Artykuł metodologiczny

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

DOI:

10.3791/61620

⸱

2 września 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamika mitochondriów jest niezbędna dla różnorodnych funkcji organelli i odpowiedzi komórkowych. Zatłoczona, przestrzennie złożona błona mitochondrialna jest trudnym środowiskiem do rozróżnienia czynników regulacyjnych. Eksperymentalna kontrola składników białkowych i lipidowych może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące regulacji. Jednak ilościowa manipulacja tymi czynnikami jest wyzwaniem w testach komórkowych. Aby zbadać molekularny mechanizm fuzji mitochondriów z błoną wewnętrzną, wprowadziliśmy platformę do rekonstytucji in vitro, która naśladuje środowisko lipidowe wewnętrznej błony mitochondrialnej. Tutaj opisujemy szczegółowe etapy przygotowania dwuwarstw lipidowych i odtworzenia białek błony mitochondrialnej. Platforma umożliwiła analizę produktów pośrednich w fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej oraz kinetyki poszczególnych przejść w sposób ilościowy. Protokół ten opisuje wytwarzanie dwuwarstw o asymetrycznym składzie lipidowym i opisuje ogólne rozważania dotyczące rekonstytucji białek transbłonowych w amortyzowaną dwuwarstwę. Metoda może być stosowana do badania innych systemów membranowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podział błony jest cechą charakterystyczną komórek eukariotycznych1 (Rysunek 1A). Błony biologiczne są coraz częściej uznawane za coś więcej niż dwuwymiarowy rozpuszczalnik i są uważane za środowisko odgrywające kluczową rolę w regulacji funkcji białka i składania kompleksów makromolekularnych2,3. Natywne lipidy to ligandy, które regulują aktywność białek błonowych3,4. Organizacja przestrzenna membrany i zdolność membran do rzeźbienia w różne kształty są ważnymi właściwościami fizycznymi przy wyborze nowych funkcji3,5.

Modelowe platformy membranowe to systemy biomimetyczne, które mogą nam pomóc w zrozumieniu struktury, dynamiki i funkcji błony komórkowej6,7,8. Błony modelowe zazwyczaj składają się z mieszaniny lipidów o dobrze określonym składzie, o określonych właściwościach biofizycznych (sztywność, grubość i elastyczność). W połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, modelowe platformy membranowe umożliwiają ilościową analizę struktury i funkcji membrany9,10,11. Strategie rekonstytucji dwuwarstwowej lipidów zostały wykorzystane do zbadania fuzji błon za pośrednictwem SNARE9,10, fuzji błonowej za pośrednictwem DNA12, and viral fusion11,13. Zaletą takich metod jest możliwość uzyskania informacji kinetycznej dla etapów pośrednich poprzedzających obserwowalne zdarzenie reakcji14.

Błona plazmatyczna została gruntownie przebadana przy użyciu błon modelowych. Dwuwarstwy z separacją faz lipidowych zostały opracowane do badania struktur tratw lipidowych ważnych w sygnalizacji komórkowej11,15,16. Mikrowzorzyste dwuwarstwowe lipidy płaskie17,18 zostały wykorzystane do zbadania organizacji receptorów komórkowych. Membrany polimerowe lub żelowe zostały wykorzystane jako systemy biomimetyczne do badania organizacji błona-cytoszkielet, partycjonowania białek błonowych podczas sygnalizacji komórkowej i migracji na styku komórka-komórka19.

Sztuczne systemy membranowe są również stosowane do badania organelli subkomórkowych20. Organelle mają charakterystyczne morfologie, które tworzą odrębne podśrodowiska. Jednym z przykładów jest sieć retikulum endoplazmatycznego (ER). Po rozpuszczeniu retikulonów w liposomach powstają struktury błony rurkowej o właściwościach podobnych do komórkowego ER21. Dodanie atlastyny, białka fuzyjnego ER, może indukować kanaliki lipidowe z liposomów w celu utworzenia sieci20. Jest to jeden z przykładów tego, w jaki sposób proteoliposomy mogą zapewnić funkcjonalny wgląd w morfologię i dynamikę organelli.

Fuzja i rozszczepienie błony mitochondrialnej są niezbędne dla zdrowia populacji mitochondriów22,23,24,25. Zestaw GTPaz z rodziny dynamin katalizuje fuzję błon mitochondriów. Mfn 1/2 katalizuje fuzję błony zewnętrznej. Opa1 pośredniczy w fuzji błony wewnętrznej26 (Rysunek 1B). Opa1 ma dwie formy: długą formę (l-Opa1), transbłonowo zakotwiczoną w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, oraz "rozpuszczalną" krótką formę (s-Opa1), obecną w przestrzeni międzybłonowej. Stosunek dwóch form Opa1 jest regulowany przez aktywność dwóch proteaz, Oma1 i Yme1L27,28,29,30. Ważne pytania dotyczące regulacji Opa1 obejmują: w jaki sposób dwie formy Opa1 (krótka i długa) pośredniczą w fuzji błonowej oraz ich regulacyjne wzajemne oddziaływanie28,29,31,32,33.

