Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

DOI:

10.3791/61654

⸱

16 sierpnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty do mózgu są najbardziej śmiertelnymi zmianami nowotworowymi; 10-30% wszystkich nowotworów daje przerzuty do mózgu, a mediana przeżycia wynosi tylko ~5-20 miesięcy, w zależności od typu nowotworu. Aby zmniejszyć obciążenie guzem z przerzutami do mózgu, należy wypełnić luki w wiedzy podstawowej i translacyjnej. Do głównych wyzwań należy niedostatek powtarzalnych modeli przedklinicznych i związanych z nimi narzędzi. Trójwymiarowe modele przerzutów do mózgu mogą dostarczyć odpowiednich danych molekularnych i fenotypowych wykorzystywanych do zaspokojenia tych potrzeb w połączeniu z dedykowanymi narzędziami analitycznymi. Co więcej, w porównaniu z modelami mysimi, modele narządów na chipie komórek nowotworowych pacjenta przechodzących przez barierę krew-mózg do mikrośrodowiska mózgu generują wyniki szybko i są łatwiejsze do interpretacji za pomocą metod ilościowych, dzięki czemu są podatne na testy o wysokiej przepustowości. Tutaj opisujemy i demonstrujemy zastosowanie nowatorskiej platformy 3D mikroprzepływowej niszy krew-mózg (μmBBN), na której wiele elementów niszy może być hodowanych przez dłuższy czas (kilka dni), obrazowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej, a obrazy rekonstruowane przy użyciu innowacyjnej techniki tomografii konfokalnej; wszystkie miały na celu zrozumienie rozwoju mikroprzerzutów i zmian w mikrośrodowisku guza (TME) w sposób powtarzalny i ilościowy. Pokazujemy, jak za pomocą tej platformy wytwarzać, wysiewać, obrazować i analizować komórki nowotworowe oraz komponenty komórkowe i humoralne TME. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób sztuczna inteligencja (AI) jest wykorzystywana do identyfikacji wewnętrznych różnic fenotypowych komórek nowotworowych, które są zdolne do przejścia przez model μmBBN i przypisywania im obiektywnego wskaźnika potencjału przerzutowego do mózgu. Zbiory danych wygenerowane tą metodą mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na podstawowe i translacyjne pytania dotyczące przerzutów, skuteczności strategii terapeutycznych oraz roli TME w obu tych obszarach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty do mózgu są najbardziej śmiertelnymi zmianami nowotworowymi; 10-30% wszystkich nowotworów daje przerzuty do mózgu, z medianą przeżycia wynoszącą tylko ~5-20 miesięcy, w zależności od typu nowotworu1,2. Głównym pytaniem, które pojawia się podczas badania przerzutów raka, jest to, w jaki sposób subklony migrują ze środowiska humoralnego krwiobiegu do narządu takiego jak mózg3,4. To pytanie doprowadziło do powstania wielu wariantów testów migracji, inwazji i wynaczynienia. Wszystkie te metody mają wspólny krytyczny etap, jakim jest zliczanie lub mierzenie właściwości komórek, które przemieszczają się z jednego miejsca do drugiego w odpowiedzi na bodziec. Większość łatwo dostępnych testów migracji jest wykorzystywana do badania dwuwymiarowej (2D) migracji komórek nowotworowych. Wyjaśniły one bogactwo wiedzy; Nie podsumowują one jednak trójwymiarowej natury systemu in vivo, którą mogą zapewnić inne metody5. W związku z tym konieczne jest badanie mikrośrodowiska nowotworu (TME) w systemach trójwymiarowych (3D), ale dostępne podejścia analityczne dla struktur 3D są ograniczone i często niespójne.

Jednym z najpopularniejszych narzędzi 3D jest komora Boydena, która składa się z membrany zawieszonej na dnie studni, oddzielającej dwa odrębne obszary. Boyden przedstawił test do badania chemotaksji leukocytów4. Dolne obszary mogą być zróżnicowane w zależności od chemii lub w inny sposób6,7, aby skłonić komórki w górnym obszarze do migracji do dolnego obszaru. Najczęstszym podejściem do ilościowego określania liczby komórek, które migrowały, jest uwolnienie komórek z dna błony za pomocą roztworu buforowego, ich liza, a następnie policzenie na podstawie ilości zawartości DNA w roztworze7. To pośrednie podejście jest podatne na błędy operatora ze względu na zmienność techniki, a procedura niszczy informacje o fenotypie raka i mikrośrodowisku. Warianty testu z komorą Boydena polegają na utrwaleniu komórek migrujących, które pozostają na błonie, ale zapewniają tylko liczbę komórek, które nie są już zdolne do kontynuowania badania6,8,9.

Ze względu na ograniczenia komory Boydena i rozwój innowacji w społeczności mikroprzepływowej, opracowano chipy do testowania migracji, które obserwują ruch komórek w odpowiedzi na bodziec w jednym kierunku, a nie w trzech10,11,12. Te testy migracji ułatwiają kontrolę nad takimi czynnikami, jak przepływ lub separacja pojedynczych komórek13,14, które umożliwiają lepszą interpretację wyników; jednak ich format 2D nieuchronnie traci część dynamicznych informacji. Ostatnie badania koncentrowały się na wynaczynieniu (tj. przemieszczaniu się komórek z krążenia do tkanki, takiej jak bariera krew-mózg) w środowisku 3D14,15. Odległość wynaczynienia w tkance i zachowanie sondujące, które zachodzi na barierze/błonie komórkowej, jest bardziej wyrafinowane niż pomiary zebrane przy użyciu komory Boydena lub urządzenia do migracji mikroprzepływowej 2D16. W związku z tym urządzenia, które umożliwiają odpowiednie obrazowanie i analizę wynaczynienia 3D, mają kluczowe znaczenie dla uchwycenia tych wyrafinowanych pomiarów, ale brakuje ich w literaturze.

