Artykuł metodologiczny

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61616

⸱

21 sierpnia 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Streszczenie

Model mysiego rany wycinającej był szeroko stosowany do badania każdej z kolejno nakładających się na siebie faz gojenia się ran: zapalenia, proliferacji i przebudowy. Rany mysie mają histologicznie dobrze zdefiniowane i łatwo rozpoznawalne łożysko rany, na którym można zmierzyć te różne fazy procesu gojenia. W tej dziedzinie często używa się arbitralnie zdefiniowanego "środka" rany do analiz histologicznych. Jednak rany są bytem trójwymiarowym i często nie są histologicznie symetryczne, co potwierdza potrzebę dobrze zdefiniowanej i solidnej metody kwantyfikacji w celu wykrycia defektów morfometrycznych o niewielkim rozmiarze efektu. W niniejszym protokole opisujemy procedurę tworzenia obustronnych ran wycinających o pełnej grubości u myszy, a także szczegółową instrukcję pomiaru parametrów morfometrycznych za pomocą programu do przetwarzania obrazu na wybranych odcinkach seryjnych. Dwuwymiarowe pomiary długości rany, długości naskórka, obszaru naskórka i obszaru rany stosuje się w połączeniu ze znaną odległością między sekcjami w celu ekstrapolacji trójwymiarowego obszaru naskórka pokrywającego ranę, całkowitej powierzchni rany, objętości naskórka i objętości rany. Chociaż ta szczegółowa analiza histologiczna jest bardziej czasochłonna i zasobożerna niż konwencjonalne analizy, jej rygor zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia nowych fenotypów w z natury złożonym procesie gojenia się ran.

Wprowadzenie

Gojenie się ran skórnych to złożony proces biologiczny z kolejno nakładającymi się na siebie fazami. Wymaga koordynacji procesów komórkowych i molekularnych, które są regulowane czasowo i przestrzennie w celu przywrócenia funkcji barierowej uszkodzonego nabłonka. W pierwszej fazie stan zapalny, neutrofile i makrofagi migrują do rany, mobilizując miejscowe i ogólnoustrojowe mechanizmy obronne1. Po fazie zapalnej i nakładającej się na nią następuje faza proliferacji. Fibroblasty zaczynają szybko się namnażać i migrować do tkanki ziarninowej. Keratynocyty z dala od krawędzi natarcia proliferują kierunkowo w kierunku rany, gdy zróżnicowane keratynocyty na krawędzi natarcia migrują, aby ponownie nabłonkować ranę2. Wreszcie rozpoczyna się faza przebudowy i dojrzewania, podczas której fibroblasty w tkance ziarninowej zaczynają syntetyzować i odkładać kolagen. Przebudowa i organizacja nowej matrycy może trwać do 1 roku po urazie3. Ze względu na złożoność nakładających się na siebie zdarzeń obejmujących wzajemne oddziaływanie między wieloma typami komórek oraz pomimo wieloletnich badań, wiele mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw gojenia się ran pozostaje słabo poznanych.

Model myszy jest dominującym modelem ssaków do badania mechanizmów gojenia się ran ze względu na łatwość użycia, stosunkowo niski koszt i możliwość manipulacji genetycznej1,4,5. Chociaż w modelu mysim opisano różne rodzaje ran, najczęstszą jest rana wycinająca (obustronna biopsja stempla lub bezpośrednia biopsja dziurka), a następnie modele ran ciętych4. Model rany wycinającej ma wyraźną przewagę nad modelem naciętym, ponieważ z natury generuje tkankę kontrolną, która nie została poddana procesowi gojenia. Tkanka z biopsji dziurkowej, która jest wycinana w ramach protokołu chirurgicznego, może być przetwarzana w taki sam sposób, jak zraniona tkanka i wykorzystywana do ustalenia warunków homeostatycznych dla pożądanego kryterium. Wycięta tkanka kontrolna może być również przydatna do oceny efektów wstępnej obróbki skóry lub potwierdzania udanej zmiany genu w momencie urazu4.

