Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61609

⸱

12 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Streszczenie

Noworodki są narażone na zwiększone ryzyko sepsy bakteryjnej ze względu na unikalny profil immunologiczny, który wykazują w pierwszych miesiącach życia. Opracowaliśmy protokół badania patogenezy E. coli O1:K1:H7, serotypu odpowiedzialnego za wysoką śmiertelność noworodków. Nasza metoda wykorzystuje obrazowanie przyżyciowe noworodków w różnych punktach czasowych podczas progresji infekcji. To obrazowanie, połączone z pomiarem bakterii we krwi, profilowaniem zapalnym i histopatologią tkanek, oznacza rygorystyczne podejście do zrozumienia dynamiki infekcji podczas sepsy. W bieżącym raporcie modelujemy dwa inokula zakaźne w celu porównania obciążenia bakteryjnego i ciężkości choroby. Stwierdzamy, że zakażenie podłopatkowe prowadzi do zakażenia rozsianego po 10 godzinach od zakażenia. Po 24 godzinach zakażenie luminescencyjnymi bakteriami E. coli było obfite we krwi, płucach i innych tkankach obwodowych. Ekspresja cytokin zapalnych w płucach jest znacząca po 24 godzinach, po czym następuje infiltracja komórkowa i dowody na uszkodzenie tkanek, które nasilają się wraz z dawką zakaźną. Obrazowanie przyżyciowe ma pewne ograniczenia. Obejmuje to próg sygnału luminescencyjnego i pewne komplikacje, które mogą wystąpić u noworodków podczas znieczulenia. Pomimo pewnych ograniczeń stwierdzamy, że nasz model infekcji oferuje wgląd w długotrwałą dynamikę infekcji podczas mysiej sepsy u noworodków, która do tej pory nie została dokładnie zbadana. Spodziewamy się, że model ten można również zaadaptować do badania innych krytycznych infekcji bakteryjnych we wczesnym okresie życia.

Wprowadzenie

Sepsa bakteryjna jest poważnym problemem dla noworodków, które wykazują unikalny profil immunologiczny w pierwszych dniach życia, który nie zapewnia odpowiedniej ochrony przed infekcją1. Sepsa noworodków nadal stanowi poważny problem opieki zdrowotnej w USA, odpowiadając za ponad 75 000 przypadków rocznie w samych Stanach Zjednoczonych2. Aby dogłębnie zbadać te infekcje, potrzebne są nowe modele zwierzęce, które podsumowują aspekty chorób u ludzi. Ustaliliśmy model zakażenia noworodków myszy przy użyciu E. scherichia coli, O1:K1:H73. E. coli jest drugą najczęstszą przyczyną sepsy noworodków w USA, ale odpowiada za większość zgonów związanych z sepsą4,5. Jest to jednak główna przyczyna, gdy dzieci urodzone przedwcześnie i z bardzo niską masą urodzeniową (VLBW) są rozpatrywane niezależnie5. Serotyp K1 jest najczęściej związany z inwazyjnymi infekcjami krwi i zapaleniem opon mózgowych u noworodków6,7. Obecnie nie ma innych opcji leczenia poza antybiotykami i leczeniem wspomagającym. Tymczasem wskaźniki oporności na antybiotyki nadal rosną w przypadku wielu bakterii chorobotwórczych, przy czym niektóre szczepy E. coli są odporne na wiele antybiotyków powszechnie stosowanych w leczeniu8. Dlatego konieczne jest, abyśmy nadal opracowywali metody badania mechanizmów sepsy i odpowiedzi gospodarza u noworodków. Wyniki te mogą pomóc w poprawie obecnych metod leczenia i wyników infekcji.

Stan immunologiczny noworodków charakteryzuje się zarówno fenotypowymi, jak i funkcjonalnymi różnicami w porównaniu z dorosłymi. Na przykład wykazano, że podwyższone poziomy cytokin przeciwzapalnych i regulatorowych, takich jak interleukina (IL)-10 i IL-27, są wytwarzane przez makrofagi pochodzące z krwi pępowinowej i są obecne w większych ilościach w surowicy mysich noworodków9,10,11. Jest to zgodne z niższymi poziomami IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 i TNF-α, które są często zgłaszane z komórek noworodków w porównaniu z dorosłymi odpowiednikami10. Ponadto układ odpornościowy noworodka jest przekrzywiony w kierunku odpowiedzi Th2 i regulatorowych limfocytów T w porównaniu z dorosłymi12. Podwyższona liczba neutrofili, limfocytów T, limfocytów B, komórek NK i monocytów jest również obecna u noworodków, ale ze znacznymi zaburzeniami funkcjonalnymi. Obejmuje to defekty w ekspresji markerów powierzchniowych komórek i prezentacji antygenu, które sugerują niedojrzałość13,14,15. Ponadto neutrofile noworodkowe mają znaczny niedobór zdolności do migracji do czynników chemotaktycznych16. Komórki supresorowe pochodzenia szpikowego (MDSC) są również znajdowane w podwyższonych poziomach u noworodków, a ostatnio wykazano, że są źródłem IL-2711. MDSC są wysoce supresyjne w stosunku do limfocytów T17. Łącznie dane te wskazują na ograniczenia w odporności noworodków, które zwiększają podatność na infekcje.