Niezależnie od testów migracji, opracowano solidne techniki obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i tomografii, które są w stanie zidentyfikować i dokładnie zrekonstruować tkankę w przestrzeni 3D17,18. Techniki te polegają na pozyskiwaniu obrazów w stosach z i segmentowaniu części obrazu na podstawie właściwości tkanki, a następnie przekształcaniu podzielonych na segmenty obrazów w trójwymiarowe siatki19,20,21. Dzięki temu lekarze mogą wizualizować w 3D poszczególne narządy, kości i naczynia, aby pomóc w planowaniu chirurgicznym lub diagnozowaniu raka lub choroby serca22,23. Tutaj pokażemy, że podejścia te można dostosować do stosowania na próbkach mikroskopowych i urządzeniach do wynaczynienia 3D.

W tym celu opracowaliśmy innowacyjną technikę tomografii konfokalnej, przedstawioną tutaj, która zapewnia elastyczność w badaniu wynaczynienia komórek nowotworowych przez błonę poprzez adaptację istniejących narzędzi tomografii. Takie podejście umożliwia badanie pełnej gamy zachowań komórek nowotworowych podczas interakcji z barierą komórkową, taką jak warstwa komórek śródbłonka. Komórki rakowe wykazują zachowania sondujące; Niektóre mogą zaatakować, ale pozostają blisko błony, podczas gdy inne łatwo przechodzą przez barierę. Ta technika jest w stanie dostarczyć informacji o fenotypie komórki we wszystkich wymiarach24. Zastosowanie tego podejścia do badania TME jest zarówno stosunkowo niedrogie, łatwe w interpretacji, jak i powtarzalne w porównaniu z bardziej złożonymi modelami mysimi in vivo. Przedstawiona metodologia powinna stanowić solidną podstawę do badania wielu typów nowotworów i mikrośrodowisk poprzez adaptację obszaru zrębu

.

Opisujemy i demonstrujemy użycie platformy 3D mikroprzepływowej niszy krew-mózg (μmBBN) (Rycina 1), gdzie krytyczne elementy bariery i niszy (komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu i astrocyty) mogą być hodowane przez dłuższy okres (około do 9 dni), obrazowane fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej, a obrazy rekonstruowane za pomocą naszej techniki tomografii konfokalnej (Rysunek 2); Wszystkie miały na celu zrozumienie rozwoju mikroprzerzutów i zmian w mikrośrodowisku guza w sposób powtarzalny i ilościowy. Interfejs bariery krew-mózg z niszą mózgową składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, które są wzmocnione przez błonę podstawną, stopy astrocytów i perycyty25. Wybiórczo skupiliśmy się na składnikach astrocytów i śródbłonka, biorąc pod uwagę ich znaczenie w tworzeniu i regulacji bariery krew-mózg. Pokazujemy, jak wytwarzać, wysiewać, obrazować i analizować komórki rakowe oraz składniki komórkowe i humoralne mikrośrodowiska nowotworowego za pomocą tej platformy. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać uczenie maszynowe do identyfikacji wewnętrznych różnic fenotypowych komórek nowotworowych, które są zdolne do przejścia przez model μmBBN i przypisania im obiektywnego wskaźnika potencjału przerzutowego do mózgu24. Zbiory danych wygenerowane tą metodą mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na podstawowe i translacyjne pytania dotyczące przerzutów, strategii terapeutycznych i roli TME w obu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj formę niszy bariery krew-mózg

UWAGA: Urządzenie do hodowli używane na tej platformie to rusztowanie oparte na PDMS, na którym budujemy niszę komórkowej bariery krew-mózg. Zbudowany jest z dwóch części oddzielonych porowatą membraną. Do przygotowania niszy bariery krew-mózg potrzebne są dwie formy SU-8 wykonane metodą fotolitografii26,27. Protokół zostanie najpierw opisany dla formy o grubości 100 μm, a następnie zostaną podane uwagi dla formy o grubości 200 μm.

  1. Aby przygotować formę, wyczyść 4-calową płytkę silikonową za pomocą acetonu z butelką do wyciskania, a następnie wysusz ją pistoletem do azotu.
    1. Piecz wafel silikonowy na płycie grzejnej przez 10 minut w temperaturze 200 °C, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalnika.
    2. Z kolei wyśrodkuj wafel silikonowy na uchwycie powlekarki wirowej i dozuj 1 ml SU8-2075 na górną formę. Wirować przez 5 s przy 500 obr./min (przyspieszenie 300 obr./min), aby rozproszyć fotorezyst, a następnie 30 s przy 2200 obr./min (przyspieszenie 300 obr./s), aby uzyskać powłokę SU-8 o grubości 100 μm. Aby osiągnąć określoną grubość, może być konieczna optymalizacja.
  2. Wafelek pieczemy na miękko na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie od razu w temperaturze 98 °C przez 20 minut.
  3. Umieść wafel w lampie fotolitograficznej i umieść maskę wyśrodkowaną na płytce zgodnie ze standardowymi procedurami. Naświetlić płytki pokryte SU-8 promieniowaniem 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm). Można przeprowadzić eksperyment z matrycą ekspozycji w celu określenia optymalnej dawki. Projekty masek są dostępne w pliku uzupełniającym 1.
  4. Wykonaj pieczenie po ekspozycji w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast w temperaturze 98 °C przez 10 minut, aby poprawić przyczepność. Schłodzić wafel do temperatury 50 °C.
  5. Usuń nienaświetlony rezystancję za pomocą wywoływacza fotograficznego SU-8. Opłucz wafel w wywoływaczu przez 5 minut w kąpieli, a następnie użyj butelki z rozpylaczem wypełnionej wywoływaczem SU-8 w kapturze chemicznym, aby wymieszać i usunąć pozostały nieutwardzony SU-8. Mikroskop 4x może być używany do obserwacji, czy cały nieutwardzony SU-8 został usunięty. Biała linia na krawędziach elementów fotorezystu wskazuje, że SU-8 nie został całkowicie usunięty.
  6. Ostatnie pieczenie na twardo w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 60 minut.
  7. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla formy o grubości 200 μm przy użyciu SU-8 2075, ale dostosuj protokół do następujących:
    1. Ustawienia powlekarki wirowej: Wirowanie przez 5 s przy 500 obr./min (przyspieszenie 300 obr./min) w celu rozproszenia fotorezystu, a następnie 30 s przy 1300 obr./min (przyspieszenie 300 obr./min), aby uzyskać powłokę o grubości 200 μm.
    2. Piec na miękko w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 98 °C przez 40 minut.
    3. Czas naświetlania 340 mJ/cm2.
    4. Pieczenie po ekspozycji: 2 min w temperaturze 65 °C, a następnie w temperaturze 98 °C przez 15 min.
  8. Na koniec sylianizować każdą płytkę, umieszczając ją w komorze próżniowej wewnątrz okapu chemicznego z plastikowym pojemnikiem, w którym umieszczono 3 krople (~150 μL) roztworu silanizującego (Trichloro perfluoro oktylosilan). Wyciągnij odkurzacz i pozostaw na noc, aby para pokryła wafel. Ten krok zmniejsza przyczepność między SU-8 i PDMS, zwiększając żywotność formy.
    UWAGA: Trichloro perfluoroktylosilan należy zawsze obchodzić się z wyciągiem i trzymać z dala od źródeł wody.
  9. Umieść poszczególne foremki waflowe na szalkach Petriego o średnicy 150 mm za pomocą dwóch pasków taśmy dwustronnej. Upewnij się, że wafle są płaskie. Alternatywą jest wykonanie aluminiowej formy, w której można umieścić wafel. Ponieważ aluminiowa forma jest zamknięta, będzie produkować odlewy o jednolitej grubości, podczas gdy metoda szalki Petriego jest wrażliwa na nachylenie powierzchni, na której jest umieszczona. Poprawiona płaskość odlewów PDMS skraca czas obrazowania konfokalnego.

