Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Streszczenie

Rozwój preparatów dla transgenicznych bezkręgowców, w których aktywność określonych zestawów neuronów może być rejestrowana i manipulowana za pomocą światła, stanowi rewolucyjny postęp w badaniach nad neuronalnymi podstawami zachowania. Jednak wadą tego rozwoju jest tendencja do skupiania badaczy na bardzo małej liczbie organizmów "zaprojektowanych" (np. C. elegans i Drosophila), co potencjalnie negatywnie wpływa na prowadzenie badań porównawczych wśród wielu gatunków, co jest potrzebne do określenia ogólnych zasad funkcjonowania sieci. Niniejszy artykuł ilustruje, w jaki sposób zapis optyczny z barwnikami wrażliwymi na napięcie w mózgach nietransgenicznych gatunków ślimaków może być wykorzystany do szybkiego (tj. w trakcie trwania pojedynczych eksperymentów) ujawnienia cech funkcjonalnej organizacji ich sieci neuronowych z rozdzielczością pojedynczej komórki. Szczegółowo opisujemy metody preparacji, barwienia i rejestrowania stosowane przez nasze laboratorium w celu uzyskania śladów potencjału czynnościowego od dziesiątek do ~ 150 neuronów podczas behawioralnie istotnych programów motorycznych w OUN wielu gatunków ślimaków, w tym jednego nowego w neurobiologii – ślimaka nagoskrzelnego Berghia stephanieae. Obrazowanie odbywa się za pomocą barwników wrażliwych na napięcie absorpcyjne i 464-elementowego układu fotodiod, który próbkuje z prędkością 1600 klatek na sekundę, wystarczająco szybko, aby uchwycić wszystkie potencjały czynnościowe generowane przez zarejestrowane neurony. Na jeden preparat można uzyskać wiele kilkuminutowych nagrań z niewielkim lub zerowym wybielaniem sygnału lub fototoksycznością. Surowe dane optyczne zebrane za pomocą opisanych metod mogą być następnie analizowane za pomocą różnych ilustrowanych metod. Nasze podejście do rejestracji optycznej może być z łatwością wykorzystane do badania aktywności sieci u różnych gatunków nietransgenicznych, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań porównawczych nad tym, jak mózg generuje zachowanie.

Wprowadzenie

Rozwój transgenicznych linii bezkręgowców, takich jak Drosophila i C. elegans, dostarczył potężnych systemów, w których neuronalne podstawy zachowania mogą być optycznie badane i manipulowane. Jednak te specjalne preparaty mogą mieć tę wadę, że zmniejszają entuzjazm dla badań nad obwodami neuronalnymi gatunków nietransgenicznych, szczególnie w odniesieniu do wprowadzania nowych gatunków do badań neurobiologicznych. Skupianie się wyłącznie na jednym lub dwóch systemach modelowych jest szkodliwe dla poszukiwania ogólnych zasad działania sieci, ponieważ badania porównawcze stanowią istotną drogę, dzięki której takie zasady są odkrywane^1,2,3,4. Naszym celem jest zademonstrowanie podejścia do obrazowania na dużą skalę w celu uzyskania szybkiego wglądu w strukturę funkcjonalną sieci neuronowych ślimaków, w celu ułatwienia badań porównawczych funkcji sieci neuronowych.

Ślimaki, takie jak Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea i inne, od dawna są wykorzystywane do badania zasad funkcjonowania sieci neuronowych, głównie dlatego, że ich zachowania są zapośredniczone przez duże, często indywidualnie identyfikowalne neurony znajdujące się na powierzchni zwojów, co czyni je łatwo dostępnymi dla technik nagrywania⁵. W latach siedemdziesiątych XX wieku opracowano barwniki wrażliwe na napięcie (VSD), które mogą integrować się z błoną plazmatyczną, co wkrótce umożliwiło pierwsze bezelektrodowe zapisy potencjałów czynnościowych generowanych przez wiele neuronów⁶. Tutaj pokazujemy nasze zastosowanie VSD do badania aktywności sieciowej u kilku gatunków ślimaków, w tym jednego nowego w neurobiologii, Berghia stephanieae. Urządzenie do obrazowania to dostępny na rynku 464-elementowy układ fotodiod (PDA), który próbkuje z prędkością 1600 klatek na sekundę (Rysunek 1), która, gdy jest używana z VSD o dużej absorbancji, ujawnia potencjały czynnościowe wszystkich zarejestrowanych neuronów⁷. Sygnały zarejestrowane przez wszystkie diody są wyświetlane natychmiast po akwizycji i nakładane na obraz zwoju w oprogramowaniu do akwizycji PDA, co umożliwia badanie interesujących neuronów za pomocą ostrych elektrod w tym samym preparacie^8,9.

W surowych danych PDA, wiele diod redundantnie rejestruje większe neurony, a wiele z nich zawiera również mieszane sygnały z wielu neuronów. Punktem zwrotnym było opracowanie zautomatyzowanej metody sortowania impulsów wykorzystującej niezależną analizę komponentów do szybkiego przetwarzania każdego surowego 464-kanałowego zestawu danych PDA na nowy zestaw śladów, w którym każdy zarejestrowany neuron pojawia się w osobnym śladzie zawierającym tylko jego potencjały czynnościowe^10,11.

W tym artykule opisujemy podstawowe kroki związane z uzyskaniem dużych zapisów potencjału czynnościowego z układów nerwowych ślimaków za pomocą układu fotodiodowego i szybkich absorbancji VSD. Ponadto ilustrujemy metody analityczne, które mogą być wykorzystane do grupowania i mapowania optycznie zarejestrowanych neuronów w odniesieniu do ich funkcjonalnych zespołów, oraz do charakteryzowania cech na poziomie populacji, które często nie są widoczne poprzez prostą inspekcję Ślady wypalania ^12,13.

Protokół

UWAGA: Opisany poniżej proces pracy jest podsumowany w Rysunek 2.

1. Minimalizacja wibracji

1. Jeśli to możliwe, upewnij się, że platforma znajduje się na parterze i użyj stołu izolacyjnego opartego na sprężynie, który tłumi szerszy zakres częstotliwości drgań niż stoły powietrzne.
2. Jeśli używasz stołu opartego na sprężynie, upewnij się, że jest on pływający (należy go regulować za każdym razem, gdy dodaje się lub zdejmuje coś ze stołu).
3. Zmniejsz hałas spowodowany wibracjami w pomieszczeniu do obrazowania tak bardzo, jak to możliwe, nawet do tego stopnia, że w razie potrzeby odciąć przepływ powietrza podczas obrazowania. Zminimalizuj wszelkie wibracje wynikające z turbulencji płynu w systemach perfuzyjnych.
   UWAGA: Preparat neuronalny nie może się poruszać podczas akwizycji. Wszelkiego rodzaju ruchy powodują przesunięcia krawędzi kontrastu w poprzek diod, co prowadzi do sztucznych sygnałów. Jeśli zabieg obejmuje bodziec podczas akwizycji, nie może on wywoływać ruchów preparacji.

