Udostępniamy protokół do generowania farmakologicznego modelu myszy dystonii DYT/PARK-ATP1A3 poprzez wszczepienie kaniul do zwojów podstawy i móżdżku podłączonych do pomp osmotycznych. Opisujemy indukcję ruchów podobnych do dystonii poprzez zastosowanie wyzwania motorycznego i charakterystykę fenotypu za pomocą behawioralnych systemów punktacji.
Artykuł metodologiczny
Implantacja pomp osmotycznych i indukcja stresu w celu ustalenia objawowego, farmakologicznego modelu myszy dla dystonii DYT/PARK-ATP1A3
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Genetycznie zmodyfikowane modele myszy napotykają ograniczenia, zwłaszcza podczas badania zaburzeń ruchowych, gdzie większość dostępnych transgenicznych modeli gryzoni nie prezentuje fenotypu motorycznego przypominającego kliniczne aspekty choroby ludzkiej. Farmakologiczne modele myszy pozwalają na bardziej bezpośrednie badanie patomechanizmów i ich wpływu na fenotyp behawioralny. Pompy osmotyczne połączone z kaniulami mózgu otwierają możliwość tworzenia farmakologicznych modeli myszy poprzez miejscowe i przewlekłe podawanie leków. W przypadku dziedzicznego zaburzenia ruchowego dystonii i parkinsonizmu o szybkim początku, mutacja powodująca utratę funkcji w podjednostce α3 ATPazy Na+/K+ może być symulowana przez wysoce specyficzną blokadę za pośrednictwem glikozydu ouabainy. W celu miejscowego zablokowania podjednostki α3 w zwojach podstawy i móżdżku, które są dwiema strukturami mózgu, które uważa się za silnie zaangażowane w patogenezę dystonii i parkinsonizmu o szybkim początku, dwustronną kaniulę wszczepia się stereotaktycznie do prążkowia, a dodatkową pojedynczą kaniulę wprowadza się do móżdżku. Kaniule są połączone za pomocą rurki winylowej z dwiema pompami osmotycznymi, które są wszczepiane podskórnie na grzbiet zwierząt i pozwalają na przewlekłe i precyzyjne dostarczanie ouabainy. Farmakologiczny mysi model dystonii i parkinsonizmu o szybkim początku niesie ze sobą dodatkową zaletę polegającą na rekapitulacji klinicznych i patologicznych cech bezobjawowych i objawowych nosicieli mutacji. Podobnie jak nosiciele mutacji w szybko rozpoczynającym się dystonizmie parkinsonicznym, myszy z perfuzją ouabainy rozwijają ruchy podobne do dystonii dopiero po dodatkowym narażeniu na stres. Demonstrujemy paradygmat łagodnego stresu i wprowadzamy dwa zmodyfikowane systemy punktacji do oceny fenotypu motorycznego.
Wprowadzenie
Korzyści płynące z ciągłego dostarczania leku bezpośrednio do mózgu są liczne. Można uniknąć powtarzających się i częstych zastrzyków, które stanowią niepotrzebny czynnik stresogenny dla zwierząt, i można osiągnąć bardziej stałe stężenie domózgowe leku. Jest to szczególnie ważne, gdy leki podawane ogólnoustrojowo nie przenikają łatwo przez barierę krew-mózg. Co więcej, przewlekłe dostarczanie leków za pośrednictwem pomp osmotycznych pozwala na miejscowe dostarczanie substratów, które w przeciwnym razie miałyby ogólnosystemowe skutki uboczne. Leki mogą być dostarczane w sposób ukierunkowany do pożądanych struktur mózgu, dzięki czemu można bezpośrednio prześledzić uzyskany efekt. Można to wykorzystać do wielu zastosowań, takich jak badanie efektów terapeutycznych, a także badanie patomechanizmów. Ta ostatnia aplikacja została wykorzystana w niniejszym projekcie w celu stworzenia farmakologicznego mysiego modelu dystonii.
Analiza i zrozumienie zespołów dystonicznych, które stanowią trzecie najczęstsze zaburzenie ruchowe, zostało mocno ograniczone przez fakt, że genetyczne modele zwierzęce w dużej mierze nie są w stanie odtworzyć fenotypu choroby występującego u chorego człowieka, jak również patofizjologii. Zagadnienie to nie ogranicza się do zespołów dystonicznych, ale w rzeczywistości dotyczy wielu transgenicznych modeli gryzoni w zakresie zaburzeń ruchowych1,2. Przyczyna braku fenotypu w transgenicznych modelach gryzoni może być oparta na wysoce skutecznych mechanizmach kompensacyjnych3. W przypadku dystonii choroba charakteryzuje się mimowolnymi skurczami mięśni powodującymi ruchy skrętne i nieprawidłową postawą4. Badanie wtórnych przyczyn (tj. uszkodzenia mózgu) objawów dystonicznych pomogło zidentyfikować struktury zaangażowane w manifestację tych nieprawidłowości motorycznych, takie jak zwoje podstawy5. Badania obrazowe mózgu nad dziedzicznymi formami dystonii wykazały nieprawidłowości funkcjonalne w prawie wszystkich obszarach mózgu odpowiedzialnych za kontrolę motoryczną i integrację sensomotoryczną6,7. Jednak modele gryzoni są nadal potrzebne, aby pogłębić zrozumienie dysfunkcji neuronalnych na poziomie molekularnym i sieci na dużą skalę, a także opracować opcje terapeutyczne. To właśnie w tym przypadku farmakologiczne modele myszy dają możliwość odtworzenia klinicznych i patologicznych cech choroby w bardziej precyzyjny sposób.
