasowych może służyć jako uzupełnienie w prezentacji zachowania ruchu. Połączenie kilku parametrów szeregów czasowych pozwala odróżnić zachowanie ruchowe NP na poziomach czasowym i przestrzennym.
    1. Ustaw czas jako X oraz parametry szeregów czasowych jako Y (takie jak przemieszczenie, kąt polarny i Rg).
    2. Kliknij „Plot | Multi-pane diagram | Stacked plot | Line + Symbol”.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W protokole zastosowano niemodyfikowane CTAB-AuNRs o wymiarach 40 x 85 nm. Jak pokazano na Rysunku 2B, ich podłużne maksimum plazmoniczne wynosi ~650 nm (obszar czerwony), a rezonans poprzeczny znajduje się przy 520 nm (obszar zielony). Wcześniejsze publikacje wykazały, że właściwości optyczne (takie jak intensywność LSPR) plazmonicznych AuNRs zmieniają się znacząco wraz z ich średnicą20,22. Na Rysunku 2C

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół jest wykorzystywany do badania dynamiki AuNRs na błonie komórkowej. Protokół składa się z czterech części: obrazowania mikroskopowego, ekstrakcji danych, obliczania parametrów dynamicznych oraz metod analizy danych, przy czym każda z tych części jest elastyczna i uniwersalna. W związku z tym istnieje wiele możliwych zastosowań w przyszłości, na przykład badanie ruchu cząsteczek błonowych połączonych z NP na błonie, dynamika endocytozy receptorów znakowanych NP, dynamiczna analiza NP wewnątrzkomórko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin grantami o numerach 21425519, 91853105 i 21621003.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Złote nanopręty powlekane CTAB (CTAB-AuNRs)NanoseedzNR-40-65085 nm * 40 nm
Kolorowa kamera CMOSOlympusDP74Japonia
Szkiełka nakrywkoweCitoglasz10212222C22*22 mm
Mikroskopia ciemnego polaMikroskop pionowyNikon80i
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco10099141
FidżiNational Institutes of Health2.0.0-rc-69/1.52 pdystrybucja ImageJ
Rowkowana szklana prowadnicaMarka żagla7103Pojedyncza wklęsła
Obraz JNational Institutes of Health1.52 j
MATLABMathWorksR2019b
Kodhttps://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimalna ilość pożywki niezbędnej (MEM)Gibco10-010-CVRz czerwienią fenolową
Minimalna pożywka niezbędna (MEM)Gibco51200038bez czerwieni fenolowej
PochodzenieOriginLabOrigin Pro 2018C
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
Plastikowe naczynia do hodowli komórkowychFalcon353002
Plastikowa hodowla komórkowa naczyniaFalcon35300135*10 mm
U87 MGkomórka American Type Culture CollectionATCC HTB-14ludzka pierwotna linia komórkowa glejaka
MATLAB

Bibliografia

  1. Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).
  2. Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
  3. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  4. Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
  5. Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
  6. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  7. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  8. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  9. Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914(2020).
  10. Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
  11. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).
  12. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177(2014).
  13. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
  14. Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
  15. Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
  16. Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
  17. Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
  18. Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887(2017).
  19. Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
  20. Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
  21. Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
  22. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  23. Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103(2015).
  24. Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
  25. Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001(2018).
  26. Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
  27. Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
  28. Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
  29. Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Śledzenie pojedynczych cząstekanaliza w programie ImageJanaliza w programie MATLABśredni kwadrat przemieszczeniaruchy Brownatransport dalekozasięgowydyfuzja ograniczona
Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.