Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.
Artykuł metodologiczny
Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dynamika mitochondriów jest niezbędna dla różnorodnych funkcji organelli i odpowiedzi komórkowych. Zatłoczona, przestrzennie złożona błona mitochondrialna jest trudnym środowiskiem do rozróżnienia czynników regulacyjnych. Eksperymentalna kontrola składników białkowych i lipidowych może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące regulacji. Jednak ilościowa manipulacja tymi czynnikami jest wyzwaniem w testach komórkowych. Aby zbadać molekularny mechanizm fuzji mitochondriów z błoną wewnętrzną, wprowadziliśmy platformę do rekonstytucji in vitro, która naśladuje środowisko lipidowe wewnętrznej błony mitochondrialnej. Tutaj opisujemy szczegółowe etapy przygotowania dwuwarstw lipidowych i odtworzenia białek błony mitochondrialnej. Platforma umożliwiła analizę produktów pośrednich w fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej oraz kinetyki poszczególnych przejść w sposób ilościowy. Protokół ten opisuje wytwarzanie dwuwarstw o asymetrycznym składzie lipidowym i opisuje ogólne rozważania dotyczące rekonstytucji białek transbłonowych w amortyzowaną dwuwarstwę. Metoda może być stosowana do badania innych systemów membranowych.
Wprowadzenie
Kompartymentyzacja błonowa jest cechą charakterystyczną komórek eukariotycznych1 (Rycina 1A). Błon biologiczne są coraz częściej postrzegane jako coś więcej niż dwuwymiarowy rozpuszczalnik i uznaje się je za środowisko odgrywające kluczową rolę w regulacji funkcji białek oraz montażu kompleksów makromolekularnych2,3. Endogenne lipidy są ligandami regulującymi aktywność białek błonowych3,4. Przestrzenna organizacja błon oraz zdolność do ich formowania w różnorodne kształty są istotnymi właściwościami fizycznymi warunkującymi nabywanie nowych funkcji3,5.
Platformy modelowych błon są systemami biomimetycznymi, które pomagają w zrozumieniu struktury, dynamiki i funkcji błon komórkowych6,7,8. Modelowe błony składają się zazwyczaj z mieszaniny lipidów o ściśle określonym składzie i zdefiniowanych właściwościach biofizycznych (sztywności, grubości i elastyczności). W połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym platformy modelowych błon umożliwiają ilościową analizę struktury i funkcji błony9,10,11. Strategie rekonstrukcji lipidowych dwuwarstw były wykorzystywane do badania fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE9,10, fuzji błon zapośredniczonej przez DNA12 oraz fuzji wirusowej11,13. Zaletą takich metod jest możliwość uzyskania informacji kinetycznych dotyczących etapów pośrednich poprzedzających obserwowalne zdarzenie reakcyjne14.
Błona plazmatyczna była szeroko badana z wykorzystaniem błon modelowych. Opracowano dwuwarstwy z separacją faz lipidowych w celu badania struktur tratw lipidowych, które są istotne w sygnalizacji komórkowej11,15,16. Mikrowzorowane płaskie dwuwarstwy lipidowe17,18 były wykorzystywane do badania organizacji receptorów komórkowych. Błony wsparte polimerem lub żelem stosowano jako systemy biomimetyczne do badania organizacji błona-cytoškielet, rozdziału białek błonowych podczas sygnalizacji komórkowej oraz migracji w miejscach kontaktów międzykomórkowych19.
Sztuczne systemy membranowe są również stosowane do badania organelli subkomórkowych20. Organelle charakteryzują się specyficzną morfologią, która tworzy odrębne mikrośrodowiska. Przykładem jest sieć retikulum endoplazmatycznego (ER). Po rekonstytucji retikulonów w liposomach powstają tubularne struktury membranowe o właściwościach zbliżonych do komórkowego ER21. Dodatek atlastyny, białka fuzyjnego ER, może indukować tworzenie sieci z tubularnych lipidów pochodzących z liposomów20. Jest to jeden z przykładów tego, jak proteoliposomy mogą dostarczyć funkcjonalnej wiedzy na temat morfologii i dynamiki organelli.
Fuzja i podział błon mitochondrialnych są niezbędne dla zdrowia populacji mitochondriów22,23,24,25. Zestaw GTPaz z rodziny dynaminy katalizuje fuzję błon mitochondrialnych. Mfn 1/2 katalizuje fuzję błony zewnętrznej. Opa1 pośredniczy w fuzji błony wewnętrznej26 (Ryc. 1B). Opa1 występuje w dwóch formach: długiej (l-Opa1), zakotwiczonej transbłonowo w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, oraz „rozpuszczalnej” formie krótkiej (s-Opa1), obecnej w przestrzeni międzybłonowej. Stosunek tych dwóch form Opa1 jest regulowany przez aktywność dwóch proteaz, Oma1 i Yme1L27,28,29,30. Ważne pytania dotyczące regulacji Opa1 obejmują to, w jaki sposób dwie formy Opa1 (krótka i długa) pośredniczą w fuzji błon oraz jak wygląda ich wzajemna interakcja regulacyjna28,29,31,32,33.
