Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61659

⸱

26 sierpnia 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KAIST Institute for BioCentury (KIB), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Streszczenie

Monitorowanie in vivo aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszających się zwierząt jest jednym z kluczowych podejść do powiązania aktywności neuronalnej z zachowaniem. W tym celu opracowano technikę obrazowania in vivo, która wykrywa stany przejściowe wapnia w neuronach za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego i soczewki gradientowego współczynnika załamania światła (GRIN), która została z powodzeniem zastosowana do wielu struktur mózgu1,2,3,4,5,6. Ta technika obrazowania jest szczególnie skuteczna, ponieważ umożliwia przewlekłe jednoczesne obrazowanie genetycznie zdefiniowanych populacji komórek przez długi okres do kilku tygodni. Chociaż ta technika obrazowania jest przydatna, nie jest łatwo zastosować ją do struktur mózgu, które znajdują się głęboko w mózgu, takich jak ciało migdałowate, struktura mózgu niezbędna do przetwarzania emocji i asocjacyjnej pamięci strachu7. Istnieje kilka czynników, które utrudniają zastosowanie techniki obrazowania do ciała migdałowatego. Na przykład artefakty ruchowe zwykle występują częściej podczas obrazowania przeprowadzanego w głębszych obszarach mózgu, ponieważ mikroskop montowany na głowie wszczepiony głęboko w mózg jest stosunkowo niestabilny. Innym problemem jest to, że komora boczna znajduje się blisko wszczepionej soczewki GRIN, a jej ruch podczas oddychania może powodować bardzo nieregularne artefakty ruchowe, których nie można łatwo skorygować, co utrudnia uzyskanie stabilnego obrazu obrazowego. Ponadto, ponieważ komórki w ciele migdałowatym są zwykle ciche w stanie spoczynku lub znieczulenia, trudno jest znaleźć i skupić się na komórkach docelowych wykazujących ekspresję GECI w ciele migdałowatym podczas procedury powlekania w celu późniejszego obrazowania. Protokół ten stanowi pomocną wskazówkę, jak skutecznie celować w komórki wyrażające GECI w ciele migdałowatym za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w celu skutecznego obrazowania wapnia in vivo w tak głębszym obszarze mózgu. Należy zauważyć, że protokół ten jest oparty na konkretnym systemie (np. Inscopix), ale nie ogranicza się do niego.

Wprowadzenie

Wapń jest wszechobecnym drugim przekaźnikiem, odgrywającym kluczową rolę w prawie każdej funkcji komórkowej8. W neuronach wyzwalanie potencjału czynnościowego i wejście synaptyczne powodują szybką zmianę wewnątrzkomórkowego wolnego [Ca2+]9,10. W związku z tym śledzenie stanów przejściowych wapnia daje możliwość monitorowania aktywności neuronalnej. GECI to potężne narzędzia, które pozwalają na monitorowanie [Ca2+] w zdefiniowanych populacjach komórek i przedziałach wewnątrzkomórkowych11,12. Spośród wielu różnych typów wskaźnika wapnia opartego na białku, GCaMP, sonda Ca2+ oparta na pojedynczej cząsteczce GFP13, jest najbardziej zoptymalizowanym, a tym samym szeroko stosowanym GECI. W wyniku wielu rund prac inżynieryjnych opracowano wiele wariantów GCaMP12,14,15,16. Używamy jednego z ostatnio opracowanych GCaMPs, GCaMP7b, w tym protokole16. Czujniki GCaMP w znacznym stopniu przyczyniły się do badania funkcji obwodów neuronalnych w wielu organizmach modelowych, takich jak obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ podczas rozwoju17, obrazowanie in vivo w określonej warstwie korowej18, pomiar dynamiki obwodów w uczeniu się zadań motorycznych19 oraz obrazowanie aktywności zespołu komórkowego związanej z asocjacyjną pamięcią strachu w hipokampie i ciele migdałowatym20,21.

Optyczne obrazowanie GECI ma kilka zalet22. Kodowanie genetyczne umożliwia stabilną ekspresję GECI przez długi czas w określonym podzbiorze komórek, które są zdefiniowane przez profil genetyczny lub określone wzorce połączeń anatomicznych. Obrazowanie optyczne umożliwia przewlekłe jednoczesne monitorowanie in vivo setek do tysięcy neuronów u żywych zwierząt. Opracowano kilka systemów obrazowania optycznego do obrazowania in vivo i analizy GECI w mózgu swobodnie zachowujących się myszy za pomocą miniaturyzowanych mikroskopów fluorescencyjnych montowanych na głowie21,23,24,25. Pomimo tego, że technika obrazowania optycznego in vivo oparta na GECI, soczewce GRIN i miniaturowym mikroskopie montowanym na głowie jest potężnym narzędziem do badania związku między aktywnością a zachowaniem obwodów nerwowych, zastosowanie tej technologii do ciała migdałowatego było trudne ze względu na kilka problemów technicznych związanych z kierowaniem soczewki GRIN na komórki wyrażające GECI w ciele migdałowatym bez powodowania artefaktów ruchu, które poważnie obniżają jakość pozyskiwania obrazu i znajdowania komórek wyrażających GECI. Protokół ten ma na celu zapewnienie pomocnych wytycznych dla procedur chirurgicznych zakładania płytki bazowej i implantacji soczewek GRIN, które są kluczowymi krokami dla udanego optycznego obrazowania wapnia in vivo w ciele migdałowatym. Chociaż protokół ten jest ukierunkowany na ciało migdałowate, większość opisanych tutaj procedur jest powszechnie stosowana do innych głębszych obszarów mózgu. Chociaż protokół ten jest oparty na konkretnym systemie (np. Inscopix), ten sam cel można łatwo osiągnąć za pomocą innych alternatywnych systemów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt w Koreańskim Zaawansowanym Instytucie Nauki i Technologii (KAIST). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).

