Artykuł metodologiczny

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

DOI:

10.3791/61640

⸱

19 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy prostą, tanią i szybką metodę oczyszczania struktury 3D zarówno mysjej, jak i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą kombinacji markerów do wizualizacji układu naczyniowego, jąder, komórek odpornościowych, neuronów i białek płaszcza lipidowo-kropelkowego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość jest głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, który zwiększa ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2 i chorób wątroby. Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej (AT) z powodu przerostu adipocytów i/lub przerostu, co prowadzi do głębokiej przebudowy jej trójwymiarowej struktury. Rzeczywiście, maksymalna zdolność AT do rozszerzania się podczas otyłości ma kluczowe znaczenie dla rozwoju patologii związanych z otyłością. Ta ekspansja AT jest ważnym mechanizmem homeostatycznym, umożliwiającym adaptację do nadmiaru pobieranej energii i unikającym szkodliwego rozlewania się lipidów na inne narządy metaboliczne, takie jak mięśnie i wątroba. Dlatego zrozumienie przebudowy strukturalnej, która prowadzi do niepowodzenia ekspansji AT, jest fundamentalnym pytaniem o dużym zastosowaniu klinicznym. W tym artykule opisujemy prostą i szybką metodę oczyszczania, która jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do badania morfologii mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Ta zoptymalizowana metoda usuwania AT jest łatwo wykonywana w każdym standardowym laboratorium wyposażonym w kaptur chemiczny, wytrząsarkę orbitalną o kontrolowanej temperaturze i mikroskop fluorescencyjny. Co więcej, stosowane związki chemiczne są łatwo dostępne. Co ważne, metoda ta pozwala na rozpoznanie struktury 3D AT poprzez barwienie różnych markerów w celu specyficznej wizualizacji adipocytów, sieci neuronalnych i naczyniowych oraz wrodzonej i adaptacyjnej dystrybucji komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej i stała się głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, biorąc pod uwagę, że osoby z otyłością mają zwiększone ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2, chorób wątroby i niektórych nowotworów.

Podstawową funkcją fizjologiczną tkanki tłuszczowej jest modulowanie homeostazy glukozy i lipidów w całym ciele1,2. W okresie karmienia adipocyty (czyli główne komórki tkanki tłuszczowej) magazynują nadmiar glukozy i lipidów dostarczonych przez posiłek w trójglicerydy. Podczas postu adipocyty rozkładają trójglicerydy na nieestryfikowane kwasy tłuszczowe i glicerol, aby podtrzymać zapotrzebowanie organizmu na energię. Podczas rozwoju otyłości tkanka tłuszczowa rozszerza się poprzez zwiększenie rozmiaru (przerost) i/lub liczby (hiperplazja) adipocytów1, w celu zwiększenia ich pojemności magazynowej. Kiedy ekspansja tkanki tłuszczowej osiąga swój limit, stały, bardzo zmienny wśród pacjentów, pozostałe lipidy gromadzą się w innych narządach metabolicznych, w tym mięśniach i wątrobie3,4, prowadząc do ich niewydolności funkcjonalnej i inicjując powikłania sercowo-metaboliczne związane z otyłością1,5. Dlatego zidentyfikowanie mechanizmów rządzących rozrastaniem się tkanki tłuszczowej jest kluczowym wyzwaniem klinicznym.