Tutaj opisujemy strategię rekonstytucji z powodzeniem zastosowaną do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która wyjaśniła rolę l- i s-Opa1 w fuzji błony wewnętrznej. Opracowaliśmy platformę naśladującą błonę wewnętrzną mitochondriów przy użyciu dwuwarstwy lipidowej na uwięzi polimerowej i jednowarstwowych pęcherzyków o długości fali 200 nm. Korzyści płynące z polimerowej linki pod dwuwarstwą lipidową są następujące. Po pierwsze, zachowuje odtworzone białko transbłonowe, które w przeciwnym razie mogłoby zostać zakłócone przez bliskość szkiełka34. Po drugie, służy grubej warstwie wody między dwuwarstwą lipidową a szklanym podłożem, co ułatwia badania otwarcia porów9, a po trzecie, lepkosprężysty charakter polimeru PEG umożliwia zmiany krzywizny membrany35. Użyliśmy trójkolorowego obrazowania fluorescencyjnego, aby scharakteryzować etapy fuzji błonowej ( Rysunek 1C-F).

figure-introduction-1
Rycina 1: Monitorowanie fuzji błon mitochondrialnych.
(A) Organelle to przedziały błony komórkowej. (B) Sekwencyjne etapy fuzji błon mitochondrialnych. Fuzja błony zewnętrznej mitochondriów jest katalizowana przez Mfn1 i/lub Mfn2, podczas gdy fuzja błony wewnętrznej jest pośredniczona przez Opa1. (C-F) Schemat platformy do rekonstytucji in vitro do badania fuzji błon mitochondrialnych. Platforma składa się z dwóch części: proteoliposomu i dwuwarstwy lipidowej na uwięzi polimerowej, obie z rozpuszczonym l-Opa1. Etykiety fluorescencyjne, w tym dwa różne fluorescencyjne barwniki membranowe i znacznik zawartości, pomagają rozróżnić etapy podczas zgrzewania membrany. Dwa markery błonowe (Cy5-PE (czerwony) i TexasRed PE (pomarańczowy) tworzą parę FRET, która może informować o bliskim dokowaniu membrany. Dyfuzja TexasRed-PE, która znakuje proteoliposom, jest wskaźnikiem demieszania lipidów (hemifuzji). Uwalnianie treści jest monitorowane poprzez wygaszanie sygnału kalceiny (pokazanego na zielono). Panele A i B wykonane przy użyciu Biorenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mieszanin lipidowych

  1. Przygotować podstawowy roztwór lipidów, rozpuszczając 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3fosfocholinę (DOPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę (POPE), L-α-fosfatydyloinozytol (PI wątroby), kardiolipinę i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (18:1 PEG2000 PE) w chloroformie o stężeniu 25 mg/ml. Rozpuścić chloroform lipidowy sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym (TexasRed DHPE i Cy5 DOPE) w stężeniu 1 mg/ml. Roztwór lipidowy należy przechowywać w bursztynowych fiolkach z wkładką odporną na chloroform, a następnie uszczelnić taśmą politetrafluoroetylenową. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Wykonaj rozwiązania A i B.
    1. Wymieszaj lipidy, aby przygotować roztwór A (końcowe stężenie 1 mg/ml), który zawiera DOPC (52,8 mol.), POPE (20 mol.), PI wątroby (7 mol%) i kardiolipinę (20 mol%) oraz 0,2 mol% fluoroforu.
    2. Przygotować roztwór B (stężenie końcowe 1 mg/ml) zawierający DOPC (47,8 mol.), POPE (20 mol.), PI wątroby (7 mol.), kardiolipinę (20 mol%) i DOPE-PEG2000 (5 mol%) oraz 0,2 mol% fluoroforu.
    3. Wytworzyć mieszaninę lipidów, dodając obliczoną objętość roztworu do przechowywania do bursztynowych fiolek za pomocą szklanej strzykawki. Dopasuj ostateczną objętość, dodając dodatkową ilość chloroformu do fiolek.
      UWAGA: W przypadku FCS (spektroskopia korelacji fluorescencji) zmniejsz stosunek lipidów sprzężonych z barwnikiem do 0,002% molowych i zastąp resztę DOPC.