Parametry leczenia mogą być oceniane za pomocą wielu różnych technik, w tym planimetrii czy histologii. Jednak planimetria może ocenić tylko widoczne cechy rany, a ze względu na obecność strupa często nie koreluje z pomiarami gojenia, które są wizualizowane przez histologię, co sprawia, że histologia jest "złotym standardem" analizy4. Pomimo tego, że analiza histologiczna jest złotym standardem, najczęściej przeprowadza się ją na dowolnym podzbiorze rany6,7. Na przykład przecięcie rany "na pół" przed osadzeniem i pocięciem rany jest obecnie powszechną praktyką mającą na celu skrócenie czasu i zasobów poświęcanych na cięcie materiałów i analizę danych. Metoda analizy morfometrycznej opisana w tym protokole została opracowana w celu objęcia całej tkanki rany, dokładnego odzwierciedlenia cech morfologicznych rany oraz zwiększenia prawdopodobieństwa wykrycia wad gojenia się rany przy niewielkim rozmiarze efektu. W tym protokole szczegółowo opisujemy chirurgiczną metodę generowania najczęściej badanej rany mysiej, obustronnej rany wycinającej o pełnej grubości, a także szczegółową i rygorystyczną metodę analizy histologicznej, która jest rzadko stosowana w terenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami federalnymi oraz polityką i procedurami Uniwersytetu Iowa, które zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Iowa.

1. Zwierzęta i hodowla

  1. Użyj dorosłych myszy z pożądanej linii myszy w wieku 8-10 tygodni, gdy mieszek włosowy jest w stadium telogenu.
  2. W dniu operacji należy umieścić myszy w czystych klatkach i pojedynczo trzymać je w domu, aby zminimalizować przerwanie rany.

2. Chirurgia

UWAGA: Nie ma potrzeby utrzymywać sterylnych warunków chirurgicznych. Chociaż należy zachować ostrożność w celu utrzymania sterylności między zwierzętami, sama biopsja stempla jest wykonywana na czystej, ale niesterylnej powierzchni. Czas trwania operacji na zwierzę wynosi od 10 do 15 minut.