Dystonia-parkinsonizm o szybkim początku (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) jest jedną z dziedzicznych form dystonii. Jest to spowodowane mutacjami powodującymi utratę funkcji w genie ATP1α3, który koduje podjednostkę α3 klasy Na+/K+-ATPase8. Ponadto uznaje się, że nosiciele mutacji genowych mogą być wolni od objawów przez lata, zanim ostro rozwiną się uporczywa dystonia uogólniona i parkinsonizm po ekspozycji na stresujące wydarzenie. Rzeczywiście, penetracja DYT/PARK-ATP1A3 to niepełne i stresujące wydarzenia działające jako zakres wyzwalający, od nadmiernego wysiłku fizycznego i ekstremalnych temperatur po nadmierne spożycie alkoholu i infekcje9,10. W celu zbadania DYT/PARK-ATP1A3 i znalezienia potencjalnych interwencji terapeutycznych, wielokrotnie próbowano naśladować rozwój choroby zależny od stresu w modelach gryzoni. Jednak oprócz jednego istniejącego genetycznego modelu myszy DYT/PARK-ATP1A3, w którym przejściowe nieprawidłowe i podobne do drgawek ruchy były indukowane przez hipotermię, wszystkie opublikowane genetyczne modele myszy dla DYT/PARK-ATP1A3 nie wywołały objawów dystonicznych1,11,12. Calderon i wsp. wcześniej wykazali, że obustronne blokowanie podjednostki α3 w zwojach podstawy i móżdżku za pomocą glikozydu sercowego ouabainy u myszy typu dzikiego powoduje łagodne zaburzenia chodu13. Dodatkowe narażenie na elektryczne wstrząsy stóp w ciepłym środowisku doprowadziło do fenotypu dystonicznego i bradykinetycznego, pokazując w ten sposób, że przewlekła i ukierunkowana perfuzja ouabainy, po której następuje stres, skutecznie naśladuje fenotyp DYT/PARK-ATP1A3.
Jednakże, wystawianie zwierząt na elektryczne wstrząsy stóp w ciepłym środowisku o temperaturze 38-40 °C przez okres dwóch godzin wywołuje u zwierząt ból i niepokój, które stanowią czynniki zakłócające, szczególnie dla oceny zmian w systemie katecholaminowym związanych z rozwojem dystonii. W związku z tym opisujemy tutaj inny rodzaj paradygmatu stresu o wysokiej wartości translacyjnej, który odnosi się do faktu, że łagodne lub umiarkowane ćwiczenia zostały opisane jako wyzwalacze u pacjentów z DYT/PARK-ATP1A39. Co więcej, powtarzające się ćwiczenia są dobrze znanym czynnikiem wywołującym dystonię ogniskową14. Myszy były wielokrotnie poddawane trudnym zadaniom motorycznym, składającym się z trzech zjazdów drewnianego słupa ("test tyczki") i trzech przejazdów na aparacie Rotarod ("test wydajności Rotarod"). Umieszczanie zwierząt na szczycie 50-centymetrowego drewnianego słupa służyło do zmuszania zwierząt do zejścia, aparat Rotarod służył do poddawania myszy przymusowej aktywności poprzez umieszczenie ich na obracającym się pręcie.
Charakterystyka fenotypu motorycznego mysiego modelu dystonii jest szczególnie trudna ze względu na brak predefiniowanych testów i wyników. Jednak jedna z odmian oceny niepełnosprawności ruchowej była wielokrotnie stosowana w ciągu ostatnich lat w celu oceny nasilenia i rozkładu ruchów podobnych do dystonii u gryzoni13,15,16. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną wersję skali oceny dystonii, która okazała się skuteczna w ocenie fenotypu podobnego do dystonii zwierząt, gdy obserwowano go w okresie czterech minut. Jako drugą metodę oceny ruchów podobnych do dystonii przedstawiamy nowo opracowany system punktacji do oceny nieprawidłowych ruchów podczas testu zawieszenia ogona. Pozwala na ocenę częstotliwości i czasu trwania ruchów i postaw przypominających dystonię kończyn przednich, tylnych, a także tułowia.
Protokół
Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z obowiązującymi międzynarodowymi, krajowymi i/lub instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt. Lokalne władze w Regierung von Unterfranken w Würzburgu w Niemczech zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Zalewanie pomp osmotycznych
UWAGA: Ten krok musi być wykonany co najmniej 48 godzin przed zabiegiem. Pompy osmotyczne ALZET muszą być wstępnie napełnione, aby zapewnić, że szybkość pompowania osiągnie stan ustalony przed implantacją.