2. Wytwarzanie dwuwarstw lipidowych

  1. Piec szkiełka mikroskopowe w temperaturze 520 °C przez 30 minut. Po upieczeniu schłodzić szkiełka pokrywy do temperatury pokojowej.
  2. Odważyć około 10 g wodorotlenku sodu i dodać do 500 ml metanolu, mieszając. Mieszaj przez 2 godziny, kontynuuj dodawanie wodorotlenku sodu do roztworu, aż zaczną pojawiać się osady. Upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej podczas całego procesu.
  3. Szkiełka podstawowe należy kolejno czyścić w 10% roztworze dodecylosiarczanu sodu, metanolu nasyconym wodorotlenkiem sodu i 50 mM kwasem solnym (sonikacja kąpieli w każdych warunkach przez 30 minut). Wyczyść szkiełko w ultraczystej wodzie przez 10 minut między każdym warunkiem.
    UWAGA: Chociaż zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżych roztworów do przygotowania szkiełek szklanych, każdy roztwór można ponownie użyć do 5 razy lub w ciągu 1 miesiąca, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Pamiętaj, aby wymieszać roztwór przed każdym użyciem.
  4. Oczyszczoną szklankę nakrywkową należy przechowywać szczelnie zamkniętą w roztworze HCl do 2 tygodni, aby zapewnić dobrą jakość dwuwarstwową. W przypadku przechowywania w ultraczystej wodzie zużyj szkiełka w ciągu tygodnia.
  5. Wyczyść koryto z politetrafluoroetylenu systemu zanurzania Langmuir-Blodgett za pomocą chloroformu i ultraczystej wody, aż nie zaobserwuje się zwilżania koryta. Rozpyl chloroform na powierzchnię koryta, dokładnie przetrzyj chusteczkami celulozowymi 3x. Spłucz ultraczystą wodą i usuń wodę przez odsysanie. Powtórz 3 razy.
  6. Przykryj powierzchnię koryta czystą, ultraczystą wodą.
  7. Weź 2 kawałki szkła nakrywkowego poddanego obróbce powierzchniowej z roztworu czyszczącego lub ultraczystej wody i płucz szkiełko ultraczystą wodą przez około 30 sekund.
  8. Umieść szkło nakrywkowe tyłem do siebie. Użyj podłoża clamp do przytrzymania szkiełek szkiełkowych. Zanurz szklaną zjeżdżalnię pod powierzchnią wody, ręcznie klikając "dipper down" w oprogramowaniu sterującym Langmuir.
  9. Wyzeruj równowagę folii, ostrożnie rozprowadzając roztwór B kropla po kropli na granicy faz powietrze-woda (Rysunek 2A). Upewnij się, że lipidy rozprzestrzeniają się tylko na granicy faz powietrze-woda, bez kropelek chloroformu i lipidów opadających na dno powierzchni politetrafluoroetylenu. Niezapewnienie tego spowoduje utworzenie "kanału" lipidowego i zapobiegnie tworzeniu się monowarstwy.
  10. Przestań dodawać lipidy do momentu odczytu balansu filmu około ~15-20 mN/m, poczekaj ~10-15 min. Zainicjuj kontroler bariery, aby zmienić powierzchnię, klikając "rozpocznij eksperymenty", aż odczyt balansu filmu do 37 mN/m. Utrzymuj ciśnienie przez ~20-30 min (Rysunek 2B).
  11. Podnieś szklankę nakrywkową z prędkością 22 mm/min, utrzymując napięcie powierzchniowe na poziomie 37 mN/m. Monowarstwa lipidowa z wiązaniem polimerowym zostanie przeniesiona z granicy faz powietrze-woda na powierzchnię szkła nakrywkowego w procesie zanurzania Blodgetta (Rysunek 2C). Tworzy to dolną ulotkę dwuwarstwy lipidowej.
  12. Oczyść interfejs powietrze-woda przez odsysanie, spłucz koryto ultraczystą wodą.
  13. Przed użyciem wyczyść szkiełko z jednym dołkiem (np. szkiełko Shaefera) za pomocą chloroformu, etanolu i ultraczystej wody. Ustaw czystą szklaną szkiełko na korycie z ultraczystą wodą pod warstwą wody. Upewnij się, że studzienka jest skierowana do góry w kierunku granicy faz powietrze-woda i wlej świeżą, ultraczystą wodę, aż szklane szkiełko zostanie całkowicie zakryte. Powtórz krok 2.8.
  14. Przytrzymaj szkło nakrywkowe z monowarstwą lipidową z kroku 2.4 za pomocą silikonowej przyssawki (upewnij się, że strona monowarstwy jest z dala od przyssawki), delikatnie wepchnij monowarstwę lipidową do granicy powietrzno-wodnej, przytrzymaj szklankę nakrywkową przez ~ 2-3 s na interfejsie, a następnie dociśnij szklankę nakrywkową do szkiełka (Rysunek 2D). Wyjmij prowadnicę ze szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Dwuwarstwa lipidowa będzie utrzymywana na powierzchni szkła nakrywkowego skierowanego w stronę obszaru umieszczonego między dwoma szkiełkami (Rysunek 2E).
  15. Weź szkło nakrywkowe z dwuwarstwą do mikroskopu epifluorescencyjnego. Wyobraź sobie dwuwarstwę lipidową. Jeśli zaobserwuje się jednorodny rozkład barwnika lipidowego, należy fotowybielać niewielki obszar dwuwarstwy przez 30 s, wyłączyć źródło światła na ~30 s-1 min., a następnie ponownie wykonać obraz, aby zaobserwować regenerację. Dwuwarstwa lipidowa wykaże regenerację fluorescencji.
    UWAGA: Membrany z defektami lub złym odzyskiem fluorescencji nie powinny być używane do dalszych eksperymentów.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Etapy tworzenia dwuwarstwy lipidowej na uwięzi polimerowej.
Etapy wytwarzania dwuwarstw lipidowych technikami zanurzania Langmuira-Blodgetta (A-C) i transferu Langmuira-Schaefera (D). (E) Końcowa "kanapka" zawierająca dwuwarstwę lipidową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Rekonstytucja białka w dwuwarstwie lipidowej na uwięzi polimerowej

