Method Article

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

DOI:

10.3791/61612

⸱

July 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq) to potężna metoda, która łączy mutagenezę transpozonów i masowe sekwencjonowanie równoległe w celu identyfikacji genów i szlaków, które przyczyniają się do sprawności bakterii w szerokim zakresie warunków środowiskowych. Zastosowania Tn-seq są rozległe i umożliwiły nie tylko badanie zależności genotyp-fenotyp na poziomie organizmu, ale także na poziomie populacji, społeczności i systemów. Bakterie Gram-ujemne są silnie związane z fenotypami oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, co zwiększa liczbę przypadków niepowodzenia leczenia antybiotykami. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe definiuje się jako wzrost bakterii w obecności antybiotyków, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne. Kolistyna przeciwdrobnoustrojowa "ostatniego rzutu" jest stosowana w leczeniu zakażeń bakteryjnych Gram-ujemnych. Jednak kilka patogenów Gram-ujemnych, w tym Acinetobacter baumannii, może rozwinąć oporność na kolistynę poprzez szereg mechanizmów molekularnych, z których niektóre scharakteryzowano przy użyciu Tn-seq. Ponadto szlaki transdukcji sygnału, które regulują oporność na kolistynę, różnią się w obrębie bakterii Gram-ujemnych. W tym miejscu proponujemy skuteczną metodę mutagenezy transpozonów u A. baumannii, która usprawnia generowanie nasyconej biblioteki insercji transpozonów i konstrukcji biblioteki amplikonów, eliminując potrzebę enzymów restrykcyjnych, ligacji adaptera i oczyszczania żelu. Opisane tu metody umożliwią dogłębną analizę determinantów molekularnych, które przyczyniają się do sprawności A. baumannii po podaniu kolistyny. Protokół ma również zastosowanie do innych Gram-ujemnych patogenów ESKAPE, które są przede wszystkim związane z lekoopornymi zakażeniami szpitalnymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrycie antybiotyków jest niewątpliwie jednym z najbardziej wpływowych wydarzeń związanych ze zdrowiem wXX wieku. Antybiotyki nie tylko szybko rozwiązują poważne infekcje bakteryjne, ale odgrywają również kluczową rolę we współczesnej medycynie. Poważne operacje, przeszczepy i postępy w medycynie neonatologicznej i chemioterapii sprawiają, że pacjenci są podatni na zagrażające życiu infekcje, a terapie te nie byłyby możliwe bez antybiotyków1,2. Jednak szybki rozwój i rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki wśród ludzkich patogenów znacznie zmniejszyło skuteczność wszystkich klinicznie ważnych klas antybiotyków3. Wiele infekcji bakteryjnych, które kiedyś można było łatwo usunąć za pomocą leczenia antybiotykami, nie reaguje już na klasyczne protokoły leczenia, powodując poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego1. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) polega na tym, że komórki bakteryjne rosną w śmiertelnych stężeniach antybiotyków, niezależnie od czasu trwania leczenia4,5. Istnieje pilna potrzeba zrozumienia czynników molekularnych i biochemicznych regulujących oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, co pomoże w ukierunkowaniu rozwoju alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności patogeny ESKAPE są problematyczne w warunkach klinicznych i związane z rozległym opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Należą do nich Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. Podczas gdy kilka mechanizmów przyczynia się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w patogenach ESKAPE, ostatnie cztery organizmy są Gram-ujemne.

Bakterie Gram-ujemne tworzą charakterystyczną zewnętrzną membranę, która chroni je przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi. Błona zewnętrzna służy jako bariera przepuszczalności, która ogranicza wnikanie toksycznych cząsteczek, takich jak antybiotyki, do komórki. W przeciwieństwie do innych błon biologicznych, błona zewnętrzna jest asymetryczna. Zewnętrzna ulotka jest wzbogacona o lipopolisacharyd naświetlony powierzchniowo, podczas gdy wewnętrzna ulotka jest mieszaniną fosfolipidów6. Cząsteczki lipopolisacharydu są zakotwiczone w błonie zewnętrznej przez konserwatywną cząstkę lipidową A osadzoną w dwuwarstwie lipidowej7. Kanoniczny lipid Domena lipopolisacharydu Escherichia coli jest wymagana do wzrostu większości bakterii Gram-ujemnych i jest syntetyzowana przez dziewięcioetapowy szlak enzymatyczny, który jest jednym z najbardziej podstawowych i konserwatywnych szlaków w organizmach Gram-ujemnych6,7,8.