Aby zbadać postęp obciążenia bakteryjnego i przeanalizować ochronne reakcje immunologiczne gospodarza podczas sepsy noworodków, opracowaliśmy nowy model infekcji. Nowonarodzone myszy w 3-4 dniu życia są trudne do wstrzyknięcia w przestrzeń dootrzewnową lub żyłę ogonową. W naszym modelu szczeniętom w dniu 3 lub 4 podaje się inokulum bakteryjne lub PBS podskórnie w okolicę łopatki. Rozwija się infekcja ogólnoustrojowa i za pomocą luminescencyjnej E. coli O1:K1:H7 możemy obrazować podłużnie poszczególne nowonarodzone myszy, aby śledzić rozsiane obciążenie bakteryjne w tkankach obwodowych. Jest to pierwszy zgłoszony model wykorzystujący obrazowanie przyżyciowe w celu zrozumienia kinetyki rozprzestrzeniania się bakterii podczas sepsy u mysich noworodków3.

Tutaj opisujemy protokół wywoływania septycznych infekcji E. coli u noworodków myszy3. Opisujemy, jak przygotować inokulum bakteryjne do wstrzyknięcia i jak pobrać tkankę do oceny patologii, pomiaru markerów stanu zapalnego za pomocą analizy ekspresji genów i wyliczenia obciążenia bakteryjnego. Ponadto opisano również zastosowanie luminescencyjnej E. coli do obrazowania przyżyciowego zakażonych noworodków i ilościowego oznaczania zabijania bakterii przez noworodkowe komórki odpornościowe. Protokoły te mogą być również dostosowane do badania innych ważnych infekcji bakteryjnych u noworodków. Przedstawione tutaj dane reprezentują nowatorskie podejście do zrozumienia dynamiki zakażeń w translacyjnym modelu sepsy noworodków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Zachodniej Wirginii i przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Przewodnika po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych przez Narodową Radę ds. Badań Naukowych18.

1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

  1. Na płytce z agarem sojowym Tryptic (TSA) umieścić pętlę zaszczepiającą w celu wyizolowania pojedynczej kolonii z wywaru E. coli O1:K1:H7-lux, który stabilnie wyraża lucyferazy i przenosi odporność na kanamycynę3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia pozwól, aby bulion Luria (LB) osiągnął temperaturę pokojową (25 °C) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Pod kapturem komory bezpieczeństwa biologicznego zidentyfikuj pojedynczą kolonię z płytki z prążkami i zaszczep ją w 3 ml LB uzupełnionym kanamycyną (30 μg/ml). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (220 obr./min). To jest kultura starterowa.
  4. Rozcieńczyć kulturę starterową w stosunku 1:100 w świeżej objętości 3 ml LB pod pokrywą komory bezpieczeństwa biologicznego i umieścić ją w inkubatorze na 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (220 obr./min). To jest kultura magazynowa.
  5. Odczytać gęstość optyczną (OD) zarówno ślepej próby, jak i kultury wyjściowej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru. Dodać 100 μl LB (niezawierającego bakterii) do jednego dołka z 96-dołkową płaską płytką testową; To jest puste miejsce. Następnie dodać 100 μl z kultury podstawowej do osobnego dołka. Powtórz te czynności dla dwóch dodatkowych powtórzeń. Odczyt absorbancji odbywa się za pomocą czytnika płytek.
  6. Odjąć absorbancję ślepej próby od wartości absorbancji kultury podstawowej (wartość OD) i porównać z poprzednio wygenerowaną i zwalidowaną krzywą wzrostu, aby określić przybliżoną gęstość bakterii w kulturze podstawowej w celu przygotowania dawki zakaźnej.
  7. Generuj docelowe inokulum w zależności od pytania badawczego. W tym badaniu użyto inokulum docelowego 2 x 106 (niskie) i 7 x 106 (wysokie) jednostki tworzące kolonie (CFU) na mysz (/ mysz).
    1. Podzielić dawkę docelową na mysz (dawkaT) przez szacowane stężenie bakterii w kulturze podstawowej (Stock), aby uzyskać potrzebną objętość bakterii z probówki podstawowej (VS).
    2. Pomnóż VS przez liczbę myszy (NM), które muszą zostać zainfekowane, wraz z wystarczającą ilością 5-10 dodatkowych na całkowitą ilość bakterii wymaganą do infekcji plus 5-10 dodatkowych dawek. Usuń tę objętość z probówki wyjściowej i dodaj ją do nowej probówki wirówkowej.
    3. Użyj poniższego równania:
      DawkaT/Stock = VS x NM = całkowita objętość (VT) bakterii, które mają zostać usunięte z probówki.
  1. Odwirować bakterie w dawce 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 50 μl PBS (pH 7,2-7,6) na mysz, która ma być zakażona (np. dla 10 dawek 2 x 106 bakterii każda, osad 2 x 107 bakterii zostanie ponownie zawieszony w 500 μl PBS). Również w tym przypadku zaleca się przygotowanie większej ilości inokulum niż jest to potrzebne. Przygotować równą objętość PBS tylko do szczepień kontrolnych. Utrzymuj zakaźne inokulum i kontrolę PBS na lodzie aż do zakażenia.
  2. Wykonać siedem dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń do PBS w 96-dołkowej plastikowej dolnej płytce rozcieńczającej i rozlać 25 μl rozcieńczeń w dwóch egzemplarzach na kwadrantowe płytki TSA uzupełnione kanamycyną (30 μg / ml), aby wyliczyć rzeczywistą ilość podanych bakterii. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w celu utworzenia kolonii przed spisem.

