Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Streszczenie

Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie (ChIP-Seq) to potężne i szeroko stosowane podejście do profilowania DNA chromatyny związane ze specyficznymi modyfikacjami histonów, takimi jak H3K27ac, w celu identyfikacji elementów DNA cis-regulatorowego. Ręczny proces wypełniania ChIP-Seq jest pracochłonny, trudny technicznie i często wymaga dużej liczby komórek (>100 000 komórek). Opisana tutaj metoda pomaga przezwyciężyć te wyzwania. Szczegółowo opisano kompletną, półautomatyczną, mikroskalową procedurę H3K27ac ChIP-Seq, obejmującą utrwalanie komórek, ścinanie chromatyny, immunoprecypitację i przygotowanie biblioteki sekwencjonowania dla partii 48 próbek dla danych wejściowych o liczbie komórek mniejszej niż 100 000 komórek. Półautonomiczna platforma zmniejsza zmienność techniczną, poprawia stosunek sygnału do szumu i drastycznie zmniejsza nakład pracy. System może w ten sposób obniżyć koszty, umożliwiając zmniejszenie objętości reakcji, ograniczając liczbę drogich odczynników, takich jak enzymy, kulki magnetyczne, przeciwciała i wymagany czas pracy. Te ulepszenia metody ChIP-Seq doskonale nadają się do badań epigenetycznych na dużą skalę próbek klinicznych z ograniczoną liczbą komórek w wysoce powtarzalny sposób.

Wprowadzenie

Szerokie zastosowanie testów ChIP-Seq do określania fragmentów DNA związanych z określonymi modyfikacjami histonów wynika częściowo z ich zdolności do identyfikacji cis-regulatorowych elementów DNA, w tym aktywnych wzmacniaczy, promotorów, tłumików, heterochromatyny i innych^1,2,3,4. Identyfikacja niekodujących regionów regulatorowych w całym genomie dostarczyła cennych informacji, które pozwolą lepiej zrozumieć regulację genów w zdrowiu i chorobach⁴. Wcześniejsze prace laboratoryjne wykorzystały ChIP-Seq, aby pokazać, że elementy cis-regulatorowe mogą odgrywać ważną rolę w różnych typach komórek⁵. Testy ChIP czynnika transkrypcyjnego (TF) zostały wykorzystane do wykazania ryzyka związanego z chorobą polimorfizmów pojedynczego nukleotydu⁶.

Użycie ChIP-Seq z ludzkimi próbkami klinicznymi jest wyzwaniem, głównie ze względu na ograniczenie liczby komórek lub pożądanej próbki tkanki. W związku z tym podjęto wspólne wysiłki w tej dziedzinie w celu ulepszenia i mikroskalowania tych technik, w wyniku czego powstało kilka testów, takich jak CUT&TAG^{5,7,8,9,10,11,12}. Ten test wykorzystuje transpozazę do oznaczania i izolowania regionów genomu związanych przez określone przeciwciało⁹. Technika ta była w stanie zmniejszyć liczbę komórek do 1000, a w niektórych przypadkach do pojedynczej komórki, jednak zastosowanie tej techniki w badaniach translacyjnych i konfiguracji klinicznej wykazało ograniczenia ze względu na wymagania dotyczące używania żywych komórek w tej metodzie^9,12. Wymóg żywych komórek sprawia, że próbki kliniczne są logistycznie trudne w obsłudze i mogą powodować efekty wsadowe, jeśli próbki nie są przetwarzane w tym samym czasie. Inni zoptymalizowali techniki mikroskalowe dla komórek utrwalonych formaldehydem, w tym opracowali ChIPmentation¹¹, który jest tutaj adaptowany w sposób wysokoprzepustowy. Zastosowanie stałych komórek umożliwia przechowywanie próbek do momentu ich pobrania, a następnie przetworzenia wszystkich próbek razem w celu zminimalizowania efektów wsadowych.

Tutaj opisany jest półautomatyczny test ChIP-Seq w mikroskali, który skraca czas eksperymentu na profilowanie modyfikacji histonów¹⁰. Półautomatyczna metoda pozwala na wysokoprzepustowe testy ChIP-Seq, co pozwala na pełne przetworzenie do 48 próbek i przygotowanie ich do sekwencjonowania w ciągu zaledwie 5 dni, przy użyciu urządzenia do obsługi cieczy ChIP. Osoba zajmująca się obsługą przeprowadza immunoprecypitację (IP) i następujące po niej płukanie w sposób autonomiczny, co pomaga zmniejszyć zmienność między próbkami. Półautomatyczna metoda skraca zarówno czas pracy fizycznej o ponad 15 godzin w przypadku 48 próbek, jak i zmienność techniczną, umożliwiając prowadzenie badań epigenetycznych na dużą skalę w powtarzalny i szybki sposób zarówno dla komórek pierwotnych, jak i hodowlanych. Protokół wyjaśnia proces od początku do końca w celu uzyskania wysokiej jakości ChIP-Seq. Jeśli określone maszyny nie są dostępne, protokół będzie nadal przydatnym zasobem do ręcznego konfigurowania i rozwiązywania problemów z eksperymentami ChIP-Seq.

Test został przeprowadzony na trzech różnych typach podstawowych ludzkich komórek odpornościowych i jednej linii komórek hodowlanych (HUT78 - ATCC: TIB-161). Dla jasności protokół został podzielony na siedem sekcji: utrwalanie komórek, ścinanie chromatyny za pomocą sonikacji, automatyczna immunoprecypitacja chromatyny, przygotowanie biblioteki przez znakowanie fragmentów DNA, amplifikacja biblioteki, oczyszczanie biblioteki, a następnie kwantyfikacja DNA. Receptury buforowe znajdują się w tabeli uzupełniającej 1.

Protokół

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna (IRB) Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla (LJI; Nr protokołu IRB SGE-121-0714) zatwierdził badanie. Zdrowi ochotnicy zostali zrekrutowani i dostarczyli próbki leukaferezy po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.