2. Uruchom test otworkowy, aby umożliwić prawidłowe wyrównanie zdjęć ganglionów z danymi PDA

1. Umieść kawałek folii aluminiowej z wbitymi w nią 3 małymi otworami na szkiełku mikroskopowym. Zrób zdjęcie trzech otworów aparatem cyfrowym zamontowanym na parafokalnym fotoportie.
2. Korzystając z oprogramowania do obrazowania dołączonego do palmtopa, uzyskaj krótki plik (np. 5 s). W trakcie akwizycji dotknij stołu, aby wywołać artefakty drgań, które będą bardzo widoczne wokół krawędzi otworków, co pozwoli na precyzyjne wyrównanie obrazu otworków z danymi optycznymi.
3. Użyj funkcji Superimpose w oprogramowaniu do obrazowania, która znajduje się w punkcie menu "Wyświetlacz | Nakładanie strony | Nakładanie śladów z obrazem zewnętrznym | Nałóż obraz", aby nałożyć dane diody na zdjęcie otworków, a następnie iteracyjnie dostosuj ustawienia x, y i powiększenia dla zdjęcia, aż otworki znajdą się bezpośrednio na artefaktach otworkowych w danych diody.
   1. Zapisz te liczby, aby wyrównać obrazy przygotowawcze wykonane aparatem z danymi diody w przyszłych eksperymentach.
      UWAGA: Wyrównanie otworkowe PDA należy wykonać tylko raz po zamontowaniu PDA na mikroskopie, aż do jego obrócenia lub usunięcia, po czym należy to zrobić ponownie.

3. Sekcje trzech gatunków ślimaków morskich

1. W przypadku gatunków, które osiągają duże rozmiary, takich jak Tritonia i Aplysia, zacznij od mniejszych osobników, które mają cieńsze, mniej nieprzezroczyste zwoje, co ułatwia uzyskanie wystarczającej ilości światła dla optymalnego stosunku sygnału do szumu.
2. Przygotuj przefiltrowaną sztuczną wodę morską, która będzie używana jako sól fizjologiczna do sekcji i eksperymentów obrazowych.
   UWAGA: We wszystkich kolejnych krokach protokołu "sola" oznacza sztuczną wodę morską.
3. Rozwarstwienie Tritonia diomedea
   1. Umieść zwierzę w lodówce na około 20 minut, aby je znieczulić.
   2. W przypadku większych zwierząt należy odsłonić mózg, trzymając zwierzę w jednej ręce, pozwalając, aby koniec głowy układał się na palcu wskazującym, aby odsłonić "szyję". W przypadku mniejszych zwierząt przypnij je grzbietową stroną do góry w wyłożonym woskiem naczyniu preparacyjnym przed odsłonięciem mózgu.
   3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 3-4 cm nacięcie w linii środkowej po grzbietowej stronie zwierzęcia, powyżej masy policzkowej (którą można wyczuć przez ścianę ciała).
      UWAGA: Potrzebna część OUN, składająca się ze zrośniętych, obustronnych zwojów mózgowo-opłucnowych i pedałowych, jest pomarańczowa i różni się wyglądem od otaczającej tkanki; Leży bezpośrednio za nosorożcami i na szczycie masy policzkowej.
   4. Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, zachowując nienaruszone wszystkie nerwy łączące środkowe zwoje. Pozostaw długi odcinek nerwu pedału 3 (PdN3) lub innego nerwu, który będzie stymulowany.
   5. Użyj maleńkich szpilek, aby przymocować OUN do dna naczynia wyłożonego elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną w celu dalszej sekcji. Utrzymuj temperaturę przygotowania na poziomie 11 °C, przetapiając naczynie solą fizjologiczną dostarczaną za pomocą sterowanego sprzężeniem zwrotnym, liniowego systemu chłodzenia Peltiera za pomocą pompy perystaltycznej.
   6. Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji ostrożnie usuń luźno przylegającą warstwę tkanki łącznej z okolic OUN. Pozostaw cienką osłonkę ściśle przylegającą do zwojów.
   7. Krótko (~10 s) zanurz zwoje w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej. Umieść zwoje nerwowe z powrotem w naczyniu wyłożonym elastomerem z perfuzją soli fizjologicznej, pozwalając soli fizjologicznej zmyć aldehyd glutarowy przed rozpoczęciem barwienia VSD.
      UWAGA: To lekkie utrwalenie tkanki łącznej i jej wewnętrznych mięśni pomoże zapobiec ruchowi podczas obrazowania.
4. Sekcja Aplysia californica
   1. Znieczulić zwierzę o wadze około 40 g, wstrzykując ~20 ml 350 mM MgCl₂ do organizmu przez powierzchnię brzuszną (stopę).
   2. Użyj szpilek, aby ustawić zwierzę brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym woskiem.
   3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 2-3 cm nacięcie w linii środkowej wzdłuż najbardziej przedniej części stopy. Przygnij płaty stopy po obu stronach nacięcia, aby odsłonić część OUN i masę policzkową.
      UWAGA: Potrzebna część OUN, składająca się ze zrośniętych zwojów mózgowych i ściśle przylegających, obustronnych zwojów opłucnej i pedału, jest żółto-pomarańczowa i różni się wyglądem od otaczającej tkanki; Znajduje się grzbietowo i tylno-bocznie w stosunku do bulwiastej mięśniowej masy policzkowej.
   4. Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie wypreparować masę policzkową, odsłaniając zwoje mózgowe.
   5. Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, zachowując nienaruszone wszystkie nerwy łączące środkowe zwoje. Pozostaw długi odcinek nerwu pedału 9 (PdN9) lub innego nerwu, który będzie stymulowany.
   6. Użyj maleńkich szpilek, aby umieścić CNS w naczyniu wyłożonym elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną. Utrzymuj temperaturę przygotowania na poziomie 15-16 °C, przetapiając naczynie solą fizjologiczną przechodzącą przez urządzenie chłodzące Peltiera.
   7. Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji usuń nadmiar tkanki łącznej z OUN i wypreparuj powierzchowną część osłonki na zwoju lub zwojach, które mają być zobrazowane. Uważaj podczas tego procesu, aby nie zrobić w osłonce, co spowodowałoby wylanie się neuronów ze środka.
   8. Krótko (~20 s) zanurzyć zwoje w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej. Umieść zwoje nerwowe z powrotem w naczyniu wyłożonym elastomerem przesyconym solą fizjologiczną, pozwalając soli fizjologicznej zmyć aldehyd glutarowy przed rozpoczęciem barwienia VSD.
5. Preparacja Berghia stephanieae
   1. Umieść zwierzę w lodówce na około 20 minut, aby je znieczulić.
   2. Używając naczynia wyłożonego elastomerem wypełnionego solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej, umieść drobne szpilki zarówno w głowie, jak i ogonie.
   3. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji wykonaj 5-7 mm nacięcie grzbietowe powierzchowne do OUN.
      UWAGA: Oczy, ciemne plamy, które znajdują się w zwierzęciu obok OUN, wygodnie zaznaczają położenie potrzebnej części OUN, która składa się z obustronnie zrośniętych zwojów mózgowo-opłucnowych i pedałowych i znajduje się na szczycie masy policzkowej.
   4. Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji. Pozostaw stymulowany nerw wystarczająco długo, aby elektroda ssąca mogła zostać potwierdzona.