2. Sformuj i zmontuj urządzenie PDMS bariery krew-mózg (BBB)

  1. Wymieszaj 75 g PDMS w stosunku wagowym 1:10 (Crosslinker:Base) w plastikowym kubku.
  2. Wlać PDMS na formy (o grubości 1 mm dla formy o grubości 200 μm i 4 mm dla formy o grubości 100 μm) i odgazować w eksykatorze próżniowym przez godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 65 °C. Grubość 1 mm można regulować w zależności od odległości roboczej obiektywu 10x w mikroskopie konfokalnym.
  3. Po utwardzeniu PDMS użyj ostrza, aby delikatnie przeciąć płytkę przez PDMS wokół krawędzi. Odklej PDMS i użyj ostrza, aby przeciąć wzdłuż prostokątnych prowadnic i stemple do biopsji 1,5 mm, aby otworzyć wloty i wyloty urządzenia. Przykryj części urządzenia PDMS taśmą pakową o szerokości 48 mm, aby utrzymać je w czystości przed kurzem i zanieczyszczeniami.
  4. Następnie za pomocą nożyczek preparacyjnych wyciąć prostokąt membrany poliwęglanowej o wymiarach 5 mm x 50 mm z porami 5 μm i przechowywać go na szalce Petriego do późniejszego wykorzystania.
  5. Zebrać następujące elementy: końcówkę do pipety o pojemności 200 μl, 2 ml PDMS w proporcji 1:10 zmieszanej z toluenem w stosunku wagowym 2:3 do szklanej fiolki, pipetę Pasteura z bańką do wyciskania, przygotowaną górną i dolną część PDMS, membranę, trzy szkiełka podstawowe o wymiarach 50 mm x 75 mm i przetransportować wszystko do powlekarki wirowej. Następujące kroki montażu i rozmieszczania komórek urządzenia są przedstawione w Rysunek 1.
  6. Za pomocą pipety Pasteura przenieś 1 ml roztworu kleju PDMS:toluen do szkiełka o wymiarach 50 mm x 75 mm na uchwycie wirówki. Wiruj przez 5 sekund przy 100 obr./min (przyspieszenie 300 obr./min/s) i 30 sekund przy 2000 obr./min (przyspieszenie 300 obr./min/s).
  7. Umieść szkiełko na stole i przykryj je jedną górną komorą PDMS i jedną dolną komorą, tak aby powierzchnie PDMS z uformowanymi w niej elementami stykały się ze szkiełkiem, a klej został przeniesiony na powierzchnię PDMS, wyznaczając obwód wszystkich elementów.
  8. Odwróć górną komorę PDMS na inny szkiełko z powłoką klejową skierowaną do góry i ostrożnie umieść membranę w poprzek urządzenia między wlotami i wylotami. Umieść końcówkę o pojemności 200 μl w roztworze kleju PDMS: toluen, aż trochę wsiąknie w końcówkę. Dotknij końcówki między każdym wlotem i wylotem, aby umieścić małą kroplę w pobliżu krawędzi membrany, w miejscu, w którym styka się z PDMS.
  9. Zdejmij drugą połowę urządzenia i umieść je z powłoką klejową w dół, wyrównując wloty i wyloty na dwóch częściach.
  10. Zmontowane urządzenie należy wstawić na noc do piekarnika w temperaturze 37 °C, aby utwardzić klej. Przełóż do próżniowego słoika dzwonowego ze środkiem osuszającym i pozostaw do odwodnienia na dwa dni. Jest to kluczowy krok, aby umożliwić odparowanie toluenu i poprawić konsystencję wysiewu urządzenia poprzez regulację pochłanianej pary wodnej w powietrzu laboratoryjnym.