Modyfikacje morfologiczne udokumentowane w tkance tłuszczowej podczas otyłości są związane z jej patologiczną dysfunkcją. Do opisania organizacji tkanki tłuszczowej zastosowano kilka procedur barwienia, w tym aktynę6, markery naczyniowe7, markery kropelek lipidów8 i specyficzne markery komórek odpornościowych9,10. Jednak ze względu na ogromną średnicę adipocytów (od 50 do 200 μm)11, konieczne jest przeanalizowanie dużej części całej tkanki w trzech wymiarach, aby dokładnie przeanalizować dramatyczne zmiany strukturalne AT obserwowane podczas otyłości. Ponieważ jednak światło nie przenika przez nieprzezroczystą tkankę, obrazowanie w 3D dużych próbek tkanek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej nie jest możliwe. Metody oczyszczania tkanek w celu nadania im przezroczystości zostały opisane w literaturze (przegląd, patrz12), co pozwala na oczyszczenie tkanek i przeprowadzenie dogłębnej mikroskopii fluorescencyjnej całych tkanek. Metody te oferują bezprecedensowe możliwości oceny organizacji komórkowej 3D w zdrowych i chorych tkankach. Każda z opisanych metod ma zalety i wady, dlatego musi być starannie dobrana w zależności od badanej tkanki (przegląd, patrz13). Rzeczywiście, niektóre podejścia wymagają długiego okresu inkubacji i/lub użycia materiałów lub związków, które są drogie, toksyczne lub trudne do uzyskania14,15,16,17,18,19. Korzystając z jednego z pierwszych związków użytych sto lat temu przez Wernera Spalteholza do oczyszczania tkanek20, stworzyliśmy przyjazny dla użytkownika i niedrogi protokół, który jest bardzo dobrze przystosowany do oczyszczania wszystkich mysich i ludzkich magazynów tkanki tłuszczowej w dowolnym laboratorium z typowym wyposażeniem, w tym kapturem chemicznym, wytrząsarką orbitalną o kontrolowanej temperaturze i mikroskopem konfokalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został przetestowany i jest zatwierdzony dla wszystkich mysich i ludzkich magazynów białej tkanki tłuszczowej. Tkanki tłuszczowe ludzkie i mysie zostały pobrane zgodnie z prawem europejskim i zatwierdzone przez francuskie i szwedzkie komisje etyczne.

1. Utrwalenie mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej

  1. Zanurz pobraną myszą lub ludzką białą tkankę tłuszczową w co najmniej 10 ml PBS zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) w plastikowej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Potrząsaj plastikową rurką w temperaturze pokojowej na walcarce przez 1 godzinę.
  3. Pozostawić plastikową rurkę w temperaturze 4 °C na płycie do walcowania na noc, aby zakończyć mocowanie.
    UWAGA: Protokół ten jest dostosowany do dużych próbek tkanki tłuszczowej, takich jak całe poduszeczki tłuszczowe najądrza uzyskane od myszy karmionych normalną dietą (≈250 mg - ≈0,6 cm3). W przypadku większych próbek, takich jak poduszeczki tłuszczowe najądrza uzyskane od myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (≈1,5 g - ≈4 cm3) lub próbek ludzkiej tkanki tłuszczowej, chociaż protokół oczyszczania powinien doskonale działać dla całej próbki (poprzez zwiększenie stężenia PFA i mieszanin przeciwciał), na ogół kroimy kawałki tkanek około 1 g (≈2,5 cm3), aby zarezerwować pozostałe próbki do dodatkowego barwienia lub zastosowań. W przypadku PFA (krok 1.1.) zalecamy użycie około 10-krotności objętości tkanki. W przypadku mieszanin przeciwciał (kroki 3.1 i 3.4) należy zwiększyć objętość, aby całkowicie zanurzyć tkankę, i użyć plastikowej probówki o pojemności 15 ml (patrz Tabela materiałów), jeśli tkanka jest zbyt duża dla plastikowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml (patrz Tabela materiałów).

2. Permeabilizacja i nasycenie mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej

  1. Utrwaloną białą tkankę tłuszczową płukać w 10 ml PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady PFA.
  2. Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,3% glicyną (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej przez 1 godzinę przy 100 obrotach na minutę (obr./min) w celu ugaszenia pozostałych wolnych grup aldehydowych.
  3. Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przez 2 godziny przy 100 obr./min.
  4. Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 i 20% DMSO (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez noc.
  5. Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,1% Tween-20 (patrz tabela materiałów), 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholanu (patrz tabela materiałów) i 20% DMSO i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez co najmniej 24 godziny.
  6. Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100 i potrząśnij probówką w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 1 godzinę.
  7. Zanurzyć tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsnąć probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez 12 godzin, aby nasycić wszelkie miejsca, które mogłyby niespecyficznie wiązać przeciwciała.
    UWAGA: W kroku 2.7 BSA można zastąpić surowicą krwi gatunku użytego przeciwciała drugorzędowego.