Polimyksyny to kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które celują w domenę lipidów A lipopolisacharydu, aby zaburzyć zewnętrzną błonę i lizować komórkę. Oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi resztami polimyksyn a ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi lipidów A rozrywa błonę komórkową bakterii, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki9,10,11,12,13. Kolistyna (polimyksyna E) jest lekiem przeciwdrobnoustrojowym stosowanym w leczeniu zakażeń wywołanych przez wielolekooporne Gram-ujemne patogeny szpitalne, takie jak Acinetobacter baumannii14,15,16. Po raz pierwszy odkryte w 1947 roku, polimyksyny są wytwarzane przez bakterie glebowe, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimyksyny były przepisywane w leczeniu zakażeń Gram-ujemnych przez lata, zanim ich kliniczne zastosowanie zostało ograniczone ze względu na doniesienia o znaczącej nefrotoksyczności i neurotoksyczności20,21.

A. baumannii jest szpitalnym patogenem Gram-ujemnym, który w ciągu ostatnich dziesięcioleci znacznie zwiększył zachorowalność i śmiertelność pacjentów22. To, co kiedyś było uważane za patogen niskiego zagrożenia, obecnie stanowi znaczne ryzyko infekcji szpitalnych na całym świecie ze względu na jego niesamowitą zdolność do nabywania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i wysokie ryzyko epidemii23,24. A. baumannii odpowiada za ponad 10% zakażeń szpitalnych w Stanach Zjednoczonych. Choroba objawia się zapaleniem płuc, bakteriemią, infekcjami dróg moczowych, infekcjami skóry i tkanek miękkich, zapaleniem opon mózgowych i zapaleniem wsierdzia25. Możliwości leczenia zakażeń A. baumannii zmniejszyły się z powodu oporności na prawie wszystkie klasy antybiotyków, w tym β-laktamy, fluorochinolony, tetracyklinę i aminoglikozydy23,24. Rozpowszechnienie wielolekoopornych, w znacznym stopniu lekoopornych i panlekoopornych izolatów A. baumannii doprowadziło do ponownego leczenia kolistyną, która została uznana za jedną z niewielu pozostałych opcji terapeutycznych nadal skutecznych przeciwko wielolekoopornemu A. baumannii. Jednak zwiększona oporność na kolistynę wśród izolatów A. baumannii jeszcze bardziej zwiększyła jej zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego10,11,12,13,27,30,31.

Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takie jak sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq), dostarczyły ważnych narzędzi do pogłębienia naszej wiedzy na temat sprawności bakterii in vitro i in vivo. Tn-seq to potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania interakcji genotyp-fenotyp u bakterii. Tn-seq ma szerokie zastosowanie w patogenach bakteryjnych, gdzie łączy tradycyjną mutagenezę transpozonów z masowym sekwencjonowaniem równoległym w celu szybkiego mapowania miejsc insercji, które można wykorzystać do powiązania mutacji DNA z wariantami fenotypowymi w skali całego genomu32,33,34,35. Chociaż metody mutagenezy transpozonów zostały już wcześniej opisane, ogólne kroki są podobne33. Po pierwsze, biblioteka insercyjna jest generowana za pomocą mutagenezy transpozonów, w której każda komórka bakteryjna w populacji jest ograniczona do pojedynczej insercji transpozonu w genomowym DNA (gDNA). Po mutagenezie poszczególne mutanty są łączone. gDNA jest ekstrahowane z puli mutantów insercyjnych, a złącza transpozonowe są amplifikowane i poddawane sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Odczyty reprezentują miejsca insercji, które można zmapować do genomu. Insercje transpozonów, które zmniejszają sprawność, szybko wypadają z populacji, podczas gdy korzystne insercje są wzbogacane. Tn-seq odegrał zasadniczą rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat wpływu genów na sprawność bakterii w stresie33.