2. Identyfikacja zwierząt

  1. Zorganizuj wystarczającą liczbę par hodowlanych, tak aby mioty mogły być zsynchronizowane dla szczeniąt w tym samym wieku. Dopuszczalna jest zmienność wieku ± 1 dzień.
  2. Zidentyfikuj ciężarną samicę myszy C57BL/6 i monitoruj narodziny miotu przed planowanym eksperymentem, aby dokładnie określić wiek.
  3. Aby odróżnić 3- lub 4-dniowe szczenięta kontrolne od zarażonych, użyj pary małych nożyczek z cienką końcówką i tęczówką, aby odciąć końce ogonów tylko szczeniąt kontrolnych. Zarażone szczenięta nie otrzymują obcinania ogonów. Przed obcięciem ogona zdezynfekuj skórę wacikiem zalanym 70% etanolem. W razie potrzeby dociśnij koniec ogona wacikiem lub gazą.
    UWAGA: Ta procedura jest wykonywana pod okapem szafy bezpieczeństwa biologicznego. Wystarczy obcięcie ogona o długości około 1/8 cala.
  4. Aby zidentyfikować młode w grupie kontrolnej i zakażonej, użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z trwałą igłą 28 G x 1/2 '' do wytatuowania ogonów szczeniąt. Przed wykonaniem tatuażu należy zdezynfekować skórę wacikiem nasączonym 70% etanolem. Ta procedura jest wykonywana pod kapturem komory bezpieczeństwa biologicznego.
  5. Aby wytatuować ogon, nałóż tusz do tatuażu zwierzęcego na końcówkę igły. Następnie ostrożnie przytrzymuj szczeniaka jedną ręką, z całkowicie odsłoniętym ogonem. Delikatnie wbić igłę pod skórę, zachowując powierzchowny poziom głębokości, i przesuwać igłę równolegle do skóry o kilka milimetrów, aż powstanie małe oznaczenie lub kropka. Odczekaj kilka sekund przed powolnym wyjęciem igły spod skóry, aby uniknąć wycieku nadmiaru tuszu spod skóry.
  6. W razie potrzeby uciskaj ranę wacikiem lub gazą. Usuń nadmiar tuszu do tatuażu z powierzchni skóry za pomocą 70% etanolu.
  7. Powtórz ten proces z kolejnymi myszami w grupie zakażonej i kontrolnej, dodając dodatkową kropkę przy każdym kolejnym wytatuowanym szczeniaku (np. szczenię 1 będzie miało 1 kropkę na ogonie, szczenię 2 będzie miało dwie kropki na ogonie itp.).
    UWAGA: W celu uzyskania dodatkowej warstwy identyfikacji zaleca się stosowanie oddzielnych kolorów tuszu do tatuażu zwierzęcego dla grup kontrolnych i zakażonych.