W niniejszej pracy opisujemy strategię rekonstytucji z sukcesem zastosowaną do badania fuzji wewnętrznej błony mitochondrialnej, która wyjaśniła role l- i s-Opa1 w tym procesie. Opracowaliśmy platformę naśladującą wewnętrzną błonę mitochondrialną, wykorzystującą dwuwarstwę lipidową przytwierdzoną do polimeru oraz unilamellarne pęcherzyki o rozmiarze 200 nm. Korzyści z zastosowania polimerowego wiązania pod dwuwarstwą lipidową obejmują następujące aspekty. Po pierwsze, chroni ono rekonstytuowane białko transbłonowe, które w przeciwnym razie mogłoby ulec destabilizacji z powodu bliskości szkiełka przedmiotowego34. Po drugie, tworzy ono grubą warstwę wody między dwuwarstwą lipidową a podłożem szklanym, co ułatwia badania otwierania się porów9, a po trzecie, wiskoelastyczna natura polimeru PEG umożliwia zmiany krzywizny błony35. Do charakterystyki etapów fuzji błon wykorzystaliśmy trójkolorowe obrazowanie fluorescencyjne (Rysunek 1C-F).
Rycina 1: Monitorowanie fuzji błon mitochondrialnych.
(A) Organella to komórkowe przedziały błonowe. (B) Kolejne etapy fuzji błon mitochondrialnych. Fuzja błony zewnętrznej mitochondriów jest katalizowana przez Mfn1 i/lub Mfn2, natomiast fuzja błony wewnętrznej jest mediowana przez Opa1. (C-F) Schemat platformy do rekonstrukcji in vitro służącej do badania fuzji błon mitochondrialnych. Platforma składa się z dwóch części: proteoliposomu i polimerowo związanej dwuwarstwy lipidowej, obie z zrekonstruowanym l-Opa1. znaczniki fluorescencyjne, w tym dwa różne fluorescencyjne barwniki błonowe i marker zawartości, pomagają rozróżnić etapy podczas fuzji błon. Dwa markery błonowe (Cy5-PE (czerwony) i TexasRed PE (pomarańczowy)) tworzą parę FRET, która może informować o bliskim dokowaniu błon. Dyfuzja TexasRed-PE znakującego proteoliposom jest wskaźnikiem demiksowania lipidów (hemifuzji). Uwalnianie zawartości jest monitorowane poprzez odgaszanie sygnału kalceiny (pokazany na zielono). Panele A i B zostały utworzone przy użyciu programu Biorender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Protokół
1. Przygotowanie mieszanin lipidowych
- Przygotować roztwór zapasowy lipidów poprzez rozpuszczenie 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholiny (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy (POPE), L-α-fosfatydyloinozytolu (Liver PI), kardiolipiny oraz 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (18:1 PEG2000 PE) w chloroformie do stężenia 25 mg/mL. Lipidy sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi (TexasRed DHPE i Cy5 DOPE) rozpuścić w chloroformie do stężenia 1 mg/mL. Roztwór lipidów przechowywać w bursztynowych fiolkach z wkładką odporną na chloroform, dodatkowo uszczelnionych taśmą z politetrafluoroetylenu. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
- Przygotować roztwory A i B.
- Zmieszać lipidy w celu przygotowania roztworu A (stężenie końcowe 1 mg/mL), który zawiera DOPC (52,8 mol%), POPE (20 mol%), Liver PI (7 mol%) i kardiolipinę (20 mol%) oraz 0,2 mol% fluoroforu.
- Przygotować roztwór B (stężenie końcowe 1 mg/mL) zawierający DOPC (47,8 mol%), POPE (20 mol%), Liver PI (7 mol%), kardiolipinę (20 mol%) i DOPE-PEG2000 (5 mol%) oraz 0,2 mol% fluoroforu.
- Przygotować mieszaninę lipidową, dodając wyliczoną objętość roztworu zapasowego do bursztynowych fiolek za pomocą strzykawki szklanej. Uzupełnić objętość końcową, dodając do fiolek dodatkowy chloroform.
UWAGA: W przypadku FCS (spektroskopii korelacyjnej fluorescencji) zmniejszyć udział lipidów sprzężonych z barwnikiem do 0,002 mol% i uzupełnić pozostałą część za pomocą DOPC.