System transpozonów marynarskich Himar1 zakodowany w pJNW684 został specjalnie skonstruowany i zoptymalizowany na potrzeby mutagenezy transpozonów. Obejmuje transpozon z rodziny marynarzy flankujący gen oporności na kanamycynę, który jest używany do selekcji mutantów insercji transpozonów u A. baumannii. Koduje również specyficzny dla A. baumannii promotor, który napędza ekspresję genu kodującego transpozazę36. Transpozon oparty na marynarzu zawiera również dwa terminatory translacyjne poniżej genu oporności na kanamycynę, co zapobiega odczytowi poniżej klasy insertion37. pJNW684 ma również warunkowe pochodzenie replikacji RP4/oriT/oriR6K, które wymaga genu λpir wniesionego przez szczep dawcy do replikacji38. W przypadku braku genu λpir, wektor pJNW684 przenoszący maszynerię transpozycji nie będzie w stanie replikować się w szczepie biorcy A. baumannii10,36,38. Dlatego podczas koniugacji bakteryjnej tylko transpozon jest wprowadzany do genomu biorcy bez insercji w tle plazmidu, który przenosi gen transpozazy. Jest to istotne, ponieważ utrata aktywności transpozazy wraz z plazmidem powoduje pojedyncze, stabilne zdarzenie transpozycji, które zapobiega przemieszczaniu się transpozonu w różne miejsca po wprowadzeniu go do genomu biorcy.

pJNW648 został również przetestowany pod kątem aktywności w innym organizmie Gram-ujemnym, E. coli. Pomyślne zmontowanie wysycającej biblioteki sekwencyjnej Tn-seq w szczepie E. coli W3110 wykazało, że system jest zdolny do przeprowadzania mutagenezy w szerokim zakresie patogenów, w tym Enterobacteriaceae. Co więcej, specyficzny promotor A. baumannii, który napędza ekspresję transpozazy, może być szybko wymieniony na promotor specyficzny dla gatunku. Wreszcie, gen oporności na kanamycynę może być wymieniany na inne kasety oporności, w zależności od fenotypu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe badanego organizmu.

Jednym z czynników, który przyczynia się do oporności na kolistynę u A. baumannii, jest podawanie niewystarczających dawek, gdzie bakterie są narażone na selektywne ciśnienie na poziomie nieśmiertelnym39. Kilka raportów wykazało, że subhamujące stężenia przeciwdrobnoustrojowe mogą indukować regulowane odpowiedzi, które zmieniają fizjologię komórki w celu zmniejszenia podatności całej populacji bakterii11,12,30,31. Korzystając z Tn-seq, odkryliśmy czynniki regulujące oporność na kolistynę w szczepie A. baumannii ATCC 17978 po ekspozycji na hamujące10 i subhamujące stężenia kolistyny. Ten przykład szczegółowo opisuje metodę Tn-seq, która usprawnia konstrukcję i wzbogacanie nasyconej biblioteki mutantów transpozonów przy użyciu rodziny transpozonów opartych na marynarzach40,41. Podczas gdy kilka protokołów Tn-seq generuje od 20 000 do 100 000 mutantów35,42,43,44,45,46, protokół opisany tutaj może szybko wygenerować bibliotekę transpozonów składającą się z 400 000 + mutantów, co w przybliżeniu odpowiada wstawieniu transpozonu co 10 par zasad w A. baumannii10. Co więcej, rozmiar biblioteki może być zwiększony bez znaczącego dodatkowego wysiłku. Metoda ta eliminuje również konieczność stosowania endonukleaz restrykcyjnych, ligacji adaptera i oczyszczania żelu, co może zmniejszyć ostateczną różnorodność biblioteki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szczepu bakterii