UWAGA: Protokół ten składa się z sześciu głównych etapów: operacji wstrzyknięcia wirusa, operacji implantacji soczewki GRIN, walidacji implantacji soczewki GRIN, mocowania płytki bazowej, optycznego rejestrowania sygnału GCaMP podczas testu behawioralnego oraz przetwarzania danych (Rycina 1A). Z wyjątkiem operacji, wykorzystywany jest komercyjny pakiet oprogramowania (Inscopix).

1. Operacja stereotaktyczna – iniekcja wirusa AAV

UWAGA: Szczep myszy wykorzystany w tej procedurze chirurgicznej to C57BL6/J. Podczas operacji ciało zwierzęcia jest przykryte sterylną draperią, a wszystkie etapy protokołu są wykonywane w sterylnych rękawiczkach. Zazwyczaj nie przeprowadza się wielu operacji w tym samym dniu. Jeśli jednak wiele myszy musi przejść tę samą operację w jednym dniu, należy używać osobnego zestawu autoklawowanych narzędzi chirurgicznych dla każdej myszy oraz 70% etanolu do dezynfekcji instrumentów chirurgicznych pomiędzy zwierzętami. Aby utrzymać ciepłotę ciała myszy podczas procedury chirurgicznej, po zamocowaniu do ramy stereotaktycznej mysz zostaje przykryta specjalnie wykonanym kocem chirurgicznym.

  1. Zdezynfekuj wszystkie wymagane narzędzia chirurgiczne 70% etanolem, a następnie przygotuj strzykawkę Hamiltona i pipetę szklaną. Napełnij pipetę szklaną wodą destylowaną.
    UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne wykorzystane w protokole są autoklawowane. Ponieważ soczewki GRIN i śruby czaszkowe nie mogą być sterylizowane w autoklawie, jako środek dezynfekcyjny zapobiegający stanom zapalnym stosuje się 70% etanol. Chociaż nie zostało to sprawdzone, można zastosować inne formy sterylizacji, np. sterylizację gazową lub chemiczną.
  2. Zapodaj myszy pentobarbital (83 mg∙kg-1 masy ciała) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. Po utracie przytomności przez mysz, wygol sierść na czaszce.
  3. Oczyść skórę nad czaszką 70% etanolem i przymocuj mysz do ramy stereotaktycznej. Ostrożnie usuń skórę i przemyj powierzchnię czaszki 35% roztworem nadtlenku wodoru za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem. Nałóż nawilżającą maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas operacji.
    UWAGA: Chociaż zazwyczaj nie ma problemu z użyciem wyłącznie 70% etanolu do aseptycznego przygotowania skóry, zaleca się zastosowanie 3 naprzemiennych rund środków dezynfekcyjnych, np. jodoforów lub roztworu chlorheksydyny oraz 70% etanolu. W niniejszym protokole zastosowano wyższe stężenie nadtlenku wodoru, aby upewnić się, że tkanka łączna na czaszce myszy została usunięta jak najdokładniej, co jest kluczowe dla redukcji artefaktów ruchowych podczas późniejszego obrazowania, ponieważ tkanka łączna na czaszce utrudnia stabilne przymocowanie płytki bazowej do czaszki. Należy zauważyć, że stężenie 35% nadtlenku wodoru jest znacznie wyższe niż standardowo stosowane (3%).
  4. Zamocuj pin w uchwycie sondy stereotaktycznej. Wyrównaj wysokość bregmy i lambdy z pinem.
  5. Wyznacz konkretne miejsce na czaszce myszy do wykonania kraniotomii.
    UWAGA: Współrzędne bocznego jądra migdałowatego (LA) dla iniekcji wirusa w tym protokole wynoszą (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) względem bregmy (AP; przednio-tylna, ML; przyśrodkowo-boczna, DV; grzbietowo-brzuszna; każdy skrót oznacza względną odległość osiową od bregmy)26. Współrzędne powinny być optymalizowane dla każdego warunku eksperymentalnego.
  6. Wywierć otwór w powierzchni czaszki (Rycina 1B). Przemyj fragmenty czaszki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Usuń pozostałą warstwę za pomocą pęsety lub igły 27 G.
    1. Podczas wiercenia czaszki staraj się nie dotykać ostatniej warstwy opony twardej, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni tkanki mózgowej. Uszkodzona powierzchnia mózgu powoduje stan zapalny wokół soczewki, co indukuje silne artefakty ruchowe i wysoką autofluorescencję podczas rejestracji. Rozmiar kraniotomii wynosi 1,6 mm. Prędkość wiercenia to 18 000 obr./min, a rozmiar wiertła to 0,6 mm.
  7. Aby opuścić soczewkę GRIN z powierzchni tkanki mózgowej w miejscu wiercenia do docelowego miejsca w jądrze migdałowatym, oblicz odległość nazwaną „Wartością A”, odejmując różnicę DV między bregmą a odsłoniętą powierzchnią mózgu od współrzędnej DV implantacji soczewki, która jest ustalona względem bregmy (w tym przypadku 4,2 mm, Rycina 1C).
  8. Do pipety szklanej wprowadź 3 µL oleju mineralnego i 0,7 µL roztworu wirusa AAV.
    UWAGA: Olej mineralny pomaga oddzielić roztwór wirusa od wody. Objętość 0,7 µL jest zoptymalizowana dla iniekcji wirusa do LA i pozwala na pełne pokrycie LA.
  9. Wyjmij pin z uchwytu sondy stereotaktycznej i przymocuj do niego pipetę szklaną.
  10. Umieść pipetę szklaną w miejscu iniekcji wspomnianym w kroku 1.5. Wprowadź pipetę szklaną do tkanki mózgowej po całkowitym ustąpieniu krwawienia.
  11. Podaj wirusa przez pipetę szklaną za pomocą pompy iniekcyjnej.
    UWAGA: Miano wirusa powinno być wyższe niż 1 x 1013 vg/mL, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek wykazujących ekspresję GCaMP. Prędkość iniekcji wynosi 0,1 µL/min, a czas dyfuzji to 10 min. W przypadku krwawienia przemyj powierzchnię mózgu PBS. Na tym etapie utrzymuj powierzchnię mózgu w stanie wilgotnym.
  12. Po zakończeniu iniekcji powoli usuń pipetę szklaną.