3. Inokulacja podłopatkowa

UWAGA: W tym badaniu przeprowadzono 2 eksperymenty z grupą niskodawkową i wysokodawkową wyznaczoną dla każdego eksperymentu. W pierwszym eksperymencie 7 szczeniętom podano inokulum o niskiej dawce (4 młode użyto jako kontrole), a 5 szczeniętom z oddzielnego miotu podano wysoką dawkę (3 młode użyto jako kontrola). Młode z eksperymentu 1 dostarczyły danych tylko dla 24-godzinnego punktu czasowego. W drugim eksperymencie 8 szczeniętom podano inokulum o niskiej dawce (2 młode użyto jako kontrolę), a 6 szczeniętom podano inokulum o wysokiej dawce (2 młode użyto jako kontrola). Szczenięta z eksperymentu 2 dostarczyły danych dla punktów czasowych 0, 10 i 24 godzin.

  1. Wiek szczeniąt pasuje ≤ 1 dzień. Przypisz każdy miot jako miot o niskiej lub wysokiej dawce. W miocie losowo przypisz młode jako szczenię kontrolne lub zainfekowane.
  2. W 3 lub 4 dniu po porodzie zapisz wagę wszystkich młodych przed inokulacją E. coli-lux lub kontrolą PBS. W tym czasie oddziel matkę od młodych, aby upewnić się, że nie są przenoszone podczas infekcji.
  3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą igły do insuliny odessać PBS lub inokulum E. coli-lux. Do tej pracy użyto inokulum 2 x 106 i 7 x 106 CFU na mysz. Przechowywać zarówno zakaźne inokulum, jak i PBS na lodzie do momentu podania we wstrzyknięciu podłopatkowym.
  4. Umieść noworodka na czystej powierzchni w kapturze komory bezpieczeństwa biologicznego i podnieś skórę na karku, jakby chciał go podrapać.
  5. W przestrzeń utworzoną między skórą a mięśniem zwierzęcia wbij igłę, skos do góry, tuż pod skórę i wstrzyknij 50 μl PBS lub E. coli-lux. Jednocześnie należy uwolnić ściśnięty fragment skóry, aby zapobiec cofaniu się wstrzyknięcia.
  6. Wyjmować igłę powoli i ostrożnie. Po zakończeniu iniekcji umieść młode z powrotem w matkach.
    UWAGA: Ze względu na ich anatomiczny etap rozwoju, podanie żyły ogonowej lub wstrzyknięcia dootrzewnowego nowonarodzonym szczeniętom w 3-4 dniu jest technicznie trudne. W związku z tym do tego badania wybrano drogę infekcji podłopatkowej ze względu na łatwość wykonania.

4. Ocena choroby i kryteria punktu końcowego

  1. Monitoruj młode dwa razy dziennie przez cały czas trwania infekcji. Zwróć uwagę na wszelkie nieprawidłowości w wyglądzie.
  2. Rejestruj wagi jako obiektywną miarę zachorowalności.
  3. Oprócz zmian masy ciała przetestuj zdolność szczeniąt do wyprostowania się, ustawiając noworodka po stronie grzbietowej. Chore zwierzęta nie będą w stanie przewrócić się na stronę brzuszną i na nogi lub z trudem wykonają tę czynność.
  4. Sprawdzić, czy następujące elementy należy oznaczyć zwierzęta w pobliżu kryteriów punktu końcowego: mniej niż 85% normalnej masy ciała; zmniejszone ruchy i niezdolność do wyprostowania się; przebarwienia skóry i bardziej szary lub przezroczysty wygląd w przeciwieństwie do różowego; uczucie chłodu w dotyku, wskazujące na obniżoną temperaturę ciała i krwotoczne siniaki wzdłuż boków, Wskazuje również na zaawansowaną chorobę.
    UWAGA: Jeśli noworodki nie przybrały na wadze w ciągu dwóch dni i nie pasują do któregokolwiek z opisów w krokach 4.4, spełniają kryteria punktu końcowego. Młode, które otrzymują dużą dawkę, często spełniają kryteria punktu końcowego po 24 godzinach. Młode kontrolne w miotach o niskiej i wysokiej dawce zostaną poddane eutanazji w tym samym czasie, aby umożliwić analizę porównawczą między grupą kontrolną i eksperymentalną. Przejdź do sekcji dotyczącej eutanazji poniżej.

