Wszechstronny system wprowadzania próbek z podwójnym wlotem do wielomodowej analizy i walidacji spektrometrii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie z pojedynczymi cząstkami

Summary

Tutaj udostępniamy protokół użycia systemu z podwójnym wlotem dla spektrometrii mas z pojedynczymi cząstkami sprzężonymi indukcyjnie, który pozwala na standardową, niezależną charakterystykę nanocząstek.

Abstract

Nanocząstki zawierające metal (NP) można scharakteryzować za pomocą spektrometrów masowych z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) pod względem ich wielkości i koncentracji liczbowej, korzystając z trybu pojedynczej cząstki instrumentu (spICP-MS). Dokładność pomiaru zależy od konfiguracji, warunków pracy przyrządu i konkretnych parametrów, które są ustawiane przez użytkownika. Efektywność transportu ICP-MS ma kluczowe znaczenie dla ilościowego określenia NP i zwykle wymaga materiału odniesienia o jednorodnym rozkładzie wielkości i znanym stężeniu liczby cząstek.

Obecnie materiały referencyjne NP są dostępne tylko dla kilku metali i w ograniczonych rozmiarach. Jeśli cząstki są charakteryzowane bez wzorca referencyjnego, wyniki zarówno dotyczące wielkości, jak i liczby cząstek mogą być obciążone. W związku z tym, aby przezwyciężyć ten problem, opracowano konfigurację z dwoma wlotami do charakteryzowania nanocząstek za pomocą spICP-MS. Konfiguracja ta opiera się na konwencjonalnym systemie wprowadzającym składającym się z nebulizatora pneumatycznego (PN) do roztworów nanocząstek i generatora mikrokropel (μDG) do roztworów do kalibracji jonowej. Opracowano nowy, elastyczny interfejs, aby ułatwić sprzężenie μDG, PN i systemu ICP-MS. Interfejs składa się z dostępnych komponentów laboratoryjnych i pozwala na kalibrację, charakterystykę nanocząstek (NP) i czyszczenie układu, podczas gdy przyrząd ICP-MS jest nadal uruchomiony.

Dostępne są trzy niezależne tryby analizy do określania wielkości cząstek i stężenia liczbowego. Każdy tryb opiera się na innej zasadzie kalibracji. Podczas gdy mod I (zliczanie) i mod III (μDG) są znane z literatury, mod II (czułość) służy do określania efektywności transportu tylko za pomocą nieorganicznych roztworów wzorcowych jonów. Jest ona niezależna od materiałów referencyjnych NP. Opisany tutaj system wlotowy oparty na μDG gwarantuje doskonałą czułość analitu, a tym samym niższe granice wykrywalności (LOD). Osiągnięte LOD zależne od wielkości są mniejsze niż 15 nm dla wszystkich badanych NP (Au, Ag, CeO₂).

Introduction

Spektrometry masowe z plazmą sprzężoną indukcyjnie są szeroko stosowane do ilościowego określania wielkości i liczby NP w różnych próbkach i matrycach w tak zwanym trybie pojedynczej cząstki^1,2,3. Tryb pojedynczej cząstki to działanie systemu akwizycji danych z krótkim czasem integracji lub przebywania. Każdy mierzony NP wytwarza zintegrowany sygnał w tym przedziale czasu (zdarzenie mierzone w liczbach na sekundę: cps), jeśli zastosowano odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny NP w celu uniknięcia podwójnych zdarzeń. Wzorzec kalibracji, jak również próbka, są zwykle wprowadzane do ICP-MS za pomocą konwencjonalnego systemu wprowadzania próbki opartego na nebulizacji pneumatycznej (PN)⁴. Jednakże jako warunek wstępny należy określić natężenie przepływu przy wprowadzaniu próbki i efektywność transportu (η) w celu dokładnego ilościowego określenia masy metalu na NP i określenia ich stężenia liczbowego w zawiesinie. Efektywność transportu opisuje stosunek liczby wstrzykniętych mas lub cząstek do masy (metoda zbierania odpadów)) lub liczby cząstek (metoda zliczania) wykrytych przez ICP-MS⁵. Wydajność transportu jest najczęściej określana przy użyciu materiałów referencyjnych na bazie nanocząstek⁵. Jednak właściwości transportowe zależą od struktury NP i obejmują takie właściwości, jak skład i dyspergator próbki. Innymi czynnikami wpływającymi są parametry instrumentalne, takie jak szybkość pobierania próbki, szybkość przepływu gazu z nebulizatora, czas przebywania i całkowity czas pomiaru.

Ponieważ dostępne są tylko ograniczone materiały referencyjne dla nanocząstek, uzyskane wyniki analizy NP mogą być stronnicze ze względu na różnice w składzie pierwiastkowym między cząstkami referencyjnymi a cząstkami próbki. Oprócz dostępności ograniczonego zakresu materiałów referencyjnych, kolejnym wyzwaniem jest wykrywanie wielu cząstek w ciągu jednego czasu przebywania detektora. Może to również mieć wpływ na dokładność określanej wydajności transportu.

Aby być niezależnym od materiałów referencyjnych, najlepiej byłoby zastosować system wprowadzania próbek o prawie 100% efektywności transportu. Jednocześnie, gdy stosuje się małą objętość w porównaniu z konwencjonalnymi systemami wprowadzania, można zastosować wyższe stężenia cząstek. Nawet jeśli dwie cząstki znajdują się blisko siebie, obie mogą być wykrywane oddzielnie za pomocą systemu opartego na μDG.