1. Utrwalenie komórek

1. Doprowadzić stężenie zawiesiny komórek do 1 do 2 x 10⁶ komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki do hodowli komórkowych w probówce o pojemności 15 ml (<10 ml zawiesiny) lub probówce o pojemności 50 ml (10-30 ml komórek). Jeśli <1 x 10⁶ komórek, użyj 0,5 ml pożywki w probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Delikatnie zwirować zawiesinę komórkową, dodać kroplami 10-krotny bufor utrwalający komórki (1:10; vol:vol) i obracać z niską prędkością przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Zatrzymaj reakcję poprzez delikatne wirowanie i dodaj 2,5 M glicyny w stosunku 1:20 (vol:vol). Odwróć probówki kilka razy i inkubuj na lodzie przez co najmniej 5 minut.
4. Pozostałe czynności należy wykonać w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Wirować probówki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
5. Delikatnie zawiesić osad z 5 ml lodowatego 1x PBS i inkubować przez 2 minuty na lodzie.
6. Powtórzyć czynności 1,4 i 1,5 z 1 ml lodowatego 1x PBS i przenieść próbkę do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml (oznaczonej do długotrwałego przechowywania). W stosownych przypadkach zaleca się przygotowanie podwielokrotności.
7. Odwirować probówki w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C i usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego. Zatrzaskowo zamroź granulkę w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Zachowaj odpowiednią ochronę podczas obchodzenia się z ciekłym azotem.

2. Ścinanie chromatyny

UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany do ścinania chromatyny granulek z 0,3 do 3 x 10⁶ komórek w probówkach o niskim poziomie wiązania 0,65 ml.

1. Wyjąć probówkę z próbkami z zamrożonymi granulkami komórek o temperaturze -80 °C i przechowywać na suchym lodzie, aby uniknąć rozmrożenia osadu przed dodaniem buforu do lizy. Ten krok ma kluczowe znaczenie.
2. Do granulatu dodać 70 μl świeżego, kompletnego buforu do lizy RT i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
3. Zawiesić osad na 1 minutę bez wprowadzania jakichkolwiek pęcherzyków, a następnie inkubować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przed umieszczeniem próbki na lodzie.
4. Przenieś zawieszony osad do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 0,65 ml i trzymaj na lodzie.
   UWAGA: Aby uzyskać powtarzalną sonikację, należy wstępnie rozgrzać sonikator, uruchamiając go tylko z pustymi probówkami przez 3-6 cykli przed sonikacją próbek.
5. Umieść próbki w uchwycie probówki sonikatora i wypełnij wszelkie szczeliny probówkami balansowymi wypełnionymi 70 μl wody. Pozostawić próbki w łaźni wodnej na około 1 minutę przed rozpoczęciem sonikacji.
6. Wykonuj sonikację przez x cykli (w zależności od typu ogniwa) z 16 s ON / 32 s OFF na cykl.
   UWAGA: Ten krok będzie wymagał eksperymentów walidacyjnych w celu określenia optymalnej liczby cykli dla skutecznej sonikacji.
7. Po każdych 3 cyklach wyjmuj próbki z sonikatora, delikatnie wiruj i pulsacyjnie obracaj probówki przed włożeniem ich z powrotem do uchwytu. Upewnij się, że na zewnątrz rurki nie ma małych kropel, ponieważ może to spowodować tworzenie się pęcherzyków.
8. Po zakończeniu niezbędnych cykli należy wirować próbki w temperaturze 14 000 x g > przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej, nisko wiążącej probówki o pojemności 0,65 ml i przechowywać na lodzie.
9. Należy odsieciować część próbek poddanych sonikacji, aby sprawdzić skuteczność sonikacji.
   1. Przenieść 1-7 μl supernatantu (co odpowiada około 250 ng ściętej chromatyny) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml i uzupełnić objętość do 10 μl krótkotrwałym buforem do lizy w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 1 μl RNazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy 800 obr./min, a następnie dodać 1 μl proteinazy K.
   3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min.
10. Usunąć 2 μl odsieciowanej próbki w celu ilościowego określenia DNA za pomocą fluorescencyjnego testu kwantyfikacyjnego¹⁰ (spektrofotometr nie jest zalecany, ponieważ mydło i zdegradowane białko mogą powodować błąd systematyczny w wynikach).
11. Pozostałą próbkę należy umieścić w 1,2% żelu agarozowym przez 1 godzinę przy napięciu 70 V. Zabarwić barwnikiem kwasu nukleinowego (1:20 000) i odczytać żel za pomocą transiluminatora UV.
12. Przygotować podstawowe porcje chromatyny do przechowywania (rozcieńczyć próbkę do 25 ng/μl w 20 μl z pełnym buforem do lizy). Przechowywać całą ściętą chromatynę w temperaturze -80 °C.

3. Zautomatyzowany ChIP-Seq do modyfikacji histonów

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do działania na ChIP typu liquid-handler. Chociaż system może korzystać z niestandardowych, wszystkie są dostarczane z zestawem ChIP. Paski ChIP z 8 rurkami użyte w tej sekcji są specyficzne dla urządzenia do obsługi cieczy.

1. Przenieść 16 porcji próbki z 500 ng ściętej chromatyny w 20 μl z temperatury -80 °C i umieścić je na lodzie w celu powolnego rozmrożenia chromatyny. Po całkowitym rozmrożeniu krótko zawiruj i pulsuj wirowanie.
2. Przygotowanie chromatyny
   1. Odpipetować 100 μl buforu tC1 uzupełnionego 1x inhibitorem proteazy i 20 mM maślanem sodu (kompletny bufor tC1) do dwóch pasków ChIP 8-probówkowych.
   2. Przenieść 20 μl każdej próbki chromatyny do odpowiedniej probówki z 8-probówkowymi paskami ChIP zawierającymi 100 μl pełnego buforu tC1. Przemyć probówki chromatyny, dodając 80 μl pełnego buforu tC1 do probówek chromatynowych, a następnie przenieść z powrotem do odpowiedniej probówki pasków z 8 probówkami ChIP do uzyskania końcowej objętości 200 μl.
3. Przygotowanie przeciwciała
   1. Obliczyć objętość przeciwciała tak, aby 0,5 μg przeciwciała znajdowało się w każdej probówce.
      Objętość przeciwciała = (liczba próbek x przeciwciało na reakcję) / stężenie przeciwciał
   2. Obliczoną ilość przeciwciała dodać do 500 μl buforu tBW1. Szybko wiruj i pulsuj wirowo.
   3. Pobrać pipetę 70 μl tBW1 do każdej z dwóch pasków ChIP 8-probówkowych i dodać 30 μl przeciwciała + tBW1 do każdej z probówek. Dzięki temu całkowita objętość w każdej z probówek wyniesie 100 μl.
4. Przygotowanie koralika magnetycznego
   1. Dokładnie wymieszaj roztwór kulki białka A. Aby uzyskać 0,5 μg przeciwciała, odpipetować 5 μl kulek do nowego zestawu pasków ChIP 8-probówkowych i odwirować impulsowo.
5. Napełnij ostatni rząd urządzenia do obsługi cieczy ChIP oznaczonymi, pustymi paskami ChIP z 8 probówkami.
6. Postępuj zgodnie ze specyfikacją programu ChIP-16-IPure-200D, aby umieścić wszystkie paski w maszynie do obsługi cieczy ChIP. Dodaj we właściwej pozycji, ale użyj tW4 zamiast tE1 buffer.
   UWAGA: Zorganizuj dzień w taki sposób, aby osoba zajmująca się obsługą płynów ChIP wykonała ChIP w nocy. Program będzie działał przez około 16 godzin dla 16 próbek. To oznacza koniec Dnia 1.