  1. Przygotuj naczynie krystalizacyjne zawierające ultraczystą wodę. Przygotuj czysty pierścień obrazu mikroskopowego i umieść go pod naczyniem.
  2. Zanurz "kanapkę" szkiełka Schaefera i szkła nakrywkowego zawierającego dwuwarstwę lipidową pod wodą, delikatnie oddziel szkiełko Schaefera i szkło nakrywkowe, przytrzymaj szkiełko nakrywkowe od dołu, z dala od strony dwuwarstwowej, przenieś szkiełko nakrywkowe do pierścienia obrazu, zamknij pierścień obrazu.
    UWAGA: Upewnij się, że szkło nakrywkowe z dwuwarstwą lipidową jest zawsze w wodzie, a pierścień jest dobrze uszczelniony.
  3. Zastąp ultraczystą wodę w pierścieniu obrazu buforem Bis-Tris NaCl, upewnij się, że dwuwarstwa lipidowa nie jest narażona na działanie pęcherzyków powietrza. Dodaj 1,1 x 10-9 M n-oktylo-β-D-glukopiranozyd do dwuwarstwy lipidowej. Natychmiast dodaj mieszaninę 1,2 x 10-9 M DDM i 1,3 x 10-12 mol oczyszczonego l-Opa136 do pierścienia obrazu. Inkubować próbkę na wytrząsarce stołowej z niską prędkością przez 2 godziny (Rysunek 3).
    UWAGA: Detergenty mogą się różnić w zależności od białka, które ma być rozpuszczone.
  4. Rozprowadź 30 mg kulek żywicy SM-2 w 3 ml buforu Bis-Tris i wstrząśnij przed aplikacją. Użyj plastikowej pipety, aby dodać 5 ~ 10 μl kulek żywicy SM-2 do pierścienia obrazu, inkubować przez 10 minut, usunąć kulki żywicy przez spłukiwanie. Końcowa objętość buforu w pierścieniu obrazu wynosi 1,5 ml.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Procedura rekonstytucji l-Opa1 w dwuwarstwie lipidowej na uwięzi polimerowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie proteoliposomów

  1. Przygotować 1 mg mieszaniny lipidów A w roztworze chloroformu. Odparować chloroform pod strumieniem azotu przez 20 minut i trzymać w próżni przez noc i utworzyć film lipidowy.
  2. Przygotować 50 mM buforu zawierającego kalceinę, rozpuszczając 15,56 g kalceiny w 50 ml roztworu NaOH o stężeniu 1,5 mola, mieszać w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia kalceiny, dodać 12,5 mM Bis-Tris i ultraczystą wodę do końcowej objętości 500 ml. Dostosuj pH do 7,5.
  3. Zawiesić film lipidowy w buforze zawierającym kalceinę, w pełni uwodnić lipid, podgrzewając zawiesinę w temperaturze 65 °C przez 20 minut. Liposomy o długości 200 nm powstają przez wytłaczanie przy użyciu membrany poliwęglanowej.
  4. Dodać 2 μg l-Opa1 w 0,5 μM DDM do 0,2 mg liposomu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny. Usunąć środek powierzchniowo czynny przez dializę przy użyciu kasety dializacyjnej 3,5 kDa w porównaniu z 250 ml 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl i 50 mM buforu kalceiny w temperaturze 4 °C przez noc, zmieniając bufor dwukrotnie.
  5. Usuń dodatkową kalceinę za pomocą kolumny odsalającej PD-10.