2. Przygotowanie dwuwarstw lipidowych
- Wypalaj szkiełka nakrywkowe do mikroskopu w temperaturze 520 °C przez 30 min. Po wypalaniu ostudź szkiełka do temperatury pokojowej.
- Odważ około 10 g wodorotlenku sodu i dodaj do 500 mL metanolu podczas mieszania. Mieszaj przez 2 h, dodając wodorotlenek sodu do roztworu, aż zaczną pojawiać się osady. Przez cały proces należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE).
- Oczyść szkiełka szklane kolejno w 10% roztworze dodecylosiarczanu sodu, metanolu nasyconego wodorotlenkiem sodu oraz 50 mM kwasie solnym (sonikacja w kąpieli w każdym z tych warunków przez 30 min). Pomiędzy każdym etapem myj szkiełko w wodzie ultraczystej przez 10 min.
UWAGA: Choć wysoce zaleca się stosowanie świeżych roztworów do przygotowania szkiełek, każdy roztwór można wykorzystać do 5 razy lub w ciągu 1 miesiąca, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Przed każdym użyciem należy wymieszać roztwór. - Przechowuj oczyszczone szkiełka nakrywkowe szczelnie zamknięte w roztworze HCl do 2 tygodni, aby zapewnić dobrą jakość dwuwarstwy. W przypadku przechowywania w wodzie ultraczystej, użyj szkiełek w ciągu tygodnia.
- Oczyść korytko z politetrafluoroetylenu w systemie zanurzeniowym Langmuira-Blodgetta, używając chloroformu i wody ultraczystej, aż do momentu, gdy na korytku nie będzie obserwowanego zwilżania. Spryskaj powierzchnię korytka chloroformem, przetrzyj dokładnie chusteczkami celulozowymi 3 razy. Płucz wodą ultraczystą i usuń wodę za pomocą ssania. Powtórz 3 razy.
- Wypełnij korytko czystą wodą ultraczystą.
- Wyjmij 2 sztuki poddanych obróbce powierzchniowej szkiełek nakrywkowych z roztworu czyszczącego lub wody ultraczystej i płucz szkiełko wodą ultraczystą przez około 30 s.
- Umieść szkiełka nakrywkowe plecami do siebie. Użyj zacisku do podłoży, aby utrzymać szkiełka. Zanurz szkiełko poniżej powierzchni wody, klikając ręcznie „dipper down” w oprogramowaniu sterującym Langmuira.
- Wyzeruj wagę filmu, ostrożnie rozprowadzając Roztwór B kropla po kropli na granicy powietrze-woda (Rycina 2A). Upewnij się, że lipidy rozprzestrzeniają się tylko na granicy powietrze-woda, a krople chloroformu i lipidów nie opadają na dno powierzchni z politetrafluoroetylenu. Niezapewnienie tego doprowadzi do powstania lipidowego „kanału” i uniemożliwi formowanie się monowarstwy.
- Przestań dodawać lipidy, gdy odczyt z wagi filmu wyniesie około 15-20 mN/m, i odczekaj około 10-15 min. Uruchom kontroler bariery, aby zmienić powierzchnię, klikając „start experiments”, aż odczyt z wagi filmu osiągnie 37 mN/m. Utrzymuj ciśnienie przez około 20-30 min (Rycina 2B).
- Podnieś szkiełko nakrywkowe z prędkością 22 mm/min, utrzymując napięcie powierzchniowe na poziomie 37 mN/m. Monowarstwa lipidowa z kotwiczeniem polimerowym zostanie przeniesiona z granicy powietrze-woda na powierzchnię szkiełka nakrywkowego poprzez proces zanurzeniowy Blodgetta (Rycina 2C). Tworzy to dolną warstwę dwuwarstwy lipidowej.
- Oczyść granicę powietrze-woda za pomocą ssania i wypłucz korytko wodą ultraczystą.
- Przed użyciem oczyść szkiełko szklane z jedną studnią (np. szkiełko Shaefera), używając chloroformu, etanolu i wody ultraczystej. Umieść czyste szkiełko w korytku z wodą ultraczystą pod warstwą wody. Upewnij się, że studnia jest skierowana do góry w stronę granicy powietrze-woda i wlej świeżą wodę ultraczystą, aż szkiełko szklane zostanie całkowicie zakryte. Powtórz krok 2.8.
- Chwyć szkiełko nakrywkowe z monowarstwą lipidową z kroku 2.4 za pomocą silikonowej przyssawki (upewnij się, że strona z monowarstwą jest odwrócona od przyssawki), delikatnie dociśnij monowarstwę lipidową do granicy powietrze-woda, przytrzymaj szkiełko nakrywkowe przez około 2-3 s na granicy, a następnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka podłożowego (Rycina 2D). Wyjmij szkiełko razem ze szkiełkiem nakrywkowym.
