Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza metod wizualizacji komórek bakteryjnych i polisacharydów syntezy locus (Psl) w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą.

Streszczenie

Wczesne wykrycie i wyeliminowanie Pseudomonas aeruginosa w płucach pacjentów z mukowiscydozą może zmniejszyć ryzyko rozwoju przewlekłej infekcji. Rozwój przewlekłych zakażeń P. aeruginosa wiąże się ze spadkiem czynności płuc i zwiększoną zachorowalnością. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie wyjaśnieniem przyczyn niepowodzenia w zwalczaniu P. aeruginosa za pomocą antybiotykoterapii, która występuje u około 10-40% pacjentów pediatrycznych. Jednym z wielu czynników, które mogą wpływać na usuwanie P. aeruginosa przez gospodarza i wrażliwość na antybiotyki, są różnice w organizacji przestrzennej (takie jak agregacja lub tworzenie biofilmu) i produkcja polisacharydów. Dlatego byliśmy zainteresowani wizualizacją charakterystyki in situ P. aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą. Technikę oczyszczania tkanek zastosowano do próbek plwociny po osadzeniu próbek w matrycy hydrożelowej w celu zachowania struktur 3D względem komórek gospodarza. Po oczyszczeniu tkanek dodano fluorescencyjne etykiety i barwniki, aby umożliwić wizualizację. Fluorescencyjną hybrydyzację in situ przeprowadzono w celu wizualizacji komórek bakteryjnych, wiązania znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał anty-Psl w celu wizualizacji egzopolisacharydu i barwienia DAPI w celu barwienia komórek gospodarza w celu uzyskania wglądu strukturalnego. Metody te pozwoliły na obrazowanie P. aeruginosa w wysokiej rozdzielczości w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Wprowadzenie

W tym badaniu, eksperymenty zostały zaprojektowane w celu wizualizacji struktury in vivo Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą (CF) u dzieci. Zakażenia P. aeruginosa stają się przewlekłe u 30-40% populacji dzieci z mukowiscydozą; Gdy przewlekłe infekcje się utrwalą, ich wyeliminowanie jest prawie niemożliwe¹. Izolaty P. aeruginosa od pacjentów z wczesnym zakażeniem są na ogół bardziej podatne na środki przeciwdrobnoustrojowe, dlatego są one leczone antybiotykami przeciw pseudomonom, aby zapobiec powstaniu przewlekłej infekcji². Niestety, nie wszystkie izolaty P. aeruginosa są skutecznie usuwane z płuc po antybiotykoterapii. Dokładne mechanizmy związane z niepowodzeniem antybiotyków nie zostały w pełni wyjaśnione. Wcześniejsze badania wykazały, że różnice w gęstości komórek biofilmu, agregacji i produkcji polisacharydów mogą wpływać na skuteczność antybiotyku³. P. aeruginosa wytwarza trzy zewnątrzkomórkowe polisacharydy: Pel, Psl i alginian⁴. Większość szczepów P. aeruginosa ma genetyczną zdolność do ekspresji każdego z egzopolisacharydów, chociaż często jeden rodzaj polisacharydów jest wyrażany głównie ⁵. Alginian egzopolisacharydu jest związany z przewlekłymi infekcjami płuc mukowiscydozy, co skutkuje fenotypem śluzówki^6,7. Polisacharydy Pel i Psl pełnią wiele funkcji, w tym wspomaganie początkowego przyłączania i utrzymywania struktury biofilmu oraz nadawanie oporności na antybiotyki⁸.

Metody mające na celu wizualizację struktur tkanek in vivo zostały opracowane dla różnych typów próbek9^,10,11. Ostatnio zostały one dostosowane do wizualizacji in vivo społeczności drobnoustrojów w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą¹². Optymalizacja protokołu oczyszczania tkanek specjalnie do identyfikacji społeczności drobnoustrojów w plwocinie została opracowana przez DePas et al., 2016¹². Termin MiPACT, który oznacza microbial identification od Passive CLARITY technique, został ukuty dla oczyszczania plwociny CF ^11,12. W przypadku technik oczyszczania tkanek próbki są najpierw utrwalane, a następnie stają się przezroczyste, pozostawiając ich naturalną architekturę nienaruszoną do barwienia i wizualizacji mikroskopowej¹¹. Utrwalanie i usuwanie próbek plwociny mukowiscydozy pozwala naukowcom odpowiedzieć na pytania związane ze strukturą biofilmu, gęstością komórek bakteryjnych, powiązaniami wielodrobnoustrojowymi oraz powiązaniami między patogenami a komórkami gospodarza. Zaletą bezpośredniego badania bakterii, które zachowały się w plwocinie, jest to, że można je analizować i wizualizować w kontekście specyficznym dla gospodarza. Chociaż hodowla in vitro izolatów klinicznych w laboratorium w celach eksperymentalnych może być bardzo pouczająca, takie metody nie są w stanie w pełni odtworzyć środowiska płuc mukowiscydozy, co powoduje rozdźwięk między wynikami laboratoryjnymi a wynikami pacjentów.