μDG jest w stanie generować kropelki monodyspersyjne o stałej objętości w zakresie pL i jest dobrze przystosowany do tego celu^6,7^,8^,9. μDG ułatwia wstrzykiwanie do ICP-MS próbek zarówno jonowych, jak i cząstek stałych w różnych rozpuszczalnikach. W przypadku próbek metali jonowych przyjmuje się, że wytworzone kropelki są w pełni rozpuszczone w drodze do ICP. W związku z tym kropla traci całą wodę, a z pozostałej soli tworzy się cząstka. Średnica tej cząstki jest wprost proporcjonalna do zastosowanego stężenia. W ten sposób domowe wzorce referencyjne o tej samej matrycy, masie i rozmiarze, o różnym stężeniu roztworu jonowego badanego NP, mogą być produkowane we własnym zakresie. Objętość kropli można łatwo obliczyć na podstawie średnicy kropli zmierzonej przez μDG. Nie jest to możliwe w przypadku PN, który wytwarza szeroki rozkład kropel o różnych średnicach^10,11. Dzięki jednolitemu wprowadzaniu próbki przy wysokiej wydajności transportu wynoszącej 100% μDG można osiągnąć wysoką czułość analitu specyficzną dla urządzenia. W zależności od zastosowanej matrycy prowadzi to do niższych granic wykrywalności (LOD) masy i wielkości cząstek w porównaniu z wynikami konwencjonalnych systemów wprowadzania opartych na PN¹². Jednak ze względu na konstrukcję μDG nie można łatwo wymieniać próbek, gdy system ICP-MS nadal działa. Pomiędzy pomiarami różnych próbek, μDG musi zostać oczyszczony, a następnie przepłukany roztworem próbki w celu stabilizacji systemu. Ponadto jego tolerancja na ciężkie próbki matrycowe nie została w dużym stopniu przetestowana. Ponadto, ze względu na wyjątkowo niskie natężenia przepływu, czas analizy w celu uzyskania dobrych statystyk byłby niezwykle długi, co ogranicza jej praktyczne zastosowanie, gdyby analizowane były "prawdziwe" próbki, takie jak na przykład wody środowiskowe.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, μDG był wcześniej używany w połączeniu z konwencjonalnym systemem opartym na nebulizatorze pneumatycznym, któremu nadano nazwę systemu z podwójnym wlotem¹³. Wprowadzając wzorce kalibracyjne z μDG i zawiesiną NP za pomocą nebulizatora pneumatycznego do ICP-MS, Ramkorun-Schmidt i in. byli w stanie wykorzystać oba systemy¹³. Uzyskano bardzo dokładne określenie frakcji masowej metalu w Au i Ag NP, bez konieczności określania efektywności transportu. Jednak w tym systemie z podwójnym wlotem nie określono żadnych stężeń cząstek. Ponadto czyszczenie i dostrajanie systemu μDG komplikowało możliwość zastosowania go w rutynowych analizach.

W tym artykule proponujemy elastyczny interfejs z podwójnym wlotem do określania wielkości cząstek NP i stężenia liczby cząstek oraz demonstrujemy jego montaż i praktyczne zastosowanie. Podobnie jak system Ramkoruna-Schmidta i wsp., składa się on zarówno z systemu wprowadzania próbek μDG, jak i PN. Wykazaliśmy, że system z podwójnym wlotem, w obecnym stadium rozwoju, pozwala na zastosowanie trzech niezależnych trybów analizy do badania i charakteryzowania nanocząsteczek zawierających metale. Nasz system z podwójnym wlotem upraszcza procedurę kalibracji do oznaczania NP i poprawia wartościowe dane analityczne, w szczególności dokładność¹⁴. Systemy wlotowe umożliwiają wygodną wymianę próbek i czyszczenie μDG nawet wtedy, gdy ICP-MS nadal pracuje, skracając w ten sposób całkowity czas analizy i zmniejszając ryzyko niewspółosiowości. W celu przetestowania wydajności systemu do walidacji i porównywalności metod stosuje się dobrze scharakteryzowane referencyjne NP (60 nm AuNP – NIST 8013, 75 nm AgNP – NIST 8017).

Protocol

1. Montaż zestawu wprowadzającego próbkę z podwójnym wlotem

UWAGA: Szczegóły dotyczące różnych części są pokazane w Tabeli 1.

	Komponenty
Część 1	Szklany żeński kulisty przegub kulowy o długości trzpienia około 10 mm
	Szklany męski przegub kulowy o długości trzpienia około 10 mm
	Trójnik metalowy (wymiary: 1/4 cala)
	Klej szklany do metalu
	Dwa zaciski do sferycznych połączeń szklanych
Część 2	Komora natryskowa ICP-MS (sugerowany typ: komora natryskowa z koralikami uderzeniowymi, komora natryskowa cyklonowa lub podobna)
	Nebulizator pneumatyczny (sugerowany typ: nebulizator koncentryczny)
	Zacisk
Część 3	Palnik kwarcowy bez O-ringów
	Złącze przewodu gazowego zamknięte
	Złącze przewodu gazowego otwarte
	Przewodząca i elastyczna rurka silikonowa
Część 4	Piezoelektryczna jednostka generowania mikrokropel
Część 5	Jednostka kontrolna mikrokropelek

Tabela 1: Lista komponentów użytych do budowy konfiguracji z dwoma wlotami.