4. Zabarwić preparat barwnikiem wrażliwym na napięcie.

1. Przygotować roztwory podstawowe RH155 (znanego również jako NK3041) lub RH482 (znanego również jako NK3630 lub JPW1132).
   1. RH155: Rozpuścić 5,4 mg stałego barwnika w 1 ml 100% EtOH, pipetując 29 μl do każdej z 34 probówek do mikrowirówek. Mając zawartość każdej tubki wystawioną na działanie powietrza, pozostaw ją do wyschnięcia przez noc w ciemności. Zakryć i umieścić otrzymane stałe porcje RH155, z których każdy zawiera 0,15 mg, w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
   2. RH482: Rozpuścić 2 mg stałego barwnika w 100 μl DMSO, podzielić roztwór na 20 porcji po 5 μl, z których każda zawiera 0,1 mg RH482 i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W przypadku Tritonia i Aplysia, w celu załadowania VSD RH155 do błon neuronów w preparacie można zastosować perfuzję w kąpieli lub aplikację ciśnieniową. Zastosowanie ciśnienia ma tę zaletę, że tylko ganglion, który jest obrazowany, jest wystawiony na VSD.
2. W celu perfuzji w kąpieli dodać 5 ml soli fizjologicznej do każdej z dwóch powyższych porcji stałego RH155 i przetoczyć wir do roztworu, otrzymując połączony roztwór 10 ml zawierający 0,03 mg/ml RH155.
   1. Perfuzja w ciemności (w celu uniknięcia fotowybielania) przez 1 do 1,5 godziny w temperaturze 11 °C dla Tritonii i w temperaturze 16 °C dla Aplysia. Utrzymuj temperaturę, przepuszczając roztwór perfuzyjny przez układ chłodzenia Peltiera.
3. W przypadku aplikacji ciśnieniowej dodać 500 μl soli fizjologicznej do jednej podwielokrotności RH155 i odwirować, aby uzyskać stężenie barwnika 0,3 mg/ml.
   1. Pobrać około 200 μl roztworu do rurki polietylenowej za pomocą ręcznego mikrodozownika, upewniając się, że średnica probówki jest dobrze dopasowana do średnicy ganglionu, który ma być zabarwiony.
   2. Użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie umieścić koniec rurki nad docelowym ganglionem, opuszczając go, aż utworzy ciasne uszczelnienie na ganglionie. Użyj opisanego powyżej typu układu chłodzenia, aby utrzymać zwoje w żądanej temperaturze.
   3. Przyciemnij światła w pomieszczeniu, aby uniknąć fotowybielania i obracaj pokrętło aplikatora mikrodozownika co 5 minut, aby wcisnąć więcej barwnika na ganglion.
   4. Sprawdź po 30 minutach, aby upewnić się, że występuje dobre barwienie, a następnie kontynuuj barwienie przez łączny czas około 1 godziny.
4. Do barwienia w Berghia dodaj 1 ml soli fizjologicznej do zamrożonej podwielokrotności RH482 i zwiruj do rozpuszczenia.
   1. Przenieść 200 μl tego roztworu do probówki mikrowirówkowej zawierającej 800 μl soli fizjologicznej i przekręcić do roztworu, otrzymując końcowy roztwór barwiący 0,02 mg/ml RH482 w soli fizjologicznej z 0,1% DMSO.
   2. Umieść cały OUN w probówce do mikrowirówki, owijając probówkę folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania, i potrząsaj ręcznie co 5-6 minut przez około 1 godzinę. Pozostałe 800 μl pierwszego roztworu przechowuj w lodówce i używaj do 3 dni w celu zabarwienia kolejnych preparatów.

5. Spłaszcz przygotowanie i przygotuj się na stymulację nerwów

UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji powinny być wykonywane przy minimalnym oświetleniu lub przy zielonym świetle, aby zminimalizować fotowybielanie.

1. Po barwieniu zanurz OUN w soli fizjologicznej w komorze obrazowania i umieść pod mikroskopem preparacyjnym
.
2. Umieść kawałki silikonu (dla Tritonii lub Aplysia) lub kropelki wazeliny (dla Berghii) po lewej i prawej stronie ganglionu/ganglii, które mają być zobrazowane.
3. Dociśnij odpowiedniej wielkości kawałek szklanego lub plastikowego szkiełka nakrywkowego do preparatu, aby go spłaszczyć. Naciskaj mocno, ale nie tak mocno, aby uszkodzić neurony.
   UWAGA: Spłaszczenie wypukłej powierzchni preparatu w ten sposób sprawi, że większa liczba neuronów stanie się parafokalna, zwiększając tym samym liczbę rejestrowanych neuronów, a ponadto pomoże unieruchomić preparat podczas obrazowania.
4. Jeśli stymulujesz nerw w celu wywołania fikcyjnego programu motorycznego, przygotuj elektrodę ssącą, której przednia końcówka jest w przybliżeniu tak szeroka, jak średnica nerwu. W tym celu należy ostrożnie stopić segment rurki polietylenowej PE-100 nad płomieniem, delikatnie pociągając oba końce segmentu rurki, a następnie przecinając powstały stożek w żądanym punkcie.
   1. Wciągnąć niewielką objętość soli fizjologicznej przez stożkowy koniec polietylenowej elektrody ssącej, a następnie koniec nerwu, który ma być stymulowany, mocując odcinek grubościennej, elastycznej rurki polimerowej do tylnego końca elektrody i używając ssania w ustach do wytworzenia podciśnienia.
   2. Upewnij się, że sól fizjologiczna w elektrodzie nie ma pęcherzyków, które mogłyby przerwać przewodzenie elektryczne.