Przedstawione tutaj metody mogą być używane do utrwalania i usuwania plwociny w celu wizualizacji bakterii, czy to od pacjentów z mukowiscydozą, czy pacjentów z innymi infekcjami dróg oddechowych. Specyficznym rodzajem barwienia i analizy mikroskopowej opisanym w niniejszym dokumencie jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), po której następuje wiązanie przeciwciał anty-Psl w hydrożelu, a następnie analiza za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Po oczyszczeniu tkanek można również zastosować inne metody immunohistochemiczne i mikroskopowe.

Protokół

Zgoda Komisji Etyki Badań (REB) jest wymagana do pobierania i przechowywania próbek plwociny od ludzi. Przedstawione w niniejszym artykule badania zostały zatwierdzone przez Szpital dla Dzieci Chorych REB#1000058579.

1. Pobieranie plwociny

1. Odkrztuszoną plwocinę przechowywać w sterylnym kubku do pobierania próbek i natychmiast przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny przed utrwaleniem.
   UWAGA: Pozostawienie plwociny zbyt długo w temperaturze 4 °C bez utrwalenia może prowadzić do degradacji komórek, szczególnie degradacji białych krwinek. Preferowana jest fiksacja tak szybko, jak to możliwe.
2. Przenieść próbki plwociny do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
3. Dodać równą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) do próbek plwociny. Na przykład, jeśli próbka plwociny ma 0,5 ml, dodaj 0,5 ml 4% PFA. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
4. Inkubować plwocinę przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Przepłukać próbkę, dodając 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdych 2 ml utrwalonej plwociny.
   UWAGA: Na tym etapie mycia nie jest wymagane wirowanie.
6. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
   UWAGA: Unikaj zasysania plwociny pipetą, kierując końcówkę z dala od plwociny i bardzo powoli odsysaj płyn z powierzchni. Etap mycia nie obejmuje wirowania, aby nie naruszyć integralności strukturalnej czopów plwociny.
7. Powtórz kroki 1.6-1.7 jeszcze dwa razy.
8. Zawiesić osad w 2-krotności objętości PBS z 0,01 % (w/v) azydkiem sodu.
9. Przechowywać plwocinę w temperaturze 4 °C.