3. Wprowadź mikrośrodowisko mózgu do urządzenia

  1. Hodowla komórkowa i odczynniki: Przed rozpoczęciem tego protokołu należy uzyskać następujące odczynniki i komórki. Hodować wszystkie linie komórkowe w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C w 5% CO2 .
    1. Utrzymuj ludzką potrójnie ujemną linię komórkową raka piersi MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) i komórki MDA-MB-231-BR-GFP (uzyskane od dr Patricii Steeg) w DMEM z 4,5 g / L glukozy, uzupełnioną 2 mM L-glutaminą, 10% FBS i 1x antybiotyko-antybiotykiem. Utwórz komórki fluorescencyjne MDA-MB-231-GFP, transdukując komórkę MDA-MB-231 z pustym wektorem lentiwirusa pLL-EV-GFP. Przed eksperymentem należy posortować transdukowaną populację GFP+ za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
    2. Utrzymuj komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu hCMEC / D3 w pożywce EGM-2. Utwórz komórki fluorescencyjne hCMEC / D3-DsRed poprzez transdukcję hCMEC / D3 z pustym wektorem lentiwirusa pLL-3.7-dsRed. Usuń wszystkie nietransdukowane, niefluorescencyjne komórki z hodowli za pomocą FACS przed użyciem eksperymentalnym.
    3. Utrzymuj normalne ludzkie astrocyty (NHA) w DMEM uzupełnione 4,5 g / L glukozy, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM pirogronianu sodu, 1x suplement wzrostu N-2 i 1x antybiotyk przeciwgrzybiczy. Unieśmiertelnić astrocyty poprzez transdukcję wektora lentiwirusowego pLOX-TERT-iresTK (Addgene 12245). Utwórz wektor za pomocą plazmidu psPAX2 i plazmidu kopertowego pMD2.G (Addgene 12260 i 12259).
  2. Wyjąć urządzenie μmBBN z eksykatora próżniowego i umieścić na powierzchni metalowej lub papierowej (tj. taśmy) wlotami skierowanymi w dół i umieścić je w komorze plazmowej. Umieść również szkiełko o wymiarach 50 mm x 75 mm w komorze plazmowej. Wyciągnij próżnię, a następnie traktuj plazmą o mocy 80 W przez 30 s.
  3. Szybko wyjmij szkiełko i urządzenie z komory plazmowej i umieść urządzenie wlotami skierowanymi do góry na szkiełku podstawowym wyrównane za pomocą prowadnicy (plik uzupełniający 2). Stworzy to trwałe połączenie między PDMS a szkiełkiem podstawowym i nie będzie można go ponownie ustawić.
  4. Następnie odetnij końcówki 16 końcówek do pipet o pojemności 200 μl, w odległości 2 mm od końcówki. Włóż końcówki pipet do wszystkich wlotów i wylotów. W tym momencie urządzenie można umieścić z powrotem w eksykatorze próżniowym, jeśli nie jest gotowe do wysiewu komórek.
  5. Umieść urządzenie z powrotem w komorze plazmowej i traktuj plazmą przez 8 minut o mocy 200 W. Po ostygnięciu urządzenia (5 minut) po zabiegu plazmowym należy umieścić je w sterylnym pojemniku wtórnym, takim jak przezroczyste pudełko z końcówkami do pipet. Kolejny krok należy wykonać w ciągu ~15 minut, w przeciwnym razie skuteczność zabiegu plazmowego może ulec zmniejszeniu, co doprowadzi do zatkania.
  6. Kilka dni przed eksperymentem posaz szalki Petriego składające się z 1 x 106 komórek śródbłonka (hCMEC/D3-DsRed) i 1 x 106 astrocytów (NHA). Podczas gdy urządzenie poddawane jest 8-minutowej obróbce osoczem, przygotuj roztwór kolagenu składający się z 0,5 ml 3 mg/ml kolagenu bydlęcego PureCol typu I z 64 μL 0,8 MNaHCO3 i 20 μL 10x MEM o wysokiej zawartości glukozy (250 mM). Zawieś 5,0 x 105 komórek NHA w roztworze kolagenu. Utrzymuj roztwór na lodzie, gdy nie jest używany.
  7. Przenieś 120 μl roztworu kolagenu/astrocytów/mikrogleju do urządzenia przez końcówkę pipety do dolnej komory (Rysunek 1 Czerwone strzałki). Pozwolić, aby roztwór przesączył się przez komorę do przeciwległej końcówki pipety. Po wypełnieniu wszystkich czterech kanałów urządzenia umieść chip w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 1 godzinę lub do momentu związania kolagenu.
  8. Po zastygnięciu kolagenu napełnij wszystkie końcówki pipet zasilające dolną komorę mieszanką kompletnego podłoża. W przypadku chipów zawierających komórki śródbłonka i astrocyty stosuje się mieszaninę pożywki śródbłonka i astrocytów w proporcji 50:50.
  9. Pokryj górną komorę 2% czynnikiem wzrostu Matrigel w kompletnym podłożu śródbłonkowym za pomocą końcówki pipety w górnej komorze (ryc. 1 Niebieskie strzałki) i umieść w inkubatorze na 1 godzinę.
  10. Przepłucz górną komorę wskazaną mieszanką pożywek i naprzemiennie, która końcówka jest wysiana komórkami śródbłonka (ryc. 1 Zielone strzałki). Zawieś 1 x 106 komórek śródbłonka w 1 ml pożywki śródbłonkowej i wysiewaj 30 μl co 15 minut na naprzemiennych końcach górnej komory, aby uzyskać równomierne pokrycie. Umieść komórki śródbłonka w każdej górnej komorze dwukrotnie, w sumie 4 razy na komorę.
  11. Po ostatecznym wysianiu komórek śródbłonka należy wypełnić wszystkie końcówki mieszanką pożywek i umieścić urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę w obu komorach co 12 godzin.