- Wcześniej przygotuj pożądany roztwór do przewlekłej perfuzji. Upewnij się, że rozpuszczalnik i środek są kompatybilne z pompami osmotycznymi i cewnikami. W ramach niniejszego projektu rozmrozić 10x roztwór podstawowy ouabainy (przechowywany w temperaturze -20 °C) w temperaturze pokojowej i wirować przez 10 s.
UWAGA: Ouabain jest toksyczny: należy obchodzić się z nim wyłącznie w rękawiczkach i otwierać tylko pod sterylnym kapturem, aby uniknąć wdychania. - Włącz sterylny kaptur; zdezynfekuj kaptur, a także wszystkie potrzebne narzędzia i materiały przed umieszczeniem ich pod maską.
- Załóż rękawice chirurgiczne przed przystąpieniem do obsługi pomp osmotycznych. Oddzielnie przygotować roztwór ouabainy przeznaczony do pomp prążkowia i móżdżku.
UWAGA: Należy wziąć pod uwagę, że stężenie roztworu w pompie do prążkowia musi być podwojone w porównaniu ze stężeniem roztworu w pompie przeznaczonej dla móżdżku. Wynika to z faktu, że pompa do prążkowia jest podłączona do podwójnej kaniuli, jednak natężenie przepływu jest takie samo jak w przypadku pompy móżdżku, która jest podłączona do pojedynczej kaniuli. - Oblicz potrzebną ilość roztworu, korzystając z następującego wzoru:
szybkość podawania masy (ko) = szybkość podawania objętości (Q) x stężenie czynnika w nośniku (C, d)
W ramach niniejszego projektu pompy osmotyczne zostały zalane i wypełnione roztworem ouabainy o stężeniu 11,2 ng/h lub 0,9% soli fizjologicznej dla grupy kontrolnej. - Wirować oba roztwory ouabainy przez 10 s i sterylny filtr (tj. 0,22 μm filtr na końcu strzykawki) do oddzielnych, nowych probówek do mikrowirówek, używając innego filtra dla każdego roztworu.
- Zważyć puste pompy osmotyczne wraz z moderatorem przepływu (około 0,4 g).
- Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml kaniulą napełniającą 27 G (najlepiej końcówką) sterylnym przefiltrowanym roztworem ouabainy lub roztworem nośnika.
- Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki, przytrzymaj pompę osmotyczną w pozycji pionowej, włóż kaniulę do końca do pompy i powoli napełniaj zbiornik, aż nadmiar roztworu pojawi się na wierzchu (unikaj szybkiego napełniania, ponieważ może to prowadzić do powstania pęcherzyków powietrza w pompie). Następnie włóż moderator przepływu do pompy (nadmiar roztworu powinien pojawić się na górze).
- Wyciągnij moderator przepływu (około 5 mm), ostrożnie zdejmij biały kołnierz nożyczkami i podłącz kawałek rurki winylowej do moderatora przepływu. Upewnij się, że cewnik ma długość około 2 cm, aby umożliwić prawidłową mobilność zwierzęcia.
- Zważyć napełnioną pompę osmotyczną jeszcze raz, aby upewnić się, że różnica w masie między napełnioną a pustą pompą jest zgodna z oczekiwaną masą załadowanego roztworu.
UWAGA: W przypadku większości roztworów wodnych masa ta jest równa objętości w mikrolitrach. Jeśli waga nie odpowiada oczekiwanej objętości, powietrze może zostać uwięzione wewnątrz pompy, którą należy opróżnić i ponownie napełnić. - Do zalewania pomp należy przygotować dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, jedną probówkę na prążkowie i jedną na móżdżek.
- Zanurz pompy w probówkach do mikrowirówek wypełnionych do połowy 0,9% roztworem soli fizjologicznej. Nie zanurzaj otwartego końca cewnika. Umieścić probówki mikrowirówkowe w termocyklerze na 48 godzin w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że pompa osiągnęła stałą szybkość pompowania przed implantacją, a cewniki są wstępnie napełnione.
2. Implantacja kaniuli i pompy osmotycznej
- Umieść mysz (samiec, C57Bl/6N, w wieku 11-12 tygodni) w komorze przeznaczonej do znieczulenia wziewnego; ustaw szybkość przepływu izofluranu na 2-3%, a szybkość przepływu tlenu na 2 l/min.
- Po głębokim znieczuleniu myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, należy ogolić czubek głowy zwierzęcia, szyję grzbietową i bliższą trzecią część grzbietu.
- Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej i kontynuuj znieczulenie izofluranem za pomocą mysiej maski anestezjologicznej przeznaczonej dla instrumentu stereotaktycznego (szybkość przepływu izofluranu 1,5-2%, 2 l/min tlenu).
- Za pomocą gumowych końcówek lub niepękających nauszników zamocuj głowę zwierzęcia w ramce stereotaktycznej, uważając, aby głowa była wypoziomowana.
- Aby zapobiec hipotermii, umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, włóż sondę temperatury doodbytniczej i ustaw temperaturę na 37 °C. Chroń oczy zwierzęcia przed wysuszeniem, używając kropli maści okulistycznej na każde oko.