5. Obrazowanie in vivo obciążenia bakteryjnego

  1. Do obrazowania i późniejszej analizy należy używać aparatu do obrazowania i analizy mikrotomografii komputerowej.
    UWAGA: Kolor skóry szczeniąt nie ma wpływu na jakość obrazowania.
  2. Umieść klatkę z nowonarodzonymi myszami zakażonymi E. coli-lux i umieść koferdam w okapie z przepływem laminarnym na poziomie BSL-2. Usuń myszy, które mają być zobrazowane, i umieść je w przezroczystej komorze izofluranu w kapturze. Zaleca się rozpoczęcie od niezakażonych grup kontrolnych, aby ocenić potrzebną ilość izofluranu.
  3. Otwórz oprogramowanie na komputerze podłączonym do mikroprzekładnika prądowego. Zainicjuj system i poczekaj, aż temperatura CCD zatrzyma się na poziomie -90 °C.
  4. Włącz parownik izofluranu i ustaw pokrętło na 5% przepływu izofluranu. Trzymaj myszy w komorze z tą mieszaniną izofluranu przez 20-30 sekund, aż przestaną się poruszać; W przypadku niektórych myszy może być konieczne wydłużenie lub skrócenie czasu ekspozycji na znieczulenie. Gdy myszy przestają się ruszać, są wystarczająco znieczulone i można je obrazować.
  5. Przenieś myszy do komory obrazowania mikrotomografii komputerowej i umieść je na pudełku do obrazowania w pozycji leżącej, z nosami skierowanymi prostopadle do stożków nosowych. Użyj wosku dentystycznego, aby delikatnie przytrzymać stopy na pudełku do obrazowania, aby ograniczyć wszelkie ruchy. Jednocześnie można obrazować do 4 nowonarodzonych myszy.
  6. Zmniejsz przepływ izofluranu do 2-4%, aby utrzymać myszy w stanie znieczulenia podczas obrazowania. Zamknij drzwi komory obrazowania mikrotomografii komputerowej. Sprawdź myszy kilka sekund później. Jeśli zaczną się poruszać, oblaj wacik izofluranem i przyłóż go do nosa poruszającego się zwierzęcia przez 5 sekund w celu znieczulenia. Trzymaj wacik w pobliżu zwierząt podczas obrazowania. Uważaj, aby nie przemęczyć myszy i nie zakończyć leczenia.
  7. Korzystając z oprogramowania, wybierz opcję Luminescencyjny do obrazowania. Użyj filtra wzbudzenia ustawionego na Blok i filtra emisji ustawionego na Otwarty, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm i 620 nm. Łącznie będzie siedem filtrów emisyjnych ustawionych dla luminescencji.
  8. Zobrazuj myszy w każdym punkcie czasowym (0, 10 i 24 godziny po infekcji [hpi]) i zapisz wszystkie obrazy w folderze dla każdego punktu czasowego. Załóż młode z powrotem do klatki z zaporą i sprawdź, czy wszystkie szczenięta wyzdrowiały po znieczuleniu.
  9. Aby przeanalizować obrazy 2D, otwórz obrazy w oprogramowaniu. Zmień jednostki na Promienność (fotony); zamieni się to w Strumień Całkowity (fotony/sekundę).
  10. Analizuj tylko jeden zestaw obrazów z wieloma filtrami emisyjnymi jednocześnie. Z każdego zestawu obrazów zwróć uwagę na minimalne i maksymalne wartości radiancji znajdujące się w prawym dolnym rogu każdego obrazu (np. jeśli jest 7 filtrów emisji, będzie 7 obrazów oraz 7 wartości minimalnych i maksymalnych). Powtórz te czynności dla każdego zestawu obrazów, który ma zostać porównany.
  11. Aby określić skalę, która obejmie wartości i luminescencję dla wszystkich obrazów, znajdź najniższą wartość minimalną i najwyższą wartość maksymalną dla każdego zestawu obrazów. W tym badaniu obrazy z filtrem otwartym zostały wykorzystane jako reprezentatywne.
    1. Podświetl i otwórz wybrany obraz, aby zmienić skalę. Na palecie narzędzi kliknij kartę Image Adjust (Dopasuj obraz) i zmień Color Scale (Skala kolorów) na najniższe wartości minimalne i najwyższe wartości maksymalne, które zostały wcześniej zidentyfikowane. Zapisz każdy zestaw obrazów jako TIFF. W ten sposób indywidualnie analizuj każdy punkt czasowy, aby upewnić się, że wyświetlana jest prawidłowa skala.
  12. Aby określić ilościowo całkowity strumień świetlny (ilość sygnału luminescencyjnego na mysz) dla każdej myszy z osobna, otwórz obraz zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 5.9-5.10. Otwórz kartę Narzędzia ROI na palecie narzędzi i wybierz narzędzie okrąg. Wybierz 1 okrąg, jeśli analizujesz jeden obszar luminescencji.
  13. Przesuń ROI do Nakładka na obszarze luminescencji. W razie potrzeby dostosuj rozmiar ROI.
    UWAGA: Jeśli korekta jest konieczna, dostosuj ROI na innych obrazach w porównywalny sposób, aby zachować spójność. Wybierz opcję Mierz zwrot z inwestycji. Otworzy się okno Measurements ROI wyświetlające całkowity strumień (p/s), średnią radiancję (p/s/cm2/sr), odchylenie standardowe promieniowania, minimalną radiancję i maksymalną radiancję.
  14. Rejestruj pomiary całkowitego strumienia dla każdego zestawu obrazów. Liczba ta to ilościowa wielkość luminescencji w myszy na obrazach 2D.
  15. Aby wykonać zrekonstruowane w 3D obrazy mikrotomografii komputerowej, otwórz panel DLIT 3D Reconstruction (Rekonstrukcja 3D) w palecie narzędzi (Tool Palette) i sprawdź wszystkie długości fal, które mają zostać uwzględnione na karcie Analyze (Analizuj). Wybierz opcję Reconstruct (Rekonstrukcja).