4. Monitoruj postęp tworzenia warstwy śródbłonka

  1. Całkowite pokrycie kanału warstwą śródbłonka obserwuje się po 3 dniach. Użyj jednej z dwóch metod monitorowania pokrycia bariery śródbłonkowej: fluorescencji lub TEER. fluorescencję hCMEC/D3-DsRed i odpowiadające jej % pokrycie na całym obszarze kanału można określić ilościowo za pomocą ImageJ.
    1. Otwórz plik TIFF w formacie ImageJ reprezentatywny dla bariery hCMEC/D3-DsRed. W oprogramowaniu ImageJ kliknij Plik > Otwórz, aby wybrać plik.
    2. Scal wszystkie warstwy Z obrazu, używając maksymalnej intensywności, postępując zgodnie z poniższymi kluczowymi poleceniami i opcjami: Obraz > Stosy > Z rzutują > Wszystkie plasterki Z, Maksymalna intensywność.
    3. Wykonaj próg koloru, który jest taki sam dla wszystkich chipów mikroprzepływowych ocenianych przy użyciu tej metody. W prezentowanym badaniu przyjęliśmy próg 450. Użyj menu progowego w ImageJ pod adresem: Image > Adjust > Threshold (Dostosuj próg).
    4. Ustaw pomiary, które mają być rejestrowane, za pomocą następujących poleceń i opcji: Analizuj > Ustaw pomiary > Ogranicz do progu, Ułamek powierzchni.
    5. Wybierz reprezentatywny obszar kanału mikroprzepływowego do pomiaru, rysując ramkę. Narzędzie ramki znajduje się w menu głównym ImageJ. Zmierz 3 kontrpróby techniczne umieszczone na początku, w środku i na końcu każdego kanału mikroprzepływowego, używając tego samego rozmiaru pudełka.
    6. Przeanalizuj każdy kanał i zapisz ułamek powierzchniowy, reprezentujący % pokrycia śródbłonka. Wyeksportuj te pomiary jako pliki arkusza kalkulacyjnego, aby wykreślić i zwizualizować dane za pomocą następujących poleceń: Analizuj > Mierz.
  2. Alternatywnie można użyć TEER opartego na spektroskopii impedancyjnej do pomiaru ciasnych połączeń śródbłonka na obszar. Kwantyfikacja bariery śródbłonkowej za pomocą TEER jest wskaźnikiem zastępczym dla integralności warstwy śródbłonka jako bariery.
    1. Umieść dwie elektrody na wlocie i wylocie górnej i dolnej komory.
    2. Określ ilościowo impedancję monowarstwy śródbłonka jako kombinację rezystancji, indukcyjności i pojemności w chipie zgodnie z modelem zaproponowanym przez Srinivasana i wsp.28,29.

5. Umieść komórki rakowe w urządzeniu

  1. Po dojrzewaniu warstwy śródbłonka należy wprowadzić komórki rakowe do urządzenia. Przygotuj 1 ml roztworu 1 x 106 komórek rakowych w kompletnym pożywce z komórek rakowych.
  2. Wymień pożywkę w chipie, aby uzupełnić składniki odżywcze w hodowli komórkowej.
  3. Wysiewaj każdy kanał górnej komory 30 μl komórek rakowych w zawiesinie, a następnie umieść urządzenie z powrotem w inkubatorze na 15 minut. Zawsze wysiewaj komórki rakowe po tej samej stronie wszystkich czterech kanałów górnej komory w jednym urządzeniu.
  4. Wymieniaj urządzenie na nowe media i uzupełniaj końcówki co 12 godzin, aż urządzenie zostanie zobrazowane pod kątem przerzutów.

6. Obrazowanie mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania konfokalnego

  1. W pożądanym eksperymentalnym punkcie czasowym (1, 2 lub 9 dni) użyj obrazowania konfokalnego, aby uchwycić obraz 3D kanału. Wykonujemy ten krok na aparacie Nikon A1, korzystając z ustawień opisanych tutaj. Ten krok jest zautomatyzowany, a każdy kanał wymaga 20-40 minut na obrazowanie, w zależności od tego, ile kanałów fluorescencyjnych jest uwzględnionych i głębokości Z potrzebnej do pokrycia pozycji wszystkich komórek.
  2. Włącz mikroskop, otwórz oprogramowanie i umieść pokrywę inkubatora na mikroskopie.
  3. Ustaw grzałkę sceniczną mikroskopu na 37 °C i CO2 do 5%, jeśli jest dostępna.
  4. Po ustabilizowaniu się inkubatora mikroskopu umieść urządzenie w stoliku mikroskopu za pomocą mocowania 50 mm x 75 mm.
  5. Skoncentruj się na jednej stronie urządzenia (po lewej, jeśli ma być używane z dostarczonym oprogramowaniem do analizy) za pomocą obiektywu 10x i ustaw wysokość Z na zero. W ustawieniach stosu z uwzględnij zakres 100 μm powyżej i 200 μm poniżej płaszczyzny ostrości. Następnie użyj ustawienia zszywania, aby ustawić liczbę pól X i Y odpowiednio na 1 i 9 z 15% nakładaniem się. Ustaw otwór na zalecane minimum, a wysokość warstwy z na 9 μm. Dostosuj ekspozycję na jasne pole tak, aby porowata membrana była widoczna. Włącz lasery wzbudzające dla kanałów dsRed (561 nm) i GFP (488 nm) i dostosuj moce lasera fluorescencyjnego i odcięcia tak, aby każdy kanał był widoczny bez prześwietlania pikseli.
  6. Sprawdź, czy wszystkie pola są aktywne po przekroczeniu. Jeśli tak, wprowadź nazwę pliku wyjściowego (001.nd2) dla obrazu i rozpocznij eksperyment, aby automatycznie przechwycić obraz konfokalny 3D.