UWAGA: Dwuwarstwa lipidowa będzie utrzymywana na powierzchni szkiełka nakrywkowego, skierowana w stronę obszaru zamkniętego między dwoma szkiełkami (Rycina 2E). - Przenieś szkiełko nakrywkowe z dwuwarstwą do mikroskopu epifluorescencyjnego. Wykonaj obrazowanie dwuwarstwy lipidowej. Jeśli zaobserwowano jednorodny rozkład barwnika lipidowego, przeprowadź fotowyblaknięcie małego obszaru dwuwarstwy przez 30 s, wyłącz źródło światła na około 30 s-1 min, a następnie ponownie wykonaj obrazowanie, aby zaobserwować regenerację. Dwuwarstwa lipidowa wykaże regenerację fluorescencji.
UWAGA: Membran z defektami lub słabą regeneracją fluorescencji nie należy używać w dalszych eksperymentach.
Rycina 2: Etapy tworzenia dwuwarstwy lipidowej przytwierdzonej do polimeru.
Etapy tworzenia dwuwarstw lipidowych z wykorzystaniem technik zanurzeniowej Langmuira-Blodgetta (A-C) oraz transferu Langmuira-Schaefera (D). (E) Końcowa struktura typu „kanapka” zawierająca dwuwarstwę lipidową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Rekonstytucja białek w polimerowej powiązanej dwuwarstwie lipidowej
- Przygotować naczynie do krystalizacji zawierające wodę ultrapure. Przygotować czysty pierścień do obrazowania mikroskopowego i umieścić go pod naczyniem.
- Zanurzyć w wodzie „kanapkę” złożoną z preparatu Schoenfera i szkiełka nakrywkowego zawierającą dwuwarstwę lipidową, delikatnie rozdzielić preparat Schoenfera i szkiełko nakrywkowe, chwycić szkiełko nakrywkowe od dołu, z dala od strony dwuwarstwy, przenieść szkiełko nakrywkowe do pierścienia do obrazowania i zamknąć pierścień.
UWAGA: Należy upewnić się, że szkiełko nakrywkowe z dwuwarstwą lipidową zawsze znajduje się w wodzie, a pierścień jest szczelnie zamknięty. - Zastąpić wodę ultrapure w pierścieniu do obrazowania buforem Bis-Tris NaCl, upewniając się, że dwuwarstwa lipidowa nie ma kontaktu z pęcherzykami powietrza. Dodać 1.1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside do dwuwarstwy lipidowej. Natychmiast dodać do pierścienia do obrazowania mieszaninę 1.2 x 10-9 M DDM oraz 1.3 x 10-12 mol oczyszczonego l-Opa136. Inkubować próbkę na wstrząsarce laboratoryjnej przy niskiej prędkości przez 2 h (Ryc. 3).
UWAGA: Rodzaj detergentów może się różnić w zależności od białka przeznaczonego do rekonstytucji. - Rozdzielić 30 mg kulek żywicy SM-2 w 3 mL buforu Bis-Tris i wstrząsnąć przed aplikacją. Za pomocą plastikowej pipety dodać 5~10 µL kulek żywicy SM-2 do pierścienia do obrazowania, inkubować przez 10 min, a następnie usunąć kulki żywicy poprzez płukanie. Końcowa objętość buforu w pierścieniu do obrazowania wynosi 1.5 mL.
Rycina 3: Procedura rekonstrukcji l-Opa1 w dwuwarstwie lipidowej przymocowanej do polimeru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Przygotowanie proteoliposomów
- Przygotować 1 mg mieszaniny lipidowej A w roztworze chloroformu. Odparować chloroform w strumieniu azotu przez 20 min, a następnie pozostawić w próżni przez noc w celu utworzenia filmu lipidowego.
- Przygotować bufor zawierający 50 mM kalceiny, rozpuszczając 15,56 g kalceiny w 50 mL 1,5 mol roztworu NaOH; mieszać w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia kalceiny, następnie dodać 12,5 mM Bis-Tris i uzupełnić wodą ultrapure do końcowej objętości 500 mL. Dostosować pH do 7,5.
- Zawiesić film lipidowy w buforze z kalceiną i w pełni nawodnić lipidy, podgrzewając zawiesinę w 65 ˚C przez 20 min. Liposomy o rozmiarze 200 nm utworzyć poprzez ekstruzję przy użyciu membrany poliwęglanowej.
- Dodać 2 µg l-Opa1 w 0,5 µM DDM do 0,2 mg liposomów i inkubować w 4 ˚C przez 1,5 h. Usunąć surfaktant poprzez dializę z użyciem kasety dializacyjnej 3,5 kDa przeciwko 250 ml buforu zawierającego 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl i 50 mM kalceiny w 4 ˚C przez noc, wymieniając bufor dwukrotnie.