6. Przygotowanie i optymalizacja do obrazowania

1. Przenieś komorę do stanowiska do obrazowania. Rozpocznij perfuzję soli fizjologicznej przez komorę rejestracyjną i umieść sondę temperatury w pobliżu preparatu. Ustaw regulator temperatury na żądaną temperaturę dla obrazowanego gatunku (dla Tritonii 11 °C, dla Aplysii 15-16 °C lub dla Berghia 26-27 °C).
2. Umieść jeden drut chlorkowanego srebra w dół elektrody ssącej, upewniając się, że styka się z solą fizjologiczną w elektrodzie, a drugi drut Ag-AgClCl (ścieżka powrotna) umieść w soli fizjologicznej kąpieli, w pobliżu elektrody ssącej.
3. Opuść soczewkę zanurzeniową w wodzie do soli fizjologicznej. Zamknij przysłonę podstawową, a następnie podnieś lub opuść kondensator podstopniowy i wyreguluj ostrość, aż krawędzie przysłony będą ostre, tworząc oświetlenie Köhlera.
   1. Skoncentruj się na obszarze przygotowania, które ma być zobrazowane. Stronniczość skupia się na mniejszych neuronach w stosunku do większych, ponieważ sygnały optyczne pochodzące z większych neuronów są bardziej prawdopodobne niż mniejsze neurony, nawet jeśli są nieco nieostre.
   2. Zrób zdjęcie ganglionu, który ma być sfotografowany za pomocą parafokalnego aparatu cyfrowego.
   3. Gdy przełącznik wzmocnienia panelu sterowania jest ustawiony na 1x, sprawdź natężenie światła spoczynkowego (RLI) w oprogramowaniu do obrazowania, klikając przycisk "RLI" i sprawdzając średnie RLI diod. Dostosuj poziom napięcia przesyłanego ze stymulatora do zasilania lampy LED i kontynuuj sprawdzanie średniego poziomu RLI, aż znajdzie się w żądanym zakresie (zwykle około 3-4 V).
      UWAGA: Pożądane są wysokie RLI, odpowiadające około 3-4 V na PDA. Im wyższe światło, tym lepszy stosunek sygnału do szumu sygnałów optycznych, jednak należy to zrównoważyć z szybszym tempem fotowybielania przy wyższych RLI. Ryzyko to jest zminimalizowane dzięki zastosowaniu soczewek obiektywowych o wysokim NA. Stosowane soczewki obiektywowe do zanurzenia w wodzie to 10x/0,6 NA, 20x/0,95 NA, 40x/0,8 NA i 40x/1,15 NA.
4. Ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 100x dla nagrywania.
5. Jeśli stymulujesz nerw, ustaw żądane napięcie, częstotliwość i czas trwania na oddzielnym stymulatorze od tego, który służy do ustawiania poziomu światła. Upewnij się, że wyzwalanie TTL między panelem sterowania a stymulatorem jest prawidłowo skonfigurowane.
   UWAGA: Przykładowe parametry bodźca nerwowego u każdego gatunku są następujące: Tritonia PdN3, 2 s, ciąg impulsów 10 Hz 5 ms, impulsy 10 V; Aplizja PdN9, 2,5 s, ciąg impulsów 20 Hz 5 ms, impulsy 8 V; nerw pedałowy Berghia, 2 s, ciąg impulsów 10 Hz 5 ms, impulsy 5 V.
6. Dokładnie sprawdź, czy stół sprężynowy lub powietrzny unosi się na wodzie.

7. Zapis optyczny

1. Wyłącz lub przyciemnij światła w pomieszczeniu, w tym górne oświetlenie fluorescencyjne.
2. Ustaw żądany czas trwania pliku, ścieżkę i nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk "Weź dane" w oprogramowaniu do obrazowania, aby pobrać pliki do pojemności dostępnej pamięci RAM komputera. Pozostań nieruchomo podczas zapisu optycznego, ponieważ małe drgania mogą wprowadzać duże artefakty do danych zapisu optycznego.
   UWAGA: W przypadku przejęć, które przekraczałyby dostępną pamięć RAM komputera, dostępny jest niestandardowy program do nabywania języka C++ za pośrednictwem dr Jian-young Wu z Uniwersytetu Georgetown.
3. Aby wyświetlić dane natychmiast po ich pozyskaniu, użyj funkcji Superimpose w oprogramowaniu do obrazowania, aby nałożyć dane zebrane przez wszystkie 464 diody na obraz ganglionu wykonany wcześniej przez preparat⁷. Kliknij dowolną z diod reprezentowanych w oprogramowaniu, aby rozwinąć to, co zarejestrowały na osobnym ekranie śledzenia.
   1. Osiągnij dokładne wyrównanie diod w odniesieniu do przygotowania, wprowadzając współczynniki x, y i powiększenia, jak wcześniej określono w teście otworkowym.
   2. Aby zmaksymalizować widoczność potencjału czynnościowego i poprawić wydajność neuronów dla późniejszego sortowania impulsów¹⁴, nałóż pasmowoprzepustowy filtr Butterwortha z odcięciami 5 Hz i 100 Hz (dostępny w oprogramowaniu do obrazowania), aby usunąć zarówno szumy o niskiej, jak i wysokiej częstotliwości.
   3. Aby zapisać przefiltrowane dane optyczne jako plik tekstowy do dalszej analizy na naukowej platformie obliczeniowej, najpierw zaznacz pole "Filtr TP" tuż pod ekranem "Strona" w oprogramowaniu do obrazowania. Następnie wybierz "Zapisz stronę jako ASCII" z zakładki "Wyjście" i wprowadź żądaną nazwę pliku w wyświetlonym oknie dialogowym.