  1. Szczep "dawcy" (E. coli MFD DAP-/pJNW684, tabela materiałów) dla izolowanych kolonii na agarze Luria-Bertani uzupełnionym 600 μM kwasem diaminopimelicznym (DAP), 100 mg/l ampicyliny i 25 mg/l kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Używając pojedynczej izolowanej kolonii, zaszczepić 50 ml bulionu Luria (LB) uzupełnionego 600 μM DAP, 100 mg/l ampicyliny i 25 mg/l kanamycyny w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i oznaczyć ją jako "dawca".
  2. Prążkować szczep "biorcy" (szczep A. baumannii ATCC 17978, Tabela materiałów) dla izolowanych kolonii na agarze Luria-Bertani. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Używając pojedynczej izolowanej kolonii, zaszczepić 50 ml LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i oznaczyć ją jako "biorcę".
  3. Inkubować obie kultury ("dawcę" i "biorcę") przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając.

2. Kojarzenie bakteryjne

  1. Przenieś nocne kultury do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  2. Osadzać zarówno kultury biorcy, jak i dawcy, wirując przy 5 000 x g przez 7 minut.
  3. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad szczepu "dawcy" w 35 ml LB uzupełnionego DAP w celu zmycia pozostałości antybiotyków.
  4. Osadzać komórki szczepu "dawcy" za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad szczepu "dawcy" w 4,5 ml LB uzupełnionego DAP. Użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  6. Przenieś ponownie zawieszony szczep "dawcy" do probówki ze szczepem "biorcy", która zawiera granulowane komórki "biorcy". Użyj tej samej pipety serologicznej o pojemności 10 ml z kroku 2.5, aby wymieszać kultury. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Całkowita objętość końcowej zawiesiny powinna wynosić 5 ml.
  7. Rozprowadzić zawiesinę do łączenia w postaci pojedynczych kropelek o pojemności 100 μl na płytkach agarowych LB uzupełnionych DAP (5-7 kropel na płytkę) (Rysunek 1A).
  8. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  9. Nie naruszając kropelek, ostrożnie przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić kultury do łączenia przez 1 godzinę.
    UWAGA: Okresy inkubacji przekraczające 1 godzinę grożą powstaniem mutantów siostrzanych.
  10. Po inkubacji dodaj 1,5 ml LB na każdą płytkę i zbierz poprzez ponowne zawieszenie bakterii z płytek. Do wymieszania należy użyć mikropipety o pojemności 1 ml. Ostateczna objętość powinna wynosić około 12 - 15 ml.
  11. Połącz zebrane komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  12. Połączyć połączone komórki za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.
  13. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 ml LB w celu usunięcia pozostałości DAP.
  14. Osadzać paski za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.
  15. Powtórz krok prania (kroki 2.13 i 2.14).
  16. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml ponownie zawiesić osad w 10 ml LB uzupełnionego 25% glicerolem.
  17. Używając umytych komórek, wykonaj pięć seryjnych rozcieńczeń w bulionie LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na 4 różnych płytkach za pomocą sterylnych szklanych kulek: agar Luria-Bertani uzupełniony kanamycyną, agar uzupełniony ampicyliną, agar uzupełniony DAP i sam agar
    19. .
  19. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  20. Pozostałą ilość materiału podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Określ odpowiednie rozcieńczenie biblioteki transpozonów

  1. Rejestruj jednostki tworzące kolonie (CFU) z nocnych płytek.
  2. Wyobraź sobie płytkę z policzalnymi koloniami dla każdego innego stanu płytki (Rysunek 2A).
    UWAGA: Zarówno szczepy "dawcy", jak i "biorcy" powinny rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych DAP, więc większość rozcieńczeń posiewu da trawnik. Tylko szczep "biorca" może rosnąć na płytkach agarowych. Ani szczep "dawcy", ani "biorcy" nie może rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych ampicyliną, więc nie powinno być żadnego/minimalnego wzrostu. Tylko docelowe komórki szczepu kodujące insercję transpozonu mogą rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych kanamycyną. Kolonie powinny różnić się wielkością, co wskazuje na insercji transpozonów w genach, które przyczyniają się do sprawności na agarze uzupełnionym kanamycyną.
  3. Obliczyć liczbę mutantów transpozonów w zamrożonym kryciu, licząc liczbę kolonii na płytkach agarowych LB uzupełnionych kanamycyną.
    UWAGA: W przypadku genomu A. baumannii (około 4 Mb/s) celem było uzyskanie około 400 000 kolonii w celu wygenerowania biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości (około jednej insercji transpozonu/10 par zasad). Jednak liczba ta powinna być zoptymalizowana w oparciu o rozmiar genomu gatunku docelowego).

