Artykuł metodologiczny

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

DOI:

10.3791/61640

⸱

19 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy prostą, tanią i szybką metodę oczyszczania struktury 3D zarówno mysjej, jak i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą kombinacji markerów do wizualizacji układu naczyniowego, jąder, komórek odpornościowych, neuronów i białek płaszcza lipidowo-kropelkowego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość jest głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, który zwiększa ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2 i chorób wątroby. Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej (AT) z powodu przerostu adipocytów i/lub przerostu, co prowadzi do głębokiej przebudowy jej trójwymiarowej struktury. Rzeczywiście, maksymalna zdolność AT do rozszerzania się podczas otyłości ma kluczowe znaczenie dla rozwoju patologii związanych z otyłością. Ta ekspansja AT jest ważnym mechanizmem homeostatycznym, umożliwiającym adaptację do nadmiaru pobieranej energii i unikającym szkodliwego rozlewania się lipidów na inne narządy metaboliczne, takie jak mięśnie i wątroba. Dlatego zrozumienie przebudowy strukturalnej, która prowadzi do niepowodzenia ekspansji AT, jest fundamentalnym pytaniem o dużym zastosowaniu klinicznym. W tym artykule opisujemy prostą i szybką metodę oczyszczania, która jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do badania morfologii mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Ta zoptymalizowana metoda usuwania AT jest łatwo wykonywana w każdym standardowym laboratorium wyposażonym w kaptur chemiczny, wytrząsarkę orbitalną o kontrolowanej temperaturze i mikroskop fluorescencyjny. Co więcej, stosowane związki chemiczne są łatwo dostępne. Co ważne, metoda ta pozwala na rozpoznanie struktury 3D AT poprzez barwienie różnych markerów w celu specyficznej wizualizacji adipocytów, sieci neuronalnych i naczyniowych oraz wrodzonej i adaptacyjnej dystrybucji komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość charakteryzuje się wzrostem masy tkanki tłuszczowej i stała się głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, biorąc pod uwagę, że osoby z otyłością mają zwiększone ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2, chorób wątroby i niektórych nowotworów.

Podstawową funkcją fizjologiczną tkanki tłuszczowej jest modulowanie homeostazy glukozy i lipidów w całym ciele1,2. W okresie karmienia adipocyty (czyli główne komórki tkanki tłuszczowej) magazynują nadmiar glukozy i lipidów dostarczonych przez posiłek w trójglicerydy. Podczas postu adipocyty rozkładają ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został przetestowany i jest zatwierdzony dla wszystkich mysich i ludzkich magazynów białej tkanki tłuszczowej. Tkanki tłuszczowe ludzkie i mysie zostały pobrane zgodnie z prawem europejskim i zatwierdzone przez francuskie i szwedzkie komisje etyczne.

1. Utrwalenie mysiej i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej

  1. Zanurz pobraną myszą lub ludzką białą tkankę tłuszczową w co najmniej 10 ml PBS zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) w plastikowej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Potrząsaj plastikową rurką w temperaturze pokojowej na walcarce przez 1 godzinę.
  3. Pozostawić plastikową rurkę w temperaturze 4 °C na....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z procedury opisanej tutaj i podsumowanej w Rysunek 1, byliśmy w stanie zabarwić i optycznie oczyścić ludzką i mysią białą tkankę tłuszczową, jak pokazano w Rysunek 2A i Rysunek 2B, odpowiednio. Oczyszczoną tkankę przeniesiono do metalowej komory obrazowania w celu wykonania obrazowania konfokalnego (Ryc. 3A). Oczyszczanie drastycznie poprawiło głębię obrazów tkanek, które udało nam się uzyskać (Rysun.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje, które zachodzą w tkance tłuszczowej w trakcie patologicznej progresji, takie jak otyłość, mają fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów stojących za patologią. Pionierskie badania, które ujawniły takie mechanizmy w tkance tłuszczowej, opierają się na globalnych podejściach, takich jak proteomika całej tkanki tłuszczowej21, cytometria przepływowa 22,23 i transkryptomika24,25

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez INSERM, Université Côte d'Azur, oraz przez granty z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) za pośrednictwem Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programu UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) poprzez Academy 2 "Systèmes Complexes" i Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) oraz Program dla Młodych Badaczy dla J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania C3M finansowanemu przez Conseil Départemental des Alpes-Maritimes i Région PACA, a także wspieranemu przez IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'A....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówki Eppendorff 1,5 ml- Dutscher33528
Probówki plastikowe 15 mlProbówki Falcon - Dutscher352096
18 mm okrągłe szklane szkiełko nakrywkoweMariendfeld0117580
szklana butelka 20 mlWheaton986546
sprzężone przeciwciało anty-mysie-alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Rozcieńczenie: 1/100
sprzężone anty-rabbit-alexa647Jackson ImmunoResearch711-605-152Rozcieńczenie: 1/100
BSAPrzeciwciało Sigma-aldrichA6003
CD301-PEBiolegendBLE145703Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało CD31AbCamab215912Rozcieńczenie: 1/50
Komercyjne oprogramowanie do analizy 3D - instrumentIMARIS Oxfordz modułem komórkowym
Mikroskop konfokalny - Nikon A1R Nikon
DapiThermoFisherD1306Stężenie podstawowe: 5 mg / mL; rozcieńczenie 1/1000
DeoksycholanSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Przeciwciało Glut4Santa Cruzsc-53566Rozcieńczenie: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Stężenie zapasów: 2 i mikro; g/&mikro; L; Wtrysk dożylny: 50 i mikro; L/myszy
Metaliczna komora obrazowania wyposażona w szklane dno - Komora AttoFluorThermofisherA7816
Salicylan metyluSigma-aldrichM6752
Przeciwciało perylopinoweProgen651156Rozcieńczenie: 1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379Rozcieńczenie: 1/100
przeciwciało TCR-β-PBBiolegendBLE109225Rozcieńczenie: 1/100
przeciwciałoTH AbCamab112Rozcieńczenie: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
przeciwciało :

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezroczysto tkanki t uszczowejobrazowanie 3Dmikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnautrwalanie tkanekpermeabilizacja Tritonem X 100barwienie przeciwcia amiobrazowanie sieci naczyniowejmorfologia adipocyt w

Powiązane artykuły