Wyniki

Tritonia
Kontakt skóry z drapieżnikiem morskim wyzwala ucieczkę Tritonia diomedea, składającą się z rytmicznej serii zgięć całego ciała, które popychają go w bezpieczne miejsce (Ryc. 3A). W izolowanych preparatach mózgowych krótki bodziec do nerwu pedałowego 3 (PdN3) wywołuje rytmiczny program motoryczny pływania (SMP) dla tego zachowania, który jest łatwo rozpoznawalny w nagraniach optycznych ze zwojów pedału. Rysunek 3B przedstawia układ eksperymentu obrazowania VSD, zaprojektowanego do rejestrowania aktywności odpalania neuronów na grzbietowej powierzchni lewego ganglionu pedału Tritonia, nad którym umieszczono PDA, jako bodziec do wywołania SMP przez przeciwległe (prawe) PdN3. Surowe i przefiltrowane dane (pasmowy filtr Butterwortha, odcięcia 5 i 100 Hz) z 20 diod rejestrujących aktywność przed, w trakcie i po stymulacji PdN3 przedstawiono odpowiednio na rysunkach 3C,D. Bodziec nerwowy został dostarczony 20 s do 2-minutowego pliku. Natychmiast po akwizycji, sygnały zmierzone przez wszystkie 464 diody matrycy rejestrującej mogą być topograficznie wyświetlone na obrazie preparatu w oprogramowaniu do obrazowania (Rysunek 3E). W tym momencie wiele śladów zawiera kolce zarejestrowane nadmiarowo z tych samych neuronów, a niektóre ślady zawierają kolce z więcej niż jednego neuronu. Sortowanie impulsów przefiltrowanych śladów diody za pomocą ICA dało 53 unikalne ślady neuronalne, z których 30 pokazano w Rysunek 3F. Kinetykę poszczególnych kolców można docenić w Rysunek 3G, który rozszerza fragment czterech śladów z Rysunek 3F (czerwona ramka); dokładność algorytmu sortowania impulsów ICA została wcześniej zweryfikowana przy użyciu jednoczesnych zapisów elektrod ostrych, które wykazały, że wszystkie skoki w posortowanych śladach odpowiadają wewnątrzkomórkowo zarejestrowanym kolcom z poszczególnych neuronów^11,14.

Aplysia
Silnie awersyjny bodziec ogonowy wobec Aplysia californica wywołuje stereotypową dwuczęściową rytmiczną reakcję ucieczki¹⁵. Pierwszą fazą odpowiedzi jest galop składający się z kilku cykli wychyleń głowy i ciągnięcia za ogon, które szybko przesuwają zwierzę do przodu. Po tym zwykle następuje okres pełzania, obejmujący powtarzające się fale skurczów mięśni od głowy do ogona, które popychają zwierzę do przodu z mniejszą prędkością przez kilka minut (Ryc. 4A). Aby uchwycić te programy motoryki ucieczki w nagraniach optycznych, PDA skupiono na grzbietowej powierzchni prawego ganglionu pedału w izolowanym preparacie mózgu, a elektrodę ssącą umieszczono na przeciwległym (lewym) nerwie pedału 9 (PdN9; Rysunek 4B). Po jednej minucie ciągłego 20-minutowego zapisu optycznego (Rysunek 4C), PdN9 został pobudzony do wywołania sekwencji programu motorycznego galopu. Probabilistyczne rozkłady przestrzenne Gaussa sygnałów ze wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów zostały zmapowane na zwoju (Rysunek 4D). Redukcja wymiarowości zastosowana do pełnego nagrania ujawniła, że fazy galopu (cyjan) i pełzania (ciemnoniebieski) programu ucieczki zajmowały odrębne obszary i tworzyły różne trajektorie, odpowiednio spiralne i pętlowe, w przestrzeni głównych komponentów (Rysunek 4E).

Trzy filmy oparte na nagraniu Aplysia przedstawione w Rysunek 4 pokazuje dalsze rodzaje analiz, które można przeprowadzić na takich zestawach danych. Film 1 animuje odpalanie wszystkich zarejestrowanych neuronów przez cały czas trwania nagrania. Początkowy okres postymulacyjny programu motorycznego ucieczki charakteryzował się galopem, w którym aktywność w zwoju charakteryzowała się naprzemiennym pękaniem różnych skupisk funkcjonalnych (Wideo 2). Galop następnie przeszedł w pełzanie, w którym aktywność w skupiskach neuronów pozostała szeroko fazowa, ale przyjęła trajektorię rotacji w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w zwoju (Wideo 3). Ostatnie dwa filmy zawierają również grupowanie konsensusu, które ujawnia oddzielnie odpalanie i lokalizacje różnych zespołów funkcjonalnych dla faz galopu i czołgania się reakcji ucieczki. Zauważ, że wiele neuronów przypisanych do tego samego klastra zarówno w fazie galopu, jak i pełzania wykazywało fizyczną bliskość względem siebie w zwoju, co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami¹².

Berghia
Ślimak nagoskrzelny Berghia stephanieae (Ryc. 5A) reprezentuje nowy system modelowy dla neuronauki. Konfiguracja obrazowania dla typowego eksperymentu Berghia jest pokazana na Rysunek 5B. Aby wywołać aktywność neuronalną na szeroką skalę, elektrodę ssącą umieszczono na najbardziej widocznym nerwie lewego pedału, a bodziec nerwowy został dostarczony po 30 sekundach 2-minutowego nagrania. Ślady przetworzone przez ICA ujawniły zarówno spontaniczną, jak i wywołaną bodźcem aktywność w 55 neuronach (Ryc. 5C). Wykrywanie społeczności za pomocą grupowania opartego na konsensusie zidentyfikowało dziesięć odrębnych zespołów funkcjonalnych, które są przedstawione na Rysunek 5D na wykresie sieci oraz w Rysunek 5E, który reorganizuje ślady pokazane w Rysunek 5C na podstawie ich przypisania do klastrów. Rozkłady gaussowskie sygnałów ze wszystkich zarejestrowanych neuronów są nakładane na obraz preparatu w Rysunek 5F, aby wskazać pozycje wszystkich 55 zarejestrowanych neuronów.