- Usunąć nadmiar kalceiny za pomocą kolumny odsalającej PD-10.
5. Obrazowanie i analiza danych
- Nabyć obrazy TIRF, korzystając z obiektywu imersyjnego olejowego 100x (N.A 1.4). Do analizy liposomów i proteoliposomów znakowanych TexasRed-PE oraz enkapsulujących kalceinę należy użyć laserów 543 nm i 488 nm. Do analizy Cy5-PE wbudowanego w płaską dwuwarstwę lipidową należy użyć lasera 633 nm.
- Ustawić kąt TIRF przy użyciu dwuwarstwy lipidowej, aby uzyskać maksymalną emisję. Jakość dwuwarstwy lipidowej po rekonstytucji jest obserwowana za pomocą obiektywu olejowego 100x w temperaturze 25 °C. Współczynnik dyfuzji fosfolipidów i zrekonstytuowanej dwuwarstwy jest wyznaczany metodą FCS zgodnie z protokołem opisanym w innym miejscu37.
- Dodać 10 µL proteoliposomów o stężeniu 2 mg/mL do pierścienia obrazowania i odczekać 10 min przed wykonaniem obrazowania. Do pierścienia reakcyjnego dodaje się GTP, GMPPCP lub GDP wraz z 1 mM MgCl2 i 1 mM nukleotydu.
- Aby określić wpływ s-Opa1 na fuzję błon, przeprowadzić miareczkowanie s-Opa1 do próbki proteoliposomów/dwuwarstwy wspieranej zawierającej l-Opa1, a następnie zarejestrować zdarzenia fuzji.
- Jednoczesne obrazowanie TexasRed-DHPE i kalceiny jest realizowane za pomocą systemu rozdzielania wiązki. Lasery 488 nm i 543 nm są jednocześnie kierowane na próbkę jako źródła wzbudzenia fluorescencyjnego. Światło emisji jest następnie dzielone za pomocą rozdzielacza wiązki 560 nm. Rozdzielone światło emisji jest filtrowane przez filtr 510 nm o szerokości pasma 42 nm oraz filtr 609 nm o szerokości pasma 40 nm. Przefiltrowana wiązka jest rzutowana na dwa sąsiednie obszary matrycy kamery.
- Emisję fluorescencyjną rejestruje się jednocześnie poprzez filtr emisyjny 609 nm o szerokości pasma 40 nm oraz filtr emisyjny 698 nm o szerokości pasma 70 nm. System mikroskopowy jest wyposażony w kamerę CMOS utrzymywaną w temperaturze -10 °C.
- Identyfikację cząsteczek liposomów można przeprowadzić przy użyciu algorytmu rozpoznawania cząstek opartego na rozkładzie Gaussa. Rozkład i intensywność cząstek są analizowane kanał po kanale. Sygnał dwuwarstwy lipidowej jest wykorzystywany jako maska do izolacji cząstek.
Wyniki
Zrekonstytuowane białko transbłonowe dyfunduje swobodnie i jest homogenicznie rozłożone w błonie.
Przykładowe obrazy dwuwarstwy lipidowej oraz potwierdzenie jej płynności za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej przedstawiono na Ryc. 4. Rozkład lipidów w dwuwarstwie przed i po fotobieleniu pokazano na Ryc. 4A,B. Homogeniczność dwuwarstwy lipidowej zwizualizowano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przed i po rekonstytucji (Ryc. 4D,E). Rekonstytucję białka l-Opa1 w dwuwarstwie lipidowej potwierdzono za pomocą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS). Do oceny dyfuzyjności lipidów w dwuwarstwie zastosowano lipidy koniugowane z barwnikiem. Rekonstytuowane białko Opa1 oznakowano za pomocą przeciwciała anty-Opa1 przeciwko końcowi C z tagiem fluorescencyjnym. Dyfuzję lipidów w dwuwarstwie zmierzono na poziomie 1,46 ± 0,12 μm2/s, natomiast współczynnik dyfuzji zrekonstytuowanego w dwuwarstwie białka l-Opa1 wyniósł 0,88 ± 0,10 μm2/s. Odczyt intensywności z krzywych FCS wskazał, że 75% l-Opa1 zostało zrekonstytuowanych w dwuwarstwie lipidowej (Ryc. 4G,H). Wyniki te sugerują, że l-Opa1 swobodnie dyfunduje w zakotwiczonej w polimerze dwuwarstwie lipidowej, wykazując potencjał do samoorganizacji w kompleksy funkcjonalne.
Rycina 4: Rozkład lipidów i zrekonstytuowanego białka w błonie modelowej.