2. MiPACT (technika oczyszczania tkanek) przetwarzanie plwociny

1. Odgazować składniki hydrożelu (30% 29:1 akrylamid: bis-akrylamid, utwardzacz i PBS) w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym pakiet beztlenowy przed 72 godzinami
   UWAGA: Pakiet beztlenowy i szczelny pojemnik są niezbędne, ponieważ tlen hamuje polimeryzację akrylamidu. Alternatywnie, tlen można usunąć, wykonując ten krok w okapie beztlenowym, stosując próżnię do szczelnie zamkniętego pojemnika lub bulgocząc gaz N₂ przez mieszaninę akrylamidu.
   1. Dodać 2 ml 30% roztworu akryloamidu:bis-akrylamidu w proporcji 29:1 do probówki o pojemności 15 ml ze zdjętą nakrętką wewnątrz szczelnie zamkniętego pojemnika anaerobowego.
   2. Przygotuj skoncentrowany zapas 10% (w/v) utwardzacza, dodając 0,5 g utwardzacza do 5 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml. Pozostaw nakrętkę z tubki i przechowuj w szczelnie zamkniętym pojemniku anaerobowym.
   3. Pozostawić kilka ml sterylnego PBS w probówce, bez nakrętki, wewnątrz pojemnika beztlenowego.
2. Przygotować 5 ml roztworu hydrożelu o końcowym stężeniu 0,2% utwardzacza i 4% 29:1 akrylamidu:bis-akrylamidu w PBS w probówce o pojemności 15 ml. Wymieszać przez inwersję i wysterylizować filtrem.
3. Wyjmij próbki plwociny z lodówki, a następnie pokrój je na małe kawałki (o średnicy około 5 mm) w sterylnych warunkach za pomocą skalpela.
   UWAGA: Jeśli plwocina jest dość płynna, ten krok można nadal wykonać, jednak usunięcie plwociny z roztworu do przechowywania za pomocą pęsety wymaga większej cierpliwości i praktyki przed użyciem skalpela do oddzielenia pożądanych frakcji.
4. Umieść pocięte próbki plwociny w studzience z 8-komorowym szkiełkiem nakrywkowym.
5. Dodać 300 μl wysterylizowanego przez filtr roztworu hydrożelu z kroku 2.2 do każdej z studzienek zawierających plwocinę.
6. Umieścić 8-komorową szklankę nakrywkową w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym pakiet beztlenowy na 3 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Po spolimeryzowaniu hydrożel z osadzoną plwociną powinien mieć konsystencję twardego żelu.
7. Przenieść zestalone próbki plwociny hydrożelowej do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml 8% dodecylosiarczanu sodu (SDS), pH 8 i pozostawić próbki do oczyszczenia przez 3-14 dni w temperaturze 37 °C (z wstrząsaniem lub bez), aż plwocina stanie się przezroczysta.
   UWAGA: Czas oczyszczania zależy od składu plwociny i można go ogólnie skrócić za pomocą potrząsania. Należy jednak uważać, aby nie zwiększać prędkości wytrząsania do punktu, w którym naruszyłoby to integralność próbki. Usunięcie większej liczby próbek bogatych w DNA zajmuje więcej czasu w porównaniu z próbkami bogatymi w śluz
.
8. Przelać 8% roztwór SDS do pojemnika na odpady. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś każdą próbkę zatopioną w hydrożelu do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml PBS do każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml, aby przepłukać hydrożele i pozostaw roztwór na 30 minut do 1 godziny przed zdekantacją. Powtórz to jeszcze 2 razy więcej razy.
   UWAGA: Ten etap mycia nie obejmuje wirowania. Nadmiar płynu i supernatantu ostrożnie usuwa się pipetą.
9. Umyte próbki należy przechowywać w PBS z 0,01% (w/v) azydkiem sodu i 1x inhibitorem RNazy w temperaturze 4 °C.

3. Protokół hydrożelowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)

1. Usuń próbki hydrożelu z roztworu do przechowywania za pomocą sterylnej pęsety i umieść próbki na sterylnej powierzchni (takiej jak szkiełko podstawowe lub szalka Petriego).
2. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój hydrożele w plastry o grubości ~ 1 mm.
3. Umieść 1 mm odcinki hydrożelu w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml.
4. Przygotować 1 ml buforu hybrydyzacyjnego (25% formamidu, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, oczyszczony i zdejonizowany_H2O) w probówce o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać znakowaną fluorescencyjnie sondę PseaerA (150,7 nM¹²) do buforu hybrydyzacyjnego i wymieszać przez inwersję.
   UWAGA: Roztwór formaliny należy trzymać z dala od otwartego ognia. Bufor hybrydyzacyjny może być przygotowany w wersji zaawansowanej i przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C¹³.
6. Dodaj 200-500 μl buforu hybrydyzacyjnego do każdego ~1 mm odcinka hydrożelu i upewnij się, że cała próbka hydrożelu jest zanurzona.
7. Pozwól sondzie PseaerA na hybrydyzację z próbkami hydrożelu, umieszczając je w ciemności na ~ 18-24 h, w temperaturze 46 °C, bez wstrząsania.
8. Zdekantować bufor hybrydyzacyjny do pojemnika na odpady.
9. Przepłukać próbki raz wysterylizowanym przez filtr buforem do płukania (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) [pH 7,2], 0,01% SDS oraz oczyszczonym i zdejonizowanym_H2O), dodając 1 ml buforu do przemywania do każdej z probówek o pojemności 1,5 ml, a następnie usunąć go.
   UWAGA: Bufor do mycia można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
10. Dodać 1 ml świeżego buforu do płukania do probówek, a następnie inkubować próbki w ciemności przez 6 godzin w temperaturze 48 °C, bez wstrząsania.