Rysunek 1: Widoki stanowiska do obrazowania optycznego i matrycy fotodiodowej (PDA). (A) Zestaw do obrazowania optycznego, wyposażony w PDA, kamerę cyfrową, mikroskop i stolik. (B) Wewnętrzna konstrukcja PDA, w której światłowody łączą aperturę obrazowania z 464 fotodiodami. Nad fotodiodami znajduje się rząd wzmacniaczy. (C) Sześciokątna powierzchnia otworu obrazowania, na której skupia się obrazowany obszar. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący niezbędny przebieg pracy w uzyskiwaniu nagrań optycznych. Podstawowe etapy protokołu obrazowania VSD, od sekcji i barwienia po szczegóły obrazowania, przedstawiono na tym schemacie blokowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyniki Tritonia diomedea, ilustrujące dane surowe, filtrowanei sortowane według skoków. (A) Tritonia uciekająca przed drapieżną gwiazdą morską Pycnopodia helianthoides poprzez pływanie, które składa się z naprzemiennych zgięć grzbietowych i brzusznych ciała. (B) Schemat konfiguracji obrazowania. Ce = płat mózgowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pl = płat opłucnowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pd = ganglion pedału. (C) Surowe dane z 20 fotodiod, pokazujące aktywność w zwoju lewego pedału do stymulacji przeciwległego PdN3 (bodziec wskazywany strzałką). (D) Przefiltrowane dane z tych samych diod co w C (filtr Butterwortha pasmowoprzepustowy 5 i 100 Hz). (E) Dane wyjściowe oprogramowania do obrazowania, w których skompresowane ścieżki zebrane przez wszystkie 464 diody są nakładane topograficznie na obraz preparatu. Pozycje 20 diod, których ślady są pokazane w C i D, są podświetlone na czerwono. (F) Trzydzieści wybranych śladów pojedynczych neuronów wygenerowanych przez sortowanie impulsów za pomocą ICA. (G) Rozszerzony widok czterech śladów pojedynczego neuronu, odpowiadających czerwonej ramce w F, pokazuje ich potencjały czynnościowe w wyższej rozdzielczości czasowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki z Aplysia californica, ilustrujące długotrwałe zapisy, mapowanie sygnału i redukcję wymiarowości. (A) Dwie fazy sekwencyjnego programu motorycznego ucieczki Aplyzji, galop i czołganie się. (B) Schemat konfiguracji obrazowania. Ce = zwój mózgowy; Pl = zwój opłucnej; Pd = ganglion pedału. (C) 20-minutowy zapis 81 neuronów w prawym zwoju pedału reagujących na bodziec do przeciwległego PdN9 (wskazanego strzałką). Zielone, cyjanowe i ciemnoniebieskie paski poniżej śladów wskazują odpowiednio okres przed bodźcem, fazy galopu i pełzania programu motorycznego ucieczki. (D) Obraz preparatu z odwzorowanymi probabilistycznymi rozkładami Gaussa lokalizacji wszystkich 81 źródeł sygnału neuronalnego zidentyfikowanych przez ICA. Zielony kontur przedstawia położenie sześciokątnej powierzchni PDA w stosunku do zwoju. Liczby na każdym Gaussie odpowiadają liczbom śladowym w C. (E) Redukcja wymiarowości przy użyciu analizy składowych głównych polegająca na wykreśleniu pierwszych trzech składowych głównych względem siebie w ciągu 20-minutowego pliku. Przedstymulacyjne epoki podstawowe, galop i pełzanie są pokazane odpowiednio na zielono, niebiesko i ciemnoniebiesko. Zobacz filmy 1-3, aby zapoznać się z animacjami odpalania neuronów odpowiadającymi temu nagraniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Wyniki badań nad Berghia stephanieae, nowym gatunkiem w neurobiologii, ilustrującym tworzenie wykresów sieciowych, grupowanie funkcjonalne i mapowanie sygnałów obustronnych. (A) Okaz z Berghii. (B) Schemat konfiguracji obrazowania. Ce = płat mózgowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pl = płat opłucnowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pd = ganglion pedału; Rh = ganglion nosofora. (C) Ślady wskazujące na spontaniczną i wywołaną bodźcem aktywność 55 obustronnych neuronów w zwojach mózgowo-opłucnowych (dostarczenie bodźca jest oznaczone strzałką). (D) Wykres sieciowy przedstawiający dziesięć funkcjonalnych zespołów, z których każdy ma przypisany unikalny kolor, zidentyfikowany za pomocą grupowania w drodze konsensusu. Węzły na tym wykresie reprezentują neurony, gdzie odległość w przestrzeni sieciowej reprezentuje stopień korelacji wypalania w obrębie i między zespołami. (E) Ślady w C są przestawiane i kodowane kolorami (zgodnie ze schematem kolorów D) w funkcjonalne zespoły. (F) Obraz preparatu pokazujący zmapowane lokalizacje sygnałów z każdego zarejestrowanego neuronu oraz liczby śladowe w C i E, którym one odpowiadają. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Animacja pełnego, 20-minutowego programu lokomotorycznego ucieczki Aplysia. Nieprzezroczystość białych kształtów pokrywających 81 pojedynczych neuronów w zwoju prawego pedału (lewy panel) była napędzana przez odpowiednie ślady neuronalne (prawy panel) i zmieniała się liniowo w funkcji średniej szybkości skoków (binowana co 0,61 s czasu rzeczywistego w nagraniu). Dla każdego neuronu pełne przezroczystość została znormalizowana do maksymalnej szybkości wyzwalania w czasie trwania nagrania. Jedna sekunda czasu, który upłynął na filmie, odpowiada 12,2 s czasu rzeczywistego. Pasek skali odpowiada czasowi rzeczywistemu, z zielonymi, cyjanowymi i ciemnoniebieskimi liniami poniżej śladów wskazujących odpowiednio linię bazową przed bodźcem, fazy galopu i czołgania się programu lokomotorycznego ucieczki. Żółte pola wokół fazy galopu i części fazy pełzania wskazują fragmenty nagrań użyte do wygenerowania animacji w filmach 2 i 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Wideo 2: Animacja fazy galopu w programie lokomotorycznym ucieczki Aplysia. Grupowanie konsensusu przeprowadzono na wszystkich 81 zarejestrowanych neuronach w fazie galopu programu motorycznego, aby wyprowadzić funkcjonalne zespoły, przy użyciu podejścia i oprogramowania opisanego i udostępnionego w ref.¹². Zespoły neuronalne wykazujące w dużej mierze toniczne lub nieregularne wzorce odpalania podczas tej fazy programu ucieczki zostały pominięte w tym filmie. Potencjały czynnościowe neuronów należących do zespołów czarnego i oliwkowo-zielonego można usłyszeć na ścieżce dźwiękowej filmu, z podświetlonymi odpowiadającymi im neuronami i śladami. Średnie wskaźniki skoków zostały znormalizowane jak w filmie 1 i z równoważnym podziałem czasu; 1 s, który upłynął czas w filmie, odpowiada 6,1 s czasu rzeczywistego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Wideo 3: Animacja fazy pełzania w programie lokomotorycznym ucieczki Aplysia. Grupowanie konsensusu przeprowadzono na wszystkich 81 zarejestrowanych neuronach w fazie pełzania programu motorycznego, aby wyprowadzić funkcjonalne zespoły. Zespoły wykazujące głównie toniczne lub nieregularne wzorce odpalania w tej fazie programu motorycznego zostały pominięte w tym filmie. Średnie wskaźniki skoków zostały znormalizowane, jak w filmach 1 i 2, z równoważnym podziałem czasu; 1 s, który upłynął czas na filmie, odpowiada około 12,2 s czasu rzeczywistego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