6. Eutanazja

  1. Przygotowanie i oznakowanie probówek dla interesujących tkanek/narządów do sekcji zwłok i odpowiednich dalszych zastosowań.
  2. Oddziel noworodki od matki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Namocz wacik w izofluranie weterynaryjnym i umieść go w przezroczystej komorze bezpieczeństwa.
  4. W przypadku pobierania krwi należy przygotować mikropipetę P200 z końcówką i mieć probówkę o pojemności 1,5 ml z 10 μl 5 mM EDTA jako antykoagulant. Oczekuje się objętości 50-200 μl krwi.
  5. Umieść noworodka w komorze i monitoruj szczeniaka, aż stanie się nieruchomy.
  6. Szybko usuń noworodka i odetnij głowę nożyczkami. Jeśli pozwoli mu się oddychać świeżym powietrzem przez dłuższy czas, szczenię może odzyskać przytomność. Noworodki mają zmniejszoną pojemność płuc w porównaniu z dorosłymi myszami i dlatego nie oddychają wystarczająco głęboko, aby można je było poddać eutanazji za pomocą samego izofluranu.
  7. Pobrać krew z tułowia u podstawy głowy za pomocą mikropipety P200. Aby zmaksymalizować ilość pobranej krwi, wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe po dekapitacji. Policz bakterie we krwi przez seryjne rozcieńczenie i standardowe liczenie płytek, jak opisano w kroku 1.9.
  8. Wysterylizuj całego noworodka 70% etanolem przed wycięciem próbek tkanek.

7. Pobieranie tkanek

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy oblać noworodka 70% etanolem, aby zapobiec skażeniu. Połóż zwierzę na prawym boku.
  2. Za pomocą kleszczy chwyć skórę w punkcie między brzuchem a tylną lewą nogą i wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi z cienką końcówką. Kontynuuj odcinanie skóry, przesuwając się w górę w kierunku tyłu. Postępuj, aż cała śledziona zostanie odsłonięta.
  3. Użyj kleszczy, aby chwycić śledzionę i usunąć ją z brzucha, używając nożyczek, aby odłączyć tkankę łączną. Umieścić śledzionę w roztworze odpowiednim do jej dalszego zastosowania.
  4. Aby uzyskać płuca, całkowicie oderwij skórę klatki piersiowej
    5. .
  5. Wchodząc u podstawy mostka z nożyczkami trzymanymi pionowo, tnij w górę, aż klatka piersiowa zostanie rozcięta.
  6. Użyj kleszczy, aby chwycić prawe i lewe płuco indywidualnie i usunąć je z klatki piersiowej. Usuń serce z tkanki płucnej, przecinając nożyczkami.
  7. Umieścić płuco w roztworze odpowiednim do jego dalszego zastosowania. Do izolacji RNA należy użyć 500 μl tiocyjanianu guanidyny/fenolu (GTCP). Do histopatologii należy użyć 5 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny.

8. Izolacja RNA z tkanki płucnej w celu ekspresji genów

  1. Wstępnie schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Zmiel tkankę płucną w GTCP nożyczkami. Następnie homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora zasilanego bateryjnie. Kontynuuj, aż roztwór będzie tak jednolity, jak to możliwe. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.
  3. Za pomocą przefiltrowanych końcówek pipet dodać 100 μl chloroformu. Odwróć probówkę przez 15 s i inkubuj 3-5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g.
  5. Podczas wirowania przygotuj probówki o pojemności 1,5 ml z 500 μl 70% etanolu. Zmontuj i oznacz kolumny i probówki zbiorcze z zestawu do izolacji RNA.
  6. Ostrożnie usuń górną, wodną warstwę, nie naruszając warstwy międzyfazowej, która powstała podczas wirowania. Umieść warstwę wodną w probówkach zawierających 70% etanolu.
  7. Przenieść mieszaninę etanolu i lizatu do kolumny w probówce zbiorczej.
  8. Od tego momentu postępuj zgodnie z protokołem produktu komercyjnego zestawu do izolacji RNA, aż do ostatecznej elucji RNA.
  9. Przeanalizuj RNA pod kątem czystości i ilości. Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