- Zastosuj lek przeciwbólowy, taki jak karprofen (5 mg/kg masy ciała), podskórnie przed rozpoczęciem zabiegu.
- Za pomocą strzykawki wstrzyknąć podskórnie do 0,2 ml 0,25% bupiwakainy i odczekać 30 sekund, aż zacznie działać znieczulenie miejscowe.
- Dokładnie zdezynfekuj ogolone miejsca środkiem antyseptycznym, takim jak dichlorowodorek oktenidyny.
- Po dokładnej dezynfekcji pola operacyjnego za pomocą skalpela należy wykonać nacięcie na czubku głowy i za pomocą nożyczek kontynuować nacięcie aż do kończyn przednich. Odsłoń czaszkę za pomocą zacisków buldoga i przetrzyj okostną sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką.
- Wyrównaj długopis lub końcówkę kaniuli poplamioną czarnym tuszem z bregmą i użyj odpowiednich współrzędnych, aby zaznaczyć trzy punkty wejścia dla kaniul mózgowych na czaszce (współrzędne dla obustronnych otworów potrzebnych do perfuzji zwojów podstawy: przedni/tylny: + 0,74 mm, przyśrodkowy/boczny: +/- 1,50 mm (+ wskazujący prawą stronę, - lewa strona w stosunku do bregmy); Współrzędne otworu w linii środkowej móżdżku: przedni/tylny: - 6,90 mm). Następnie ostrożnie wywierć otwory na podwójną kaniulę przeznaczoną dla zwojów podstawy i pojedynczą kaniulę przeznaczoną dla móżdżku (Rysunek 1A).
- Wywierć czwarty otwór na małą między prążkowiem a móżdżkiem. Śruba ta zostanie ostatecznie osadzona w cemencie dentystycznym i zapewni dodatkowe mocowanie kaniul. Za pomocą cienkich kleszczyków i śrubokręta ostrożnie włóż do małego otworu, aż zostanie mocno zamocowana w czaszce. Nie należy wkręcać zbyt głęboko, ponieważ uszkadza to tkankę mózgową.
UWAGA: Zaleca się kontynuowanie implantacji pompy osmotycznej przed włożeniem kaniul osmotycznych. Pozwala to uniknąć przypadkowego uszkodzenia kaniul podczas wszczepiania pomp. - Aby stworzyć małą kieszeń na pompę osmotyczną po obu stronach grzbietu zwierzęcia, użyj kleszczyków tkankowych, aby oddzielić warstwy tkanki podskórnej. Przesuń kleszcze w kierunku jednej tylnej nogi i lekko je rozchyl, aby poszerzyć kieszeń podskórną. Powtórz tę samą procedurę dla drugiej strony, najpierw usuwając kleszcze z nacięcia, a następnie delikatnie popychając je w kierunku drugiej tylnej nogi.
UWAGA: Kieszeń powinna umożliwiać łatwe wsunięcie pompki, jednak nie powinna mieć zbyt dużo miejsca na przesuwanie się pod skórą. - Za pomocą kleszczyków tkankowych weź pierwszą pompkę wraz z połączonym kawałkiem rurki i wsuń ją do jednej kieszeni podskórnej. Powtórz tę samą procedurę z drugą pompą.
- Za pomocą uchwytu minipompki wprowadź pojedynczą kaniulę osmotyczną o niestandardowej długości 3,0 mm do otworu wywierconego w linii środkowej móżdżku. Ostrożnie odłącz główkę kaniuli i przymocuj kaniulę oraz małą z cementem dentystycznym, uważając, aby nie zakryć elementu łączącego rurkę pompy osmotycznej. Upewnij się, że cement dentystyczny otaczający kaniulę całkowicie wyschł przed kontynuowaniem zabiegu.
- Przed włożeniem podwójnej kaniuli o odległości od środka do środka 3,0 mm i niestandardowej długości 4,0 mm do obustronnie wywierconych otworów nad zwojami podstawy, przymocuj dwa krótkie kawałki rurki winylowej (0,5 cm) do dwóch elementów łączących podwójnej kaniuli. Połącz rurki winylowe z adapterem bifurkacyjnym i ostrożnie napełnij cały system przewodów, w tym adapter i kaniulę, roztworem ouabainy lub nośnikiem (temperatura pokojowa, wcześniej sterylnie przefiltrowany). Najlepiej można to zrobić za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i kaniuli napełniającej o sile 27 G wprowadzonych do pojedynczego tylnego końca adaptera bifurkacyjnego (Rysunek 1B).
- Za pomocą uchwytu minipompki ostrożnie włóż podwójną kaniulę do obustronnych otworów. Użyj zacisku, aby odłączyć główkę kaniuli i przymocuj podwójną kaniulę za pomocą cementu dentystycznego.
- Podłącz cewniki pomp osmotycznych odpowiednio do adaptera bifurkacyjnego oraz do pojedynczej kaniuli. Upewnij się, że cewniki mocno przylegają do elementów łączących kaniul.