  1. Znieczulenie
    1. Znieczulaj zwierzę przez 1-2 minuty w komorze indukcyjnej z parownikiem izofluranu ustawionym na 4-5% natężenie przepływu i przepływomierzem tlenu ustawionym na 1 litr na minutę. Zobacz Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami znieczulenia.
    2. Przed rozpoczęciem zabiegu należy potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Głębokość znieczulenia można potwierdzić mocnym uszczypnięciem palca u nogi.
    3. Przenieś mysz z pojemnika indukcyjnego na stożek nosowy i zmniejsz natężenie przepływu izofluranu do 1,5%, a przepływomierza tlenu do 0,5 l/min.
    4. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, gdy zabieg trwa dłużej niż 5 minut.
    5. Utrzymuj normalną temperaturę ciała za pomocą podkładki termicznej.
  2. Przygotowanie miejsca rany
    1. Użyj elektrycznej maszynki do golenia w ogonowym ruchu rostralnym, aby usunąć sierść z tyłu myszy na poziomie ramion. W razie potrzeby usuń włosy poniżej pleców, jeśli wykonujesz więcej niż dwie rany.
    2. Usuń pozostałe włosy za pomocą żyletki w rostralnym ruchu ogonowym trzymanym pod kątem 20° od tyłu myszy, aby dokładnie ogolić przycięty obszar (Rysunek 1A).
    3. Oczyść ogolony obszar wacikiem z powidonem i jodem.
    4. Przetrzyj skórę sterylnym wacikiem z 70% alkoholem izopropylowym, aby zmniejszyć potencjalne podrażnienie skóry spowodowane wacikiem jodowym.
  3. Postrzelaj
    1. Ściśnij skórę między łopatkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odciągnij warstwowy fałd skórny od ciała (Rysunek 1B).
    2. Ustaw mysz na boku z fałdem skórnym na płaskiej powierzchni pokrytej czystym ręcznikiem papierowym lub jego odpowiednikiem. Użyj arkusza wosku dentystycznego pod ręcznikiem, aby chronić znajdującą się pod spodem powierzchnię przed uszkodzeniem (Rysunek 1C).
    3. Umieść stempel biopsyjny o pożądanej wielkości jak najbliżej ciała i pozwól skórze się rozluźnić. Nie rozciągaj skóry, ponieważ rana będzie miała większy rozmiar niż wyznaczony rozmiar stempla (Rysunek 1D).
    4. Uderz w skórę, naciskając w dół, można użyć ruchu kołyszącego, aby upewnić się, że wszystkie warstwy skóry po obu stronach zostały przebite (Rysunek 1E). Użyj nowego stempla do biopsji dla każdego zwierzęcia.
    5. Usuń biopsje stempla z ran (Rysunek 1F). Jeśli nadal znajdują się miejsca przyczepu, użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby uwolnić stempel od otaczającej skóry. Przetwarzaj tkankę kontrolną biopsji stempla zgodnie z wymaganiami w oparciu o dalsze plany analiz gojenia się ran (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z sugestiami).
    6. Wykonuj zdjęcia makroskopowe z równej odległości od miejsc rany lub za pomocą linijki w kadrze, aby zmierzyć początkowy obszar rany i wyeliminować wartości odstające z analizy.
    7. Analgezję należy podawać przez co najmniej 24 godziny zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. Na przykład: Buprenorfina SR-LAB, wstrzykiwana w pojedynczej dawce podskórnie w dawce 0,5-2 mg/kg przez 48 godzin łagodzenia bólu (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi sugestiami i rozważaniami).
    8. Monitoruj mysz po wyjściu z narkozy, aż utrzyma wyprostowaną postawę i będzie normalnie chodzić po klatce.

3. Monitorowanie po ranie

  1. Codziennie monitoruj myszy pod kątem eksperymentalnych punktów końcowych określonych przez badacza oraz zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Przykładami są: infekcja, widoczna utrata masy ciała lub zgarbiona postawa.
  2. Wykonuj codzienne zdjęcia makroskopowe w kontrolowany sposób, tak jak robiono to po pierwszej operacji.

4. Zbieranie ran

  1. Eutanazja myszy w pożądanym punkcie czasowym po zranieniu zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.
  2. Wykonaj makroskopowe zdjęcia miejsc ran w sposób kontrolowany, zgodny z wcześniejszym pozyskiwaniem zdjęć (Rysunek 2A,C).
  3. Wytnij szeroki prostokąt wokół miejsc rany za pomocą skalpela (Rysunek 2D,E).
  4. Uwolnij prostokątny kawałek tkanki za pomocą nożyczek i pęsety, aby odkleić i odciąć skórę od tkanki znajdującej się pod spodem (Rysunek 2F). Umieść na szalce Petriego (Rysunek 2G).
  5. Zbierz rany. Przyciąć do 2 mm niezranioną tkankę otaczającą ranę ze wszystkich stron w kształcie prostokąta (Rysunek 2H,I). Zobacz Dyskusję, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami zbierania rany.
  6. Przetwarzaj rany zgodnie z wymaganiami do kolejnych badań. Zarezerwować co najmniej jedną ranę na mysz do zatopienia w parafinie i analizy histologicznej.