5. Obrazowanie i analiza danych

  1. Rejestruj obrazy TIRF za pomocą obiektywu zanurzonego w oleju 100x (N.A 1.4). Użyj lasera 543 nm i lasera 488 nm do analizy liposomów i proteoliposomów znakowanych TexasRed-PE otoczonych kalceiną. Użyj lasera 633 nm do analizy Cy5-PE osadzonego w płaskiej dwuwarstwie lipidowej.
  2. Wyrównaj kąt TIRF za pomocą dwuwarstwy lipidowej, aby uzyskać maksymalną emisję. Jakość dwuwarstwy lipidowej po rozpuszczeniu obserwuje się za pomocą 100-krotnego obiektywu olejowego w temperaturze 25 °C. Współczynnik dyfuzji fosfolipidu i odtworzonej dwuwarstwy określa się za pomocą FCS z protokołem opisanym gdzie indziej37.
  3. Dodaj 10 μl proteoliposomów 2 mg/ml do pierścienia obrazu i ustaw na 10 minut przed obrazem. GTP, GMPPCP lub GDP dodaje się do pierścienia reakcyjnego z 1 mM MgCl2 i 1 mM nukleotydu.
  4. Aby określić wpływ s-Opa1 na fuzję błonową, miareczkować s-Opa1 do proteoliposomu/podpartego próbki dwuwarstwowej zawierającej l-Opa1 i rejestrować zdarzenia fuzji.
  5. Jednoczesne obrazowanie TexasRed-DHPE i kalceiny uzyskuje się za pomocą systemu rozdzielania wiązki. Zarówno lasery o długości fali 488 nm, jak i 543 nm są jednocześnie stosowane do próbki jako źródła wzbudzenia fluorescencyjnego. Światło emisyjne jest następnie dzielone za pomocą rozdzielacza wiązki o długości fali 560 nm. Światło o podzielonej emisji jest następnie filtrowane przez filtr 510 nm o szerokości pasma 42 nm oraz filtr 609 nm o szerokości pasma 40 nm. Przefiltrowana wiązka jest rzutowana na dwa sąsiednie obszary na chipie kamery.
  6. Emisja fluorescencyjna jest jednocześnie rejestrowana przez filtr emisyjny 609 o szerokości pasma 40 nm i filtr emisyjny 698 o szerokości pasma 70 nm. System mikroskopowy wyposażony jest w kamerę CMOS utrzymywaną w temperaturze -10 °C.
  7. Identyfikacja cząstek liposomów może być przeprowadzona za pomocą algorytmu rozpoznawania cząstek opartego na Gaussowie. Rozkład i intensywność cząstek są analizowane kanał po kanale. Sygnał dwuwarstwowy lipidowy jest używany jako maska do izolowania cząstek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odtworzone białko transbłonowe swobodnie dyfunduje i jest jednorodnie rozmieszczone w błonie.

Przykładowe obrazy dwuwarstwy lipidowej i jej płynności lipidowej potwierdzonej mikroskopią epifluorescencyjną pokazano w Rysunek 4. Rozkład lipidów w dwuwarstwie przed i po fotowybielaniu pokazano w Rysunek 4A,B. Jednorodność dwuwarstwy lipidowej uwidoczniono za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przed i po rekonstytucji (Rysunek 4D,E). l-Opa1 rozpuszczony w dwuwarstwie lipidowej zwalidowano za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). Używamy lipidów sprzężonych z barwnikiem do oceny dyfuzyjności lipidów dwuwarstwy. Odtworzony Opa1 znakowano za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała C-końcowego anty-Opa1. Dwuwarstwową dyfuzję lipidów zmierzono jako 1,46 ± 0,12 μm2/s, natomiast współczynnik dyfuzji dwuwarstwowego l-Opa1 odtworzonego przez dwie warstwy wynosił 0,88 ± 0,10 μm2/s. Odczyt intensywności z krzywych FCS wykazał, że 75% l-Opa1 jest odtwarzane w dwuwarstwie lipidowej (Rysunek 4G, H). Wyniki te sugerują, że l-Opa1 swobodnie dyfunduje w dwuwarstwie lipidowej na uwięzi polimerowej z potencjałem do samoorganizacji w funkcjonalne kompleksy.