UWAGA: Obie pompy mają równe natężenie przepływu, dlatego należy uważać, aby podłączyć pompę osmotyczną z podwójnie stężonym roztworem do adaptera bifurkacji, aby upewnić się, że to samo stężenie dociera zarówno do zwojów podstawy, jak i móżdżku. - Zamknij nacięcie na grzbiecie zwierzęcia szwami tak daleko, jak to możliwe, w kierunku czaszki, uważając, aby nie rozciągnąć nadmiernie skóry (Rysunek 1C).
- Podskórnie wstrzyknąć 0,5 ml 0,9% soli fizjologicznej, która powinna mieć temperaturę ciała, w fałd skórny po obu stronach grzbietu zwierząt, aby uniknąć odwodnienia myszy, ostrożnie unikając pomp.
3. Wyzwanie motoryczne
- Poddaj myszy z ouabainą lub nośnikiem trudnym zadaniom motorycznym jako formę łagodnej ekspozycji na stres 4 godziny po operacji i powtarzalnie co 24 godziny po operacji w celu wywołania ruchów podobnych do dystonii. Nie obejmuje to charakterystyki behawioralnej; Jego celem jest wywołanie wyższego poziomu stresu w porównaniu z normalnym trzymaniem w klatce.
- Umieść mysz na drewnianym drążku o grubości 50 cm o szorstkiej powierzchni i średnicy 1 cm, z nosem skierowanym w dół. Upewnij się, że kij jest umieszczony w dużej klatce z wystarczającą ilością ściółki na wypadek upadków. Nie jest konieczne mierzenie czasu zejścia, ale należy zwrócić uwagę na mimowolne przeprosty kończyn przednich i tylnych, które występują u zwierząt z perfuzją ouabainy podczas schodzenia ze słupa. Pozwól myszom zejść ze słupa trzy razy i pozwól na 2 minuty regeneracji między zejściami.
UWAGA: Myszy z perfuzją ouabainy powinny wykazywać pierwsze objawy, takie jak bradykinezja 4 godziny po operacji. Jednak 24 godziny po operacji myszy powinny zacząć wykazywać mimowolne przeprosty kończyn przednich i tylnych jako oznakę ruchów podobnych do dystonii podczas opadania. - W przypadku drugiego zadania motorycznego umieść myszy na obracającym się pręcie, tak jak w przypadku testu wydajności Rotarod. Aparat Rotarod nie jest używany jako miara opóźnienia do upadku, celem jest poddanie myszy wymuszonej aktywności. Umieść myszy na obracającym się pręcie trzy razy i pozwól na 2 minuty rekonwalescencji między testami.
UWAGA: Aby zwiększyć narażenie na stres, użyj przyspieszającego aparatu Rotarod. W przypadku opisanego tutaj projektu pręt przyspiesza od 5 do 50 obr./min w ustalonym czasie 300 sekund. - Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez 30 minut pomiędzy testem biegunowym a testem wydajności Rotarod i ponownie przez kolejne 30 minut przed oceną ruchów podobnych do dystonii, jak opisano w kroku 4 protokołu. Pomiędzy powtarzającymi się ekspozycjami na stres pozwól myszom na regenerację przez 24 godziny.
4. Systemy punktacji do oceny ruchów podobnych do dystonii
UWAGA: Eksperymentator powinien być zaślepiony na analizowane zadanie grupowe, aby zapobiec stronniczości. Testy behawioralne stosowane do scharakteryzowania fenotypu myszy to dwa systemy punktacji: skala oceny dystonii oceniająca nieprawidłowe, podobne do dystonii ruchy oraz ocena behawioralna za pomocą testu zawieszenia ogona. Oceń ruchy podobne do dystonii po czasie rekonwalescencji wynoszącym 30 minut po ekspozycji na łagodny stres
.- Skala oceny dystonii
UWAGA: Ze względu na brak predefiniowanych zadań behawioralnych, skala oceny dystonii została ustanowiona jako system punktacji oparty na obserwatorze, podobny do klinicznych skal oceny dystonii ludzkiej. Jest to zmodyfikowana wersja skali oceny dystonii używanej przez Calderona i wsp.13.- Rejestruj postawę i chód zwierząt przez okres 4 minut po umieszczeniu zwierząt w plastikowym lub drewnianym pudełku.
- Wynik za częstotliwość i rozkład ruchów podobnych do dystonii od 0 do 4 punktów: (0) normalne zachowanie motoryczne; (1) nieprawidłowe zachowanie motoryczne, brak ruchów podobnych do dystonii; (2) łagodne upośledzenie ruchowe z łagodnymi ruchami przypominającymi dystonię ogniskową; (3) umiarkowane upośledzenie ruchowe z ciężkimi ruchami przypominającymi dystonię ogniskową; (4) ciężkie upośledzenie, z utrzymującymi się, uogólnionymi ruchami podobnymi do dystonii (Ryc. 2). Rozważ następujące ruchy lub postawy jako podobne do dystonii: nadmierny wyprost kończyn przednich, szeroka postawa lub nadmierny wyprost kończyn tylnych, a także kifoza. Rozważ dystonię jako ogniskową w przypadku, gdy dotknięta jest pojedyncza część ciała i uogólniona, w przypadku gdy dotknięty jest tułów i co najmniej dwie inne części ciała.