1. Budowa łącznika trójnikowego (Rysunek 1 Część 1).
   UWAGA: Ta część łączy konwencjonalny system wprowadzania próbek (krok 1.2) i jednostkę transportową μDG (krok 1.3).
   1. Włóż męskie i żeńskie przeguby kulowe do przeciwległych otworów złącza trójnikowego.
   2. Zabezpiecz męskie i żeńskie przeguby kulowe za pomocą kleju szkło-metal (np. kleju silikonowego).
   3. Podłącz żeński przegub kulowy do wtryskiwacza ICP-MS za pomocą zacisku.
2. Dołączenie konwencjonalnego systemu wprowadzania próbek (Rysunek 1 Część 2)
   UWAGA: Ta część jest podłączona do łącznika trójnika (krok 1.1)
   1. Połącz komorę natryskową ICP-MS z nebulizatorem pneumatycznym (PN), który pasuje do używanej komory natryskowej.
   2. Użyj zacisku, aby podłączyć wylot komory natryskowej do męskiego przegubu kulowego łącznika trójnika (opisanego w kroku 1.1).
      UWAGA: Wylot komory natryskowej jest zwykle wyposażony w żeńskie złącze przegubu kulowego. Kombinacja pokazana w Rysunek 1 składa się z nebulizatora i komory natryskiwania kulek udarowych. Zamiast studzienki natryskowej z kulką udarową można zastosować inne komory natryskowe o wydajności transportu w zakresie od 2 do 10% lub wyższej.
3. Budowa jednostki transportu mikrokropel (Rysunek 1 Część 3)
   UWAGA: Ta część łączy jednostkę złącza trójnika (krok 1.1) i jednostkę μDG (krok 1.4).
   1. Przymocuj demontowalny palnik kwarcowy, z usuniętą rurką wtryskiwacza, do stojaka laboratoryjnego z wlotem palnika na górze za pomocą odpowiednich clamps.
   2. Zablokuj wlot plazmy/gazu pomocniczego palnika za pomocą zamkniętych złączy gazowych.
      UWAGA: Próbka jest transportowana za pomocą pompy perystaltycznej do nebulizatora. Argon gazowy jest używany do nebulizacji próbek do komory natryskiwania i dalszego transportu do plazmy.
   3. Podłącz przewód helu gazowego do palnika przez wlot gazu chłodzącego za pomocą odpowiedniego złącza gazowego.
      UWAGA: Zastosowany hel gazowy służy do desolwatacji wytworzonych kropel i działa jak gaz osłonowy, zapobiegając zderzeniu kropli ze ściankami zestawu oraz zapobiegając wprowadzeniu tlenu atmosferycznego przez przyrząd ICP-MS, podczas gdy głowica wlotowa próbki μDG musi zostać usunięta w celu oczyszczenia i wymiany próbki.
   4. Podłącz przewodzącą i elastyczną rurkę silikonową o długości 30 cm (średnica wewnętrzna 0.75 cm) za pomocą adaptera do końca wyjściowego latarki (spód latarki).
   5. Podłącz dolny koniec rurki silikonowej do łącznika trójnika, rozciągając elastyczną rurkę silikonową na pozostałym pionowym metalowym połączeniu.
      UWAGA: Elastyczna silikonowa rurka umożliwia strojenie instrumentu ICP-MS za pomocą podłączonej konfiguracji.
4. Podłączenie jednostki generującej mikrokrople i jednostki sterującej generacją mikrokropel (Rysunek 1 Część 4, Część 5)
   UWAGA: Ta część jest podłączona do jednostki transportowej μDG (krok 1.3)
   1. Podłącz przygotowaną jednostkę μDG do jednostki transportu mikrokropel, wkładając głowicę μDG do końcówki wlotu próbki palnika.
   2. Podłącz zasilacz do jednostki sterującej μDG.
      UWAGA: Opisana tutaj konfiguracja składa się z dostępnej na rynku głowicy μDG i zasilacza μDG. W zależności od zastosowanej głowicy μDG konfiguracja musi być odpowiednio dostosowana.

2. Kwantyfikacja wielkości kropli

1. Użyj światła stroboskopowego i kamery CCD (np. w konfiguracji otwartej, patrz Rysunek 1 konfiguracja pomiaru rozmiaru) do robienia zdjęć wytwarzanych kropel przez μDG.
2. Skalibruj kamerę CCD, wykonując zdjęcia obiektu o znanej wielkości w zakresie μm (np. drutu miedzianego o średnicy 150 μm).
3. Zrób zdjęcia co najmniej 1 000 kropli przy ustawieniach użytych w eksperymencie (patrz Tabela 2).
4. Użyj odpowiedniego programu graficznego (patrz Spis materiałów), aby ocenić obrazy dotyczące obiektu i rozmiaru kropli w następujących krokach:
   1. Kliknij Plik i Otwórz, aby załadować obraz obiektu.
   2. Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg, aby zdefiniować obszar obiektu poprzez przesuwanie pasków przewijania.
   3. Kliknij przycisk Zastosuj, aby zastosować ustawienia.
   4. Kliknij przycisk Segment prosty.
   5. Kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby narysować linię wzdłuż obiektu.
   6. Naciśnij Ctrl + M, aby zmierzyć rozmiar obiektu.
   7. Zmierz średnicę obiektu w 5 różnych punktach.
   8. Skopiuj i wklej tabelę "Wyniki" w arkuszu kalkulacyjnym.
   9. Oblicz średnią arytmetyczną kolumny "Długość".
   10. Oblicz współczynnik proporcji pikseli (PAR): rzeczywisty rozmiar obiektu (μm)/średni rozmiar obiektu na obrazie (px).
   11. Kliknij pozycję Plik | Import | Sekwencja obrazów, aby zaimportować i załadować obrazy kropel.
   12. Kliknij opcję Prostokątny i zaznacz kroplę pierwszego obrazu.
   13. Kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładce myszy i wybierz Duplikuj, aby oddzielić kropelki sekwencji obrazu od reszty obrazu.
   14. Oddziel kropelki od tła, jak określono w kroku 2.4.2.
   15. Kliknij opcję Process (Proces) | Binarny | Erodować, aby usunąć odbicia światła na powierzchni kropli.
   16. Kliknij opcję Process (Proces) | Binarny | Rozwiń się, aby odwrócić krok "Erozji".
   17. Kliknij pozycję Analizuj | Analizowanie cząstek | Ok, aby zmierzyć wszystkie kropelki.
   18. Skopiuj i wklej tabelę "Podsumowanie" lub "Wynik" do arkusza kalkulacyjnego.
   19. Oblicz średnią arytmetyczną średnicy fretki w px.
   20. Użyj PAR, aby przekształcić średnicę w μm: średnica fretki w px/PAR.
       UWAGA: Wielkość kropel utworzonych przez μDG różni się w zależności od wybranej długości i czasu trwania impulsu prądowego przyłożonego do elementu piezoelektrycznego⁷.