2. Operacja stereotaktyczna – implantacja soczewki GRIN

UWAGA: Chirurgiczne wszczepienie soczewki GRIN jest najkrytyczniejszym etapem niniejszego protokołu. Ponieważ stała, niska prędkość ruchu soczewki GRIN jest kluczowa dla pomyślnej implantacji, pomocne może być zastosowanie zmotoryzowanego ramienia chirurgicznego. Zmotoryzowane ramię chirurgiczne to manipulator stereotaktyczny sterowany przez oprogramowanie komputerowe. Chociaż w niniejszym protokole wykorzystano ramię zmotoryzowane, można zastosować również inne metody, pod warunkiem że soczewka porusza się w sposób jednolity i powolny podczas implantacji. Szczegółowe informacje o urządzeniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Wywierć otwory w czaszce, aby zaimplantować dwie śruby czaszkowe. Przemyj wszystkie fragmenty czaszki roztworem PBS.
    UWAGA: Aby zredukować artefakty ruchu w późniejszym obrazowaniu optycznym, wymagane są co najmniej dwie śruby. Dwie śruby czaszkowe i pozycja implantu soczewki GRIN tworzą trójkąt równoboczny (Rysunek 1B). Rozmiar kraniotomii powinien ściśle odpowiadać średnicy śruby. W przypadku wystąpienia krwawienia przemyj krwawiącą powierzchnię roztworem PBS. Prędkość wiercenia wynosi 18 000 obr./min, a rozmiar wiertła to 0,6 mm.
  2. Zdezynfekuj śruby 70% etanolem, aby zapobiec stanom zapalnym. Zaimplantuj śruby tak głęboko, jak to możliwe.
    UWAGA: Śruby powinny być mocno przymocowane bez użycia dodatkowych środków adhezyjnych, takich jak cement.
  3. Zainstaluj zmotoryzowane ramię chirurgiczne w ramie stereotaktycznej. Podłącz wymagany sprzęt do laptopa, na którym zainstalowano oprogramowanie sterujące (Tabela materiałów).
  4. Przed opuszczeniem soczewki GRIN przygotuj tor prowadzący za pomocą igły 26 G.
    UWAGA: Tor prowadzący jest rodzajem ścieżki pomocniczej, która ułatwia implantację stosunkowo grubej soczewki GRIN w głębokich obszarach mózgu, takich jak ciało migdałowate, bez powodowania poważnych zniekształceń struktury mózgu wzdłuż drogi wstrzyknięcia. Ścieżkę tę nazywa się torem prowadzącym, ponieważ jest ona tworzona poprzez procedurę opuszczania i podnoszenia stosunkowo cienkiej igły 26 G.
  5. Zamocuj uchwyt do kaniuli, aby stabilnie utrzymać igłę w ramie stereotaktycznej.
  6. Uchwyć igłę 26 G za pomocą uchwytu do kaniuli i oblicz współrzędne miejsca wprowadzenia igły.
    UWAGA: W niniejszym protokole współrzędne miejsca wprowadzenia igły znajdują się 50 µm bocznie od miejsca wstrzyknięcia wirusa (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
  7. Uruchom oprogramowanie sterujące i zakończ przygotowania do manipulowania pozycją igły.
    1. Uruchom oprogramowanie sterujące i wybierz przycisk Start new project, aby rozpocząć sesję sterowania.
      UWAGA: W sesji sterowania znajduje się kilka pustych pól i przycisków menu. Puste pola są miejscami wprowadzania współrzędnych. Po wprowadzeniu współrzędnych w puste pola, zmotoryzowane ramię stereotaktyczne porusza się po kliknięciu przycisku Go To. Przycisk Go To zmienia się w przycisk STOP, gdy ramię stereotaktyczne jest w ruchu. spośród kilku przycisków menu, w tym protokole wymagany jest tylko przycisk Tool.
    2. Kliknij przycisk Tool. Skalibruj oprogramowanie sterujące, klikając przycisk menu Calibrate the frame. Kalibracja jest procesem, w którym rzeczywista pozycja manipulatora jest ustawiana jako wartości w oprogramowaniu Stereodrive.
  8. Zlokalizuj końcówkę igły na odsłoniętej powierzchni mózgu na powierzchni czaszki za pomocą manipulatora stereotaktycznego.
    UWAGA: Prędkość igły jest ustawiana w menu Microdrive speed w menu Tool. Prędkość domyślna wynosi 3,0 mm/s. W tym kroku zaleca się jednak prędkość 0,5 mm/s. Ruch igły jest sterowany za pomocą klawiszy strzałek.
  9. Dodaj 2-3 krople PBS, aby utrzymać powierzchnię mózgu w wilgotnym stanie. Wprowadź w puste pole na ekranie komputera odpowiednie współrzędne DV dla LA. Jeśli powierzchnia mózgu jest sucha, utrudnia to penetrację igły w tkankę mózgową.
  10. Opuść igłę 26 G, klikając przycisk Go To. Zatrzyma się ona automatycznie, gdy igła osiągnie miejsce docelowe wyznaczone przez współrzędne DV. Prędkość igły wynosi 100 µm/min. W przypadku wystąpienia krwawienia zatrzymaj igłę, klikając przycisk STOP, i przemyj powierzchnię mózgu roztworem PBS. W tym kroku należy utrzymywać powierzchnię mózgu w wilgotnym stanie. Po ustąpieniu krwawienia ponownie rozpocznij opuszczanie.
  11. Po całkowitym zatrzymaniu ruchu igły wprowadź wartość 45,00 mm w puste pole na ekranie komputera.
    UWAGA: 45,00 mm to wartość współrzędnej DV, która sprawia, że igła wraca do pozycji początkowej.
  12. Podnieś igłę, klikając przycisk Go To. Prędkość ruchu igły wynosi 100-200 µm/min.