- Test zawieszenia ogona
UWAGA: Test zawieszenia ogona jest często używany do obserwacji i oceny zaciskania kończyn tylnych. Jest to jednak wysoce niespecyficzny fenotyp wskazujący na upośledzenie motoryczne. Poniższy protokół proponuje system punktacji specyficzny dla ruchów podobnych do dystonii. Ze względu na uogólnienie dystonii u pacjentów z DYT/PARK-ATP1A3 należy ocenić ruchy podobne do dystonii w kończynach przednich, tułowiu i kończynach tylnych. Opracowano nowo opracowany system punktacji od 0 do 8 punktów, łączny wynik < 2 wskazywał, że nie występują ruchy podobne do dystonii (Ryc. 3).- Podnieś mysz za ogon w pobliżu jej podstawy i podnieś zwierzę. Nagraj 2-minutowy film z testu zawieszenia ogona i przypisz wynik w kolejnej, dokładnej analizie nagrania.
- Oceń kończyny przednie w skali od 0 do 4 punktów, gdzie powtarzające się lub utrzymujące się retrakcje toniczne jednej lub obu kończyn przednich, a także przeprost połączony ze skrzyżowaniem kończyn przednich, zostały sklasyfikowane jako podobne do dystonii: (0) brak nieprawidłowych ruchów; (1) zmniejszony ruch kończyn przednich z nadmiernym wyprostem łap widocznym ≥ 50% zarejestrowanego czasu; (2) łagodne ruchy kończyn przednich podobne do dystonii < 50% zarejestrowanego czasu; (3) łagodne ruchy kończyn przednich podobne do dystonii ≥ 50% zarejestrowanego czasu lub ciężkie < 50% zarejestrowanego czasu; (4) ciężkie ruchy kończyn przednich podobne do dystonii ≥ 50% zarejestrowanego czasu.
UWAGA: Zaciskanie kończyn tylnych jest nieprawidłowym ruchem, który nie powinien być oceniany jako podobny do dystonii. - Oceń kończyny tylne w skali od 0 do 3 punktów, gdzie wycofanie i zaciskanie kończyn tylnych, a także utrzymujące się nadmierne wyprostowanie oceniano jako podobne do dystonii: (0) brak nieprawidłowych ruchów; (1) zmniejszony ruch kończyn tylnych z nadmiernym wyprostem łap widocznym ≥ 50% zarejestrowanego czasu; (2) podobne do dystonii ruchy jednej kończyny tylnej; (3) Dystoniczne ruchy obu kończyn tylnych.
- W przypadku zniekształceń poprzecznych > 80% nagranego czasu, do partytury dodawany jest dodatkowy punkt.
- Umieść zwierzę z powrotem w klatce.
Wyniki
Rycina 4 została zmodyfikowana na podstawie pracy Rauschenberger i wsp.17. W celu analizy danych zarówno dla skali oceny dystonii (A), jak i testu zawieszenia za ogon (B), należy obliczyć całkowitą punktację dla każdego punktu czasowego dla każdego zwierzęcia. Średnią dla każdego punktu czasowego i każdej grupy należy przedstawić na odpowiednim wykresie. Należy zbadać rozkład wartości i zastosować odpowiedni test statystyczny w celu określenia istotności. Przy odpowiedniej liczbie zwierząt fenotyp motoryczny można wykryć zarówno za pomocą skali oceny dystonii, jak i poprzez ocenę nieprawidłowych ruchów w teście zawieszenia za ogon. Fenotyp dystonopodobny objawia się znacząco wyższą punktacją motoryczną w obu ocenach w grupie z perfuzją ouabainy poddanej stresowi w porównaniu do myszy z perfuzją ouabainy niepoddanych stresowi oraz myszy z grupy kontrolnej.