3. Procedura barwienia mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej

  1. Przenieś tkankę w plastikowej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA i przeciwciałami pierwszorzędowymi (10 razy bardziej skoncentrowanymi niż w przypadku barwienia kriosekcją, ale dla każdego przeciwciała należy ocenić optymalne stężenie przeciwciał). Chronić probówkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową i wstrząsać probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez co najmniej dwa dni (patrz uwaga w kroku 1.1 i kroku 3.7.1).
  2. Wypłucz chusteczkę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i potrząśnij probówką chronioną przed światłem w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez 5 godzin. Wykonaj ten krok dwukrotnie.
  3. Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez jedną noc do dwóch dni.
  4. Przenieś tkankę do plastikowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl PBS uzupełnionego 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA i przeciwciałami drugorzędowymi (10 razy bardziej skoncentrowanymi niż w przypadku barwienia kriosekcyjnego). Chronić probówkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową i wstrząsać probówką w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez co najmniej dwa dni (patrz uwaga w kroku 1.1 i kroku 3.7.1).
  5. Opłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze 100 obr./min przez 5 godzin. Wykonaj ten krok dwukrotnie.
  6. Wypłucz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS uzupełnionej 0,2% Triton X-100, 10% DMSO i 3% BSA i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze przy 100 obr./min przez jedną noc do dwóch dni.
  7. Wypłukać chusteczkę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBS i wstrząsnąć probówką, chroniąc przed światłem, w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze z prędkością 100 obr./min przez 2 h.
    UWAGA: W celu znakowania specyficznych struktur, takich jak jądra lub aktyna, należy dodać 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI lub równoważny) i/lub znakowaną fluorescencyjnie falloidynę w kroku 3.1. gdy stosowane są tylko znakowane fluorescencyjnie przeciwciała pierwszorzędowe lub na etapie 3.4. gdy stosowane są przeciwciała drugorzędowe.
    UWAGA: Do procedury barwienia można użyć przeciwciał pierwszorzędowych już sprzężonych z fluorochromami (takich jak te stosowane w cytometrii przepływowej) i zalecamy to ze względu na zysk czasu i swoistości. Rzeczywiście, nawet jeśli można zastosować mysie przeciwciała pierwszorzędowe, a następnie drugorzędowe przeciwciała mysie, jak wykazaliśmy tutaj, często obserwowaliśmy niespecyficzne zabarwienie naczyń krwionośnych spowodowane krążącą immunoglobuliną. Dlatego, aby uniknąć tego problemu, wysoce zalecane są przeciwciała pierwszorzędowe, które są już znakowane, a tutaj przedstawiamy dowody na to, że przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej są zgodne z naszą procedurą. Jednak w szczególnym przypadku antygenu, którego ekspresja jest na niskich poziomach, obowiązkowy jest etap amplifikacji sygnału za pomocą przeciwciał drugorzędowych; gdy jedyne dostępne przeciwciało pierwszorzędowe jest wytwarzane u myszy, perfuzja serca myszy z PBS przez co najmniej 5 minut podczas ofiarowania może usunąć dużą część krążącej immunoglobuliny, a tym samym niespecyficzne barwienie.

4. Procedura oczyszczania białej tkanki tłuszczowej myszy i człowieka

  1. Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 50% etanolu i potrząsaj probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.
  2. Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 70% etanolu i potrząsaj probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.
  3. Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 95% etanolu i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.
  4. Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 100% etanolu i potrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 2 godziny.
  5. Zanurz tkankę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 100% etanolu i wstrząśnij probówką, chronioną przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez noc.
  6. Zanurzyć tkankę w szklanej butelce o pojemności 20 ml z plastikową nakrętką (patrz tabela materiałów) zawierającej 5 ml salicylanu metylu (patrz tabela materiałów) pod kapturem chemicznym i wstrząsnąć szklanym pojemnikiem, chronionym przed światłem, w temperaturze pokojowej w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: Procedurę rozliczania można znacznie przyspieszyć (w razie potrzeby), unikając kroków 4.3. i 4,5., chociaż końcowa jakość czyszczenia byłaby nieznacznie obniżona.