  13. Po zatrzymaniu ruchu igły usuń PBS z powierzchni mózgu. Zdemontuj igłę i uchwyt do kaniuli z ramy stereotaktycznej. Eksperymentator może ręcznie zatrzymać igłę, klikając przycisk STOP w razie potrzeby.
  14. Wyposaż pręt stereotaktyczny w uchwyt soczewki. Zamontuj soczewkę GRIN w uchwycie soczewki.
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano soczewkę GRIN zoptymalizowaną pod kątem targetowania LA (średnica 0,6 mm, długość 7,3 mm). Jeśli uchwyt soczewki nie jest przygotowany, alternatywnym rozwiązaniem jest użycie żabki typu bulldog do uchwycenia soczewki GRIN.
  15. Zdezynfekuj soczewkę 70% etanolem i przymocuj pręt stereotaktyczny do ram stereotaktycznych.
  16. Zlokalizuj końcówkę soczewki GRIN w wyznaczonym miejscu na powierzchni czaszki (tą samą metodą, która została opisana w kroku 2.8).
    UWAGA: Współrzędne soczewki GRIN to (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (Rysunek 1C). Soczewka nie powinna dotykać czaszki, aby uniknąć uszkodzenia jej końcówki.
  17. Oblicz współrzędną DV, odejmując wartość bezwzględną „Value A” od współrzędnej DV implantacji soczewki opisanej w kroku 2.16.
  18. Nanieś 2-3 krople PBS na powierzchnię mózgu. Wprowadź w puste pole na ekranie komputera wartość 1000 µm dla opuszczania i 300 µm dla podnoszenia soczewki.
  19. Powtarzaj opuszczanie (1000 µm w dół) i podnoszenie (300 µm w górę) soczewki GRIN, aż dotrze ona do miejsca docelowego. Ta procedura góra-dół jest stosowana w celu ułatwienia rozładowania ciśnienia generowanego w tkance mózgowej podczas procesu opuszczania soczewki, co w przeciwnym razie mogłoby spowodować zniekształcenie struktur mózgu wzdłuż drogi implantacji.
    UWAGA: Prędkość ruchu soczewki GRIN wynosi 100 µm/min. Nawet w przypadku wystąpienia krwawienia nie przerywaj ruchu soczewki GRIN i przemywaj powierzchnię mózgu roztworem PBS. W tym kroku należy utrzymywać powierzchnię mózgu w wilgotnym stanie. Jeśli powierzchnia mózgu jest sucha, tkanka mózgowa przykleja się do powierzchni soczewki GRIN, co powoduje zniekształcenie struktury mózgu.
  20. Jeśli soczewka GRIN dotrze do miejsca docelowego, usuń PBS i ostrożnie nałóż żywiczny cement dentystyczny wokół soczewki GRIN, śrub i ich ścianek bocznych (Rysunek 1D).
    UWAGA: Nałożenie cementu żywicznego na całą czaszkę może zredukować artefakty ruchu. Z drugiej strony, jeśli cement żywiczny przypadkowo pokryje mięśnie przyczepione do czaszki, zwiększa to artefakty ruchu.
  21. Po stwardnieniu żywicznego cementu dentystycznego zdemontuj soczewkę GRIN z uchwytu i nałóż cement akrylowy na całą czaszkę (Rysunek 1D).
  22. Aby przymocować płytkę głowową, zdemontuj uchwyt soczewki z pręta stereotaktycznego i przymocuj płytkę głowową do końcówki pręta za pomocą taśm. Potwierdź, czy płytka głowowa jest pozioma.
    UWAGA: Przechylona płytka głowowa powoduje przechylony obraz. Płytka głowowa jest wymagana do utrwalenia głowy myszy w systemie klatki domowej z możliwością przemieszczania się (w sekcji mocowania płyty bazowej). Jeśli eksperymentator nie korzysta z tego systemu, pomiń ten krok (krok 2.22) oraz następny krok 2.23.
  23. Powoli opuszczaj pręt, aż płytka głowowa znajdzie się na szczycie kołnierza soczewki. Opuść płytkę głowową o kolejne 1000 µm. Przesuń płytkę głowową dla zaimplantowanej soczewki GRIN tak, aby znajdowała się przy prawej krawędzi wewnętrznego pierścienia płytki głowowej.
    UWAGA: Płytka głowowa powinna być ustawiona niżej niż powierzchnia zaimplantowanej soczewki GRIN; w przeciwnym razie mikroendoskop nie będzie mógł zbliżyć się wystarczająco do zaimplantowanej soczewki GRIN w celu regulacji płaszczyzny ogniskowania z powodu cementu akrylowego.
  24. Nałóż cement akrylowy, aby przymocować płytkę głowową do warstw cementu (Rysunek 1D).
  25. Nałóż folię parafinową na powierzchnię zaimplantowanej soczewki GRIN, aby chronić powierzchnię soczewki przed kurzem. Następnie nałóż usuwalny klej epoksydowy na folię parafinową, aby utrzymać folię parafinową na powierzchni soczewki.
  26. Wstrzyknij do jamy otrzewnej myszy roztwór karprofenu, leku przeciwbólowego (0,5 mg/mL w PBS), oraz deksametazonu, leku przeciwzapalnego (0,02 mg/mL w PBS).
    UWAGA: Dawka leku zależy od masy ciała: karprofen (5 mg∙kg-1 masy ciała) i deksametazon (0,2 mg∙kg-1 masy ciała). Zarówno karprofen, jak i deksametazon są podawane po operacji i raz dziennie przez 7 dni po zabiegu.
  27. Wymieszaj 0,3 mg/mL amoksycyliny, antybiotyku, z wodą w klatce domowej, aby podawać lek przez 1 tydzień.
  28. Wróć mysz do klatki domowej i odczekaj 5-8 tygodni na rekonwalescencję i transdukcję wirusa.
    UWAGA: Mysz regeneruje się w podgrzanej klatce na kocu elektrycznym, aż obudzi się z narkozy.