(A-C) Przykładowe obrazy dwuwarstwy lipidowej oraz walidacja jej płynności za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. (A) Homogeniczny rozkład lipidów w dwuwarstwie przed fotowyblakaniem. (B) Migawka bezpośrednio po fotowyblakaniu. (C) Obraz dwuwarstwy po powrocie fluorescencji wskazujący na dobrą płynność lipidową błony po rekonstytucji. (D,E) Reprezentatywne obrazy rozkładu lipidów przed (D) i po (E) rekonstytucji l-Opa1 wskazujące, że proces rekonstytucji nie spowodował defektów w dwuwarstwie. Reprezentatywny obraz TIRF l-Opa1 znakowanego przeciwciałem sprzężonym z Alexa 488 (F) wykazujący homogeniczny rozkład Opa1 po rekonstytucji. G. Reprezentatywne surowe zliczenia fotonów sygnału l-Opa1 otrzymane za pomocą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji. W próbie kontrolnej l-Opa1 nie został zrekonstytuowany w dwuwarstwie, natomiast dodano i wypłukano przeciwciało. Dyfuzja l-Opa1 jest znacznie wolniejsza niż lipidów w błonie, co jest zgodne z pomyślną rekonstytucją transbłonowego l-Opa1 (H). Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Stopniowe wygaszanie fluorescencji (step bleaching) wykazało, że w danym liposomie zrekonstytuowano średnio 2-3 kopie l-Opa1 (Rysunek 5A,B). Rozkład wielkości zrekonstytuowanych proteoliposomów Opa1 został sprawdzony po rekonstytucji za pomocą DLS (Rysunek 5C). Rekonstytucja Opa1 w proteoliposomach została również zweryfikowana przy użyciu FCS. Współczynnik dyfuzji wolnego przeciwciała wynosił 164 ± 22 μm2/s; współczynnik dyfuzji liposomów znakowanych barwnikiem lipidowym wynosił 2,22 ± 0,33 μm2/s, a współczynnik dyfuzji proteoliposomów l-Opa1 związanych z przeciwciałem anty-His znakowanym TexasRed wynosił 2,12 ± 0,36 μm2/s.
Rysunek 5: Wytwarzanie i charakterystyka proteoliposomów.
(A) Etapy wytwarzania proteoliposomów z enkapsulowaną, wygaszoną kalceiną. (B) Reprezentatywne dane fluorescencyjnego stopniowego wybielania (step-bleaching) wskazują na średnio 2-3 kopie l-Opa1 wbudowane w liposom. (C) Reprezentatywne rozkłady wielkości proteoliposomów (czerwony) bez nukleotydów 1 h po inkubacji z GTP (zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wykrywanie powiązań błonowych, demiksowania lipidów/hemifuzji oraz otwierania się porów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Tethering błony monitoruje się poprzez obserwację sygnału TexasRed na powierzchni lipidowej dwuwarstwy przy użyciu mikroskopii TIRF (Rysunek 6A). Zachowanie demiksowania lipidów błonowych (hemifuzja) monitorowano za pomocą TexasRed, gdy barwnik dyfunduje z liposomów do lipidowej dwuwarstwy. Odquenching kalceiny pomaga odróżnić tworzenie pełnego poru fuzyjnego od samego demiksowania lipidów. Pozwala to na porównanie warunków, w których cząsteczki zatrzymują się na etapie hemifuzji (Rys. 6B), z cząsteczkami, które przechodzą do pełnej fuzji (Rysunek 6C).
Przymocowanie błon (membrane tethering) objawia się stabilnym sygnałem lipidowym z liposomów. Odległość można ocenić na podstawie sygnału FRET pomiędzy znacznikami obu błon36. Sygnał hemifuzji charakteryzuje się brakiem odgaszania (dequenching) sygnału kalceiny (Rysunek 6B, dolny rząd), natomiast szybki spadek sygnału TexasRed wskazuje na dyfuzję barwnika do dwuwarstwy lipidowej (Rysunek 6B, górny rząd). Pełna fuzja (z otwarciem poru) charakteryzuje się zarówno spadkiem sygnału lipidowego, jak i uwalnianiem zawartości (Rysunek 6C). Intensywność TexasRed oraz intensywność kalceiny mogą być monitorowane w funkcji czasu, aby dostarczyć ilościowych szczegółów dotyczących kinetyki fuzji błon36.
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki pokazujące przytwierdzanie cząsteczek (A, pasek skali 10 µm), hemifuzję (B, pasek skali 0.5 µm) oraz fuzję (C, pasek skali 0.5 µm).