5. 3D-konfokalne obrazowanie oczyszczonej białej tkanki tłuszczowej

  1. Przenieść tkankę do metalowej komory obrazowania wyposażonej w szklane dno (patrz tabela materiałów) pod kapturem chemicznym i napełnić komorę świeżym salicylanem metylu.
    UWAGA: Aby zabezpieczyć tkankę na miejscu, a tym samym zapobiec jej unoszeniu się lub przesuwaniu na boki w komorze, nałóż wiele okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm (patrz Tabela materiałów) na chusteczkę podczas wkładania jej do komory.
  2. Umieść komorę obrazowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym.
  3. Zobrazuj tkankę za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (np. obiektywu 4x), aby wygenerować mapy 3D o wielkości kilku cm3 całej tkanki tłuszczowej lub próbki tkanki ludzkiej.
  4. Wybierz kilka obszarów do pobrania tkanki w większym powiększeniu. Zazwyczaj używa się obiektywu powietrznego o dużym zasięgu 20x, który zapewnia dobry stosunek rozdzielczości do głębokości. Pozyskujemy duże obrazy mozaikowe ze stosami z o głębokości od 600 do 2000 μm.
    UWAGA: Użyj obiektywu długodystansowego, aby zobrazować głębiej w tkance.

6. Ekstrakcja wyników ilościowych z obrazów 3D tkanki tłuszczowej

UWAGA: Segmentacja różnych struktur i późniejsza ekstrakcja informacji ilościowych ze stosu obrazów 3D wygenerowanych w punkcie 5 może być przeprowadzona przy użyciu dowolnej z wielu istniejących opcji oprogramowania do analizy obrazu, zarówno komercyjnego, jak i darmowego. W poniższych punktach opisujemy strategię, która jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium w celu wydobycia informacji ilościowych z obrazów 3D tkanki tłuszczowej za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).

  1. Przekonwertuj stosy 3D na format oprogramowania, aby zwolnić miejsce w pamięci.
  2. Podziel komórki na segmenty.
    1. Otwórz moduł Cell w oprogramowaniu.
    2. Zmień ustawienie Cell Detection (Wykrywanie komórek) na Plasma membrane (Barwienie błony plazmatycznej).
    3. Wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do wyznaczania obwodu komórki (falloidyna, która oznacza aktynę korową lub markery błony plazmatycznej, takie jak F4 / 80 dla makrofagów, TCR-β dla limfocytów T lub klaster różnicujących białek CD specyficznych dla podtypów komórek odpornościowych).
    4. Ustaw progi i podaj zakres oczekiwanej wielkości komórki (tj. od 1 do 200 μm w przypadku wykrywania komórek).
    5. Uruchom segmentację. Objętość odpowiadająca stosowi z zostanie wygenerowana z segmentowanymi komórkami oznaczonymi innym kolorem dla każdej z sąsiednich komórek.
    6. Zastosuj filtry statystyczne (rozmiar, okrągłość, okrągłość itp.) w zakładce statystyki, aby wykluczyć artefakty segmentacji i/lub zawęzić segmentowane komórki do komórki będącej przedmiotem zainteresowania na podstawie ich wielkości (tj. 20-200 μm dla adipocytów; 5-25 μm dla makrofagów; 1-3 μm dla limfocytów).
    7. Wyodrębnij pomiary i dane ilościowe (objętość, liczba, rozmiar, średnica itp.) z zakładki statystyki.
  3. Segmentuj składniki komórkowe (jądra, pęcherzyki itp.) lub naczynia jako strukturę.
    UWAGA: Chociaż segmentacja włókien jest bardzo przydatna do badania połączeń naczyń, używamy segmentacji modułu powierzchniowego do wyodrębnienia danych o rozmiarze, objętości i średnicach naczyń. Rzeczywiście, kwantyfikacja rozmiarów naczyń jest tracona podczas korzystania z modułu filamentów.
    1. Otwórz moduł Surface w oprogramowaniu.
    2. Wybierz kanał fluorescencyjny markera używanego do specyficznego oznaczania komponentu subkomórkowego, aby zrekonstruować go w 3D.
    3. Ustal progi i podaj zakres oczekiwanej średnicy struktury (tj. 0,5-5 μm dla jąder; 0-100 μm dla naczyń itp.).
    4. Uruchom segmentację. Zostanie wygenerowany wolumin z segmentowaną strukturą komórkową. Pomiary i dane ilościowe (objętość, liczba, rozmiar, średnica itp.) można pobrać z zakładki statystyki.
  4. Podziel naczynia na segmenty jako kontinuum rurowe.
    UWAGA: Chociaż segmentacja włókien jest bardzo przydatna do badania połączeń naczyń, używamy segmentacji modułu powierzchniowego do wyodrębnienia danych o rozmiarze, objętości i średnicach naczyń. Rzeczywiście, kwantyfikacja rozmiarów naczyń jest tracona podczas korzystania z modułu filamentów.
    1. Otwórz moduł Filamenty w oprogramowaniu.
    2. Wybierz kanał fluorescencyjny odpowiadający barwieniu naczynia.
    3. Ustaw progi intensywności fluorescencji i wybierz odpowiednią liczbę oczekiwanych węzłów łączących.
    4. Uruchom segmentację. Filamenty reprezentujące sieć naczyń zostaną wygenerowane w 3D. Pomiary można pobrać z zakładki statystyki, co pozwala na uzyskanie danych ilościowych m.in. długości naczynia, liczby rozgałęzień naczyń itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z procedury opisanej tutaj i podsumowanej w Rysunek 1, byliśmy w stanie zabarwić i optycznie oczyścić ludzką i mysią białą tkankę tłuszczową, jak pokazano w Rysunek 2A i Rysunek 2B, odpowiednio. Oczyszczoną tkankę przeniesiono do metalowej komory obrazowania w celu wykonania obrazowania konfokalnego (Ryc. 3A). Oczyszczanie drastycznie poprawiło głębię obrazów tkanek, które udało nam się uzyskać (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje, które zachodzą w tkance tłuszczowej w trakcie patologicznej progresji, takie jak otyłość, mają fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów stojących za patologią. Pionierskie badania, które ujawniły takie mechanizmy w tkance tłuszczowej, opierają się na globalnych podejściach, takich jak proteomika całej tkanki tłuszczowej21, cytometria przepływowa 22,23 i transkryptomika24,25