3. Walidacja implantacji soczewki GRIN

UWAGA: Walidacja implantacji soczewki GRIN dostarcza informacji o tym, czy zaimplantowana soczewka GRIN jest skierowana na komórki wykazujące ekspresję GCaMP. Na podstawie tych informacji eksperymentator oszczędza czas, unikając czasochłonnych procesów, takich jak testy behawioralne i przetwarzanie danych, poprzez wykluczenie zwierząt z błędnie umiejscowioną soczewką GRIN. Podczas procedury walidacji w polu widzenia rejestracji należy ustawić ostrość na komórki z ekspresją GCaMP. W tym kroku wykorzystywana jest mobilna klatka domowa (mobile home cage). Mobilna klatka domowa to specjalistyczne urządzenie o okrągłym kształcie, które pozwala myszom z unieruchomioną głową na swobodne poruszanie kończynami podczas walidacji implantacji soczewki GRIN i mocowania płytki bazowej. Stół powietrzny w tym urządzeniu, na którym spoczywają kończyny myszy z unieruchomioną głową, umożliwia taki swobodny ruch nóg pomimo stabilizacji głowy. Komórki w bocznym jądrze ciała migdałowatego są zazwyczaj nieaktywne w stanie spoczynku lub pod wpływem znieczulenia, dlatego w tych warunkach rzadko wykrywa się sygnały fluorescencyjne GCaMP, co sprawia, że znalezienie komórek wykazujących ekspresję GCaMP podczas walidacji implantacji soczewki GRIN i mocowania płytki bazowej jest bardzo trudne, a czasem niemożliwe. Jednakże ruch kończyn często generuje sygnały fluorescencyjne GCaMP w komórkach bocznego jądra ciała migdałowatego, co może pomóc w ustawieniu mikroskopu. Dlatego w niniejszym protokole zastosowano mobilną klatkę domową.

  1. Zamontuj manipulator stereotaksyczny do mobilnego systemu klatek domowych.
  2. Zanurz mysz w narkozie, stosując 1,5% gazu izofluranu. Po całkowitej utracie przytomności przez zwierzę, umieść mysz na wsporniku głowy w mobilnym systemie klatek.
  3. Umieść klatkę węglową pod myszą. Zamknij klatkę węglową i włącz przepływ powietrza, aby klatka mogła swobodnie poruszać się bez tarcia. Odczekaj kilka minut, aż mysz stanie się aktywna.
    UWAGA: Prędkość przepływu powietrza powinna zostać zoptymalizowana dla każdego warunku eksperymentalnego (w tym przypadku 100 L/min).
  4. Usuń folię parafinową i spoiwo epoksydowe z powierzchni wszczepionej soczewki GRIN, a następnie przetrzyj powierzchnię soczewki 70% etanolem za pomocą papieru do soczewek.
  5. Przygotować oprogramowanie do akwizycji danych (DAQ) (np. Inscopix). Ustalić warunki obrazowania.
    UWAGA: Oprogramowanie DAQ służy do sterowania mikroskopem (moc diod LED, ostrość obiektywu itp.).) oraz przechowywanie danych.
    1. Włącz moduł DAQ i podłącz do niego mikroskop. Następnie połącz go z laptopem bezpośrednio za pomocą kabla lub bezprzewodowo przez internet.
      UWAGA: Oprogramowanie DAQ jest zainstalowane w dodatkowym module sprzętowym zwanym modułem DAQ (np. Inscopix). Po podłączeniu modułu DAQ do laptopa oprogramowanie DAQ staje się dostępne na komputerze przenośnym.
    2. Uruchom oprogramowanie DAQ za pomocą przeglądarki internetowej (zalecany jest Firefox).
    3. Ustaw wszystkie niezbędne szczegóły (data, identyfikator myszy itp.).) w Zdefiniowana sesjaNastępnie kliknij Zapisz i kontynuujPo zapisaniu przejdź do Uruchom sesję.
    4. W Uruchom sesjęskonfiguruj parametry obrazowania, takie jak czas ekspozycji, wzmocnienie, autofocus elektroniczny oraz moc diody LED.
      UWAGA: Wzmocnienie oraz moc oświetlenia LED (ekspozycja) mogą być zmieniane w zależności od warunków laboratoryjnych. Zalecana wartość dla ostrzenia elektrycznego wynosi 500, a czas ekspozycji 50 ms. Nie ma ograniczeń w zakresie zmiany mocy LED i wzmocnienia. Należy jednak pamiętać, że wyższa intensywność światła może powodować silniejsze blaknięcie. Czas ekspozycji podczas rejestracji określa częstotliwość klatek nagrania wideo. Wyższa częstotliwość klatek obniży intensywność sygnału. Częstotliwość klatek powinna zostać zoptymalizowana pod kątem GECI użytych do obrazowania.
  6. Aby zamocować mikroskop na manipulatorze stereotaktycznym, należy przytwierdzić pręt stereotaktyczny z uchwytem do mikroskopu do manipulatora stereotaktycznego.
    UWAGA: Chwytak to małe akcesorium, które można przymocować do aparatu stereotaktycznego w celu utrzymania korpusu mikroskopu i umieszczenia go w docelowym miejscu w mózgu.
  7. Uchwyć mikroskop za pomocą chwytaka do mikroskopu. Włącz diodę LED podłączoną do mikroskopu i ustaw mikroskop pionowo. Obniżaj mikroskop, obserwując obraz, aż do pojawienia się powierzchni wszczepionej soczewki GRIN.
  8. Wyrównaj środek zaimplantowanej soczewki GRIN ze środkiem pola widzenia.
    UWAGA: W tym kroku można przeprowadzić walidację implantacji soczewki GRIN (wspomniana w sekcji wyników, Rycina 2B, Rycina 2D, Rysunek 2F).
  9. Należy wykonać obraz powierzchni wszczepionej soczewki GRIN (Kliknij Zrzut ekranu przycisk na klawiaturze). Obraz powierzchni zaimplantowanej soczewki GRIN jest niezbędny do odrzucenia komponentów nieneuronalnych podczas późniejszego przetwarzania danych (krok 6.8).
  10. Znajdź odpowiednią pozycję mikroskopu. Powoli podnoś obiektyw mikroskopu, obserwując obraz w poszukiwaniu komórek wykazujących ekspresję GCaMP7b.
    UWAGA: Może być konieczne dostosowanie wzmocnienia podczas akwizycji obrazu lub mocy diody LED odpowiedzialnej za ekspozycję. Na tym etapie można przeprowadzić walidację implantacji soczewki GRIN (omówiono to w sekcji wyników, Rycina 2A, Rycina 2C, Rycina 2E).