Jednym z najważniejszych szczegółów we wdrażaniu naszego podejścia do obrazowania VSD na dużą skalę jest minimalizacja wibracji, które powodują ruchy krawędzi kontrastu na diodach, co skutkuje dużymi sztucznymi sygnałami. Ponieważ absorbancja VSD wytwarza bardzo małe procentowe zmiany natężenia światła z potencjałami czynnościowymi, artefakty wibracyjne, jeśli nie zostaną zapobieżone, mogą przesłaniać interesujące sygnały neuronalne. Stosujemy kilka metod w celu zminimalizowania artefaktów drgań. Po pierwsze, na parterze znajduje się nasza pracownia obrazowania, która izoluje preparat od drgań związanych z budynkowymi urządzeniami wentylacyjnymi i wieloma innymi źródłami. Po drugie, zastosowano sprężynowy stół izolacyjny, który według innych użytkowników PDA zapewnia lepsze tłumienie drgań niż bardziej powszechny stół powietrzny¹⁶. Po trzecie, zastosowano obiektywy zanurzenia w wodzie, które eliminują fluktuacje obrazu wynikające z fal powierzchniowych. Po czwarte, obrazowany preparat został lekko wciśnięty między dno szkiełka nakrywkowego komory a fragment szkiełka nakrywkowego dociśnięty od góry, który jest utrzymywany na miejscu przez korki silikonowe lub wazelinę, co dodatkowo stabilizuje preparat. Powoduje to również spłaszczenie wypukłej powierzchni obrazowanego zwoju lub zwojów, co skutkuje większą liczbą neuronów w płaszczyźnie ostrości obiektywu, co zwiększa liczbę rejestrowanych neuronów.

Aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu dla bardzo małych zmian stopnia absorpcji światła VSD wynikających z potencjału czynnościowego, konieczne jest uzyskanie światła bliskiego nasyceniu przez przygotowanie do PDA, przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania barwnika. W tym celu zazwyczaj pracujemy przy napięciu 3-4 V spoczynkowego natężenia światła, mierzonego przełącznikiem wzmocnienia panelu sterowania PDA w pozycji 1x (wzmacniacze PDA 464 nasycają się przy 10 V światła). Podczas akwizycji danych ten współczynnik wzmocnienia jest zmieniany na 100x. Uzyskanie wystarczającej ilości światła do osiągnięcia 3-4 V mierzonego przez PDA można osiągnąć na kilka sposobów. Po pierwsze, użyj ultrajasnego źródła światła LED, które dostarcza długość fali odpowiednią do właściwości absorpcyjnych używanego barwnika absorpcyjnego. W związku z tym zastosowano lampę kolimowaną LED o długości fali 735 nm, która pokrywa się z optymalnymi długościami fal absorpcji RH155 i RH482. Po drugie, jeśli to konieczne, użyj kondensatora podstopniowego typu flip-top, który koncentruje światło ze źródła światła LED na mniejszym obszarze. Po trzecie, dostosuj wysokość kondensora, aby uzyskać oświetlenie Köhlera, które zapewnia wysoką, równomierną jasność i maksymalną jakość obrazu. Po czwarte, upewnij się, że w ścieżce optycznej nie ma filtrów termicznych, które mogą tłumić długość fali lampy LED 735 nm. Po piąte, usuń dyfuzory, jeśli potrzeba więcej światła, ze ścieżki optycznej. Po szóste, należy używać obiektywów o wysokiej rozdzielczości NA, które zapewniają wysoką rozdzielczość przestrzenną i pozwalają na dotarcie światła do PDA przy niższych natężeniach lampy. Pozwoliło nam to zminimalizować fotowybielanie do tego stopnia, że możemy uzyskać kilka plików akwizycyjnych o czasie trwania 10-20 minut na preparat przy użyciu tego samego natężenia światła we wszystkich plikach i bez znacznej utraty amplitudy sygnału lub konieczności ponownego barwienia. Co najważniejsze, jeśli eksperymentator chce śledzić neurony w tych dłuższych plikach, powinien upewnić się, że płaszczyzna ogniskowa się nie zmienia, a preparat się nie porusza. Wreszcie, dodatkowym sposobem na skierowanie wystarczającej ilości światła do PDA jest użycie młodszych zwierząt, które mają cieńsze, a tym samym mniej nieprzezroczyste zwoje.

Od czasu do czasu zauważamy, że stosunek sygnału do szumu sygnałów optycznych pogarsza się i/lub rytmy programów motorycznych są nieoptymalne (np. wolne lub nieprawidłowe). Kiedy zaczyna to zachodzić konsekwentnie, mieszamy świeże roztwory VSD. Podwielokrotności VSD zazwyczaj zachowują żywotność przez około 6 miesięcy w zamrażarce o temperaturze -20 °C. W związku z tym warto zauważyć, że w przypadku Berghii najlepsze wyniki uzyskano do tej pory przy użyciu absorbancji VSD RH482. Ponieważ RH482 jest bardziej lipofilowy niż RH155, może lepiej barwić stosunkowo mniejsze neurony Berghia lub skuteczniej pozostawać w błonach neuronalnych przy wyższej temperaturze zapisu soli stosowanej dla tego tropikalnego gatunku.

Jedno z ograniczeń obrazowania aktywności neuronalnej za pomocą PDA odnosi się do sprzężenia sygnałów napięciowych prądu przemiennego w sprzęcie przed 100-krotnym krokiem przedwzmacniacza: chociaż stanowi to niezbędną cechę do usunięcia dużego przesunięcia prądu stałego wytwarzanego przez wysoki poziom światła spoczynkowego wymagany przez tę technikę, sprzężenie prądu przemiennego nieodłącznie związane z PDA wyklucza pomiar powolnych zmian potencjału błony, takie jak te związane z wejściami synaptycznymi. Jeśli pożądane jest rejestrowanie powolnych lub ustalonych zmian potencjału, można wykorzystać system obrazowania kamery CMOS sprzężony z prądem stałym do uchwycenia aktywności podprogowej. Byrne i współpracownicy niedawno wykorzystali taką konfigurację z RH155 do zobrazowania aktywności neuronów w zwoju policzkowym Aplysia ^17,18. Korzystaliśmy z obu systemów i stwierdziliśmy, że kamera CMOS, ze względu na znacznie większą gęstość detektorów (128 x 128), generuje 50x większe pliki danych dla tego samego czasu obrazowania⁷. Mniejsze pliki PDA ułatwiają szybsze przetwarzanie i analizę. Umożliwia to również rozszerzone nagrania pojedynczej próby (Rysunek 4) oraz badania uczenia się, w których dane z wielu prób są łączone w jeden duży plik przed sortowaniem skokowym, co pozwala na śledzenie organizacji sieci w miarę rozwoju uczenia^się19.