4. Integracja adapterów bibliotecznych transpose'owych do przygotowania biblioteki

1. Ustaw termomikser na 37 °C i 500 obr./min. Schłodzić magnes na paski probówek o pojemności 0,2 ml na lodzie.
2. Dla 16 próbek należy przygotować 440 μl buforu do znakowania na lodzie. Odpipetować 53 μl do jednego nowego paska z 8 probówkami i przechowywać na lodzie.
3. Do nowego paska z 8 probówkami o pojemności 0,2 ml dodaj 220 μl zimnego buforu tC1 i trzymaj na lodzie. 8 probówek paskowych może pomieścić tę objętość i nadal być zakryte.
4. Wyjmij probówkę z paskiem "IP samples" z maszyny do obsługi cieczy ChIP (rząd 12) i zakryj probówki przed wirowaniem impulsowym. Chwyć kulki za pomocą magnesu na paski z 8 probówkami przez 2 minuty i ostrożnie usuń supernatant.
5. Przenieś 25 μl buforu do kulek za pomocą wielokanałowego, wyjmij z magnesu i delikatnie mieszaj, aż kulki będą jednorodne (około 5 razy w górę i w dół z pipetą ustawioną na 20 μl).
6. Zakryj probówki i umieść je w nagrzanym termomikserze i inkubuj przez 3 minuty. Wydłużenie czasu zmniejszy efektywność przygotowania biblioteki.
7. Przenieść probówki na schłodzony metalowy stojak i dodać 100 μl schłodzonego buforu tC1 do każdej próbki. Ustawić pipetę wielokanałową na 80 μl i mieszać próbkę, aż kulki staną się jednorodne, zatrzymując reakcję znakowania.
8. Umieść próbki z powrotem w urządzeniu do obsługi cieczy ChIP i kontynuuj procedurę mycia Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Upewnij się, że mycie zostało wykonane dwa razy z buforem tC1 i dwa razy z tW4. Elucja powinna być zakończona zgodnie z oznaczeniem w układzie programu, z buforem tE1.
9. Desieciowanie DNA
   1. Usunąć paski z 8 probówkami ChIP z ostatniego rzędu urządzenia do obsługi cieczy ChIP i dodać 2 μl RNazy A do każdej próbki.
   2. Zakręć probówki, wiruj pulsacyjnie, delikatnie wymieszaj kulki pipetą wielokanałową, aż mieszanina będzie jednorodna, a następnie ponownie zakręć probówki.
   3. Próbki należy inkubować w termomikserze przez 30 minut w temperaturze 37 °C i przy prędkości 900 obr./min.
   4. Wyjąć próbki z termomiksera, dodać 2 μl proteinazy K. Po dodaniu należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, co w ppkt 4.9.2.
   5. Próbki należy inkubować w termomieszalniku przez 4 godziny w temperaturze 55 °C i prędkości obrotowej 1 250 obr./min, a następnie przez noc w temperaturze 65 °C przy 1 000 obr./min.
      UWAGA: To już koniec Dnia 2.

5. Oczyszczanie oznaczonych fragmentów DNA

1. Oznacz szesnaście probówek o pojemności 1,5 ml odpowiednim numerem próbki i dodaj do każdej z nich 400 μl buforu wiążącego DNA z zestawu do oczyszczania DNA.
2. Wyjmij paski z 8 probówkami z termomiksera i wiruj impulsowo, aby upewnić się, że odparowany produkt został zatrzymany. Umieść paski na magnesie z 8 paskami, aby uchwycić koraliki.
3. Przenieś 100 μl usieciowanego DNA do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 100 μl buforu wiążącego DNA do pasków z 8 probówkami, aby przepłukać kulki, a następnie przenieś do odpowiedniej probówki o pojemności 1,5 ml.
4. Wiruj przez około 10 s i pulsacyjnie obracaj probówki o pojemności 1,5 ml.
5. Załadować kolumny 600 μl zawierającymi bufor wiążący DNA i próbkę ChIP.
6. Wiruj próbki przez 20 s przy 10 000 x g i ponownie załaduj kolumnę przepływem. Zakręć ponownie w tych samych warunkach i wyrzuć przepływ.
7. Przepłukać kolumny dwukrotnie buforem płuczącym o pojemności 200 μl (to samo odwirowanie, co w poprzednim etapie) i odrzucić przepływ
.
8. Wysuszyć kolumny przez odwirowanie przez 2 minuty przy 12 000 x g.
9. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodać 9 μl ciepłego buforu TE (wstępnie podgrzanego do 55 °C) bezpośrednio do matrycy kolumny. Pozostawić kolumnę do inkubacji przez 1 minutę przed wirowaniem przez 1 minutę przy 10 000 x g.
10. Przenieść 9 μl elucji do odpowiedniego nowego zestawu pasków z 8 probówkami.
11. Zakończyć elucję ponownie za pomocą 8 μl buforu TE, jak poprzednio. Przenieść elucję do odpowiednich pasków składających się z 8 probówek (końcowa objętość 17 μl na próbkę) i przechowywać na lodzie.