7. Pomiar mikrośrodowiska guza za pomocą tomografii konfokalnej

  1. Użyj tomografii konfokalnej, podejścia do oszacowania zestawu wskaźników i pomiarów, które opisują poszczególne komórki i mikrośrodowisko guza w urządzeniu. Konfokalna analiza tomograficzna (Rysunek 2) przekształca konfokalny stos z w trójwymiarową reprezentację komórek. Korzystając z niestandardowego skryptu języka Python w środowisku Jupyter notebook/lab, płaszczyzna jest następnie dopasowywana do warstwy komórek, które tworzą barierę krew-mózg, taką jak membrane30. Na koniec dokonaj pomiarów fenotypowych populacji komórek nowotworowych (Tabela 1).
    1. Wykonaj tę analizę na końcu eksperymentu lub w ciągu czasu. Zainstaluj Pythona i odpowiednie biblioteki zgodnie z przywoływanym przewodnikiem po oprogramowaniu, a następnie otwórz oprogramowanie z wiersza polecenia systemu Windows, uruchamiając polecenie "conda activate", a następnie "jupyter lab". Środowisko Jupyter zostanie załadowane w domyślnej przeglądarce.
    2. W eksploratorze plików Jupyter kliknij dwukrotnie notes Jupyter "contom.ipynb", aby go otworzyć. Uruchom komórkę poniżej tytułu Importowanie bibliotek, klas niestandardowych/funkcji i skonfiguruj notes, klikając komórkę notesu, a następnie klikając przycisk odtwarzania. Wszystkie poniższe komórki notesu są wykonywane przy użyciu tego samego podejścia. Należy pamiętać, że w tym miejscu "komórka" notesu odwołuje się do bloku kodu języka Python w notesie Jupyter.
  2. Przygotuj dane. Ten algorytm wykorzystuje zestaw narzędzi do wizualizacji (VTK) do manipulowania i wyświetlania stosu z i trójwymiarowych danych17.
    1. Umieść dostarczony plik . XLSX ("Experiment Tracker.xlsx") w tym samym folderze systemu Windows co notes Jupyter. Plik śledzi eksperymenty i interfejsy z notesem Jupyter. Umieść plik ND2 z sekcji 6 w podfolderze o nazwie "\Experiment_XXX\Confocal\" poniżej lokalizacji notesu Jupyter. Dodatkowe foldery eksperymentów można dodawać w ich obrębie, dostosowując "XXX" do numerycznego identyfikatora przypisanego do nowych folderów.
    2. Oznacz pierwszy folder eksperymentu "Experiment_001" i plik ND2 "001.nd2". Najpierw przekonwertuj plik obrazowania ND2 na zszyty plik TIFF z wieloma obrazami oddzielony kanałem koloru. W tym celu należy wykonać polecenie "Read the confocal z stack into memory" (Odczyt stosu konfokalnego z do pamięci) za pomocą funkcji Save_tiff_from_ND2() uncommented30. Plik ND2 jest zastrzeżonym formatem obrazowania firmy Nikon, dlatego konieczne jest przekonwertowanie go na format, z którym oprogramowanie open source jest kompatybilne.
      UWAGA: Format TIFF (Tag Image File Format) jest używany, ponieważ jest wszechobecny, zgodny z 16 bitami, łatwo importowany do VTK, a wiele obrazów można przechowywać w jednym pliku, co jest odpowiednie dla obrazów z-stack. Wykonanie komórki notatnika spowoduje odczytanie obrazu z pliku ND2, wyodrębnienie informacji o kolorze i pozycjach XYZ, a następnie zapisanie tego obrazu w tablicy numpy zgodnie z wcześniej ustaloną strukturą. Następnie zapisze tablicę jako plik TIFF przy użyciu biblioteki Pythona tifffile.
  3. Konwertowanie danych obrazowania na model 3D
    1. Zaimportuj plik TIFF do VTK (vtkTIFFReader) za pomocą renderingu 3D w celu wizualizacji komórek (Rysunek 2). Wybierz próg na podstawie koloru komórek na obrazie. Dla wyjaśnienia, obiekt VTK reprezentuje blok pikseli (X, Y, Z) w przestrzeni (objętości), ale tylko niektóre piksele (zielony lub czerwony) reprezentują komórki, reszta to tło lub szum ().
    2. Dlatego ustaw filtr nieprzezroczystości na woluminie, który usuwa tło, upewnij się, że pozostała fluorescencja to tylko komórki. W tym celu należy użyć komórki notesu Jupyter zatytułowanej Zmień wartości krycia dla każdego kanału mikroskopu, dostosowując zmienne wartości Channel_alpha (tj. GFP_alpha). Wizualizuj efekt przy użyciu komórki notesu zatytułowanej Wyświetl renderowanie 3D, aby sprawdzić, czy próg jest ustawiony poprawnie.