4. Mocowanie płyty podstawowej

UWAGA: Krok mocowania płytki podstawowej następuje po walidacji implantacji soczewki GRIN. Płytka podstawowa stanowi platformę do montażu mikroskopu do głowy myszy. Jak wspomniano w poprzedniej sekcji, w niniejszym protokole stosowana jest mobilna klatka domowa.

  1. Po zweryfikowaniu implantacji soczewki GRIN, odłącz miniaturowy mikroskop od uchwytu mikroskopu.
  2. Przymocuj płytkę podstawy do mikroskopu. Dokręć śrubę za pomocą klucza imbusowego, aby zapewnić stabilne połączenie płytki podstawy z mikroskopem.
  3. Chwyć mikroskop za pomocą uchwytu mikroskopu. Włącz diodę LED podłączoną do mikroskopu i ustaw mikroskop pionowo. Obniżaj mikroskop, aż zaobserwowana zostanie powierzchnia implantowanej soczewki GRIN. Wyrównaj środek implantowanej soczewki GRIN ze środkiem pola widzenia.
  4. Znajdź odpowiednią pozycję mikroskopu. Powoli podnoś obiektyw mikroskopu, aż do znalezienia płaszczyzny ogniskowej, która daje najlepsze obrazy komórek z ekspresją GCaMP7b (Rycina 2A).
    UWAGA: Na tym etapie może być konieczna regulacja wzmocnienia akwizycji obrazu lub mocy ekspozycji diody LED.
  5. Nałóż cement akrylowy, aby stabilnie przymocować płytkę podstawy do płytki głowowej (Rycina 2G). Wypełnij ścianki boczne cementem akrylowym pomiędzy płytką podstawy a płytką głową.
    UWAGA: Cement akrylowy kurczy się podczas utwardzania. Z tego powodu nie należy usuwać mikroskopu, dopóki cement całkowicie nie stwardnieje (ten etap trwa co najmniej 30 min). Cementowanie należy przeprowadzić bardzo ostrożnie, aby uniknąć przypadkowego sklejenia mikroskopu i jego obiektywu cementem akrylowym.
  6. Po całkowitym stwardnieniu cementu akrylowego poluzuj śrubę i powoli podnieś korpus mikroskopu.
  7. Jeśli na ściance bocznej występuje szczelina, wykonaj dodatkowe cementowanie, aby chronić implantowaną soczewkę GRIN przed kurzem.
  8. Przykryj płytkę podstawy, aby chronić implantowaną soczewkę GRIN przed kurzem, i dokręć śrubę płytki podstawy.
  9. Zwolnij płytkę głową z pręta głowowego. Przenieś mysz do klatki domowej do czasu przyszłego obrazowania optycznego.

5. Optyczna rejestracja sygnału GCaMP podczas testu behawioralnego

UWAGA: Procedura rejestracji sygnału GCaMP podczas zachowania może się znacznie różnić w zależności od systemów wykorzystywanych do obrazowania optycznego, projektu eksperymentalnego oraz środowiska laboratoryjnego. Dlatego w tej sekcji została ona opisana w uproszczony sposób.

  1. Przez kilka dni przed testem behawioralnym należy przeprowadzać oswojenie zwierząt.
  2. Przygotować aparat do badań behawioralnych (np. komorę do warunkowania lękowego, oprogramowanie behawioralne i urządzenie Coulbourn Instrument) oraz komputer przenośny.
  3. Podłącz mikroskop do modułu DAQ i włącz moduł DAQ.
  4. Podłącz moduł DAQ do laptopa za pomocą bezprzewodowego połączenia internetowego.
  5. Uruchom oprogramowanie DAQ (zalecana jest przeglądarka Firefox) na laptopie. Kliknij Menedżer plików przycisk i sprawdź pozostałą pojemność pamięci modułu DAQ w celu zapisania zarejestrowanych danych.
    UWAGA: Rozmiar danych dla 30-minutowego nagrania wynosi około 80 GB.
  6. Wprowadź niezbędne informacje (datę, identyfikator myszy itd.).) w Zdefiniowana sesja i wprowadzić do Uruchom sesję.
  7. Delikatnie chwyć mysz i zdejmij pokrywę płytki podstawowej z jej głowy. Umieść mikroskop na platformie płytki podstawowej.
  8. Dokręć śrubę płyty podstawowej i umieść zwierzę z zamontowanym na głowie mikroendoskopem w komorze behawioralnej.
    UWAGA: W tym kroku mysz może próbować uciec, jeśli sposób jej unieruchomienia jest niewystarczający.
  9. Podłącz płytkę NI do portu TRIG modułu DAQ za pomocą kabla BNC. Płytka NI odbiera sygnały TTL z oprogramowania do analizy behawioralnej (np. FreezeFrame) i koordynuje procedurę jednoczesnej rejestracji sygnału GCaMP oraz zachowania zwierzęcia.
  10. Ustaw płaszczyznę ogniskowania.
    UWAGA: Płaszczyzna ogniskowa jest określana przez odległość między obiektywem mikroskopu a soczewką GRIN wszczepioną do mózgu. Aby dostosować płaszczyznę ogniskową, manipuluje się pozycją obiektywu podczas obserwacji obrazów. Odległość między tymi dwiema soczewkami, przy której widoczna jest wyraźna morfologia komórek i naczyń krwionośnych, zostaje ustawiona jako płaszczyzna ogniskowa obrazowania. W niniejszym protokole do sterowania ruchem obiektywu podczas regulacji wykorzystuje się oprogramowanie DAQ.
  11. Ustaw zoptymalizowany czas ekspozycji, wzmocnienie oraz moc diody LED w Uruchom sesję.
    UWAGA: Zazwyczaj jako czas ekspozycji stosuje się 50 ms. Wzmocnienie (gain) oraz moc diody LED są ustawiane na podstawie histogramów obrazu. Histogramy wskazują rozkład intensywności fluorescencji pikseli. Na podstawie inspekcji wizualnej prawa krawędź histogramu powinna mieć wartość między 40% a 60% w przypadku GCaMP7b. Wartość ta ulega zmianie w zależności od użytych do obrazowania wskaźników GECI.
  12. Zmień opcję nagrywania na Rejestracja wyzwalanaKliknij Nagraj i rozpocząć zachowanie.
    UWAGA: Opcja rejestracji wyzwalanej zapewnia dopasowaną oś czasu sesji rejestracji oraz sesji behawioralnej. Po odebraniu sygnału TTL nad portem TRIG zapala się czerwona kontrolka.
  13. Po zakończeniu testu behawioralnego odłącz mikroskop i zamocuj pokrywę płyty podstawowej.
  14. Przenieś mysz do klatki domowej. Następnie wybierz Menedżer plików oraz wyeksportować dane z modułu DAQ.
  15. Po teście behawioralnym uśmierć mysz w celu pośmiertnej weryfikacji histologicznej.