6. Amplifikacja i wybór wielkości oczyszczonych próbek

1. W kolejnych krokach wykorzystuje się qPCR do określenia liczby cykli wymaganych do optymalnej amplifikacji (CtD – oznaczenie Ct)
2. Przygotować mieszaninę CtD dla wszystkich próbek, mnożąc zawartość buforu mieszającego CtD przez liczbę próbek.
3. Dozować 3,6 μl mieszanki CtD do płytki qPCR i dodać 1,4 μl oznakowanych próbek DNA (~10% całkowitej objętości). Wykonaj następujące qPCR: 98 °C przez 3 min, 72 °C przez 5 min, 98 °C przez 30 s, 26 cykli po 98 °C przez 10 s, 63 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s.
4. Przygotuj Amp Mix dla wszystkich próbek, mnożąc zawartość bufora AMP Mix przez liczbę próbek. Dozować 14 μl oznakowanego DNA do oddzielnych dołków płytki PCR, a następnie dodać 2,5 μl dwóch starterów o wskaźniku sekwencjonowania (25 μM) do każdej próbki (końcowa objętość reakcji wynosi 50 μL).
5. Wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i wykonać program amplifikacji stosowany w CtD z odpowiednią liczbą cykli.
   UWAGA: Jest to dobry punkt zatrzymania, ponieważ amplifikowane próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Jednak oczyszczanie może zostać zakończone tego samego dnia. W przypadku 48 próbek etapy 3 - 6.5 zakończono dwiema innymi oddzielnymi partiami, a następnie amplifikowano w jednej partii, jak opisano poniżej.
6. Wykonaj postamplifikację, wybór rozmiaru i kwantyfikację oznakowanego DNA, jak opisano poniżej. Zwykle można to wykonać za pomocą 48 próbek (w razie potrzeby można to zrobić z mniejszą liczbą próbek).
   1. Dodaj 90 μl kulek paramagnetycznych (stosunek 1:1,8) do każdej studzienki, wymieszaj i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   2. Chwyć koraliki za pomocą płyty magnetycznej i wyrzuć supernatant. Umyj kulki 3 razy 200 μl świeżego 80% etanolu, nie naruszając granulki kulek.
   3. Po ostatnim umyciu usuń nadmiar etanolu za pomocą końcówek o pojemności 20 μl i pozostaw kulki do wyschnięcia na 10 minut lub do momentu, gdy pojawią się pęknięcia w granulkach kulek.
   4. Trzymając płytkę nadal na magnesie, dodaj 40 μl podgrzanej wody do każdej studzienki. Uszczelnij płytkę, dokładnie odwiruj i krótko pulsacyjnie odkręć płytkę.
   5. Uchwyć kulki, umieszczając płytkę z powrotem na magnesie i przenieś elucję o pojemności 40 μl na nową płytkę "próbki". Próbki są teraz oczyszczane, a kolejne etapy wzbogacają fragmenty w zakresie od 200 do 1000 pz.
   6. Opcjonalny etap kontroli jakości: Usunąć 4 μl z próbek i przenieść na płytkę kontroli jakości. Dodać 4 μl wody z powrotem do próbek. Określa to procent dużych fragmentów.
   7. Dodać 22 μl kulek paramagnetycznych (w stosunku 1:0,55) do próbek, ostrożnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   8. Umieścić na magnesie, aby uchwycić kulki przez 5 minut i przenieść supernatanty do kolumn 7-12 płytki "próbki". Wyjmij płytkę z magnesu i dodaj 30 μl kulek (końcowy stosunek 1:1,3). Dokładnie wymieszaj i pozostaw na 2 minuty w temperaturze RT.
   9. Chwytaj kulki przez 5 minut, a następnie wyrzuć supernatant.
   10. Umyć wszystkie kulki 3 razy 200 μl świeżego 80% etanolu, jak opisano wcześniej (kroki 6.6.2 – 6.6.3).
   11. Gdy granulki wyschną, wymyj DNA za pomocą 8 μl wstępnie podgrzanego buforu TE do każdej studzienki, nadal na magnesie.
   12. Zdejmij płytkę z magnesu, uszczelnij i dokładnie odwiruj. Pozostawić płytkę do inkubacji przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, wirować impulsowo i umieścić płytkę z powrotem na magnesie na 2 minuty. Przenieść supernatant na nową płytkę (tabliczka 2).
   13. Aby uzyskać maksymalny odzysk, powtórzyć elucję z dodatkowymi 8 μl wstępnie podgrzanego buforu TE. Umieść próbki w odpowiednich studzienkach tak, aby każda próbka miała 16 μl końcowej biblioteki.
       UWAGA: Na końcu tego kroku powinny znajdować się dwie tabliczki (jedna, jeśli nie została ukończona żadna tabliczka kontroli jakości). Płytka kontroli jakości będzie zawierała wstępnie wybrane fragmenty, a druga płytka powinna mieć 48 dołków końcowej biblioteki (łącznie 16 μl).

7. Ilościowe określenie końcowych bibliotek i próbek QC za pomocą testu fluorescencji

1. Zakończ kwantyfikację DNA za pomocą testu ilościowego fluorescencji lub podobnej metody.
2. Jeśli kwantyfikacja QC została zakończona, określ procent utraty próbki, który wynosił < 1,000 pz. Strata nie powinna być większa niż około 20% – gdyby było ich więcej, mógłby wystąpić problem z zastosowanymi proporcjami ściegu.
3. Określić wielkość fragmentów każdej próbki, najlepiej przy użyciu maszyny do elektroforezy kapilarnej. Aby obliczyć stężenie molowe, użyj następującego równania: [Stężenie biblioteczne (ng/μL) * 10⁶]/[660 * Mediana wielkości fragmentu (bp)]).
   UWAGA: Biblioteki są gotowe do łączenia (ilości równomolowe) i sekwencjonowania zgodnie ze standardowymi procedurami sekwencjonowania nowej generacji.

Wyniki

Jako dowód koncepcji, ChIP-Seq został ukończony dla sześciu ludzkich dawców z trzema zestawami typów komórek odpornościowych: naiwnymi limfocytami T CD4 (CD4), klasycznymi monocytami (MO) i komórkami NK (NK), wzbogaconymi przez sortowanie FACS, jak opisano wcześniej¹³. Podkreślona procedura składa się z dziewięciu odrębnych procedur przedstawionych w Rysunek 1.