4. Generowanie końcowej biblioteki mutantów bakteryjnych

  1. Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego krycia na lodzie.
  2. Łączenie płytek na 150 mm płytkach agarowych Luria-Bertani uzupełnionych kanamycyną na podstawie jtk obliczonych w kroku 3.1. Dostosuj objętość za pomocą LB, aby uzyskać 13 333 kolonii na 150 μl przed posiewem.
    UWAGA: Liczba CFU została tutaj określona na około 105 CFU/ml, więc objętość krycia została dostosowana, aby uzyskać 13 333 kolonii na płytkę, ponieważ zapewniłoby to optymalną liczbę kolonii na 30 płytkach dla biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości bez przepełniania płytek.
  3. Użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić 150 μl rozcieńczenia na płytce na płytkach agarowych Luria-Bertani o wymiarach 30 x 150 mm uzupełnionych kanamycyną, aby uzyskać 400 000 kolonii (Rysunek 1C).
    UWAGA: Do rozprowadzania bakterii na płytkach można używać sterylnych prętów lub wszelkiego rodzaju sterylnych narzędzi do rozsiewania (tj. szklanych kulek).
  4. Zużytą probówkę zawierającą nadmiar matowania należy zutylizować
    UWAGA: Cykle zamrażania/rozmrażania powodują selektywne wywieranie nacisku na kulturę bakteryjną, co może zniekształcić wyniki eksperymentu Tn-seq. Za każdym razem należy używać nowej porcji.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 14 h.
    UWAGA: Czas inkubacji jest zoptymalizowany, aby zapobiec przerostowi (stykaniu się kolonii). Sugeruje się minimalizację wzrostu poprzez skrócenie czasu inkubacji.

5. Szacowanie zagęszczenia biblioteki i pulowanie dla pamięci masowej

  1. Policz jtk na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% z co najmniej 3 płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek (Rysunek 2A). Upewnij się, że kolonie nie stykają się z inną kolonią.
  2. Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj 3-5 ml LB (lub więcej w razie potrzeby) do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania.
    UWAGA: Sterylne pętle zaszczepiające służyły do skutecznego skrobania płytek.
  3. Zbierz zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (Rysunek 1D). Będzie to wymagało wielu stożkowych probówek o pojemności 50 ml, co najmniej 3.
  4. Zawiesina bakteryjna w postaci granulatu przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 7 min.
  5. Wyrzuć supernatant i ponownie wymieszaj osad w 5 ml LB uzupełnionego 30% glicerolem.
  6. Podwielokrotność 1 ml z biblioteki transpozonów do kriowialiów i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Identyfikacja czynników regulujących oporność na kolistynę u A. baumannii