6. Przetwarzanie danych

UWAGA: Procedura przetwarzania danych różni się znacząco w zależności od zastosowanego oprogramowania do analizy danych oraz rodzaju GECI użytych w eksperymencie obrazowania. W związku z tym w tej sekcji została ona opisana w sposób uproszczony. Niniejszy protokół wykorzystuje komercyjne oprogramowanie do przetwarzania danych (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie, bez problemu można zastosować inne oprogramowanie open source wymienione w sekcji dyskusji. Zmienne użyte w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1.

  1. Zaimportuj plik z danymi wideo z rejestracji (1280 pikseli x 800 pikseli) z modułu DAQ do komputera stacjonarnego w celu przetworzenia danych. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania danych.
    UWAGA: Oprogramowanie do przetwarzania danych różni się od oprogramowania DAQ używanego w poprzednich krokach. W oprogramowaniu do przetwarzania danych występuje 6 etapów: down-sampling (redukcja próbkowania), cropping (wycinanie), filtr przestrzenny, korekcja ruchu, obliczanie ΔF/F oraz detekcja zdarzeń, które są niezbędne do wyodrębnienia danych o przejściach wapniowych pojedynczych komórek z zarejestrowanego wideo.
  2. Przeprowadź down-sampling i cropping wideo.
    UWAGA: Redukcja próbkowania i wycinanie są niezbędne do zwiększenia szybkości przetwarzania danych. Wytnij obszary poza regionem zainteresowania, w którym obserwowany jest sygnał GCaMP.
  3. Zastosuj filtr przestrzenny. Po zastosowaniu filtra przestrzennego utwórz obraz projekcji średniej intensywności.
    UWAGA: Filtr przestrzenny rozróżnia każdy piksel w zarejestrowanym obrazie wideo i zapewnia obraz o wysokim kontraście. Istnieją dwa rodzaje filtrów odcinających: filtr dolnoprzepustowy i górnoprzepustowy. Wyższa wartość filtrów dolnoprzepustowych zwiększa kontrast obrazu, ale jednocześnie zwiększa ogólny szum szary. Niższa wartość filtra górnoprzepustowego powoduje rozmycie obrazu.
  4. Zastosuj korekcję ruchu. Jako obraz referencyjny do korekcji ruchu wykorzystaj obraz projekcji średniej intensywności.
  5. Zastosuj korekcję ruchu ponownie, używając obrazu pierwszej klatki jako obrazu referencyjnego.
    UWAGA: Dwuetapowa korekcja ruchu znacząco zmniejsza artefakty ruchowe.
  6. Przeprowadź obliczenia ΔF/F, aby zwizualizować piksele wykazujące zmianę jasności.
    UWAGA: Zmiana jasności pikseli jest spowodowana zmianą intensywności fluorescencji GCaMP i wskazuje na przejścia wapniowe.
  7. Zastosuj algorytm PCA/ICA, aby zwizualizować krzywą przejść wapniowych dla każdej komórki.
    UWAGA: PCA/ICA to algorytm służący do sortowania grupy danych w zestaw danych pojedynczych komponentów. Zmienne powinny być zoptymalizowane dla każdych warunków laboratoryjnych. W niniejszym protokole wszystkie zmienne są domyślne, z wyjątkiem czasowej wagi ICA (w tym protokole zastosowano wartość 0,4)27.
  8. Ręcznie odznacz komponenty nieneuronalne spośród zidentyfikowanych komponentów na podstawie kryteriów opisanych w poniższej Uwadze.
    UWAGA: Do tego celu stosuje się dwa główne kryteria. Po pierwsze, sygnał GCaMP pochodzący z neuronu ma wyraźny kształt sferyczny. Dlatego jako neuron wybierany jest tylko sygnał o wyraźnym kształcie sferycznym. Po drugie, biorąc pod uwagę, że średnica ciała komórki piramidowej ciała migdałowatego wynosi około 20 µm28,29,30, jako neuron wybierany jest tylko sygnał, który mniej więcej odpowiada temu rozmiarowi. Aby określić rozmiar sygnału GCaMP, rzeczywisty rozmiar pojedynczego piksela jest obliczany na podstawie uchwyconego obrazu powierzchni soczewki (krok 3.9), a następnie obliczana jest maksymalna szerokość pojedynczego kształtu sferycznego. Na przykład w tym protokole średnica wszczepionej soczewki GRIN wynosi 600 µm. Zatem, jeśli średnica soczewki wynosi 800 pikseli, rzeczywisty rozmiar pojedynczego piksela to 1,5 µm (20 µm to około 7 pikseli).
  9. Zastosuj funkcję detekcji zdarzeń, aby wykryć znaczący wzrost przejścia wapniowego (zdarzenie wapniowe).
    UWAGA: W tym kroku wymagana jest zmienna zwana najkrótszym czasem zaniku zdarzenia (τ). W niniejszym protokole jako zoptymalizowana zmienna dla GCaMP7b zastosowano wartość 1,18 s. Średni czas połowicznego zaniku (t1/2=0,82 s) oblicza się na podstawie krzywej ΔF/F podczas spontanicznej aktywności komórek. Ponieważ GCaMP wykazuje zanik wykładniczy, τ = Wzór na okres połowicznego rozpadu t1/2 przez ln(2), równanie, obliczanie szybkości zaniku..