Rysunek 1: Ogólny schemat blokowy procedury. (A) Rysunek przedstawiający całą procedurę (wygenerowany w BioRender). (B) Schemat blokowy dla wszystkich głównych etapów protokołu oraz szacowany czas pracy praktycznej i całkowity związany z każdym dniem. Sekwencjonowanie może nastąpić pod koniec dnia 5 lub później z wieloma rundami. Oś czasu może być również rozłożona w czasie, przy czym sekwencyjne dni 3-4 mogą być wykonywane wiele razy w tygodniu, aby wygenerować 48 próbek ChIP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po izolacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej¹³, posortowane komórki zostały odwirowane, a komórki naprawione i przechowywane w sposób opisany powyżej. Po zebraniu wszystkich próbek, próbki poddano lizie i przygotowano do ścinania chromatycznego w partiach po 12 sztuk, jak opisano powyżej. Dla każdej próbki wykonano liczbę cykli do osiągnięcia optymalnej sonikacji¹⁰. Pomiary ilościowe, jak również pomiary wielkości ściętych fragmentów chromatyny wykazały dużą powtarzalność naszej metody na trzech zestawach komórek odpornościowych (Rysunek 2A). Różne ludzkie komórki odpornościowe poddano sonikacji w oddzielnych partiach i uzyskano bardzo konsekwentnie z > 70% próbki w zakresie 100 - 500 pz przez 14 cykli (16 s włączenia, 32 s przerwy na cykl). W tym momencie próbki z dużymi fragmentami po sonikacji (< 70% próbki między 100 - 500 pz) uznano za niezaliczone. Próbki te mogły być poddawane sonikacji przez 1-2 dodatkowe cykle lub były odrzucane i zastępowane później komórkami z innego osadu. Nasza metoda wykazała, że żadna z próbek nie wymagała większej sonikacji ani nie została wyeliminowana, co sugeruje absolutną solidność procedury.

Rysunek 2: Przykłady kontroli jakości przed sekwencjonowaniem. (A) 1,2% żele agarozowe wykazują odtwarzalność sonikacji. Próbki sonikacyjne dla 6 dawców w trzech typach komórek: naiwne limfocyty T CD4 (CD4), klasyczne monocyty (MO) i komórki NK (NK). Próbki poddano sonikacji przez 14 cykli (16 s ON, 32 s OFF na cykl). Dla każdej próbki około 200 ng usieciowanej chromatyny załadowano na 1% żel agarozowy. Próbki uznano za dobre, jeśli więcej niż 70 % fragmentów mieści się w zakresie 100-500 pz. (B) Góra - Analiza krzywych amplifikacji qPCR w celu określenia optymalnej liczby cykli amplifikacji (Ct, gdzie występuje 1/2 maksymalnej intensywności). Idealne próbki mają Ct około 15, a amplifikacja może być zakończona do 2 cykli więcej mierzonego Ct. Strzałka jest przykładem złego przykładu, w którym Ct jest większe niż 18. Dół - Pokazano przykład ubogiego zestawu próbek, które mają Ct większe niż 18. Próbki te wykazywały również niższą intensywność fluorescencji. (C) Po lewej - Ślady elektroforezy analizatora fragmentów pokazały rozkład końcowych oznakowanych bibliotek po amplifikacji i doborze rozmiaru. Za dobre próbki uznano próbki, w których ponad 85% biblioteki fragmentów mieści się w przedziale 200-1000 pz. Pomiar szczytowej intensywności fluorescencji jest również uważany za ważny parametr kontroli jakości, w rzeczywistości, jeśli sygnał jest niski, jest mało prawdopodobne, aby próbka dobrze zsekwencjonowała. Po prawej — pokazano przykłady próbek dodatnich w CD4, MO i NK. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po kwantyfikacji, próbki zostały przeprowadzone na urządzeniu do obsługi cieczy ChIP z przeciwciałami H3K27ac, a następnie oznaczone enzymem transpozazy Tn5. Aby określić odpowiednią liczbę cykli amplifikacji metodą qPCR, wykorzystano 10% oznakowanych próbek. W celu określenia liczby cykli amplifikacji próbek znajdujemy cykl, w którym intensywność próbki jest połową średniego maksimum dla oznaczania cyklu (Rysunek 2B). Próbki o wartościach Ct większych niż 18 nie wypadały dobrze po sekwencjonowaniu, a zatem ich wartość Ct wskazywała na nieudaną próbkę ChIP. Próbki te na ogół dawały również mniejszą ilość DNA po amplifikacji. Próbki (100 000 komórek) o wartości Ct równej lub mniejszej niż 15 były idealne, a próbki między 15 a 18 były akceptowalne, ale mniej spójne po sekwencjonowaniu. W przypadku próbek zawierających mniej niż 100 000 komórek wejściowych wartości Ct znajdowały się zwykle między 15 a 18, ale nie wymagały więcej niż 18 cykli, aby uzyskać wystarczającą ilość produktu do sekwencjonowania.

Po amplifikacji DNA, biblioteki zostały oczyszczone i dobrane pod względem rozmiaru, aby uzyskać idealny rozkład rozmiarów, od 200 do 1,000 pz, dla sekwencjonowania NextGen. Ocena rozkładu wielkości w każdej z bibliotek została zakończona, ponieważ najlepsze dane sekwencjonowania uzyskano, gdy ponad 85% fragmentów DNA mieściło się w zakresie od 200 do 1000 pz (Rysunek 2C). Warto zauważyć, że gdy załadowano tę samą ilość DNA (mierzoną za pomocą kwantyfikacji fluorescencji), zauważono, że próbki o niższej intensywności fluorescencji na ogół były słabo sekwencjonowane (Rysunek 2C).

Po sekwencjonowaniu zastosowano standardowe kontrole jakości oparte na wytycznych ENCODE ChIP-Seq^5,14,15.