  1. Przygotuj 4 kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, z których każda zawiera 50 ml bulionu LB i oznacz jako (Rysunek 2B)
    1. A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (+) colistin_1
    4. A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (+) colistin_2
      UWAGA: W opisanym tutaj wzroście prowokacji każdy warunek, (-) kontrola kolistyny i (+) prowokacja kolistyną, jest testowany w dwóch egzemplarzach. W związku z tym konfiguracja wymaga 4 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml po dwie na warunek.
  2. Dodać 50 μl 0,5 mg/l kolistyny do (+) kolb kolistyny (6.1.3 i 6.1.4) i 50 μl wody do (-) kolb kolistyny (6.1.1 i 6.1.2).
  3. Rozmrozić zamrożoną podwielokrotność biblioteki Tn-seq z kroku 5 na lodzie.
  4. Odpipetować 1 μl rozmrożonej biblioteki do 1 ml PBS.
  5. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i pomnóż przez 1 000,
    UWAGA: Określa OD600 z 1 μL biblioteki Tn.
  6. Na podstawie obliczeń w kroku 6.5 zaszczepić każdą kolbę zawierającą 50 ml LB do końcowego OD600 0,001.
  7. Hodować kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C do OD600 0,5,
    UWAGA: Ważne jest, aby kultury pozostawały w logarytmicznej fazie wzrostu, więc jeśli twój szczep ma inną OD600 podczas wykładniczego wzrostu, OD600 należy dostosować, aby zapewnić, że kultura replikuje się jak najwięcej razy w logarytmicznej fazie wzrostu. Jeśli kultura replikuje się tylko 3 razy, zdolność do wykrywania defektów sprawności u mutantów jest teoretycznie ograniczona do 3-krotnych różnic. Ponieważ różne bakterie mają różne czasy podwajania, ważne jest, aby wysiewać kultury przy ustalonym OD600, aby znormalizować początkowe inokulum. Zapewnia to spójną reprezentację całej biblioteki we wszystkich kulturach.
  8. Zbierać kultury za pomocą wirowania w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 7 minut.
  9. Usunąć sklarowany osad i przemyć 50 ml PBS.
  10. Osad przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 7 min.
  11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Podwielokrotność ~ 200 μL do 5 probówek do mikrowirówek.
  12. Osad należy przetworzyć przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć cały supernatant za pomocą końcówki pipety.
  13. Przechowuj granulki w temperaturze -20 °C lub przystąp do ekstrakcji gDNA.

7. ekstrakcja gDNA

  1. Rozmrozić jedną komórkę na lodzie.
  2. Dodać 0,6 ml buforu do lizy (tabela materiałów) i odwirować, aby całkowicie zawiesić osad.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Dodać 0,6 ml fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego do próbki i energicznie przetrząsać.
  5. Rozdzielaj fazy za pomocą wirowania w mikrowirówce z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki. Unikaj zakłócania interfejsu fazowego podczas przenoszenia.
  7. Dodać równą objętość chloroformu do fazy wodnej otrzymanej powyżej i energicznie wirować.
  8. Rozdziel fazy, wirując w mikrowirówce z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  9. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki.
    UWAGA: Pamiętaj, aby nie zakłócać działania interfejsu podczas przesyłania.
  10. Dodać 2,5 razy więcej zimnego 100% etanolu w fazie wodnej i delikatnie wymieszać. Wytrącone DNA będzie widoczne.
  11. Umieścić probówkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę.
  12. Osad DNA poprzez odwirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  13. Ostrożnie usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu DNA i przemyć go pipetowaniem 150 μl 70 % etanolu.
  14. Osad DNA za pomocą wirowania z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 2 min.
  15. Ostrożnie usunąć supernatant.
  16. Powtórz krok 7.14 jeden raz. Ostrożnie usuń cały pozostały etanol.
  17. Suszyć DNA przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
  18. Zawiesić osad DNA w 100 μl buforu TE przez pipetowanie.

8. Ścinanie DNA (Rysunek 3A)

  1. Rozcieńczyć gDNA buforem TE do stężenia 250 ng/ml w całkowitej objętości 200 μL.
  2. Umieść probówki w sonikatorze łaźni wodnej.
  3. Sonizacja DNA w celu uzyskania fragmentów około 300 nukleotydów. Moc: 60 %, czas całkowity: 20 min, cykle: 10 s wł. i 10 s wył. w temperaturze 4 °C (Rysunek 3A).
  4. Potwierdź, że DNA jest odpowiednio ścinane, oddzielając 10 μl nieściętego DNA i 10 μl ściętego DNA na 1% żelu agarozowym. Powtórz sonikację lub zoptymalizuj w razie potrzeby (Rysunek 3B).