(A) Proteoliposomy przytwierdzone do dwuwarstwy lipidowej z rekonstytuowanym białkiem Opa1 przed dodaniem GTP. (B) Przykład hemifuzji. Górny rząd w B pokazuje demiksowanie lipidów (sygnał TexasRed, czerwony), dolny rząd w B pokazuje brak uwalniania zawartości (sygnał kalceiny, zielony) w tych warunkach. (C) Reprezentatywny przebieg fuzji proteoliposomu z dwuwarstwą lipidową. Uwalnianie zawartości można zaobserwować na obrazach w dolnym rzędzie, pokazujących zniesienie wygaszania fluorescencji kalceiny (dolny rząd, zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Systemy modelowo-membranowe in vitro mogą opisywać złożone procesy membranowe w ściśle określonych warunkach. Systemy te potrafią rozróżniać minimalne składniki niezbędne do złożonych procesów molekularnych w celu ujawnienia mechanizmów molekularnych 6,15,20,38. W przypadku białek błonowych liposomy i dwuwarstwy podparte planarnie są powszechnymi systemami rekonstytucji. W przeciwieństwie do dwuwarstw lipidowych na podłożu stałym, poduszka polimerowa między podłożem a błoną podpartą w dwuwarstwach na uwięzi polimerowej umożliwia swobodną mobilność dużych białek błonowych, a białka transbłonowe dyfundują i gromadzą się swobodnie34. Te cechy pomogły nam zbadać kinetykę fuzji mitochondriów z błoną wewnętrzną36.
Przygotowaliśmy dwuwarstwę lipidową na uwięzi polimerowej przy użyciu technik Langmuira-Blodgetta/Langmuira-Schaefera (LB/LS). Dzięki temu możemy przygotować dwuwarstwę z asymetrycznymi składnikami lipidowymi. Błony komórkowe mają asymetryczny skład listków, a podejście LB/LS pozwala na badanie takich dwuwarstw. Dzięki transferowi Schaefera całe szklane podłoże może być pokryte dwuwarstwą lipidową. Bardzo ważne jest przygotowanie czystej powierzchni do przygotowania dwuwarstwowego. Dodatkowo, aby prawidłowo wykonać transfer Schaefera, potrzebna jest praktyka. Nieudany transfer Schaefera może spowodować niepożądane defekty w dwuwarstwie lipidowej. W tym protokole ciśnienie dodane do balansu folii ma zastosowanie do dwuwarstwy zawierającej 20% kardiolipiny. W przypadku dwuwarstw z innymi składnikami należy zapoznać się z izotermą powierzchni nacisku i powierzchni kluczowych składników. Alternatywną metodą jest metoda fuzji Langmuira-Blodgetta/pęcherzyków (LB/VF), w której dolna monowarstwa lipidowa jest przenoszona z granicy faz powietrze-woda koryta Langmuira na czyste podłoże, a następnie liposomy łączą się z górną częścią podpartej monowarstwy lipidowej i tworzą końcową dwuwarstwę39. Rekonstytucja białek błonowych przy użyciu metody LB/VF jest prostsza niż LB/LS, ponieważ rekonstytucję można przeprowadzić poprzez fuzję proteoliposomów. Jednak fuzja pęcherzyków wymaga dodania nadmiaru liposomów, co może skomplikować badanie zdarzeń błonowych zależnych od zależnych od stężenia interakcji białko-białko.
Pomyślne odtworzenie białek transbłonowych zarówno w dwuwarstwach lipidowych na uwięzi polimerowej, jak i w liposomach w preferowanej orientacji funkcjonalnej jest ważne, ale trudne do wyegzekwowania. Aby to uwzględnić, potrzebne są kontrole eksperymentalne. W przypadku dwuwarstw lipidowych na uwięzi polimerowej ważne jest również zachowanie integralności dwuwarstwy lipidowej podczas rekonstytucji. Stężenia środków powierzchniowo czynnych muszą być utrzymywane na stosunkowo niskim poziomie, aby zapobiec rozpuszczeniu dwuwarstwy lipidowej, ale wystarczająco wysokim, aby zapobiec denaturacji białka będącego przedmiotem zainteresowania37,40. Opisana tutaj metoda jest idealna do odtwarzania białek błonowych do badań pojedynczych cząsteczek, ale niekoniecznie jest skalowalna do badań na większą skalę. Kolejną ważną kwestią jest wybór środka powierzchniowo czynnego. Często dobrym punktem wyjścia jest środek powierzchniowo czynny używany do oczyszczania i przechowywania. Maksymalne stężenie środka powierzchniowo czynnego jest zwykle ~200 razy mniejsze niż CMC36, w zakresie, w którym środek powierzchniowo czynny utrzymuje stabilność białka i zapobiega agregacji białek, zachowując jednocześnie integralność błony36. Można rozważyć koktajle zawierające 2 lub 3 środki powierzchniowo czynne. Do rozpuszczenia w liposomach nie jest konieczne niskie stężenie środka powierzchniowo czynnego. Jednak stężenia środków powierzchniowo czynnych poniżej CMC są preferowane w celu utrzymania jednolitej wielkości i rozkładu morfologii liposomów. Aby zapobiec wyciekowi barwnika zawartości, konieczne jest dializowanie w buforze zawierającym barwnik.