Rysunek 3: Odtwarzalność próbek komórek odpornościowych. (A) Ścieżki H3K27ac (UCSC Genome Browser, maksymalna intensywność, funkcja wygładzania 4, wszystkie z równomiernie skalowaną osią Y) dla 6 dawców (100 000 komórek na replikę) w każdym typie komórki (CD4, MO i NK). Pokazano cztery przykładowe loci, dwa z locus (IL2RA i PTPRC) i dwa bez wzbogacenia dla H3K27ac (CCR4 i MS4A1). (B) Korelacja Pearsona między dawcami a odpowiadającymi im wykresami korelacji wygenerowanymi przy użyciu rozszerzenia 300 pz i okna 500 pz w pakiecie MEDIPS dla każdego z typów komórek replicates¹⁶. (C) Scalone pliki dawców dla każdego typu komórki pokazujące ślady H3K27ac (maksymalna intensywność UCSC Genome Browser, funkcja wygładzania 4) w regionach specyficznych dla typu komórki (IL17R dla CD4, CCR2 dla MO i KLRC1 dla NK) oraz gen utrzymania domu B2M, obecny we wszystkich typach komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Do wizualnej kontroli jakości przygotowano ścieżki wzbogacania H3K27ac do wyświetlenia w przeglądarce genomu UCSC. W przypadku czterech loci genów indywidualne ścieżki dla każdej próbki wykazały wysoką jakość mapowania i stosunek sygnału do szumu, co odzwierciedla wysoką spójność i solidność naszego testu (Rysunek 3A). Dwa loci po lewej stronie zawierają dobrze wyrażone geny w tych typach komórek, podczas gdy geny w dwóch loci po prawej stronie nie są wyrażane i służą jako kontrole tła¹³ (Figura 3A). Co więcej, pakiet analizy MEDIPS został wykorzystany jako zmienna po sekwencjonowaniu do oceny wskaźnika korelacji między powtórzeniami technicznymi (Rysunek 3B)^5,16,17, ustalając stopień korelacji dla poziomu wzbogacenia odczytów dla 500 bp bins¹⁶. W przypadku większości porównań parami, wskaźniki korelacji Pearsona wykazały ponad 90% korelację, co sugeruje wysoki poziom spójności między replikami biologicznymi (Rysunek 3B). Rekompilacje z akceptowalną korelacją połączono w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Podczas gdy loci specyficzne dla typu komórki wykazywały wysokie wzbogacenie w odpowiednich komórkach, gen utrzymania domu (B2M) wykazywał bardzo spójną modyfikację histonów (Figura 3C). Na potrzeby analizy łączenie ścieżek z kontrprób zwiększy wzbogacenie, wzmocni specyficzny sygnał, w tym dla ważnych wzmacniaczy specyficznych dla typu komórki, i zmniejszy zmienność międzyosobniczą nieodłącznie związaną z próbkami ludzkimi⁵.

Chociaż do tego badania użyto 100 000 komórek, stwierdzono wysoką powtarzalność już dla 10 000 komórek w ludzkiej hodowli linii komórek T (HUT78). Analiza korelacji między zestawem danych ChIP-Seq przeprowadzona z próbek zawierających mniej niż 100 000 komórek wykazała wysoką odtwarzalność i korelację do 10 000 komórek (Rysunek 4A).

Rysunek 4: Odtwarzalność próbek o niskiej wartości wejściowej. (A) Przykłady konsystencji H3K27ac ChIP-Seq dla komórek od 100 000 do 10 000 w komórkach HUT-78 (linia komórkowa chłoniaka z komórek T). Ścieżki (UCSC Genome Browser, maksymalna intensywność, funkcja wygładzania 4, wszystkie z równomiernie skalowaną osią Y) pokazują locus IL4. (B) Korelacje Pearsona powtórzeń przy użyciu rozszerzenia 300 pz i okna 500 pz w pakiecie MEDIPS¹⁶. (C) Korelacje Pearsona między różnymi grupami numerów komórek (100 000, 50 000 i 10 000 komórek) przy użyciu tych samych parametrów MEDIPS, co w (B)¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza korelacji Pearsona wykazała wysoki wskaźnik korelacji (83% do 92%), co sugeruje utrzymanie sygnału w próbkach o niskiej liczbie komórek. Jednak wraz ze zmniejszeniem liczby komórek nastąpiło zwiększenie tła, a także spadek współczynników korelacji (Rysunek 4B). Aby utrzymać niskie sygnały tła, połączono techniczne duplikaty i przetestowano korelację między grupami (Rysunek 4C).

powiedział: pkt. pkt. pkt.

10-krotny bufor do utrwalania komórek
związek	Stężenie końcowe
Roztwór formaldehydu	11%
Zawartość NaCl	100 mM
EDTA, pH 8,0	1 mM
EGTA, pH 8,0	0,5 mM
HEPES, pH 7,5	50 mM
Kompletny bufor do lizy
związek	Stężenie końcowe
Tris-HCI, pH 8,0	50 mM
EDTA, pH 8,0	10 mM
Sds	0.25%
Maślan sodu	20 mM
Koktajl inhibitorów proteazy	1X
Krótkotrwały bufor do lizy
związek	Stężenie końcowe
Tris-HCI, pH 8,0	50 mM
EDTA, pH 8,0	10 mM
Sds	0.25%
Mieszanka tagów
związek	Stężenie końcowe
Tris-HCI, pH 8,0	10 mM
MgCl2	5 mM
N,N-dimetyloformamid	10%
Enzym znakujący Illumina	1:24 obj.
CtD Mix
związek	Na próbkę (μl)
NextEra Index Primer A (25 μM)	0,275
NextEra Index Primer B (25 μM)	0,275
2X KAPA HiFi HotStart Gotowy Mix	Godzina 2,75
1:1000 SYBR Zielony barwnik	0,11
Barwnik pasywny ROX	0,11
Woda	Napełnienie do 4 μl
Miks AMP
związek	Na próbkę (μl)
2X KAPA HiFi HotStart Gotowy Mix	27,5
Woda	Napełnienie do 31 μL

Tabela uzupełniająca 1: Receptury.