figure-results-1
Rysunek 4: Rozkład lipidów i odtworzonych białek w błonie modelowej.
(A-C) Przykładowe obrazy dwuwarstwy lipidowej i jej płynności lipidowej potwierdzone za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. (A) Jednorodny rozkład lipidów w dwuwarstwie przed fotobieleniem. (B) Migawka bezpośrednio po fotowybielaniu. (C) Dwuwarstwa zobrazowana po odzyskaniu fluorescencji wskazuje na dobrą płynność lipidową błony po rekonstytucji. (D,E) Reprezentatywne obrazy rozmieszczenia lipidów przed (D) i po (E) rekonstytucji l-Opa1 wskazują, że proces rekonstytucji nie spowodował defektów w dwuwarstwie. Reprezentatywny obraz TIRF l-Opa1 znakowany sprzężonym przeciwciałem Alexa 488 (F) pokazującym jednorodny rozkład Opa1 po rozpuszczeniu. G. Reprezentatywna liczba surowych fotonów sygnału l-Opa1 za pomocą fluorescencyjnej spektroskopii korelacji. W grupie kontrolnej nie odtworzono l-Opa1 w dwuwarstwie, podczas gdy przeciwciało dodano i przepłukano. Dyfuzja l-Opa1 jest znacznie wolniejsza niż lipidów w błonie, co jest zgodne z pomyślną rekonstytucją transbłonowego l-Opa1 (H). Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Etapowe wybielanie fluorescencyjne wykazało, że średnio 2-3 kopie l-Opa1 zostały odtworzone w danym liposomie (Rysunek 5A,B). Rozkład wielkości proteoliposomów odtworzonych Opa1 przetestowano po rozpuszczeniu przy użyciu DLS (Rysunek 5C). Rekonstytucja Opa1 w proteoliposomach została również zweryfikowana za pomocą FCS. Współczynnik dyfuzji wolnego przeciwciała wynosił 164 ± 22 μm2/s; Współczynnik dyfuzji dla liposomów znakowanych barwnikiem lipidowym wynosił 2,22 ± 0,33 μm2/s, a współczynnik dyfuzji dla proteoliposomów l-Opa1 związanych z przeciwciałem anty-He znakowanym TexasRed wynosił 2,12 ± 0,36 μm2/s.

figure-results-2
Rysunek 5: Wytwarzanie i charakterystyka proteoliposomów.
(A) Etapy wytwarzania proteoliposomów z otoczkowaną, wygaszoną kalceiną. (B) Reprezentatywne dane dotyczące fluorescencyjnego wybielania krokowego pokazują średnio 2-3 kopie l-Opa1 osadzone w liposomie. (C) Reprezentatywne rozkłady wielkości proteoliposomów (kolor czerwony) bez nukleotydu 1 h po inkubacji GTP (kolor zielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykrywanie wiązania błony, demiksowania lipidów/hemifuzji i otwierania porów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wiązanie błony jest monitorowane poprzez obserwację sygnału TexasRed na powierzchni dwuwarstwy lipidowej za pomocą mikroskopii TIRF (Rysunek 6A). Zachowanie demieszania lipidów błonowych (hemifuzji) monitorowano za pomocą TexasRed, gdy barwnik dyfunduje z liposomów do dwuwarstwy lipidowej. Wygaszanie kalceiny pomaga odróżnić pełne tworzenie porów fuzyjnych od samego wymieszania lipidów. Pozwala to na porównanie warunków, w których cząstki zatrzymują się na półfuzji (rys. 6B), a cząstkami, które przechodzą do pełnej fuzji (Rysunek 6C).

Wiązanie błony jest sygnalizowane przez stabilny sygnał lipidowy z liposomów. Odległość można ocenić na podstawie sygnału FRET między etykietami dwóch membran36. Sygnał hemifuzyjny nie charakteryzuje się wygaszaniem sygnału kalceiny (Rysunek 6B, dolny rząd), ale szybki zanik sygnału TexasRed wskazuje na dyfuzję barwnika do dwuwarstwy lipidowej (Rysunek 6B górny rząd). Pełna fuzja (z otwarciem porów) charakteryzuje się zarówno rozpadem lipidów, jak i uwalnianiem zawartości (Rysunek 6C). Intensywność TexasRed i intensywność kalceiny można śledzić w sposób zależny od czasu, aby uzyskać ilościowe szczegóły dotyczące kinetyki fuzji membranowej36.