W innych badaniach opartych na kamerach, fluorescencyjne VSD zostały wykorzystane przez Kristana i współpracowników do zbadania funkcji sieci w zwojach segmentowych pijawki. W jednym z wpływowych badań doprowadziło to do zidentyfikowania neuronu zaangażowanego w decyzję zwierzęcia o pływaniu lub czołganiu^się. W innym badaniu Kristan i in. zbadali, w jakim stopniu zachowania pijawki związane z pływaniem i pełzaniem są napędzane przez^obwody wielofunkcyjne i dedykowane. Niedawno Wagenaar i jego współpracownicy użyli dwustronnego mikroskopu do obrazowania napięcia, który pozwala im rejestrować z prawie wszystkich neuronów w zwoju segmentowym^{pijawki 22}. W przeciwieństwie do wielu metod obrazowania opartych na kamerach, zaletą naszej metody obrazowania opartej na PDA jest szybkie i bezstronne sortowanie impulsów przez ICA, forma ślepej separacji źródeł, która nie wiąże się z podejmowaniem decyzji o granicach neuronów w celu przetwarzania wyników.

Jeśli chodzi o wybór VSD, jedną z zalet barwników absorpcyjnych RH155 i RH482 jest związana z nimi fototoksyczność^{23,24 lub} niewielka lub zerowa ^23,24, co umożliwia dłuższy czas rejestracji niż jest to typowe dla fluorescencyjnych VSD. Co więcej, stosowane przez nas VSD o dużej absorpcji doskonale nadają się do rejestrowania przekroczonych somatycznych potencjałów czynnościowych w preparatach ślimaków, które zwykle mają amplitudę 80 mV. Jak pokazano na rysunku 3G, nasza metoda optyczna może rejestrować niedoregulowania potencjału czynnościowego (żadne z naszych zapisów nie jest uśrednione śladowo): sugeruje to, że używane przez nas VSD powinny być w stanie dostrzec potencjały czynnościowe w innych układach modelowych, które tłumią się do pewnego stopnia, a zatem nie są przekroczone, zanim dotrą do somy. Niemniej jednak nasze podejście optyczne może nie być idealne dla gatunków, o których wiadomo, że wykazują wysoce osłabione potencjały czynnościowe po zarejestrowaniu w somie.

Wiele obecnych badań nad sieciami neuronowymi koncentruje się na niewielkiej liczbie zaprojektowanych gatunków transgenicznych. Jednak neuronauka czerpie korzyści z badania szerokiej gamy filogenetycznie odrębnych gatunków. Badanie wielu różnych gatunków dostarcza informacji na temat ewolucji obwodów^25,26 i rzuca światło na zasady funkcjonowania sieci, które mogą być wspólne dla typów ^1,2,3,4,27. Do tej pory zastosowaliśmy naszą metodę obrazowania do wielu gatunków ślimaków, w tym Aplysia californica 8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea ^{8,9,11,14,19,28}, Tritonia festiva²⁸, Pleurobranchaea californica (dane niepublikowane), a ostatnio Berghia stephanieae (ryc. 5). Zaletą tego podejścia jest to, że można je łatwo zastosować do wielu gatunków, bez potrzeby stosowania zwierząt transgenicznych. Pragniemy potwierdzić, że nasze zastosowanie obrazowania VSD z barwnikami o szybkiej absorpcji i PDA podąża śladami pionierskich prac, które osiągnęły to w częściowo nienaruszonych, zachowujących się preparatach Navanax²⁹ i Aplysia³⁰. Nasz nacisk na szybkość naszego podejścia jest po części odpowiedzią na obawy, że wielu badaczy może być coraz bardziej niechętnych do rozpoczynania badań sieciowych na nowych gatunkach z powodu obaw, że konieczne będą lata badań, aby scharakteryzować podstawową organizację sieci, zanim będą mogli zgłębić pytania naukowe o szerokim znaczeniu dla neuronauki^.. W związku z tym naszym celem jest zademonstrowanie techniki, która znacznie przyspiesza ten proces – do tego stopnia, że można uzyskać znaczące informacje na temat organizacji sieci tego samego dnia z pojedynczych preparatów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Achromatyczny skraplacz wahadłowy 0,9 NA	Nikon	N/A
Bipolarny regulator temperatury	Warner Instruments	CL-100 z SC-20	Kontroluje temperaturę soli perfuzyjnej Termometr
komorowy	Physitemp	BAT-12 z mikrosondą IT-18 Aparat
cyfrowy	Optronics	S97808
Kleszcze preparacyjne	Dumont	#5
Nożyczki preparacyjne	American Diagnostic Corp.	ADC-3410Q
Mikroskop obrazowy	Olympus	BX51WIF
Obrazowa komora perfuzyjna	Siskiyou	PC-H
Instant Ocean	Instant Ocean	SS6-25	Wytwarza jednorazowo 25 galonów
Stymulator impulsów Master-8	A.M.P.I.	Master-8
Mikrodozownik	Drummond Scientific	3-000-752	Aplikator barwnika do barwienia ciśnieniowego
Nożyczki do mikrodysekcji	Moria	15371-92
Szpilki Minutien (0,1 mm)	Fine Science Tools	NC9677548	Do pozycjonowania i stabilizacji CNS
Zmotoryzowana platforma mikroskopowa	Thorlabs	GHB-BX	Gibraltar
Oprogramowanie do obrazowania	NeuroPlex RedShirtImaging	NeuroPlex	Kompatybilny z matrycą fotodiod WuTech
Soczewki obiektywowe	Olympus	XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340
Rurki polietylenowe PE-100 VWR		63018-726	Rurki do wytwarzania elektrod ssących
Pompa perfuzyjna	Instech	P720 z zestawem	rurek DBS062SDBSU
Wazelina	Equate	NDC 49035-038-54
Matryca fotodiod z panelem sterowania	WuTech Instruments	469-IV tablica fotodiod	Skontaktuj się z jianwu2nd@gmail.com w celu zamówienia
informacji RH155	Santa Cruz Biotechnology	sc-499432	Barwnik wrażliwy na napięcie
RH482	Univ of Conn. Health Center	JPW-1132	Barwnik wrażliwy na napięcie; specjalne zamówienie od Leslie Leow
Silikonowe zatyczki do uszu	Mack's	Model 7	Do użycia do przygotowania kompresji
Barwienie rurek PE VWR		63018-xxx	Różne rozmiary w zależności od dopasowania
Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184 Zestaw		elastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184
Thorlabs LED i sterownik	Thorlabs	M735L2-C1, DC2100	Lampa LED i sterownik Rurka
Tygon	Fisher Scientific	14-171-xxx
Stół wibroizolacyjny	Kinetic Systems	MK26	Na bazie sprężyny