Rycina 1: Główne etapy chirurgiczne implantacji kaniuli i pompy osmotycznej. (A) Dla wskazanych współrzędnych należy obustronnie wywiercić otwory dla podwójnej kaniuli przeznaczonej do jąder podstawy oraz dla pojedynczej kaniuli umieszczonej w linii środkowej móżdżku. Po obu stronach zwierzęcia przedstawiono dwie w pełni zamontowane pompy osmotyczne. (BNa zdjęciu przedstawiono implantowaną pojedynczą kaniulę w móżdżku, utrwaloną cementem stomatologicznym. Podwójną kaniulę do jąder podstawy należy połączyć z adapterem rozgałęźnikowym i przed implantacją wypełnić ouabainą.C) Obraz zakończonej procedury. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 2: Ocena ruchów przypominających dystonię za pomocą skali oceny dystonii. W ciągu 4-minutowego nagrania wideo oceniano ruchy przypominające dystonię pod kątem ich rozmieszczenia w obrębie ciała oraz czasu trwania. Jako objawy przypominające dystonię klasyfikowano mimowolne wyprosty kończyn przednich, szeroki rozstaw łap lub wyprosty kończyn tylnych, a także kifozę. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 3: Ocena ruchów przypominających dystonię podczas testu zawieszenia za ogon. Nowo opracowany system punktacji dla ruchów nieprawidłowych podczas 2-minutowego testu zawieszenia za ogon ocenia ruchy przypominające dystonię w kończynach przednich, kończynach tylnych i tułowiu w skali od 0 do 8 punktów łącznie. W przypadku kończyn przednich za ruchy przypominające dystonię uznano hyperekstensję i krzyżowanie kończyn przednich, a także toniczne zgięcie w kierunku tułowia. W przypadku kończyn tylnych jako ruchy przypominające dystonię punktowano mimowolną hyperekstensję oraz retrakcję z wyprostem poza linię środkową. Zniekształcenie tułowia utrzymujące się przez ponad 80% zarejestrowanego czasu oceniano na jeden punkt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Reprezentatywne wykresy skali oceny dystonii oraz testu zawieszenia ogona. (AWykres przedstawia skalę oceny dystonii dla myszy perfundowanych NaCl i poddanych stresowi (czarna linia przerywana), myszy perfundowanych ouabainą i niepoddanych stresowi (pomarańczowa linia przerywana) oraz myszy perfundowanych ouabainą i poddanych stresowi (ciemnoniebieska linia). Dla każdego punktu czasowego przedstawiono wartości średnie ± błąd standardowy średniej (SEM).BWykres przedstawia ocenę nieprawidłowych ruchów podczas 2-minutowego testu zawieszenia za ogon u myszy poddanych stresowi z perfuzją NaCl (czarna przerywana linia), myszy bez stresu z perfuzją ouabainy (pomarańczowa przerywana linia) oraz myszy poddanych stresowi z perfuzją ouabainy (ciemnoniebieska linia). Analiza statystyczna skali oceny dystonii oraz punktacji testu zawieszenia za ogon została przeprowadzona przy użyciu dwustronnego testu U Manna-Whitneya. Korekcja Bonferroniego-Holma (§) wartości p wykazała istotną różnicę dla 72-godzinnego okresu obserwacji. Ciemnoniebieskie * oznaczają istotne różnice między myszami poddanymi stresowi z perfuzją ouabainy a myszami bez stresu z perfuzją ouabainy, natomiast czarne * oznaczają istotne różnice między myszami poddanymi stresowi z perfuzją NaCl a myszami poddanymi stresowi z perfuzją ouabainy, a także między myszami poddanymi stresowi z perfuzją NaCl a myszami bez stresu z perfuzją ouabainy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Ten mysi model farmakologiczny DYT/PARK-ATP1A3 pozwala na szczegółową analizę śródmózgowych zmian strukturalnych i neurochemicznych wywołanych wyłącznie przez hamowanie pompy jonów sodowo-potasowych w zwojach podstawy i móżdżku, a także zmian związanych z ekspozycją na stres. W przypadku myszy można wszczepić podskórnie maksymalnie dwie pompy osmotyczne. Przedstawiamy tutaj metodę szczegółowo opisującą przewlekłe dostarczanie leków do wielu struktur mózgu poprzez zastosowanie podwójnej kaniuli podłączonej do adaptera bifurkacyjnego oprócz pojedynczej kaniuli. Metodologia ta może być stosowana w dowolnym zastosowaniu wymagającym jednoczesnej i przewlekłej perfuzji wielu struktur mózgu.
Przedstawiamy mysi model rzadkiego zaburzenia ruchowego, w którym u pacjentów rozwijają się trwałe objawy po ekspozycji na stres. Ta przypuszczalna interakcja gen-środowisko wciąż nie jest dobrze poznana, ale może reprezentować jeden z kluczowych patomechanizmów w rozwoju DYT/PARK-ATP1A3. W przeszłości opublikowano różne metody wystawiania myszy na stres, które obejmują elektryczne wstrząsy stopami, krępowanie, zimne lub ciepłe środowisko oraz narażenie na różne zapachy 11,12,13. Starając się wystawić myszy na łagodny czynnik stresowy o wartości translacyjnej, opisujemy tutaj powtarzające się poddawanie myszy trudnym zadaniom motorycznym. W teście na tyczce zwierzęta z perfuzją ouabainy wykazały mimowolne nadmierne wyprostowanie kończyn przednich i tylnych. Ruchy te były bardzo podobne do ruchów podobnych do dystonii obserwowanych podczas 4-minutowego nagrania wideo zwierząt, a także testu zawieszenia ogona. Zastosowanie łagodnego stresu w postaci trudnych zadań motorycznych może okazać się przydatne w innych modelach mysich wykazujących objawy motoryczne lub neurodegenerację, w których interakcje gen-środowisko mają ogromny wpływ na stopień postępu choroby.