3. Przygotowanie próbki

1. Przygotować jonowy roztwór kalibracyjny analitu do pomiaru w zakresie stężeń od 0,2 do 20 μg/l w rozcieńczonym kwasie (np. HCl (0,5 v/v), HNO₃ (3,5 v/v)).
2. Przygotować roztwór jonowy do jednopunktowej kalibracji w zakresie stężeń od 1 do 10 μg/l w rozcieńczonym kwasie.
3. Przygotować zawiesiny wzorcowe NP zgodnie z instrukcjami producenta lub wewnętrznymi protokołami.
   UWAGA: Kroki 3.3.1 – 3.3.4 wyjaśniają przygotowanie standardowych zawiesin NP na przykładzie Ag, Au, CeO₂ NPs.
   1. Przygotować 10 ml 0,05 μg/l roztworu AuNP dla PN i 1 μg/l roztworu AuNP w wodzie ultraczystej dla μDG. Wiruj przez 20–60 sekund przed użyciem.
   2. Przygotować roztwór AgNP o stężeniu 0,05 μg/l dla PN i roztwór AgNP o stężeniu 2 μg/l, oba w wodzie ultraczystej, dla μDG. Dobrze wstrząsaj przez 20–60 sekund przed użyciem¹⁵.
   3. Przygotuj roztwory CeO₂ NP do użycia zgodnie z wcześniejszym opisem dla tlenków metali^16,17.
   4. Przygotować 0,05 μg/l roztworu CeO₂ NP dla PN i 1 μg/L roztwór dla μDG.
      1. Odważyć 25,6 mg/ml CeO₂ NP w szklanym naczyniu o łącznej objętości 15 ml – 20 ml i dodać 10 ml 0,05 (v/v) roztworu BSA przygotowanego w wodzie ultraczystej.
      2. Użyj sonikatora opuszków palców o mocy 7,35 W, aby homogenizować roztwór cząstek przez 309 s.

4. Strojenie instrumentalne i parametry

1. Upewnij się, że generator MDG jest wyłączony i połącz konfigurację wprowadzania próbek z podwójnym wlotem, która została wbudowana w kroku 1, z wtryskiwaczem przyrządu ICP-MS za pomocą zacisku. Przepłukać układ dolotowy przez 5 – 10 minut gazem nebulizatora (Ar) i gazem transportującym kropelki (He).
   UWAGA: Przyrząd ICP-MS musi być zabezpieczony przed przenikaniem wysokich poziomów tlenu do pomieszczenia plazmowego.
2. Wyłącz gaz transportujący kropelki (He) i uruchom system ICP-MS
3. Nastroić przyrząd w trybie pomiaru, który ma być używany, korzystając ze standardowego rozwiązania do strojenia przyrządu, które jest określone przez producenta systemu ICP-MS.
   UWAGA: Standardowy roztwór strojeniowy składa się na przykład z baru, ceru, indu, uranu, bizmutu, kobaltu, litu (wszystkie 1 μg/l) w mieszaninie 2,5% (v/v) kwasu azotowego i 0,5% (v/v) kwasu solnego.
4. Oznaczanie szybkości absorpcji próbki PN.
   1. Napełnij naczynie 15 ml wody.
   2. Zważyć naczynie.
   3. Podłączyć naczynie do rurki PN.
   4. Uruchom pompę perystaltyczną, klikając przycisk uruchamiania pompy perystaltycznej w oprogramowaniu przyrządu.
   5. Uruchom 5-minutowy timer.
   6. Przewód poborowy należy wyjąć z naczynia dokładnie po 5 minutach. Ponownie zważyć naczynie.
   7. Obliczyć szybkość pobierania próbki (ml/min) za pomocą wzoru: masa naczynia przed - masa naczynia po / czas trwania.
5. W razie potrzeby zoptymalizuj parametry instrumentalne, aby poprawić czułość analitu, np. natężenie przepływu gazu w nebulizatorze, głębokość próbkowania, moc plazmy.
   UWAGA: Patrz Tabela 2 jako przykład parametrów instrumentalnych, które można zoptymalizować w systemie ICP-MS.
6. Dostosuj przepływ gazu He, aż będzie można wykryć stałą szybkość sygnału w funkcji szybkości tworzenia kropli.

parametr	wartość
ICP – Stwardnienie Rozdzielcze:
Moc Plazmy (W)	1600
Głębokość pobierania próbek (mm)	4
Natężenia przepływu (L min-1):
Gaz pomocniczy	0.65
Gaz chłodzący	14
Czasy (s)
Pozyskiwanie danych	1200
Czas przebywania (s)	0.01
interfejs:
PN Szybkość pobierania próbki (ml min-1)	0.21
Gaz do nebulizatora (L min-1)	0.92
μDG:
Średnica kapilary (μm)	75
Częstotliwość wypadania (Hz)	10
Gaz do makijażu (L min-1)	0.27
Tryb pracy	Potrójny impuls
	Zestaw 1	Zestaw 2	Zestaw 3
Napięcie (V)	53 Rozdział 53	51 Rozdział 51	Rozdział 47
Szerokość impulsu (μs)	20	25	12
Opóźnienie impulsu (μs)	4	cyfra arabska	1

Tabela 2: Wartości użytych parametrów instrumentalnych.