9. Dodatek do końca 3' z tworzywa sztucznego (Rysunek 3A)

  1. Ustawić reakcję poli-C zgodnie z tabelą 1.
  2. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Oczyść reakcję poli-C za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości (Rysunek 3A), wykonując poniższe czynności.
    1. Do każdej próbki dodać 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości. Wir ~ 5 s lub pipeta w górę iw dół.
    2. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Krótko mówiąc, odwirować probówki, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).
    4. Przenieś probówki na stojak magnetyczny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    5. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym ostrożnie usuń supernatant.
    6. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu (nie przeszkadzaj kulkom).
    7. Próbki należy inkubować przez co najmniej 30 sekund, aż roztwór będzie klarowny.
    8. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym ostrożnie usuń supernatant.
    9. Powtórz etap prania (kroki 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Zebrać płyn na dnie probówki, wykonując krótki etap wirowania (~ 2 s).
    11. Przenieś probówki do stojaka magnetycznego i usuń pozostały płyn.
    12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut w celu wysuszenia próbek. Nie suszyć zbyt mocno.
    13. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj do każdej 25 μl wody. Wirować przez ~ 5 s lub pipetować w górę iw dół.
    14. Krótko mówiąc, odwirować probówki, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).
    15. Przenieś probówki na stojak magnetyczny i pozostaw na ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    16. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym usuń płyn bez naruszania kulek i przenieś do nowej probówki (~ 23 μL DNA).