    3. Zapisz wartości krycia w arkuszu kalkulacyjnym, aby użyć ich w następnym kroku. Przekształć dane objętościowe w pojedyncze obiekty 3D, z których każdy reprezentuje komórkę na obrazie, korzystając z techniki zwanej marching cubes31. Algorytm ten wyodrębnia wielokątną siatkę izopowierzchni z trójwymiarowych dyskretnych pól skalarnych wokseli.
    4. Użyj wartości krycia w algorytmie maszerujących sześcianów, aby oddzielić każdą komórkę od tła. Wykonaj ten krok dla wszystkich komórek fluorescencyjnych zidentyfikowanych w każdym kanale mikroskopu, uruchamiając polecenie Konwertuj obraz woksela na trójkątną siatkę i zapisz jako plik VTK w notesie.
  4. Dopasowanie płaszczyzny do membrany
    1. Dopasuj płaszczyznę do bariery śródbłonka, lokalizując najpierw centroidy komórek (komórka notebooka: Analizuj kanał RFP (bariera śródbłonka)). Iteruj po siatkach listy w woluminie i wyodrębnij regiony, które nie są połączone przy użyciu filtru PolyDataConnectivityFilter z VTK. Oblicz środek ciężkości każdej siatki i dodaj pomiar do listy centroidów filtrujących pod kątem siatek, które są zbyt duże lub zbyt małe (<50, >1000000 wokseli).
    2. Dopasuj płaszczyznę do listy centroidów komórek śródbłonka, korzystając z metody minimalizacji błędów (komórka notesu: Dopasuj płaszczyznę do centroidów RFP (bariery śródbłonka)) (Rysunek 2, Rysunek 3)32. Sprawdź dopasowanie płaszczyzny, kreśląc płaszczyznę i centroidy, a w razie potrzeby dostosuj ręcznie (za pomocą theta, beta i z), uruchamiając komórkę notesu zatytułowaną Wizualizacja centroidów zapytania ofertowego i dopasowania płaszczyzny.
    3. Po prawidłowym dopasowaniu płaszczyzny, zapisz normalną płaszczyzny do pliku śledzenia eksperymentu . Plik XLSX do wykorzystania w przyszłości.
  5. Przeanalizuj cechy opisowe poszczególnych komórek nowotworowych dla następujących deskryptorów (Tabela 1).
    UWAGA: Jeśli komputer wykonujący analizę jest opóźniony, opcjonalnie dostępna jest analiza o wysokiej przepustowości za pomocą obliczeń o wysokiej wydajności. Algorytm ten jest przydatny w standardowych laptopach do analizy niewielkiej liczby komórek, jednak VTK nie nadaje się do dużej liczby pojedynczych obiektów (>1000). W związku z tym opcjonalne jest użycie dostosowanego algorytmu do działania w klastrze obliczeniowym o wysokiej wydajności. Umożliwia to szybką analizę eksperymentów z wieloma komórkami (Rysunek 2). Cała wersja 7.5 jest realizowana przez uruchomienie komórek notatnika zatytułowanych Analizuj pozostałe kanały mikroskopu pod kątem deskryptorów fenotypowych oraz Odczyt informacji Experiment_tracker i Przeanalizuj istniejące kanały.
    1. Zmierz wynaczynienie komórek rakowych: Po scharakteryzowaniu warstwy śródbłonka płaszczyzną, zmierz objętość każdej komórki rakowej, która migrowała przez błonę. Przytnij każdą komórkę (wartość logiczna) tak, aby siatka pod membraną została zachowana, a część nad membraną została usunięta33. Następnie zamknij otwartą siatkę (vtkFillHoles).
      1. Ponownie oblicz normalną i nową środek ciężkości przyciętej siatki. Zmierz objętość i położenie każdej przyciętej komórki rakowej do analizy. Objętość jest równa liczbie wokseli, które siatka wypełnia w każdej pojedynczej komórce. Oblicz odległość między płaszczyzną śródbłonka a położeniem każdej komórki rakowej.
    2. Zmierz fenotyp komórkowy: Oblicz morfologię każdej komórki rakowej, biorąc pod uwagę jej kształt, objętość i położenie.
  6. Sprawdź poprawność pomiarów i zapisz je w arkuszu kalkulacyjnym lub na wykresie. Uruchom komórkę notesu zatytułowaną Sprawdź, czy centroidy zostały dokładnie zmierzone, a pojawi się renderowanie pokazujące centroidy zidentyfikowane na górze obrazowanego woluminu według typu komórki. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów wyeksportuj cały zestaw danych jako pojedynczy plik arkusza kalkulacyjnego, wpisując eksperymenty, które mają zostać uwzględnione według identyfikatora, w komórce notesu zatytułowanej Eksportuj dane jako pojedynczy plik Data.XLSX dla eksperymentów zmiennych, zastępując podane identyfikatory eksperymentów. Jeśli zweryfikujesz ukończony zestaw danych, wykreśl go za pomocą komórki notesu o nazwie Wykres pasków ekstrawakowanych odległości. Wykres pojawi się w środowisku notatnika i zostanie zapisany do pliku.