5. Wielomodowy pomiar próbek nanocząstek

1. Przygotowanie jednostki sterującej μDG
   1. Włącz wyłącznik zasilania jednostki sterującej μDG.
   2. Kliknij Start na pierwszym ekranie, aby uruchomić jednostkę sterującą.
   3. Kliknij Ustawienia globalne, aby wybrać tryb impulsowy, który ma być używany.
   4. Kliknij prawy przycisk graficzny w trybie impulsowym, aby wybrać tryb potrójnego impulsu.
      UWAGA: Ustawienia dla trybu potrójnego impulsu są podane w Tabeli 2.
2. Przygotowanie jednostki μDG
   1. Kliknij przycisk On/Off, aby uruchomić μDG.
   2. Napełnić naczynie na próbkę roztworem próbki, który ma być mierzony.
   3. Podłączyć naczynie na próbkę do modułu μDG.
   4. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przepuścić powietrze przez naczynie i jednostkę μDG.
   5. Podłączyć strzykawkę do portu strzykawki w zbiorniku na próbkę.
   6. Naciskać tłok strzykawki tak długo, aż z głowicy μDG zacznie wypływać stały strumień cieczy.
   7. Utrzymuj ciśnienie przez 10 s.
   8. Wyjąć strzykawkę.
   9. Umieść jednostkę μDG w strefie ostrości kamery CCD, aby obserwować powstające krople.
   10. Podłącz kamerę CCD do komputera stacjonarnego lub laptopa.
   11. Uruchom oprogramowanie kamery CCD, aby obserwować powstające kropelki
   12. Kliknij przycisk Start, aby wyświetlić podgląd na żywo kropel.
   13. Obserwuj stałe tworzenie się kropel.
   14. Umieść głowicę μDG na odwróconym palniku w systemie wprowadzania próbek z podwójnym wlotem.
3. Zweryfikuj zarówno jednostkę μDG, jak i PN dla każdego elementu będącego przedmiotem zainteresowania, mierząc wielokrotne kalibracje wielopunktowe.
   UWAGA: Do akwizycji danych ICP-MS należy używać oprogramowania powiązanego z urządzeniem.
4. Określ zakres liniowy kalibracji wielopunktowej, importując dane eksperymentalne do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.
   1. Obliczyć średnią arytmetyczną każdego punktu kalibracji.
   2. Określ współczynnik przecięcia, nachylenia i korelacji.
      UWAGA: Dla sp-ICP-MS współczynnik korelacji powinien wynosić >0,99¹⁸.
5. Wybierz stężenie w zakresie liniowym krzywych kalibracyjnych, aby później przeprowadzić kalibrację jednopunktową.
6. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby dokonać pomiaru i walidacji (przy użyciu materiałów referencyjnych, takich jak NIST 8012, NIST 8013 lub NIST 8017 lub podobnych) wielomodowej kwantyfikacji nanomateriałów (Rysunek 2).
   1. Wybierz nanocząstkę i wzorzec jonowy zgodnie z interesującym Cię analitem.
   2. Przygotować jednostkę μDG zgodnie z ppkt. 5.2 z jonowym roztworem wzorcowym.
   3. Dodać rozcieńczony roztwór kwasu (np. 0,5% v/v HCl) przez PN.
   4. Rozpocznij pomiar systemu ICP-MS w trybie czasowo-rozdzielczym.
   5. Kliknij On/Off po 120 s, aby zatrzymać μDG i wymienić rozcieńczony roztwór kwasu w PN na wzorzec jonowy.
   6. Po 330 s ponownie wymienić wzorzec jonowy na PN na rozcieńczony roztwór kwasu.
   7. W międzyczasie usuń jednostkę μDG z konfiguracji.
   8. Wymienić naczynie na próbkę (szklaną fiolkę) jednostki μDG na naczynie zawierające rozcieńczony roztwór kwasu (np. 3,5% HNO₃) w celu oczyszczenia jednostki μDG.
      1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml powietrzem.
      2. Podłączyć strzykawkę do portu iniekcyjnego jednostki μDG i opróżnić strzykawkę do momentu, aż z głowicy μDG pojawi się strumień płynu i utrzymuj ciśnienie przez 30 sekund.
      3. Przygotuj μDG zgodnie z opisem w kroku 5.2 z próbką NP i podłącz jednostkę μDG z powrotem do zestawu po 510 sekundach.
   9. Kliknij przycisk On/Off po 810 s, aby zatrzymać μDG.
   10. Rozcieńczony roztwór kwasu w PN należy wymienić na próbkę NP i mierzyć przez kolejne 300 s.
   11. Zatrzymaj pomiar po ok. 1 200 s.
   12. Wyczyść jednostkę μDG zgodnie z opisem w kroku 5.5.8.

Rysunek 2: Strategia pomiarowa dla wielomodowej kwantyfikacji nanomateriałów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analiza danych

UWAGA: Aby uprościć wszystkie kroki obliczeń, przygotowano odpowiedni arkusz kalkulacyjny (patrz Plik uzupełniający).