9. synteza cDNA

  1. Oznaczyć probówki do PCR i odłożyć na bok.
  2. Dodać 1 μg RNA do mieszaniny reakcyjnej cDNA dla każdej próbki.
  3. Dodaj odczynniki i matrycę do probówki PCR zgodnie z opisem w protokole cDNA. Na końcu dodaj enzym do mieszaniny.
  4. Umieść probówki PCR w termocyklerze z następującymi ustawieniami pracy: 5 min w 25 °C, 40 min w 42 °C, 15 min w 85 °C i 4 °C końcowe wstrzymanie.
  5. Wyjmij probówki PCR z termocyklera i użyj natychmiast lub przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.

10. Ilościowy cykl PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym

  1. Przygotuj koktajl mieszanki reakcyjnej dla każdego z genów, które mają być analizowane. Każda reakcja PCR o pojemności 15 μl wymaga 7,5 μl 2x mieszanki odczynników, 0,75 μl startera/sondy specyficznego dla genu znakowanego 20X 5'-FAM i 3,75 μl wody wolnej od nukleaz. Amplikony zwykle wahają się od 60 do 120 pz.
  2. Dodaj 3 μl matrycy cDNA dla każdej grupy eksperymentalnej do odpowiednich studzienek.
  3. Dodać 12 μl koktajlu mieszanki reakcyjnej specyficznej dla genu do odpowiednich studzienek.
  4. Przykryj płytkę optyczną folią samoprzylepną i odwiruj przez 1 minutę przy 1 000 x g, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły powstać w studzienkach.
  5. Umieść płytkę PCR w termocyklerze PCR w czasie rzeczywistym.
  6. Ustaw metodę pracy w następujący sposób: 3 min w 95 °C, 40 cykli po 95 °C przez 15 s, a następnie 60 °C przez 1 min.
  7. Analizuj dane, normalizując gen będący przedmiotem zainteresowania do kontroli wewnętrznej i wyraź dane z zakażonych próbek w stosunku do niezakażonych próbek kontrolnych przy użyciu wzoru 2-ΔΔCt i transformacji liczb logarytmicznej2.

11. Histopatologia płuc

  1. Usuń płuca z nowonarodzonego szczeniaka, jak opisano powyżej.
  2. Umieść tkankę w objętości 10% neutralnie buforowanej formaliny tak, aby stosunek roztworu do tkanki wynosił około 20:1 przez 3-7 dni.
  3. Koordynuj z odpowiednią służbą histologiczną w zakresie zatapiania parafiny, cięcia oraz barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Do tej pracy wykorzystano rdzeń histopatologiczny Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Alternatywnie, postępuj zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami19.