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja implantacji soczewki GRIN
Przed trwałym przymocowaniem płytki bazowej do mózgu za pomocą cementowania należy przeprowadzić walidację implantacji soczewki GRIN. U zwierząt z udaną implantacją soczewki, zarówno komórki wykazujące ekspresję GCaMP, jak i naczynia krwionośne były wyraźnie widoczne w zakresie płaszczyzny ogniskowej wyznaczonym przez odległość między obiektywem mikroskopu a implantowaną soczewką GRIN (Rycina 2A i B). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Umiejętne techniki chirurgiczne są niezbędne do osiągnięcia udanego optycznego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniaturowej mikroskopii montowanej na głowie w głębszych obszarach mózgu, takich jak ciało migdałowate, jak opisaliśmy tutaj. Dlatego, chociaż protokół ten stanowi wytyczne dla zoptymalizowanych procesów chirurgicznych mocowania płytki bazowej i implantacji soczewek GRIN, dodatkowe procesy optymalizacyjne mogą być konieczne w przypadku krytycznych kroków. Jak wspomniano w sekcji protokołu, współrzędne ciał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantami z Samsung Science and Technology Foundation (numer projektu SSTF-BA1801-10).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 26GBD302002Chirurgia
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREAddgene104493-AAV1Chirurgia
AAV2/1-CaMKiiα-GFPzamówienieChirurgia
Cement akrylowo-dentystyczny (Ortho-jet Acrylic Pink)Lang1334-różowyChirurgia & Nasadka do płyty bazowej
Manipulator przepływu powietrzaNeurotarNTR000253-04Nasadka
AmoksycylinaSIGMAA8523-5GPłytka chirurgiczna
INSCOPIX1050-002192Mocowanie płytki bazowej
Osłona płyty bazowejINSCOPIX1050-002193Nasadka do płytki bazowej
Aparat (komora) behawioralnyCoulbourn Test zachowania klatki testowej instrumentu
Aparatura behawioralna (oprogramowanie)zachowaniastopklatki instrumentu Coulbourn
Klatka węglowaNeurotar180mm x 70mmMocowanie płytki bazowej
CarprofenSIGMAPHR1452-1GChirurgia
przetwarzania danychINSCOPIXOprogramowanie do przetwarzania danych INSCOPIX Oprogramowanie do przetwarzania danychPłytka bazowa Załącznik & Test zachowania
DeksametazonSIGMAD1756-500MGWiertło chirurgiczne
Seyangmarathon-4Wiertło chirurgiczne
ELAUS1/2, Shank104Szklana
igłachirurgiczna WPIPG10165-4Chirurgia
Soczewka GRIN (sonda soczewkowa INSCOPIX Proview)INSCOPIX1050-002208Chirurgia
Hamilton StrzykawkaHamilton84875Chirurgia
Płyta głównaNeurotarModel 5Chirurgia
Klucz sześciokątnyINSCOPIX1050-004195Mocowanie płyty bazowej
LaptopSamsungNT950XBVSurgery & Mocowanie płytki bazowej
Uchwyt soczewki, pręt stereotaktyczny (zestaw implantów INSCOPIX proview)INSCOPIX1050-004223Chwytak
do mikroskopuINSCOPIX1050-002199Mikroskop do mocowania płytki podstawowej
, oprogramowanie DAQ, sprzętINSCOPIXnVista 3.0i Test zachowania
Mobilna klatka domowaNeurotarMHC V5Podstawa Mocowanie
Zmodyfikowane ramięNeurostarCustomized Surgery
Oprogramowanie dla zmodyfikowanych ramionNeurostarCustomized Surgery
NI BoardKrajowy instrumentTest zachowania
Zdejmowane wiązanie epoksydoweWPIKwik-CastSurgery
Cement żywiczny (Super-bond)Sun medicalSuper bond C& BChirurgia
Śruba czaszkiStoelting51457Chirurgia
Stereotaktyczny uchwyt elektrodyASIEH-600Chirurgia
Rama stereotaktycznaStoelting51600Chirurgia
Manipulator stereotaktycznyStoelting51600Mocowanie płyty bazowej
na do płytki bazowejTest Oprogramowanie do chirurgicznego Nasadka do płytki bazowej

Bibliografia

  1. Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
  2. Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).
  3. Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
  4. Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
  5. Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
  6. Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
  7. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  8. Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
  9. Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
  10. Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
  11. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  18. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  19. Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  20. Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
  21. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  22. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  23. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).
  24. Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).
  25. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  26. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).
  27. Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  28. Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
  29. McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
  30. McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskop montowany na g owieobrazowanie cia a migda owategoimplantacja soczewki GRINiniekcja AAVchirurgia stereotaktycznaekspresja GCaMPzmotoryzowane rami chirurgicznemobilna klatka domowamikroskopia fluorescencyjna
Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.