1. Użyj arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania, które obsługuje ramki danych, aby przetworzyć dane i zaimportować zmierzone dane. Wklej wartości intensywności całego pomiaru w arkuszu kalkulacyjnym (zawartym w elektronicznym suplemencie) w kolumnie A, dane zostaną zobrazowane. Wprowadź wszystkie niezbędne parametry eksperymentalne do obliczeń w tabeli "Parametr wejściowy".
2. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) dla μDG jonowych (I), PN jonowych (II), μDG NP (III) i PN NP (IV), wybierając odpowiednie komórki arkusza kalkulacyjnego. Korzystając z wykresu w przygotowanym arkuszu, zdefiniuj granice ROI i wprowadź wartości do tabeli "Określenie regionu zainteresowania" (komórki C1:E7).
3. Skopiuj i wklej każdy zestaw danych w osobnej kolumnie. Naciśnij przycisk Kopiuj ROI w przygotowanym arkuszu, aby podzielić pomiar na cztery ROI (kolumna M:P).
4. Oblicz średnią arytmetyczną I i II.
5. Zastosuj podejście iteracyjne do oddzielenia sygnałów cząstek lub kropelek oraz tła dla III i IV.
   1. Oblicz średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe wszystkich zmierzonych wartości.
   2. Oblicz wartość graniczną lub odciętą na podstawie wartości średniej + 5*odchylenie standardowe.
   3. Usuń wszystkie sygnały mniejsze niż wartość graniczna III i IV za pomocą polecenia Wytnij na zidentyfikowanych sygnałach cząstek. Użyj opcji Wklej, aby wkleić je w osobnej kolumnie.
   4. Powtarzaj kroki 1-3, aż wartość średnia i odchylenie standardowe będą stałe.
      UWAGA: W kolumnach od Q do BD przygotowanego arkusza przeprowadza się pięciokrotnie iteracyjne podejście do rozdzielania sygnałów tła i cząstek.
6. Obliczyć średnią arytmetyczną zidentyfikowanych sygnałów cząstek III i IV.
7. Obliczyć minimalną wykrywalną wielkość cząstek (_wielkość LOD - nm) dla μDG NP i PN NP, wykorzystując instrumentalną granicę wykrywalności analitu (LOD - liczby), czułość analitu (S_C,jonowy – liczby/(μg/L)), szybkość pobierania próbki (q_s – mL/min), wydajność transportu (η – jednostka względna) oraz gęstość materiału sypkiego (ρ – g/cm³):
   1. 
   2. 
8. Obliczyć masę (m_a,p) i wielkość cząstek (d – nm, zakładając, że cząstki są kuliste) sygnałów zidentyfikowanych cząstek dla μDG NP i PN NP zgodnie z trzema zastosowanymi trybami analizy, biorąc pod uwagę stężenie jonów metalu w roztworze wzorcowym (c_a - μg/l) i strumień jonów w osoczu (liczby/s):
   1. Masa:
   2. Rozmiar:
9. Obliczyć właściwą efektywność transportu w trybach analizy, wykorzystując liczbę wykrytych cząstek (q_p), stężenie cząstek w próbce (c_{p, użyte} - 1/ml), czułość analitu PN i MDG (S_{m, jonowy, PN,} S_{m, jonowy, MDG} – liczby/(μg/L)), objętość kropli (_kropla V – pL), czas przebywania (t_d – ms), efektywność transportu PN (η_PN), wydajność transportu μDG (η_μDG), intensywność roztworów jonowych mierzona przez PN i μDG (_{I ionc, PN,} I_{ionowy, μDG} – zlicza) oraz stężenie roztworu jonowego stosowanego w obu układach iniekcyjnych (c_{jonowy, PN,} c_{jonowy, μDG} - μg/L):
   1. Tryb I:
   2. Tryb II:
   3. 
   4. 
   5. 
   6. 
10. Załóżmy, że wydajność transportu μDG jest równa 1:¹⁹
    1. 
11. Obliczyć stężenie liczby cząstek w analizowanym roztworze NP, biorąc pod uwagę objętość wstrzykniętej próbki podczas pomiaru (_{wstrzyknięta} V):
    
    UWAGA: W przygotowanym arkuszu wszystkie obliczenia wykonywane są automatycznie po podziale. Wyniki są przedstawione w tabeli "Parametry wyjściowe" (komórki BH7:BR35) i zawierają wzory opisane powyżej, w tym poszczególne kroki obliczeń.

Results

Rysunek 3: Określanie wielkości kropli za pomocą kamery CCD. Kalibracja kamery CCD za pomocą drutu miedzianego 150 μm (A) i określenie wielkości kropli po przekształceniu uzyskanych obrazów kropel na binarny obraz kolorowy (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Walidacja konfiguracji z podwójnym wlotem. Wielopunktowa kalibracja układu wlotowego μDG(A) i PN(B) dla złota (Au), srebra (Ag) i ceru (Ce). Stosowane stężenie w zakresie 0,2 – 20 μg ^mL-1 przelicza się, w zależności od zastosowanych warunków doświadczalnych, na masę na wykryte zdarzenie. Prezentowane dane są średnimi wartościami z trzech niezależnych powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Pomiar dla konfiguracji z dwoma wlotami. Kwantyfikacja CeO₂ NP za pomocą kolorowych pasków, jak wykonano w Rysunek 2 dla różnych etapów iniekcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Próbka	Tryb analizy /	Wlot dla próbki NP	Wlot do wzorców kalibracji	η	ma, p	Rozmiar NP (d)	#NPs		Odzyskaj(%)
	η oznaczanie cząstek stałych			(%)	Panie przewodniczący, panie i panowie!	(nm)	(mL-1 x103)
Au 56 nm	Tryb-I /	PN	PN: Standardy Au ionic i AuNP	1.8 (0.1)	1.9 (0.5)	57.2 (4.3)	28.1 (0)		100
Zobacz materiał NIST 8013	Metoda liczenia
	Tryb II /	PN	PN/μDG:	1.9 (0.1)	2 (0.4)	58 (3.6)	25.6 (1.6)		91
	Współczynnik czułości		Standardy au jonowe
	Tryb III /	μDG	μDG:	100	1.7 (0.2)	55 (2.4)	394.4 (29.3)		70
	ημDG = 1		Norma Au ionic
Oczekiwany rozmiar (nm)						56,0 (0,5)
Ag 75 nm	Tryb-I /	PN	PN: Wzorce ag jonowe i AgNP	2.3 (0.2)	1.9 (0.2)	70.2 (2.3)	21.6 (0)		100
Zobacz materiał NIST 8017	Metoda liczenia
	Tryb II /	PN	PN/μDG:	2.5 (0.2)	2 (0.2)	71.5 (2.1)	20.5 (1.9)		95
	Współczynnik czułości		Wzorce agi jonowe
	Tryb III /	μDG	μDG:	100	2.5 (0.2)	76.7 (2.3)	757.1 (68.7)		88
	ημDG = 1		Wzorzec agr ioniczny
Oczekiwany rozmiar (nm)						74,6 (3,8)
CeO2 JRC NM212	Tryb-I /	PN	PN: Standardy Ce jonowe i AuNP	1.7 (0)	0.90 (0.09)	61.9 (2.0)	7.59 (0.32)		-
10-100 nm	Metoda liczenia
	Tryb II /	PN	PN/μDG:	4.9 (1.4)	1.36 (0.35)	70.6 (5.9)	5.42 (1.7)		-
	Współczynnik czułości		Wzorce ce-jonowe
	Tryb III /	μDG	μDG:	100	1.63 (0.62)	74.4 (9.2)	590 (168)		-
	ημDG = 1		Ce-jonowy wzorzec