5. Utrwalanie ran i osadzanie

  1. Napraw ranę
    1. Utrwalić tkankę rany w świeżo przygotowanym 4% roztworze paraformaldehydu8 przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść na noc do 4 °C. Filtracja paraformaldehydu i roztworu w mikroskopii elektronowej (EM) nie jest wymagana.
    2. Przemyć rany dwukrotnie przez 30 minut w 1x PBS.
    3. Zastąp PBS 70% ETOH i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia. Przetwarzaj tkanki w ciągu 24-48 godzin, aby uniknąć utraty antygenu lub w ciągu 1-2 tygodni, jeśli oceniasz tylko cechy histologiczne.
  2. Przetwarzaj i osadź ranę
    1. Przenieś każdą ranę do kasety do zatapiania. Oznacz kasety do osadzania ołówkiem, ponieważ proces ten usunie atramenty.
    2. Przetwarzaj tkankę ręcznie lub za pomocą automatycznego procesora, odwadniając tkankę ze zwiększaniem zawartości procentowej etanolu, oczyszczając ją ksylenem, a następnie naciekając tkankę woskiem parafinowym (Tabela 1).
    3. Osadź ranę pod kątem 90° ("stojąc") od poziomej powierzchni formy do zatapiania (Rysunek 3A,B).

6. Dzień 0 analiza obszaru rany

  1. Pobierz bezpłatne oprogramowanie NIH-Image J lub NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Otwórz plik ze zdjęciem ran z dnia 0.
  3. Zaznacz pole "Obszar" w obszarze Analiza | Ustaw wymiary.
  4. Wybierz "Ustaw skalę" w obszarze Analizuj. Wprowadź odległość w pikselach, znaną odpowiednią odległość i jednostkę odległości (= jednostkę długości), jeśli pomiary makroskopowe są częścią badania, lub pomiń ten krok, jeśli wymagane są tylko pomiary względne.
  5. Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.
  6. Nakreśl obwód rany.
  7. Kliknij pozycję Zmierz w obszarze Analizuj.
  8. Utwórz arkusz kalkulacyjny, aby śledzić wymiary na zwierzę na ranę.
  9. Skopiuj wymiar obszaru rany w arkuszu kalkulacyjnym.
  10. Obliczyć średnią powierzchnię i odchylenie standardowe wszystkich ran dla danego eksperymentu.
  11. Wykluczyć z analizy histologicznej wszelkie rany poza dwoma odchyleniami standardowymi średniej.

7. Podział szeregowy

  1. Bloki ran zatopione w parafinie schłodzić w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Włóż blok parafiny do uchwytu bloku mikrotomu i ustaw go tak, aby ostrze cięło prosto w poprzek bloku. Ustaw blok tak, aby tkanka "stała" pod kątem 90°, umożliwiając jednoczesne cięcie naskórka i skóry właściwej (Rysunek 3C, D).
  3. Wykonaj 2-4 wstęgi po 20-30 kawałków parafiny po 7 μm każda.
  4. Użyj suchego pędzla i igły do rozwarstwiania, aby przenieść każdą wstążkę na twardą, ale łatwą do manipulowania powierzchnię, taką jak twardy plastikowy arkusz.
  5. Odłącz górną część każdej wstążki za pomocą żyletki i umieść na szkiełku mikroskopowym.
  6. Obserwuj niezabarwione skrawki pod mikroskopem jasnego pola, aby określić, które z nich zawierają zranioną tkankę, którą można zidentyfikować po braku mieszków włosowych, zmianach w wyglądzie tkanki łącznej lub naskórka i/lub obecności strupa (Rysunek 4A,B).
  7. Wyrzuć niezranione odcinki do 20 odcinków przed rozpoczęciem rany.
  8. Przeciąć ranę, powtarzając kroki 7.3 i 7.4 do momentu, gdy nie zostanie wykryta żadna rana w niebarwionych skrawkach.