Tabela uzupełniająca 2: Korelacje próbek Spearmana i Pearsona dla 6 dawców i każdego typu komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda rozszerza procedurę ChIPmentation¹¹, która implementuje protokół przygotowania biblioteki tagmentacji przed oczyszczaniem DNA, poprzez automatyzację i mikroskalowanie protokołu. Od początku ChIP-Seq wymagana liczba komórek została drastycznie zmniejszona, z około 20 milionów komórek dla histonów do setek, a nawet pojedynczych komórek 1,7,10,12,18,19,20,21. Te nowo opracowane metody pozwoliły na głębsze zrozumienie, w jaki sposób mechanizmy cis-regulacyjne działają w komórkach, zwiększając czułość i umożliwiając badanie rzadkich populacji komórek klinicznych 5,6,12,17. Na przykład jedna z nowszych i bardziej popularnych procedur, zwana CUT&TAG, jako solidna i czuła alternatywa ChIP-Seq⁹. Wytwarza doskonały stosunek sygnału do szumu, ponieważ enzym Tn5 jest kowalencyjnie związany z białkiem A i rozpoznaje łańcuch Fc przeciwciała ChIP o wysokiej swoistości⁹. Aktywność tła enzymu Tn5 jest zmniejszona, ponieważ enzym nie jest funkcjonalny przed związaniem się z docelowym przeciwciałem⁹. Jednak wdrożenie tej metody w kontekście klinicznym jest ograniczone, ponieważ wymaga ona niestałych, żywych komórek. Ponadto usunięcie fragmentów DNA z jądra hipotonicznego może mieć negatywny wpływ na chromatynę, ponieważ jest ona usuwana podczas testu. Niezbędny wymóg pracy ze świeżymi i żywymi komórkami jest źródłem problemów w przypadku rzadkich próbek klinicznych i dużych kohort próbek,^{ponieważ zebranie} dużych kohort może zająć wiele lat. Inny rodzaj metody, drop-ChIP, elegancko wykorzystuje urządzenie mikroprzepływowe do generowania wzmianek o tagach na podstawie kropelek przed przetworzeniem ChIP¹⁹. Wykorzystuje jednak wysoce wyspecjalizowane urządzenie mikroprzepływowe i chociaż możliwe jest wykonanie jednokomórkowego ChIP-Seq, jest ono również ograniczone do użycia żywych komórek 7,8,9,18,19. Nowsze metody opierające się na ChIP-Seq, takie jak PLAC-Seq lub HiChIP, próbują zrozumieć trójwymiarowe (3D) interakcje między pikami ChIP-Seq^22,23. Te metody 3D są ekscytujące, ponieważ identyfikują interakcje cis-regulatorowe lub za pośrednictwem TF w całym genomie i lepiej rozumieją regulację ekspresji genów w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania, w zdrowych tkankach i w kontekście choroby.

Aby protokół był skuteczny, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków, takich jak jakość sonikowanej chromatyny i jakość przeciwciała. Wydajność ścinania ma kluczowe znaczenie, jeśli chromatyna nie jest dobrze sonikowana, wydajność testu drastycznie spada²⁴. Sonikacja jest trudnym aspektem ChIP-Seq ze względu na wymaganą liczbę komórek. W przypadku sonikatora użytego w protokole wydajność została drastycznie zmniejszona poniżej 300 000 komórek. Jest to trudny aspekt w ChIP-Seq, ponieważ sonikacja poniżej tego poziomu często wymagałaby fragmentacji enzymatycznej, która jest mniej bezstronna. W rezultacie, sonikacja jest głównym czynnikiem ograniczonym dla prawdziwego mikroskalowanego ChIP-Seq. Inne platformy sonikacyjne i dostępne na rynku zestawy zostały przetestowane pod kątem sonikacji chromatyny, ale zastosowany tutaj sonikator miał najbardziej solidne i powtarzalne wyniki. Kolejną zaletą sonikatora jest brak konieczności zakupu specjalistycznych probówek do przeprowadzenia sonikacji, co obniża koszty w przypadku dużej liczby próbek. Aby uzyskać optymalną sonikację, po pierwsze, ważne jest, aby wstępnie podgrzać sonikator, jak opisano powyżej. Po drugie, aby lizować osad, zaleca się, aby końcówka pipety dotykała dna probówki podczas lizy, aby rozbić komórki z bardziej fizycznymi ograniczeniami. Po trzecie, jakiekolwiek tworzenie się pęcherzyków przed sonikacją utrudnia zdolność próbki do równomiernej sonikacji. Jeśli podczas lizy powstały jakiekolwiek pęcherzyki, ważne jest, aby usunąć je pipetą. Może to być trudne bez usuwania dużej ilości próbki, ale jeśli końcówka zostanie lekko dociśnięta do pęcherzyka, można ją powoli wyciągnąć bez utraty dużej ilości próbki. Na koniec, określając liczbę cykli, wykonaj przebieg czasowy, w którym co trzy cykle próbka jest usuwana, oczyszczana i podawana w żelu agarozowym. Należy unikać nadmiernej/niedostatecznej sonikacji próbek, ponieważ zmniejsza to wydajność ChIP. Jeśli próbka jest poddawana sonikacji, duże fragmenty mogą mieć negatywny wpływ na jakość ChIP-Seq²⁴. Z drugiej strony, jeśli próbka jest nadmiernie sonikowana, istnieje ryzyko utraty docelowego epitopu w procesie.

Kolejną istotną częścią ChIP-Seq jest jakość przeciwciała. Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania na dużą skalę konieczne jest zoptymalizowanie przeciwciała, które zostanie użyte. Celem jest uzyskanie znacznie wyższego stosunku sygnału do szumu w znanych regionach genomu, a kolejnym celem jest odtwarzalność. Jeśli przeciwciało ciągnie dużo sygnału tła, może być zalecane użycie większego wkładu lub wypróbowanie innej partii/dostawcy. Wydłuży to czas przed rozpoczęciem eksperymentu na dużą skalę, ale jest to niezbędny krok. Aby przetestować stosunek sygnału do szumu, zaleca się stosowanie qPCR z regionami, o których wiadomo, że są celem przeciwciał i innym regionem, o którym wiadomo, że jest nieobecny. Zauważono, że modyfikacje histonów są bardziej niezawodne i łatwiejsze do optymalizacji niż TF.

Opisany powyżej protokół zapewnia solidną metodę wysokoprzepustowej modyfikacji histonów ChIP-Seq w półautonomiczny, mikroskalowy sposób. Metoda ta ogranicza ilość czasu poświęcanego na pracę i zwiększa odtwarzalność w porównaniu z ręcznym sekwencją ChIP. Poprzednie badania przeprowadzone w laboratorium wykorzystywały ręczny ChIP na kontrpróbach technicznych i uzyskały średnią korelacji Spearmana wynoszącą 0,50⁵, jednak w przypadku systemu półautomatycznego korelacja Spearmana między różnymi dawcami ze średnią komórek NK wynoszącą 0,66 (Tabela uzupełniająca 2). Udało się to również osiągnąć przy około 40% krótszym czasie pracy. Opisana tutaj metoda została zoptymalizowana pod kątem modyfikacji histonów (H3K27ac pokazany tutaj, ale protokół nie powinien wymagać żadnych modyfikacji dla innych) i wymagałaby tylko drobnych modyfikacji, aby mogła zostać zaimplementowana dla TF ChIP-Seq. Pomimo jakości przeciwciała, główną modyfikacją byłby czas sonikacji i potencjalnie stosowane w okresie objętym dochodzeniem. Zwykle, w przypadku testów TF ChIP, metoda może działać lepiej z nieco dłuższymi fragmentami chromatyny (w zakresie około 350-800 pz), ponieważ kompleksy TF:DNA są prawdopodobnie mniej zdolne do utrzymania przez rygorystyczną sonikację⁶. mogą również wymagać zmiany na niestandardową mieszankę lub inne dostępne w branży zestawy, ponieważ TF mogą zachowywać się inaczej niż modyfikacje histonów.