W przeciwieństwie do testów fuzji opartych na liposomach, stworzona przez nas platforma zapewnia podejście do badania kinetyki każdego etapu fuzji membranowej. Metoda ta daje możliwość badania transbłonowych białek fuzyjnych w warunkach zbliżonych do natywnych. Modelowe platformy błonowe mogą być stosowane do badania składania i oligomeryzacji białek błonowych, "rzeźbienia" błony i interakcji białko-lipid białek w środowiskach subkomórkowych, takich jak wewnętrzna błona mitochondrialna. Metoda ta pozwala również na badanie ważnych warunków fizjologicznych we wzajemnym oddziaływaniu błona-białko, takich jak asymetria składu dwuwarstwowego. Rola kluczowego lipidu mitochondrialnego, kardiolipiny, we właściwościach dwuwarstwowych zarówno liposomów, jak i dwuwarstw wspieranych przez polimery, pozostaje do określenia. Właściwości takie jak siła jonowa, grubość błony, sztywność błony, krzywizna błony i właściwości elastycznej lepkości błony mogą wpływać na zdolność białek do łączenia się w określone stany funkcjonalne. Przyszłe badania z kreatywnym zastosowaniem modelowych systemów błonowych mają potencjał, aby odkryć nowe aspekty organizacji i funkcji białek błonowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Charlesa H. Hooda za Nagrodę za Badania nad Zdrowiem Dzieci oraz hojne wsparcie ze strony Wydziału Biologii Molekularnej w Massachusetts General Hospital.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(cyjanina 5) | Avanti polarny lipid | Kat #: 810335C1mg | membranowe markery fluorescencyjne |
| 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | cząsteczki lipidów |
| 1',3'-bis[1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol (sól sodowa) | Avanti Polar lipidy | Kat #: 710335P | cząsteczki lipidowe |
| 18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Kat #: 850375P | cząsteczki lipidów |
| 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina | Avanti Polar lipidy | Kat #: Cząsteczki lipidowe 850757P | |
| Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
| Bursztynowa fiolka z wkładką PTFE | Fisher scientific | 14-955-332 | do przechowywania lipidów rozwiązania |
| Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Identyfikator substancji: 24892279 | barwnik fluorescencyjny |
| Chloroform | Fisher scientific | 298-500 / C295-4 | Chloroform marki Fisher jest zwykle dość niezawodny w przypadku prac lipidowych. |
| Szkiełko wklęsłe (1 dołek) | Mikroskopia elektronowa Science | 71878-05 | Schaefer Slide |
| Narzędzie programowe | Smith Lab, University of Akron | ||
| Fidżi / ImageJ | Narzędzie programowe | Fiji | SCR_002285 |
| Okulary ochronne Fisherbrand: Koła | Fisher scientific | 12-545-102 | Szkło nakrywkowe dla dwuwarstw lipidowych na stałym nośniku, pozycja jest obecnie wycofana z produkcji, ponieważ autorzy przygotowali manuskrypt. Alternatywą jest szkło nakrywkowe premium marki Fisher o numerze katalogowym: 12-548-5M |
| GTP Sól disodowa | SIGMA-ALDRICH INC | Kat #: 10106399001 | |
| Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
| L-&alfa;-lizofosfatydyloinozytol (wątroba, bydło) (sól sodowa) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | cząsteczki lipidów |
| Mini wytłaczarka | Avanti Polar lipids | 610020 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Kot #: D310 25 GM | środek powierzchniowo czynny do rekonstytucji |
| n-oktylo-&alfa;-D-glukopiranozyd | Anatrace | Kat #: O311HA 25 GM | środek powierzchniowo czynny do rekonstytucji |
| Membrany PC 0,2μ | m Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Rabbit Przeciwciało anty-Opa1 | NOVUS BIOLOGICALS | Kat #: Przeciwciało NBP2-59770 | do wykrywania C-końca Opa1 |
| Slidebook | Inteligentne obrazowanie | RRID: SCR_014300 | narzędzie programowe |
| uszczelniająca z gwintem teflonowym | Fisher Scientific | NC0636085 | taśma taflonowa do przechowywania próbek |
| Czerwona teksańska 1,2-diheksadekanoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina, sól trietyloamoniowa (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | markery fluorescencyjne membranowe |
Bibliografia
- Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
- Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
- Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
- Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
- Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
- Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401(2016).
- Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37(2011).
- Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389(2014).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
- Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
- Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
- Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
- Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
- Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611(2019).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
- Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
- Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
- Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
- Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
- Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
- DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
- Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
- Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
- Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973(2020).
- Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
- Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
- Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).
Przedruki i uprawnienia