Tabela 3: Wyniki konfiguracji z podwójnym wlotem. Wydajność transportu, frakcja masowa metalu, średnica i stężenie liczby NP dla materiałów NP Au NIST 8013, Ag NIST 8017 i CeO₂ JRC NM 212 (n=3) przy użyciu trzech trybów analizy i trzech metod określania efektywności transportu. % odzysku definiuje się jako stosunek wyznaczonej #NPs do oczekiwanej #NPs. Tabela jest przedrukowywana za zgodą reference¹⁴.

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na określenie masy i stężenia liczbowego cząstek. Formowanie się kropel μDG, w tym wielkość kropli (Rysunek 3) zostało wcześniej scharakteryzowane (Tabela 3).

Po złożeniu zestawu (Rysunek 1) i ustaleniu wielkości kropli, oba systemy wtrysku zostały zweryfikowane za pomocą standardów jonowych (Rysunek 4). Dokładność r² > 0,99 udało się osiągnąć przy użyciu obu systemów wtrysku dla wszystkich badanych pierwiastków. Istnieją jednak różnice w obu systemach ze względu na ilość wprowadzanego i transportowanego analitu. Ponieważ μDG ma bardzo wysoką wydajność transportu (do 100%), przy jednoczesnym niskim wkładzie masy obserwuje się wyższą czułość analitu w porównaniu z PN. Zmierzone stężenia wprowadzone przez μDG muszą być jednak podzielone na dwa zakresy liniowe. W przypadku Ag pierwszy zakres liniowy można zaobserwować między 0 a 0,5 fg ^zdarzenie-1, a drugi między 0,5 a ^{zdarzeniem fg-1}. Natomiast pierwszy liniowy zakres dla Ce wynosi od 0 do 0,25 fg ^zdarzenie-1, a drugi od 0,25 do 3 fg ^zdarzenie-1. Zakres liniowy dla PN dla mierzonych stężeń wydaje się być wyższy. Jest to najprawdopodobniej związane z różnicą masy wprowadzanej do ICP-MS na zdarzenie detekcji. μDG wstrzykuje stałą ilość bezwzględną w małej objętości na kroplę i zdarzenie detekcji, co skutkuje niższą wykrytą masą w porównaniu z wprowadzeniem próbek z PN.

Po udanej walidacji, eksperymenty mogą być przeprowadzane zgodnie z opisem w Rysunek 2. Wynik takich eksperymentów jest zilustrowany na rysunku Rysunek 5 do określenia wielkości cząstek i stężenia liczbowego CeO₂ NP. W ten sposób można zidentyfikować sygnały dla wprowadzonych roztworów jonowych i NP za pośrednictwem μDG i PN. Dla wszystkich badanych cząstek przeprowadzono potrójne oznaczenie.

Ocena uzyskanych danych została przeprowadzona w sposób opisany powyżej i jest podsumowana w Tabeli 3. W przypadku Au i Ag NP stosowanych do walidacji układu duel-inlet i trzech trybów analizy, certyfikowaną wielkość i stężenie liczbowe cząstek można było osiągnąć we wszystkich przeprowadzonych trybach analizy. Średnie wielkości cząstek uzyskane dla CeO₂ wynoszą od 10 do 100 nm, przy czym zakres ten jest określony przez producenta.

Rysunek 1: Projekt konfiguracji interfejsu z dwoma wlotami. Część 1 - jednostka złącza, Część 2 - konwencjonalny system wprowadzania, Część 3 - jednostka transportu mikrokropel, Część 4 - jednostka generowania mikrokropel, Część 5 - jednostka sterująca mikrokroplami oraz otwarta konfiguracja do pomiaru wielkości kropli, w tym światło stroboskopowe i kamera CCD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Celem opracowanego układu z podwójnym wlotem jest jak najdokładniejsze scharakteryzowanie i ilościowe określenie NP pod względem ich wielkości i stężenia liczbowego przy użyciu różnych trybów analizy, niezależnie od badanego analitu. Jest to możliwe dzięki połączeniu systemu wprowadzania o małej objętości (pL) i wysokim transporcie masy (do 100%) (μDG) z konwencjonalnym systemem wprowadzania (PN). Korzystając z konfiguracji przedstawionej w tej pracy, można określić specyficzną dla pierwiastka wydajność transportu wymaganą do ilościowego określenia masy cząstek na podstawie wzorców jonowych i niezależnie od materiałów odniesienia NP. Ponadto nanocząsteczki wprowadzone do ICP-MS za pomocą μDG mają węższy (AuNP) lub podobny (AgNP) rozkład wielkości cząstek. W przeciwnym razie dla CeO₂ zaobserwowano szerszy rozkład wielkości dla μDG, który można przypisać wyższej polidyspersyjności analizowanej próbki. Ze względu na wprowadzenie małej głośności dwa NP mogą być wykrywane oddzielnie od siebie, co w przeciwnym razie zostałoby zinterpretowane jako jeden NP w konwencjonalnym układzie¹⁴.