8. Montaż sekcji parafinowych

  1. Oddziel sekcje parafiny co 5 sekcji żyletką, zaczynając od pierwszej wstążki (Rysunek 3E).
  2. Oznacz szkiełka mikroskopowe zarówno numerem preparatu, jak i numerami wszystkich sekcji.
  3. Chwyć grupę 5 sekcji mokrym pędzlem i unieś je na powierzchni wody w ciepłej łaźni wodnej (40-45 °C), aby je spłaszczyć.
  4. Za pomocą jednego z oznaczonych szkiełek mikroskopowych należy wybrać grupę 5 sekcji z kąpieli wodnej (Rysunek 3F) i umieścić na szkiełku podstawowym ustawionym na temperaturę 37 °C na okres do 24 godzin.
  5. Przechowuj slajdy w pozycji pionowej w pudełku na slajdy.

9. Barwienie histologiczne

  1. Przenieś co 8szkiełko mikroskopowe (co odpowiada każdemu 40 krawkowi parafiny) do stojaka do barwienia i zabarwić hematoksyliną i eozyną.

10. Obrazowanie mikroskopowe

  1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w obiektyw 4x i możliwość akwizycji cyfrowej. Zapisz skalę, w jakiej zdjęcie zostało wykonane.
  2. Wyobraź sobie całą ranę w górnej części każdego barwionego szkiełka i upewnij się, że po obu stronach znajduje się trochę niezranionej tkanki. Zrób wiele nakładających się na siebie zdjęć, jeśli rana jest większa niż ramka pojedynczego zdjęcia.
  3. Zapisz plik wraz z numerem przekroju do analizy morfometrycznej. Użyj numeru sekcji, po którym następuje a, b, c itd., aby uzyskać nakładające się zdjęcia tej samej rany.

11. Analiza morfometryczna

UWAGA: Gdy rana obejmuje wiele obrazów, zsumuj pomiary wykonane z poszczególnych zdjęć, aby uzyskać jedną wartość dla każdej metryki na sekcję rany, aby zapisać ją w arkuszu kalkulacyjnym.