Chociaż zautomatyzowany płyn ChIP został przetestowany na zaledwie 10 000 komórek, zauważalny był spadek odtwarzalności przy niższych stężeniach chromatyny. Z tego powodu protokół nie był zalecany dla mniej niż 10 000 komórek, przy czym 100 000 komórek to optymalne warunki. Protokół został również ukończony przy użyciu branżowych ChIP, co stanowiło dodatkowy wydatek, ale zapewniło wyższą jakość danych. Protokół może być modyfikowany w odniesieniu do warunków sonikacji (o ile ścięta chromatyna jest utrzymywana w tym samym zakresie), mogą być dostosowane do immunoprecypitacji (IP; może być wymagana optymalizacja) lub nie można używać płynu ChIP. Ograniczeniem protokołu jest użycie urządzenia do obsługi cieczy ChIP, które może być kosztowną inwestycją i może uruchomić tylko 16 próbek jednocześnie. Obsługa cieczy ChIP jest ograniczona do reakcji na małą skalę, a liczba komórek większa niż milion nie jest zalecana. Jednak protokół można ukończyć bez niego, wypełniając ręcznie kroki IP i prania. Jeśli IP i mycie zostały wykonane ręcznie, czas zakończenia testu wydłuży się, a odtwarzalność może się zmniejszyć, ale ten przewodnik nadal będzie przydatny do przeprowadzenia wysokiej jakości eksperymentu ChIP-Seq. Warto zauważyć, że inne urządzenia do obsługi cieczy mogą być przystosowane do prowadzenia półautomatycznych reakcji ChIP.

Podsumowując, główną zaletą tego systemu jest wysoka przepustowość, ponieważ etapy IP i mycia są wykonywane autonomicznie. W związku z tym można przeprowadzić sekwencyjne rundy eksperymentów ChIP, co pozwala na pełne przetworzenie i przygotowanie do sekwencjonowania do 48 próbek w ciągu 5 dni, przy ograniczonym czasie pracy w porównaniu z ręcznymi eksperymentami ChIP-Seq. Kolejną korzyścią jest zwiększona odtwarzalność, ponieważ uzyskanie wysoce powtarzalnych wyników może być trudne. Inne metody wymagają żywych komórek, złożonych systemów mikropipetowania lub ręcznego wykonania pracy. System ten będzie musiał zostać zoptymalizowany pod kątem próbek o niskim wkładzie (<10 000 komórek), co ostatecznie umożliwi reakcje ChIP w pojedynczych komórkach. System można również dostosować do nowszych metod ChIP, takich jak PLAC-Seq i HiChIP^22,23.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
200 i mikro; l paski rurowe (8 probówek/pasek) + paski nasadkowe	Diagenode	C30020002	Probówki paskowe do stosowania na IP Star; ChIP 8-probówkowy
pasek AMPure XP do oczyszczania PCR	Beckman Coulter	A63880	Koraliki SPRI
Axygen 0,6 ml MaxyClear Snaplock Probówka do mikrowirówek	Corning	MCT-060-C	0,65 ml rurka o niskim poziomie wiązania
Bioruptor Pico Sonicator	Diagenode	B01060010	Sonicator używany w laboratorium, ale można stosować inne
ChIP DNA Clean & Koncentrator (kolumny z zaślepką)	Zymo Research	D5205	Zestaw do oczyszczania DNA
Dynabeads Białko A do immunoprecypitacji	ThermoFisher	10001D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, bez RNaz	ThermoFisher	AM9260G
EGTA pH 8,0	Millipore Sigma	E3889-25G
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000667
Roztwór formaldehydu	Millipore Sigma	252549-1L
Glicyna	Millipore Sigma	50046-250G
Przeciwciało poliklonalne H3K27ac - Premium	Diagenode	C15410196
HEPES (1 M) pH 7,5	ThermoFisher	15630080
IDT dla Illumina Nextera DNA Unikalne podwójne indeksy	Illumina	20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit	Illumina	20034197
IP-Star Compact Automated System	Diagenode	B03000002	Zautomatyzowany system do badań ChIP-Seq; Obsługa cieczy ChIP
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KK2601	PCR mix
Średni pojemnik na odczynnik do SX-8G IP-Star Compact	Diagenode	C30020003
MgCl2 (chlorek magnezu) (25 mM)	ThermoFisher	R0971
N,N-dimetyloformamid	Millipore Sigma	D4551-250ML	UWAGA - niska temperatura zapłonu
NaCl (5 M), Bez RNaz	ThermoFisher	AM9760G
PBS (10X), pH 7,4	ThermoFisher	70011044
PCR Flex-free 8-tubowe paski, dołączone indywidualne nasadki optyczne	USA Scientific	1402-4700	probówek, 0,2 ml 8 probówek
Koktajl inhibitorów proteinazy	Milipore Sigma	P8340
Roztwór proteinazy K (20 mg/ml), klasa	RNAThermoFisher	25530049
PureLink RNaza A (20 mg/ml)	ThermoFisher	12091021
Quant-iT Odczynnik dsDNA PicoGreen	ThermoFisher	P7581	Stosowany do oznaczania ilościowego fluorescencji
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	ThermoFisher	4485699	qPCR
ROX Barwnik referencyjny	ThermoFisher	12223012
Maślan sodu	Millipore Sigma	303410-100G
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000X koncentrat w DMSO)	ThermoFisher	S11494	barwnik kwasu nukleinowego
SYBR Green I Kleinowy barwnik żelowy - 10 000X koncentrat w DMSO	ThermoFisher	S7563
TE	Końcówki	do 12090015
ThermoFisher (luzem)	Diagenode	C30040020	Wskazówki dotyczące zestawu IP
Star True MicroChIP	Diagenode	C01010130	Zawiera wszystkie dla IP; Zestaw ChIP
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8,0	ThermoFisher	15568025
UltraPure SDS Solution, 10%		ThermoFisher 24730020