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez INSERM, Université Côte d'Azur, oraz przez granty z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) za pośrednictwem Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programu UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) poprzez Academy 2 "Systèmes Complexes" i Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) oraz Program dla Młodych Badaczy dla J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania C3M finansowanemu przez Conseil Départemental des Alpes-Maritimes i Région PACA, a także wspieranemu przez IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Dziękujemy Marion Dussot za pomoc techniczną w przygotowaniu tkanek. Dziękujemy Abby Cuttriss z UCA International Scientific Visibility za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówki Eppendorff 1,5 ml- Dutscher33528
Probówki plastikowe 15 mlProbówki Falcon - Dutscher352096
18 mm okrągłe szklane szkiełko nakrywkoweMariendfeld0117580
szklana butelka 20 mlWheaton986546
sprzężone przeciwciało anty-mysie-alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Rozcieńczenie: 1/100
sprzężone anty-rabbit-alexa647Jackson ImmunoResearch711-605-152Rozcieńczenie: 1/100
BSAPrzeciwciało Sigma-aldrichA6003
CD301-PEBiolegendBLE145703Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało CD31AbCamab215912Rozcieńczenie: 1/50
Komercyjne oprogramowanie do analizy 3D - instrumentIMARIS Oxfordz modułem komórkowym
Mikroskop konfokalny - Nikon A1R Nikon
DapiThermoFisherD1306Stężenie podstawowe: 5 mg / mL; rozcieńczenie 1/1000
DeoksycholanSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Przeciwciało Glut4Santa Cruzsc-53566Rozcieńczenie: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Stężenie zapasów: 2 i mikro; g/&mikro; L; Wtrysk dożylny: 50 i mikro; L/myszy
Metaliczna komora obrazowania wyposażona w szklane dno - Komora AttoFluorThermofisherA7816
Salicylan metyluSigma-aldrichM6752
Przeciwciało perylopinoweProgen651156Rozcieńczenie: 1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379Rozcieńczenie: 1/100
przeciwciało TCR-β-PBBiolegendBLE109225Rozcieńczenie: 1/100
przeciwciałoTH AbCamab112Rozcieńczenie: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
przeciwciało :

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezroczysto tkanki t uszczowejobrazowanie 3Dmikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnautrwalanie tkanekpermeabilizacja Tritonem X 100barwienie przeciwcia amiobrazowanie sieci naczyniowejmorfologia adipocyt w

Powiązane artykuły