  1. Na obrazie J otwórz plik cyfrowy z poplamionym obrazem rany. Nie używaj zszytych obrazów do analizy. Wykonuj pomiary na powiększonych, nakładających się na siebie obrazach, znajdując punkty orientacyjne, które można pominąć, i pobieraj pomiary z obrazu na obraz.
  2. Ustaw preferencje skali i pomiaru.
    1. Wybierz "Ustaw skalę" w obszarze Analizuj. Wprowadź odległość w pikselach, znaną odpowiednią odległość i jednostkę odległości (= jednostkę długości). Skala powinna pojawić się w oknie i powinna odpowiadać skali, w jakiej obraz został uzyskany.
    2. Zaznacz pole "Globalny", aby skala była taka sama dla każdego otwartego obrazu.
    3. Powtórz kroki od 11.2.1 do 11.2.2 za każdym razem, gdy obraz J jest zamykany i ponownie otwierany.
    4. Zaznacz pole "Obszar" w obszarze Analiza | Ustaw wymiary.
  3. Zmierz długość rany
    1. Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.
    2. Zmierz zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany (Rysunek 4A,B).
    3. Śledź wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego, aby dotrzeć do tych dwóch punktów orientacyjnych. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, podążaj za połączeniem skórno-naskórkowym po jednej stronie rany i tam, gdzie kończy się migrujący język, kontynuuj podążanie za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem, aż dotrzesz do migrującego języka, a następnie do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie (Rysunek 4E, F).
    4. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz. Długość pomiaru pojawi się w tych samych jednostkach, co ustawione na skali.
    5. Utwórz arkusz kalkulacyjny, aby śledzić pomiary (Tabela uzupełniająca 1).
    6. Skopiuj długość rany do arkusza kalkulacyjnego.
  4. Zmierz długość naskórka
    1. Jeśli naskórek pokrywa całą ranę, długość naskórka jest taka sama jak długość rany.
      1. Skopiuj pomiar "długości rany" do kolumny "długość naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym Excel i przejdź do kroku 11.5.
    2. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, wybierz "Selekcje odręczne" i zmierz odległość między każdą krawędzią natarcia naskórka podążającą za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem do pierwszego mieszka włosowego (Rysunek 4C,D).
      1. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.
      2. Odejmij ten pomiar od długości rany i zapisz liczbę w polu "długość naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym Excel.
  5. Zmierz obszar rany
    1. Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.
    2. Mierz zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany (Rysunek 4A,B,E,F).
    3. Śledź wzdłuż górnej części naskórka (nie należy uwzględniać strupka) lub górnej części tkanki ziarninowej, jeśli rana nie jest w pełni pokryta przez naskórek.
    4. Kontynuuj śledzenie pionowo wzdłuż mieszka włosowego do tkanki ziarninowej po osiągnięciu przeciwległego mieszka włosowego i aż do osiągnięcia tkanki tłuszczowej lub mięśnia. Podążaj za dolną granicą tkanki ziarninowej na przeciwną stronę rany i połącz punkt początkowy wzdłuż mieszka włosowego, aby zamknąć obszar (Rysunek 4E,F).
    5. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.
    6. Skopiuj obszar rany do arkusza kalkulacyjnego w sekcji "zmierzona powierzchnia rany".
  6. Zmierz obszar naskórka
    1. Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.
    2. Jeśli rana jest w pełni nabłonkowana:
      1. Śledź wzdłuż górnej części naskórka, aż do osiągnięcia przeciwległego mieszka włosowego i zakończ obszar, "wracając" do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym między naskórkiem a skórą właściwą (Rysunek 4D).
      2. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.
      3. Skopiuj obszar naskórka do arkusza kalkulacyjnego Excel w sekcji "zmierzony obszar naskórka" i przejdź do kroku 11.7.
    3. Jeśli rana nie jest w pełni nabłonkowana:
      1. Śledź wzdłuż górnej części naskórka aż do krawędzi czołowej i wróć do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym (Rysunek 4C).
      2. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.
      3. Powtórzyć kroki 11.6.3.1 i 11.6.3.2 po przeciwnej stronie rany.
      4. W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.
      5. Zsumuj dwie liczby uzyskane w krokach 11.6.3.2 i 11.6.3.4 i wprowadź wynik w polu "zmierzona powierzchnia naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym.
  7. Powtórz kroki od 11.3 do 11.6 na co 40sekcji (co 8slajdzie).
  8. Oblicz obszar naskórka całej rany.
    1. Utwórz nową kolumnę w arkuszu kalkulacyjnym "obliczono obszar naskórka" obok "długość naskórka".