figure-results-3
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki pokazujące wiązanie cząstek (A, podziałka 10 μm), hemifuzja (B, podziałka skali 0,5 μm) i fuzja (C, podziałka skali 0,5 μm).
(A) Proteoliposomy przywiązane do dwuwarstwy lipidowej odtworzonej przez Opa1 przed dodaniem GTP. (B) Przykład hemifuzji. Górny wiersz w B pokazuje demieszanie lipidów (sygnał TexasRed, czerwony), dolny wiersz w B pokazuje brak uwalniania zawartości (sygnał kalceiny, zielony) w tych warunkach. (C) Reprezentatywny ślad zespolenia proteoliposomu z dwuwarstwą lipidową. Uwalnianie treści można zaobserwować na zdjęciach w dolnym rzędzie pokazujących gaszenie kalceiny (dolny rząd, zielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy modelowo-membranowe in vitro mogą opisywać złożone procesy membranowe w ściśle określonych warunkach. Systemy te potrafią rozróżniać minimalne składniki niezbędne do złożonych procesów molekularnych w celu ujawnienia mechanizmów molekularnych 6,15,20,38. W przypadku białek błonowych liposomy i dwuwarstwy podparte planarnie są powszechnymi systemami rekonstytucji. W przeciwieństwie do dwuwarstw lipidowych na podłożu stałym, poduszka polimerowa między podłożem a błoną podpartą w dwuwarstwach na uwięzi polimerowej umożliwia swobodną mobilność dużych białek błonowych, a białka transbłonowe dyfundują i gromadzą się swobodnie34. Te cechy pomogły nam zbadać kinetykę fuzji mitochondriów z błoną wewnętrzną36.

Przygotowaliśmy dwuwarstwę lipidową na uwięzi polimerowej przy użyciu technik Langmuira-Blodgetta/Langmuira-Schaefera (LB/LS). Dzięki temu możemy przygotować dwuwarstwę z asymetrycznymi składnikami lipidowymi. Błony komórkowe mają asymetryczny skład listków, a podejście LB/LS pozwala na badanie takich dwuwarstw. Dzięki transferowi Schaefera całe szklane podłoże może być pokryte dwuwarstwą lipidową. Bardzo ważne jest przygotowanie czystej powierzchni do przygotowania dwuwarstwowego. Dodatkowo, aby prawidłowo wykonać transfer Schaefera, potrzebna jest praktyka. Nieudany transfer Schaefera może spowodować niepożądane defekty w dwuwarstwie lipidowej. W tym protokole ciśnienie dodane do balansu folii ma zastosowanie do dwuwarstwy zawierającej 20% kardiolipiny. W przypadku dwuwarstw z innymi składnikami należy zapoznać się z izotermą powierzchni nacisku i powierzchni kluczowych składników. Alternatywną metodą jest metoda fuzji Langmuira-Blodgetta/pęcherzyków (LB/VF), w której dolna monowarstwa lipidowa jest przenoszona z granicy faz powietrze-woda koryta Langmuira na czyste podłoże, a następnie liposomy łączą się z górną częścią podpartej monowarstwy lipidowej i tworzą końcową dwuwarstwę39. Rekonstytucja białek błonowych przy użyciu metody LB/VF jest prostsza niż LB/LS, ponieważ rekonstytucję można przeprowadzić poprzez fuzję proteoliposomów. Jednak fuzja pęcherzyków wymaga dodania nadmiaru liposomów, co może skomplikować badanie zdarzeń błonowych zależnych od zależnych od stężenia interakcji białko-białko.

Pomyślne odtworzenie białek transbłonowych zarówno w dwuwarstwach lipidowych na uwięzi polimerowej, jak i w liposomach w preferowanej orientacji funkcjonalnej jest ważne, ale trudne do wyegzekwowania. Aby to uwzględnić, potrzebne są kontrole eksperymentalne. W przypadku dwuwarstw lipidowych na uwięzi polimerowej ważne jest również zachowanie integralności dwuwarstwy lipidowej podczas rekonstytucji. Stężenia środków powierzchniowo czynnych muszą być utrzymywane na stosunkowo niskim poziomie, aby zapobiec rozpuszczeniu dwuwarstwy lipidowej, ale wystarczająco wysokim, aby zapobiec denaturacji białka będącego przedmiotem zainteresowania37,40. Opisana tutaj metoda jest idealna do odtwarzania białek błonowych do badań pojedynczych cząsteczek, ale niekoniecznie jest skalowalna do badań na większą skalę. Kolejną ważną kwestią jest wybór środka powierzchniowo czynnego. Często dobrym punktem wyjścia jest środek powierzchniowo czynny używany do oczyszczania i przechowywania. Maksymalne stężenie środka powierzchniowo czynnego jest zwykle ~200 razy mniejsze niż CMC36, w zakresie, w którym środek powierzchniowo czynny utrzymuje stabilność białka i zapobiega agregacji białek, zachowując jednocześnie integralność błony36. Można rozważyć koktajle zawierające 2 lub 3 środki powierzchniowo czynne. Do rozpuszczenia w liposomach nie jest konieczne niskie stężenie środka powierzchniowo czynnego. Jednak stężenia środków powierzchniowo czynnych poniżej CMC są preferowane w celu utrzymania jednolitej wielkości i rozkładu morfologii liposomów. Aby zapobiec wyciekowi barwnika zawartości, konieczne jest dializowanie w buforze zawierającym barwnik.