10. Wzmocnienie złącza transpozonowego (Rysunek 3A)

  1. Ustaw PCR 1 zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla pierwszego zagnieżdżonego PCR (Tabela 2).
  2. Przeprowadzić PCR 1 w warunkach opisanych w Tabeli 1.
  3. Oczyść produkty PCR za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości (kroki 9.3.1 – 9.3-12). Eluować w 50 μl wody (etapy 9.3.13 – 9.3.16). W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotuj kulki paramagnetyczne sprzężone ze streptawidyną:
    1. Ponownie zawiesić kulki Streptawidyny, energicznie potrząsając.
    2. Dodać 32 μl kulek na próbkę do świeżej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Koraliki na 6 + próbki można przygotować w jednej tubie.
    3. Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    4. Za pomocą rurki na stojaku magnetycznym usuń supernatant.
    5. Wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego. Przepłukać kulki przez ponowne zamieszanie w 1 ml 1x bufor czarno-biały, pipetując w górę iw dół.
    6. Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    7. Z rurką na stojaku magnetycznym usuń supernatant.
    8. Powtórz etap mycia z 1 ml 1x buforem czarno-białym (kroki 10.4.5 – 10.4.7) jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania.
    9. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 52 μl 2x czarno-białego bufora na próbkę.
  5. Połączyć 50 μl przygotowanych kulek z 50 μl oczyszczonego PCR1 (z kroku 10.3). Odpipetować do mieszania.
  6. Obracaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  7. Zmyj niezwiązane DNA:
    1. Krótko odwirować, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).
    2. Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    3. Z rurką na stojaku magnetycznym usuń supernatant.
    4. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, umyj kulki, ponownie umieszczając je w 100 μl 1x bufor czarno-biały i pipetując w górę iw dół.
    5. Przenieś rurkę do stojaka magnetycznego. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.
    6. Za pomocą rurki na stojaku magnetycznym usuń supernatant.
    7. Powtórz kroki mycia ze 100 μl LoTE (kroki 10.7.4 – 10.7.6) jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania.
  8. Ustawić PCR 2 zgodnie z opisem w Tabeli 1, aby wzmocnić złącza transpozonów i dodać pojedynczy kod kreskowy do każdej próbki (Tabela 2 i Tabela 3).
  9. Przeprowadzić PCR 2 w warunkach opisanych w Tabeli 1.
  10. Oczyść za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych do wyboru wielkości (kroki 9.3.1 – 9.3.12). Eluować w 17 μL wody (kroki 9.3.13 – 9.3.16), zebrać ~ 15 μL.
  11. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą fluorometru. Stężenia końcowe powinny wynosić od ~ 50 do 250 ng/μl.
  12. Oceń jakość DNA za pomocą elektroforezy kapilarnej opartej na chipie (Rysunek 4A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane metody opisują tworzenie biblioteki transpozonów o dużej gęstości w szczepie A. baumannii ATCC 17978 poprzez koniugację bakteryjną przy użyciu E. coli MFD DAP-, która replikuje plazmid pJNW684 (Rysunek 4B). Szczegółowy protokół wykorzystuje koniugację bakteryjną oburodzicielską do transferu pJNW684 ze szczepu dawcy E. coli λpir+ do szczepu biorcy A. baumannii. Jest to wydajna i niedroga metoda generowania gęstych bibliotek mutantów transp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. baumannii stanowi nowe zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego ze względu na szybkie nabywanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe przeciwko terapiom "ostatniego rzutu", takim jak kolistyna 10,11,12,23,24,30,31. W ostatnich dziesięcioleciach Tn-seq odegrał kluczową r...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez fundusze z Narodowego Instytutu Zdrowia (Grant AI146829 dla J.M.B.) i jest wdzięczna.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoksycytydyno-5'-TrifosforanAffymetrix77112
100 mM dCTP 2'-deoksycytydyno-5'-trifosforanInvitrogen10217-016
100bp Drabinka DNA Marker masy cząsteczkowejPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Szalki PetriegoCorning351029
150mm x 15mm Szalki PetriegoCorning351058
1X B& WN/AN/ARozcieńczony 2X B& W o połowę, aby uzyskać 1X czarno-biały.
Kwas 2,6-diaminopomelicznyAlfa AesarB2239103stosowany w 600 &mikro; M
2X B& Wn/an/dDodać 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,5) do wody. Stosowany z kulkami Streptawidyny. Roztwory przechowywać w temperaturze pokojowej.
50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkoweFisher Scientific12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTPN/A N/A9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml wody. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760stosowany przy 100 mg/L
System oczyszczania AMPure XP PCRBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerBioanalizator AgilentG2939B
Analiza DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
Stojak magnetyczny DynaMag-2 Invitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/A N/A N/AAuksotrof DAP, wymaga do wzrostu 600 mM egzogennie dodanego DAP. Zawiera maszynerię RP4 do transferu plazmidu. Nośnik do JNW68 (36).
EtanolFisher ScientificA4094
Fiolki kriogeniczne z gwintem zewnętrznymCorning09-761-71
Koraliki szklaneCorning72684
GlicerolFisher ScientificG33
Pętle do zaszczepianiaFisher Scientific22-363-602Narzędzie do skrobania
KanamycynaFisher ScientificBP906stosowany w agarze 25 mg/L
LB,Fisher ScientificBP1425
LB, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/ADodaj 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) do wody. Stosowany z kulkami Streptawidyny. Roztwory przechowywać w temperaturze pokojowej.
Bufor do lizyNiedotyczy9,34 ml buforu TE; 600 ml 10% SDS; 60 ml proteinazy K (20 mg/ml)
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (mieszanina 25:24:1, pH 6,7/8,0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X roztwórFisher Scientific BP39920Rozcieńczony do 1X
Fluorometr Qubit 4Thermo FisherQ33238
Probówki do oznaczania kubitówThermo FisherQ32856
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo FisherQ32851
Sonikator z lodówką kąpiel wodnaQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptawidyna Kulki magnetyczneNew England Biolabs (NEB)S1420S
Bufor TEN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)
Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (rTdt)PromegaPR-M1875
bulion Miller dotyczy nie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478(2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263(1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24(1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503(2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28(2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163(2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578(2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033(2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291(2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251(2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315(2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298(2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transposon MutagenesisTn Seq LibraryGram Negative BacteriaA baumanniiColistin ResistanceBacterial ConjugationMechanical ShearingPoly C Tail AdditionSize Selection BeadsChip Electrophoresis

Related Articles