8. Analizuj powiązane cechy za pomocą sztucznej inteligencji

UWAGA: Identyfikuj cechy fenotypowe przerzutowe za pomocą algorytmów sztucznej inteligencji.

  1. Wykonaj klasyfikację binarną za pomocą Orange zgodnie ze schematem pokazanym w Rysunek 5 i plik uzupełniający 3. Uruchom Orange z drugiego wiersza polecenia systemu Windows, wpisując "conda activate", a następnie "python -m Orange.canvas" i kliknij Nowy w wierszu polecenia. Pomarańczowy to oprogramowanie oparte na przeciąganiu i upuszczaniu, więc uporządkuj funkcje, przeciągając każdy element z lewego menu na płótno, aby dopasować go do pliku uzupełniającego 3. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie ikonę Plik i wybierz Data.XLSX plik.
  2. Filtruj dane, aby usunąć nieprawidłowe pomiary, zdefiniowane jako te, które nie powiodły się w operacji logicznej lub podające wartości zmiennych parametrycznych poza znanymi granicami za pomocą ikony "Wybierz wiersze". Kliknij dwukrotnie ikonę i ustaw warunki odpowiadające filtrowi, takie jak "Kulistość wynosi od 0 do 1". Utwórz warunki dla wersji 8.2.1, 8.2.2 i 8.2.3.
    1. Odległość filtra wynaczynione pomiary w zakresie -100-200 μm.
    2. Filtruj pomiary sferyczności kształtu komórki w zakresie od 0 do 1.
    3. Filtruj pomiary objętości komórek rakowych w zakresie od 0 do 2000 wokseli.
    4. Użyj wszystkich zmiennych parametrycznych (Tabela 1), aby sklasyfikować MDA-MB-231-BR-GFP z przerzutami do mózgu i MDA-MB-231-GFP bez przerzutów do mózgu. Kliknij dwukrotnie ikonę Wybierz kolumny na płótnie. Za pomocą przycisku > można przenieść Dostępne zmienne do Obiektów, Zmiennych docelowych lub Atrybutów meta. Jedyną zmienną, która powinna być zmienną docelową, jest etykieta metastatyczna, która określa, czy komórki w zestawie danych są uważane za przerzutowe (1), czy nie (0). Zmienne eksperymentu można umieścić w sekcji Meta Atrybuty.
  3. Próbkowanie danych do zestawu treningowego (80%) i testowego (20%). Kliknij dwukrotnie ikonę Próbnik danych i wybierz Typ próbkowania Stała proporcja danych: ustaw na 80% i zaznacz pola wyboru Replikowalny i warstwowy. Stratyfikacja i krzyżowa walidacja zestawu treningowego przy użyciu 10 krotności względem każdego modelu/klasyfikatora. Kliknij dwukrotnie Test & Score i wybierz opcję Cross validation with Number of folds: set (Liczba zagięć): ustaw na 10 i zaznacz opcję Stratified (Stratyfikacja). Ustaw klasę docelową na 1.
  4. W tej metodzie użyj algorytmów uczenia sieci neuronowych i lasu losowego, ponieważ są one odporne na dane. Na ikonie Losowy las wybierz liczbę drzew, które mają wynosić 50 i nie wybieraj żadnych innych opcji. W ikonie sieci neuronowej wybierz Neurony na ukryty układr: 100, Aktywacja: ReLu, Solver: Adam, Alfa: 0,0001 i Maksymalna liczba iteracji: 200. Jednak ustawienia te będą się znacznie różnić w zależności od badania i powinny być dobrze zrozumiane przed zastosowaniem.
  5. Po skonfigurowaniu płótna kliknij dwukrotnie każdą ikonę od Plik do Przykładowe dane i naciśnij Zastosuj lub Wyślij dane. Kliknij dwukrotnie Test & Score, a dane treningowe zaczną być używane do opracowania modelu przy użyciu algorytmów. Po wytrenowaniu modelu uczenia maszynowego ponownie otwórz Test & Score i wybierz pozycję Test na danych testowych i zamknij wyskakujące okienko, aby ocenić wydajność modelu, klasyfikując komórki w chipie według prawdopodobieństwa, że mają przerzuty do mózgu od 0 do 1.
  6. Zapisz wydajność modelu uczenia maszynowego w pliku (Tabela 2). Uwzględnij obszar pod krzywą (AUC) ROC, dokładność i wynik F1. Zapisz drugi plik, który zawiera poszczególne wskaźniki przerzutów i prawdopodobieństwa klasyfikacji. Kliknij dwukrotnie ikonę Zapisz i kliknij Zapisz jako, aby zapisać prawdopodobieństwa klasyfikacji. Podobnie, krzywą ROC można wyświetlić, klikając dwukrotnie ikonę Analiza ROC, a wydajność modelu można obliczyć, klikając dwukrotnie ikonę Macierzy pomyłek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej techniki, przeanalizowaliśmy typy komórek oznaczone różnymi białkami fluorescencyjnymi lub barwnikami. Demonstrujemy zastosowanie tego podejścia za pomocą chipa μmBBN opracowanego z hCMEC/D3-DsRed i astrocytów niefluorescencyjnych. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu wysiano na porowatej błonie (wytrawione pory o długości 5 μm) i umieszczono w inkubatorze34 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 . Po trzech dniach potwierdzono zbieganie się warstwy śródbłonka za po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy i zaprezentowaliśmy nową metodę, która adaptuje narzędzia często wykorzystywane w analizach obrazowania klinicznego do pomiaru wynaczynienia i migracji komórek nowotworowych przez barierę śródbłonkową do tkanki mózgowej. Uważamy, że takie podejście może być przydatne zarówno w przypadku pomiarów in vivo, jak i in vitro; Pokazaliśmy jego zastosowanie w systemie mikroprzepływowym 3D rekapitulującym unaczynienie mózgu. Pomiary komórek rakowych, w tym odległość wynaczyniona, procent wynaczynionych objętości, sf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Steeg Lab w National Cancer Institute za hojną darowiznę komórek MDA-MB-231-BR-GFP. Mikroskopię konfokalną przeprowadzono w Instytucie Biointerfejsów Uniwersytetu Michigan (BI). Cytometrię przepływową przeprowadzono w University of Michigan Flow Cytometry Core. Wektory wirusowe zostały stworzone przez University of Michigan Vector Core. Dziękujemy również Kelley Kidwell za wskazówki w analizie statystycznej tych danych.

FINANSOWANIE:

C.R.O. był częściowo wspierany przez NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) i 1R21CA245597-01. T.M.W. był częściowo wspierany przez 1R21CA245597-01 i National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1TR002240. Finansowanie materiałów i charakterystyki zostało zapewnione przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody o numerze 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation oraz Breast Cancer Research Foundation. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTA z czerwienią fenolowąThermo Fisher Scientific25200056
Dziurkacz do biopsji 1,5 mm z tłokiemIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
szalki Petriego 150 mmFisher Scientific FB0875714
1x DPBS, bez Ca i MgThermo Fisher Scientific14190144
Końcówka do pipety 200uLFisher Scientific02-707-411
4-calowy wafelkrzemowy University Wafer452
Taśma pakowa o szerokości 48 mmFisher Scientific19-072-097
Szkiełko szklane 50 x 75 mmFisher Scientific12-550C
A1Nikon
acetonFisher ScientificA9-20
antybiotyk/antybiotyk (penicylina/streptomycyna/amfoterycyna)Gibco15240062
nóż do pudełekFisher
Scientific Fisher Scientific08-951-5
DMEM z 4,5 g/L glukozyThermo Fisher Scientific11960-044
taśma dwustronnaFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznieOprogramowanie CorningMT35011CV
FidżiSzklana
Fisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Notebook JupyterAnaconda
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - czynnik wzrostu zredukowany czerwienią fenolowąCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr Patricia Steeg, NIH
Suplement wzrostu N-2Thermo Fisher Scientific17502048
normalnych ludzkich astrocytów (NHA)LonzaCC-2565
Oprogramowanie OrangeUniwersytet w Lublanie
Pipeta PasteuraFisher Scientific13-711-9AM
Maski fotolitograficznePhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
poliwęglanowa, wielkość porów 5umMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mlAdvanced Biomatrix5005kolagen bydlęcy typu I
Thermo Fisher Scientific25080094
pirogronian soduThermo Fisher Scientific11360070
Kubek SoloFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 deweloperMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
ToluenSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro oktylosilanSigma-Aldrich448931-10G
Mikroskop konfokalny Nożyczki do cięcia NC1721575 fiolka ImageJ 35050061 membrana Wodorowęglan sodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415(2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564(2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456(2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190(2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980(2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759(2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23(2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705(2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
  27. Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
  33. Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33(2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16(2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259(2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przerzuty do m zgumikrofluidyczny model BBNekstrawasacja kom rek nowotworowychbariera r db onkowaobrazowanie fluorescencyjneanaliza fenotypowa

Powiązane artykuły