Na ogół brakuje predefiniowanych zadań behawioralnych, a także skal ocen do klasyfikowania nieprawidłowych ruchów i postaw u myszy. Większość dostępnych zadań motorycznych ujawnia niespecyficzne nieprawidłowości, takie jak zaciskanie kończyn tylnych, które jest dobrze znanym zjawiskiem w wielu mysich modelach zaburzeń ruchowych z neurodegeneracją 18,19. Dla właściwej charakterystyki fenotypu konieczne jest jednak przeanalizowanie, czy model mysi podsumowuje istotne cechy choroby. W niniejszym artykule przedstawiamy zmodyfikowaną wersję skali oceny dystonii stosowanej wcześniej do oceny niepełnosprawności ruchowej w modelach myszy z dystonią 15,16. Dodatkowo opracowaliśmy oparty na obserwatorach system punktacji dla testu zawieszenia ogona, który został ustalony podobnie do klinicznych skal oceny ludzkiej dystonii. Obie skale oceny wykazują znacznie wyższy wynik u myszy zestresowanych perfuzją ouabainy w porównaniu ze zwierzętami perfuzyjnymi, niezestresowanymi, a także zwierzętami z perfuzją nośnika. Wadą każdego systemu punktacji opartego na obserwatorach jest niezbędne szkolenie oceniających w celu zapewnienia spójnej punktacji i zmniejszenia zmienności obserwatorów, a także niebezpieczeństwo możliwej stronniczości oceniającego, jeśli nie jest on w pełni ślepy na analizowaną grupę. Jednak systemy punktacji oparte na obserwatorach nadal stanowią łatwo dostępną metodę charakteryzowania fenotypu i mogą być dostosowane do analizowanego modelu mysiego, jak to ma miejsce w niniejszym projekcie w celu oceny ruchów podobnych do dystonii. Aby zapewnić spójną punktację wśród różnych oceniających, należy udostępnić filmy szkoleniowe. Aby zmniejszyć potencjalne odchylenia, zaleca się, aby różni oceniający oceniali te same klipy wideo i aby poszczególne wyniki były uśredniane. Oba systemy punktacji wymienione w tej pracy rejestrują obecność ruchów podobnych do dystonii u zwierząt. Skale ocen mogą być dostosowywane do konkretnych wymagań w ramach projektu, tak jak to zrobili wcześniej Ip i wsp., gdzie tylko kończyny tylne były oceniane pod kątem ruchów podobnych do dystonii w mysim modelu dystonii 1 (DYT-TOR1A)20. Skale ocen mogą być uzupełnione o inne wcześniej opublikowane systemy punktacji, oceniające na przykład stopień bradykinezji u gryzoni, jak to zrobiono za pomocą oceny niepełnosprawności lokomocyjnej Calderona i wsp.13.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF DysTract do C.W.I.) oraz przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) na Uniwersytecie w Würzburgu (Z2-CSP3 do L.R.). Autorzy dziękują Louisie Frieß, Keali Röhm, Veronice Senger i Heike Menzel za ich pomoc techniczną, a także Heldze Brünner za opiekę nad zwierzętami.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% sól fizjologiczna | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Pompy osmotyczne Alzet | Durect | 4317 | model 1002, natężenie przepływu 0,25 μ |
| kotwiące | AgnTho's | MCS1x2 | o długości 2 mm z gwintem 1mm OD |
| Bulldog Zaciski | AgnTho | 13-320-035 | proste, 3,5 cm |
| Bupivacain 0,25% Jenapharm | mibe GmbH Kaniula Arzneimittel | ||
| i uchwyt do minipompy | Stoelting Co. | 51636 | przeznaczony do przechowywania główek kaniuli 3,4 mm |
| Bifurkacja kaniuli | Tworzywa sztuczne Jedna | 21Y | wykonana na zamówienie |
| rurka kaniuli | Tworzywa sztuczne Jeden | C312VT/PKG | , 0,69 mm x 1,14 mm |
| Kleszczyki Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | cienkimi kleszczami |
| Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Maska do znieczulenia gazowego do Stereotaktyka, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hartowane drobne nożyczki | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 ml / mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | wymagana recepta |
| System izofluranu Drä ger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Mü ller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | cement dentystyczny, płynny |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | cement dentystyczny, czerwony proszek |
| Adapter myszy i noworodków | Stoelting Co. | 51625 | adapter do myszy do tradycyjnego uchwytu |
| na igły | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Niepękające nauszniki i gumowe końcówki f/ Mysz Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schü lke | 118211 | |
| Złącze pompy osmotycznej Kaniula dla myszy, podwójne | Tworzywa sztuczne One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, długość 4.0 mm, odległość c/c 3.0 mm |
| Złącze pompy osmotycznej Kaniula dla myszy, pojedyncze | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, niestandardowa długość 3.0 mm |
| Oktahydrat Ouabainy 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | UWAGA: toksyczny |
| Waga precyzyjna | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Doodbytnicza sonda termiczna | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, Zoetis | Carprofen do wstrzykiwań, wymagana recepta | ||
| Podgrzewacz do gryzoni X1 z podkładką grzewczą dla myszy | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| Zestaw wkrętaków | AgnTho's | 30090-6 | |
| Frezy ze stali nierdzewnej | AgnTho | HM71009 | 0,9 mm i Oslash; żarna |
| ze stali nierdzewnej | AgnTho | HM71014 | 1,4 mm i Oslash; żarna |
| StereoDrive | Neurostar | oprogramowanie | |
| Instrument stereotaktyczny | Stoelting Co. | wykonane na zamówienie przez Neurostar | |
| Robot stereotaktyczny | Neurostar | ||
| szew: powlekany vicryl, poliglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
Bibliografia
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56(2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763(2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109(2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787(2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108(2016).
Przedruki i uprawnienia