Zaletą jednostki transportowej μDG jest wysoki stopień elastyczności dzięki elastycznym rurkom silikonowym, które upraszczają ustawienie konfiguracji. Palnik z wtryskiwaczem można również regulować podczas konfiguracji, gdy jest nadal podłączony do ICP-MS. Dodatkowy przepływ gazu He zapobiega zderzeniu kropel utworzonych przez głowicę μDG ze ściankami rurki²⁰. Co więcej, gaz He pozwala na usunięcie głowicy μDG podczas wymiany próbki, nawet gdy ICP-MS nadal pracuje. Utrzymanie ICP w stanie operacyjnym ma kluczowe znaczenie dla stabilnego i solidnego pomiaru. Ponieważ głowica μDG musi być czyszczona i płukana przy każdej nowej próbce lub wzorcu, przepływ He ma kluczowe znaczenie dla działania systemu dolotowego wprowadzonego w tej pracy. Ponadto wszystkie części układu z podwójnym wlotem muszą być prawidłowo podłączone, aby zapobiec przenikaniu tlenu do systemu. W celu zmniejszenia ilości tlenu w prezentowanym układzie, układ jest przepłukiwany nebulizatorem i gazem transportującym kropelki przed zapłonem plazmy przez co najmniej 5 do 10 minut.

Kiedy uformowane kropelki docierają do jednostki łącznika, są transportowane do plazmy przez strumień cieczy w nebulizacji, określany również jako stan mokrej plazmy. W porównaniu ze stosowaniem suchego osocza prowadzi to do zwiększonej zawartości cieczy w osoczu. W konsekwencji zmniejsza się natężenie sygnału, a wraz ze wzrostem fluktuacji sygnału, tj. większe odchylenie standardowe średniego sygnału pomiarowego¹³. Jednak za pomocą μDG i stężeń w zakresie 0,2 μg/L można wykryć sygnały powyżej tła. Odpowiednia masa wtryskiwana na kroplę ma niską zawartość metalu, która jest bliska granicom wykrywalności dla niektórych pierwiastków (tj. Au, Ag, Ce). Jeśli stosuje się różne stężenia do kalibracji wzdłuż tego limitu, można zaobserwować dwa obszary liniowe z nakładaniem się na poziomie około 0,05 μg/L dla Ce i 2 μg/L dla Ag. Poniżej nakładającego się obszaru obserwowane sygnały są zbliżone do tła specyficznego dla pierwiastka²¹. Powyżej tych granic można określić liniowy zakres roboczy μDG. Nawet przy możliwości pomiaru niskich stężeń niemożliwe jest rozróżnienie jonów i NP tego samego analitu w kropli, jeśli są one obecne jednocześnie. W przeciwnym razie, przy użyciu konwencjonalnego systemu wprowadzania, średnie tło jonowe można określić i odjąć od wszystkich sygnałów, aby uzyskać tylko sygnały cząstek.

System oparty na MDG ma również kilka ograniczeń, które można częściowo obejść poprzez zastosowanie proponowanego systemu podwójnego wlotu. Jeśli jednak częstotliwość kropel μDG przekracza 50 Hz, nie jest możliwe stworzenie spójnego wzoru kropel. Powstałe kropelki mogą się zderzać, a zatem dochodzi do wymiany analitu. Prawidłowa regulacja natężeń przepływu gazu jest również ważna dla niezawodnego transportu kropli do systemu ICP-MS, a także dla prawidłowego działania PN. Proponowany system podwójnego wlotu nie obsługuje obecnie automatyzacji procedury pomiarowej, ponieważ istnieje wymóg ręcznej zmiany roztworów próbek.

W przyszłości μDG może być używany do charakteryzowania i ilościowego oznaczania nanocząsteczek w złożonych matrycach i próbkach środowiskowych. Aby zapobiec zatykaniu się μDG ze względu na wyższą lepkość roztworu, złożoność i napięcie powierzchniowe, należy zastosować odpowiednią konstrukcję głowicy. W zależności od konstrukcji głowicy μDG i działania zasilacza, możliwe jest generowanie kropel zawierających układy podobne do cząstek, takie jak komórki, micele lub nośniki lipidowe, dla których standardowe materiały referencyjne nie są w ogóle dostępne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Au jonowy (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85550.18E
Ag ionic (1000 mg L-1 stock)	Ultra Scientific, RI, USA	ICM-103
Ag NP (75nm, NIST 8017)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		nie jest już dostępny
Au NP (60nm, NIST 8013)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		nie jest już dostępny
Ce jonowy (1000 mg L-1 magazyn)	VWR, Wielka Brytania	85557.18E
CeO2 (10-100nm, NM212)	Wspólne Centrum Badawcze UE	NM212
Excel 2016	Microsoft
Fiji	ImageJ
Szklana żeńska kula kulista + Szklana męska kula	Fisher Scientific	12499016
HCl (emprove bio)	Merck, Niemcy	100317
Komora natryskowa ICP-MS z koralikiem ipact	LabKings	LK6-45013 (OEM 3600170)
Metalowe zaciski do sferycznego złącza szklanego	Fisher Scientific 11322015
Metalowy trójnik	Swagelok	SS-4-VCR-T Głowica
dozująca mikrokrople, niepodgrzewana	mikrokropla Technologie	944
System dozowania mikrokropli MD-E-3000	microdrop Technologie
Woda MilliQ (gradient MilliPore)	Merck MilliPore, Darmstadt, Niemcy
Palnik kwarcowy bez o-ringów	Nebulizator	450-301
PFA-ST	Elemental Scientific	ES-2042
60° Shore - Utwardzany platyną -	Silex
XIMEA Cam Tool	XIMEA