    2. Pomnóż liczbę "długości naskórka" przez 280 dla każdej sekcji z wyjątkiem ostatniej (sekcja o grubości 7 μm x 40 sekcji).
    3. Pomnóż liczbę "długości naskórka" przez 7 dla ostatniego odcinka (grubości przekroju).
    4. Zsumuj wartość "obliczonej powierzchni naskórka" dla każdego odcinka, aby uzyskać powierzchnię naskórka całej rany.
  9. Oblicz powierzchnię rany całej rany.
    1. Powtórz kroki od 11.8.1 do 11.8.4, korzystając z pomiarów długości uzwojenia.
  10. Oblicz objętość naskórka całej rany.
    1. Powtórzyć kroki od 11.8.1 do 11.8.4, używając pomiarów "zmierzonej powierzchni naskórka".
  11. Oblicz objętość całej rany.
    1. Powtórzyć kroki od 11.8.1 do 11.8.4, korzystając z pomiarów "zmierzona powierzchnia rany".
  12. Oblicz procentową objętość naskórka w ranie.
    1. Podziel całkowitą objętość naskórka przez całkowitą objętość rany i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent (nie rób tego stosunku dla każdego odcinka).
  13. Oblicz procentowy udział powierzchni naskórka w obszarze rany.
    1. Podziel całkowitą powierzchnię naskórka przez całkowitą powierzchnię rany i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent. Jeśli rana jest w pełni nabłonkowana, liczba ta powinna wynosić 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia zakres zmierzonych i obliczonych wartości uzyskanych poprzez przeprowadzenie analizy morfometrycznej ran typu dzikiego u różnych szczepów myszy, wykonanych przez wielu chirurgów i analizowanych przez różne osoby. Myszy typu dzikiego z różnych szczepów mogą wykazywać różnice statystyczne, co zostało opisane zarówno w naszych badaniach, jak i w literaturze9,10. W oparciu o te reprezentatywne wyniki zalecamy, aby w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obustronny model rany wycinającej jest wysoce konfigurowalną procedurą, która może być wykorzystana do badania wielu różnych aspektów gojenia się ran. Przed rozpoczęciem projektu gojenia się ran badacze powinni przeprowadzić analizę mocy, aby określić liczbę ran potrzebnych do wykrycia defektu o określonej wielkości efektu. W literaturze istnieją niespójności co do tego, czy poszczególne myszy lub rany powinny być używane jako repliki biologiczne, jednak ostatnie badanie wykazało, że nie ma znaczącej korelacji między dwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom Laboratorium Dunnwald, którzy przyczynili się do optymalizacji tego protokołu na przestrzeni lat, oraz Ginie Schatteman, której wytrwałość w promowaniu stosowania seryjnego cięcia do analizy ran umożliwiła jego stworzenie. Prace te były wspierane przez fundusze z NIH/NIAMS dla Martine Dunnwald (AR067739).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% etanol
70% etanol
80% etanol
95%
Przygotowanie alkoholuNOVAPLUSV910070% Alkohol izopropylowy, sterylne
Wodorotlenek
Podkładki do biopsjiCellpath22-222-012
plastikowy arkuszCoś mocnego, ale podatnego na manipulację o wielkości kartki papieru
jasnego polaZ cyfrowymi możliwościami akwizycji i obiektywem 4X
Aplikatory
Szkiełka nakrywkowe22 x 60 #1
Arkusze
wosku dentystycznegoAparatDołącz linijkę do skali, jeśli dotyczy
Igła do rozwarstwiania (prosta)
do zatapiania22 x 22 x 12
Pierścienie do osadzaniaSimport Scientific Inc.M460
Eozyna Y
Lodowaty kwas
Maszynka
Poduszka grzewczaConairWilgotna sucha poduszka grzewcza
Hematoksylina
Mikrotom
Ostrza
Pędzle malarskie
Parafina Typ 6
Paraformaldehyd
Permount
Fosforan roztwór buforowy (PBS)
Powidon-jodAplicare82-255
Kaseta procesowaSimport Scientific Inc.M490-2
ŻyletkiASR.009
Ostrza skalpela #10
Rękojeść
Ostre nożyczkisterylne do operacji
Stemple do biopsjiRozmiar określony przez badacza
Pudełka
do szkiełków
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostedFisher Scientific22 037 246
Kąpiel
StacjaMinimum dozownika parafiny i zimnej płyty
ProcesorMinimum piekarnika z pompą próżniową
Potrójny antybiotyk
, zakrzywiona końcówkasterylna do
pęsety chirurgicznej, stożkowa końcówkasterylna do operacji
WypAll X60Kimberly-Clark34865
etanol amonuMikroskop z bawełnianą końcówką cyfrowy Formy octowydo strzyżenia włosówmikrotomu Regular Dutyskalpela chirurgiczne skóry na prowadnicePodgrzewacze wodna z regulacją temperatury zatapiania tkanek tkanek pęseta do maści optalmicznej

Bibliografia

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040(2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Histologiczna analiza morfometrycznaci cie seryjnepomiar powierzchni nask rkaobliczanie obj to ci ranyrany pe nej grubo ci sk rytechnika biopsji wycinanejprogram do przetwarzania obraz wekstrapolacja obj to ci nask rka

Powiązane artykuły