W przeciwieństwie do testów fuzji opartych na liposomach, stworzona przez nas platforma zapewnia podejście do badania kinetyki każdego etapu fuzji membranowej. Metoda ta daje możliwość badania transbłonowych białek fuzyjnych w warunkach zbliżonych do natywnych. Modelowe platformy błonowe mogą być stosowane do badania składania i oligomeryzacji białek błonowych, "rzeźbienia" błony i interakcji białko-lipid białek w środowiskach subkomórkowych, takich jak wewnętrzna błona mitochondrialna. Metoda ta pozwala również na badanie ważnych warunków fizjologicznych we wzajemnym oddziaływaniu błona-białko, takich jak asymetria składu dwuwarstwowego. Rola kluczowego lipidu mitochondrialnego, kardiolipiny, we właściwościach dwuwarstwowych zarówno liposomów, jak i dwuwarstw wspieranych przez polimery, pozostaje do określenia. Właściwości takie jak siła jonowa, grubość błony, sztywność błony, krzywizna błony i właściwości elastycznej lepkości błony mogą wpływać na zdolność białek do łączenia się w określone stany funkcjonalne. Przyszłe badania z kreatywnym zastosowaniem modelowych systemów błonowych mają potencjał, aby odkryć nowe aspekty organizacji i funkcji białek błonowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Charlesa H. Hooda za Nagrodę za Badania nad Zdrowiem Dzieci oraz hojne wsparcie ze strony Wydziału Biologii Molekularnej w Massachusetts General Hospital.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(cyjanina 5)Avanti polarny lipidKat #: 810335C1mgmembranowe markery fluorescencyjne
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)Avanti Polar lipidsCat #: 880130Pcząsteczki lipidów
1',3'-bis[1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol (sól sodowa)Avanti Polar lipidyKat #: 710335Pcząsteczki lipidowe
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti Polar lipidsKat #: 850375Pcząsteczki lipidów
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar lipidyKat #: Cząsteczki lipidowe 850757P
Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA20181
Bursztynowa fiolka z wkładką PTFEFisher scientific14-955-332do przechowywania lipidów rozwiązania
CalceinSigma-AldrichCat #: C0875; PubChem Identyfikator substancji: 24892279barwnik fluorescencyjny
ChloroformFisher scientific298-500 / C295-4Chloroform marki Fisher jest zwykle dość niezawodny w przypadku prac lipidowych.
Szkiełko wklęsłe (1 dołek)Mikroskopia elektronowa Science71878-05Schaefer Slide
Narzędzie programoweSmith Lab, University of Akron
Fidżi / ImageJNarzędzie programoweFijiSCR_002285
Okulary ochronne Fisherbrand: KołaFisher scientific12-545-102Szkło nakrywkowe dla dwuwarstw lipidowych na stałym nośniku, pozycja jest obecnie wycofana z produkcji, ponieważ autorzy przygotowali manuskrypt. Alternatywą jest szkło nakrywkowe premium marki Fisher o numerze katalogowym: 12-548-5M
GTP Sól disodowaSIGMA-ALDRICH INCKat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett TroughBiolin ScientifcKN2002
L-&alfa;-lizofosfatydyloinozytol (wątroba, bydło) (sól sodowa)Avanti Polar lipidsCat #: 850091Pcząsteczki lipidów
Mini wytłaczarkaAvanti Polar lipids610020
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceKot #: D310 25 GMśrodek powierzchniowo czynny do rekonstytucji
n-oktylo-&alfa;-D-glukopiranozydAnatraceKat #: O311HA 25 GMśrodek powierzchniowo czynny do rekonstytucji
Membrany PC 0,2μ m Avanti Polar Lipids610006
Rabbit Przeciwciało anty-Opa1NOVUS BIOLOGICALSKat #: Przeciwciało NBP2-59770do wykrywania C-końca Opa1
SlidebookInteligentne obrazowanieRRID: SCR_014300narzędzie programowe
uszczelniająca z gwintem teflonowymFisher ScientificNC0636085taśma taflonowa do przechowywania próbek
Czerwona teksańska 1,2-diheksadekanoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina, sól trietyloamoniowa (Texas Red DHPE)ThermoFisher ScientificCat #: T1395MPmarkery fluorescencyjne membranowe
Fiolki na próbki stosowana jako narzędzie do analizy FCS Taśma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401(2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37(2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389(2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611(2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973(2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lipid Bilayer FormationLangmuir Blodgett TechniqueProtein ReconstitutionFluorescence Correlation SpectroscopyTIRF MicroscopyLiposome ExtrusionOPA1 Fusion AssayAsymmetric Lipid CompositionMembrane Tethering Analysis

Powiązane artykuły