4. Wiązanie hydrożelu i przeciwciał Psl0096

1. Sterylnie usunąć bufor do przemywania za pomocą pipetora o pojemności 1 ml.
2. Przepłukać próbki 2% roztworem BSA (w/v) w roztworze PBS, dodając i usuwając 1 ml 2% roztworu BSA.
3. Dodać 500 μl 2% roztworu BSA/PBS do próbek hydrożelu, aby zablokować niespecyficzne wiązanie białek. Następnie inkubować próbki przez noc, w ciemności, w temperaturze pokojowej, bez wstrząsania.
4. Sterylnie usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
5. Przygotować roztwór przeciwciała Psl0096-Texas Red, rozcieńczając przeciwciało do końcowego stężenia 0,112 μg/ml w 500 μl świeżego 2% BSA/PBS.
6. Dodać 500 μl roztworu przeciwciał do próbek hydrożelu i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, chroniąc przed światłem, bez wstrząsania.

5. Barwienie DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenyloindol)

1. Przygotować roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła (RIMS), dodając 40 g ośrodka o niejonowym gradiencie gęstości, 30 μl Tween20, 3 μg azydku sodu i 30 ml PBS do kolby zawierającej mieszadło magnetyczne. Mieszaj roztwór przez 15 minut na mieszadle magnetycznym lub do całkowitego rozpuszczenia.
2. Filtruj roztwór sterylizuj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i sterylnego filtra 0,2 μm.
   UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
3. Usunąć roztwór przeciwciała Psl0096-Texas Red za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml.
4. Przepłukać próbki hydrożelu, dodając, a następnie usuwając 1 ml PBS.
5. Próbki hydrożelu inkubować z 250 μl roztworu RIMS i 10 μg/ml DAPI w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, w ciemności, przez noc.
6. Przed obrazowaniem konfokalnym umieścić próbki w komorach perfuzyjnych 0,9 mm lub 1,7 mm i uszczelnić szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
   UWAGA: Po badaniu FISH i/lub immunohistochemii, a przed zanurzeniem w RIMS, można zastosować fluorescencyjne barwienia lektyny, jeśli pożądana jest wizualizacja śluzu plwociny¹².

6. Obrazowanie

1. Wykonuj obrazowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej przy użyciu standardowych technik przy powiększeniach 25x, 40x, 63x lub 100x.

Wyniki

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Rysunek 1 zawiera podsumowanie protokołów przetwarzania i klarowania plwociny. Przetwarzanie i klarowanie plwociny może trwać do 17 dni. Protokół można jednak przerwać, a próbki przechowywać po utrwaleniu PFA (dzień 2.) lub po klarowaniu tkanek (dni 5–17, w zależności od czasu klarowania). Na Rysunku 2 podsumowano protokoły hybrydyza...

Dyskusja

Celem tego protokołu jest umożliwienie wglądu w organizację in situ komórek P. aeruginosa w plwocinie od pacjentów z mukowiscydozą. Próbki plwociny powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia, jeżeli nie można ich natychmiast utrwalić. Wykazano, że liczba komórek P. aeruginosa w plwocinie nie zmienia się znacząco, jeśli jest przetwarzana w ciągu 1 godziny, 24 godziny lub 48 godziny, gdy jest przechowywana w temperaturze 4 °C, chociaż jeśli pozostawiona w temperaturze 25 °C przez...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
29:1 bisakryloamid akrylamidu, roztwór 30 %	BioRad	161-0146
8-komorowa szklana osłona Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Komory perfuzyjne Coverwell	Mikroskopia elektronowa Nauki	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnazy	Inhibitor Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Szczegóły zamówienia: Produkt: Zmodyfikowany Oligo DNA; Nazwa: PseaerA; Sekwencja: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synteza: 50 nmol; Oczyszczanie: HPLC; Stan statku: Pełna wydajność (sucha)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		Czerwone przeciwciała Psl0096-Texas były prezentem uprzejmie dostarczonym przez Medimmune i należy skontaktować się z firmą w przypadku pytań dotyczących zamówienia.
VA-044 Utwardzacz	Wako	27776-21-21