12. Test zabijania bakterii in vitro

  1. Usunąć śledzionę z niezakażonego noworodka w sposób opisany powyżej i umieścić go w nylonowym koszu o średnicy 40 μm na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Powtórz to i zbierz śledziony w jednej probówce, która zostanie zebrana i zhomogenizowana razem.
  2. Dodaj 5 ml PBS uzupełnionego 10% FBS.
  3. Zdezagregować tkankę za pomocą sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 3 ml, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  4. Zebrać zawiesinę jednokomórkową na zewnątrz nylonowego kosza, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i granulować komórki o wymiarach 350 x g przez 5 minut.
  5. Zawieś komórki w buforze do lizy czerwonych krwinek (2 ml dla maksymalnie 7-8 śledzion) i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować erytrocyty.
  6. Przemyć splenocyty PBS i osadem jak wyżej.
  7. Zawiesić splenocyty w 0,25 ml PBS uzupełnionym 0,5% BSA i 2 mM EDTA zgodnie z oczekiwaną wydajnością komórek.
  8. Policz splenocyty za pomocą hemocytometru lub innej odpowiedniej aplikacji.
  9. Wyizoluj komórki Ly6B.2+ (mieloidowa populacja granulocytów/monocytów zapalnych) za pomocą kulek immunomagnetycznych zgodnie z protokołem producenta.
  10. Nasiona komórek Ly6B.2+ o gęstości 1 x 105 komórek na dołek na czarnej lub białej 96-dołkowej płytce w objętości 0,1 ml DMEM, która zawiera 10% FBS, 2 mM glutaminy i 25 mM HEPES (kompletna pożywka).
  11. Wymienić bioluminescencyjne E. coli zgodnie z opisem w sekcji 1 i przygotować inokulum bakteryjne w pożądanej wielokrotności infekcji (MOI) w końcowej objętości 0,1 ml. Najlepiej zrobić to, wykonując to, co jest niezbędne dla wszystkich studni we wspólnym MOI w partii.
  12. Dodać 0,1 ml inokulum bakteryjnego lub samej pożywki jako kontrolę. Inkubować płytkę wielodołkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  13. Zastąp pożywkę 0,2 ml świeżą, kompletną pożywką zawierającą gentamycynę (100 μg/ml), delikatnie usuwając pożywkę pipetą i dodając świeżą pożywkę z nową końcówką do pipety. Przywróć kulturę do inkubacji na dodatkowe 2 godziny.
  14. Po 3 godzinach od zakażenia zmierz luminescencję w każdym dołku płytki hodowlanej z pokrywką od dołu za pomocą czytnika płytek, a następnie przywróć kulturę do inkubacji.
  15. Powtórz pomiary luminescencji w innych żądanych punktach czasowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół indukuje sepsę bakteryjną u noworodków myszy; w celu zbadania przebiegu choroby zastosowano podłużne obrazowanie intravitalne, wyliczanie liczby bakterii we krwi, oceny histologiczne zmian patologicznych oraz profile ekspresji cytokin zapalnych. Objawy zachorowania obserwowano w czasie u noworodków zakażonych zarówno niską (~2 x 106 CFUs), jak i wysoką (~7 x 106 CFUs) dawką inokulum E.coli. Noworodki, które otrzymały większą dawkę inokulum, wykazywały wyraźniejsze objawy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz model infekcji podłopatkowej do indukowania sepsy bakteryjnej u nowonarodzonych myszy jest nowatorską metodą badania podłużnego rozprzestrzeniania się patogenów bakteryjnych w czasie rzeczywistym. Obrazowanie przyżyciowe daje możliwość zbadania rozprzestrzeniania się bakterii w czasie rzeczywistym u noworodków. Ma to kluczowe znaczenie dla zrozumienia kinetyki rozprzestrzeniania się bakterii i dalszego badania odpowiedzi i uszkodzeń gospodarza w odpowiedniej fazie choroby. Młodem mysim podaje się podskórne, podłopat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze instytucjonalne dla C.M.R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawki insulinowejCoviden1188128012inokulum lub wstrzyknięcie PBS
10% neutralna buforowana formalinaVWR89370-094Histopatologia
ACK Bufor do lizyGibcoLSA1049201Test klirensu bakteryjnego
Pasta do tatuażu zwierzęcegoKetchumKI1482039Identyfikacja zwierząt
Tusz do tatuażu dla zwierząt Zielona pastaKetchumKI1471039Identyfikacja zwierząt
Mikrogranulki anty-Ly-6B.2Miltenyi Biotec130-100-781Izolacja komórek
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (wyraża lucyferazę)N/AN/AZbudowany we własnym zakresie w WVU
E.Z.N.A. Zestaw do całkowitej ekstrakcji RNA HPOmega Bio-tekR6812Ekstracja RNA
DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Tryptic Soy AgarBecton, Dickinson and Company236950Wzrost bakterii
IL-1 beta Primer/sonda (Mm00434228)Thermo Fisher Scientific4331182Ekspresja cytokin qPCR
IL-6 Starter/sonda (Mm00446190)Thermo Fisher Scientific4331182Ekspresja cytokin qPCR
iQ SupermixBio-Rad1708860Ilościowy zestaw
Bufor izolacyjnyMiltenyi BiotecN/ATest klirensu bakteryjnego
IVIS Spectrum CT i Living Image 4.5 OprogramowaniePerkin ElmerN/AObrazowanie przyżyciowe
LB Broth, LennoxFisher BioReagentsBP1427-500Sitko do wzrostu bakterii
EASY (kosz nylonowy)Greiner Bio-one542 040Sitko do komórek
SpectraMax iD3Urządzenia molekularneNie dotyczyCzytnik płytek
Silnik do peletówGrainger6HAZ6Homogenizacja tkanek Granulat
polipropylenowy TłuczkiGrainger6HAY5Homogenizacja tkanek
Prime Thermal CyclerTechne3PRIMEBASE/02Synteza cDNA
Starter/sonda TNF-alfa (Mm00443258)Thermo Fisher Scientific4331182Ekspresja cytokin Triodczynnik qPCR
(GTCP)Centrum Badań MolekularnychEkstracja RNATR 118
do syntezy cDNA PCR iScript w czasie rzeczywistym do syntezy cDNA Bio-Rad 1708891

Bibliografia

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model sepsy noworodkowejobrazowanie witalnerozsiew bakteriiE. coli O1:K1:H7śledzenie bakterii luminescencyjnychobrazowanie mikro-CTekspresja cytokin zapalnychanaliza histopatologiczna tkanekpomiar obciążenia bakteryjnegoodpowiedź immunologiczna gospodarza
Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.