Artykuł metodologiczny

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

DOI:

10.3791/61662

⸱

6 października 2020

 ,  , 
1Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 2Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, 3UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja stała się kluczową metodą transferu określonych genów do komórek, aby zrozumieć ich funkcję. W tym miejscu opisujemy technikę elektroporacji pojedynczej komórki, która maksymalizuje wydajność (~ 80%) transfekcji genów in vitro w pobudzających i specyficznych dla klasy neuronach hamujących w mysiej organotypowej hodowli plastrów hipokampa. Korzystając z dużych szklanych elektrod, sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego zawierającego tetrodotoksynę i łagodnych impulsów elektrycznych, dostarczyliśmy interesujący nas gen do hodowanych neuronów piramidowych CA1 hipokampa i interneuronów hamujących. Co więcej, elektroporację można przeprowadzić w hodowanych wycinkach hipokampa do 21 dni in vitro bez zmniejszenia wydajności transfekcji, co pozwala na badanie różnych etapów rozwoju kultur warstwowych. Wraz z rosnącym zainteresowaniem badaniem funkcji molekularnych genów w różnych typach komórek, nasza metoda demonstruje niezawodne i proste podejście do transfekcji genów in vitro w tkance mózgowej myszy, które można przeprowadzić przy użyciu istniejącego sprzętu i technik elektrofizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W biologii molekularnej, jednym z najważniejszych zagadnień dla badacza jest to, jak dostarczyć interesujący gen do komórki lub populacji komórek, aby wyjaśnić jego funkcję. Różne metody dostarczania można podzielić na biologiczne (np. wektor wirusowy), chemiczne (np. fosforan wapnia lub lipid) lub fizyczne (np. elektroporacja, mikroiniekcja lub biolistyka)1,2. Metody biologiczne są bardzo skuteczne i mogą być specyficzne dla typu komórki, ale są ograniczone przez rozwój określonych narzędzi genetycznych. Podejścia chemiczne są bardzo skuteczne in vitro, ale transfekcje są na ogół losowe; Co więcej, podejścia te są w większości zarezerwowane tylko dla komórek pierwotnych. Spośród podejść fizycznych, biolistyka jest najprostsza i najłatwiejsza z technicznego punktu widzenia, ale ponownie daje losowe wyniki transfekcji przy stosunkowo niskiej wydajności. W przypadku zastosowań, które wymagają transferu do określonych komórek bez konieczności opracowywania narzędzi genetycznych, zwracamy uwagę na elektroporację pojedynczych komórek3,4.

Podczas gdy elektroporacja odnosiła się tylko do elektroporacji polowej, w ciągu ostatnich dwudziestu lat opracowano wiele protokołów elektroporacji pojedynczych komórek in vitro i in vivo w celu poprawy specyficzności i wydajności5,6,7, co pokazuje, że elektroporacja może być używana do transferu genów do pojedynczych komórek i dlatego może być niezwykle precyzyjna. Procedury te są jednak wymagające technicznie, czasochłonne i stosunkowo mało efektywne. Rzeczywiście, nowsze prace badały wykonalność zmechanizowanych urządzeń do elektroporacji8,9, co może pomóc w wyeliminowaniu kilku z tych barier dla badaczy zainteresowanych instalacją takiej robotyki. Ale dla tych, którzy szukają prostszych środków, problemy z elektroporacją, a mianowicie śmierć komórki, niepowodzenie transfekcji i zatkanie pipety, pozostają problemem.

Niedawno opracowaliśmy metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane pipety z większą końcówką, łagodniejsze parametry impulsów elektrycznych i unikalny krok cyklu ciśnienia, co wygenerowało znacznie wyższą efektywność transfekcji w neuronach pobudzających niż poprzednie metody i umożliwiło nam po raz pierwszy transfekcję genów w interneuronach hamujących, w tym interneuronów hamujących wyrażających somatostatynę w regionie CA1 hipokampa w hodowli organotypowej myszy10. Jednak niezawodność tej metody elektroporacji w różnych typach interneuronów hamujących i etapach rozwoju neuronów nie została poruszona. Tutaj wykazaliśmy, że ta technika elektroporacji jest zdolna do transfekcji genów zarówno do neuronów pobudzających, jak i różnych klas interneuronów. Co ważne, skuteczność transfekcji była wysoka niezależnie od dni testowanych pod kątem wieku hodowli warstwowej in vitro (DIV). Ta sprawdzona i przyjazna dla użytkownika technika jest wysoce zalecana każdemu badaczowi zainteresowanemu zastosowaniem elektroporacji pojedynczych komórek dla różnych typów komórek w kontekście tkanki mózgowej myszy in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szkole Medycznej Uniwersytetu Massachusetts. Przygotowanie kultur warstwowych, przygotowanie plazmidu i elektroporacja są również szczegółowo opisane w naszych wcześniej opublikowanych metodach i można się do nich odwołać w celu uzyskania dodatkowych informacji10.

1. Przygotowanie kultur plasterków

  1. Przygotuj organotypowe kultury plastrów hipokampa myszy, jak opisano wcześniej11, używając pourodzeniowych myszy w wieku od 6 do 7 dni obu płci.
    1. Przygotować pożywki preparacyjne do organotypowej hodowli plastrów składających się z (w mM): 238 sacharozy, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, a następnie gaz z 5% CO2/95% O2 do pH 7,4.
    2. Przygotować organotypową pożywkę hodowlaną w warstwach składającą się z: 78,8% (v/v) minimum niezbędnego podłoża Eagle, 20% (v/v) surowicy końskiej, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glukozy, 2 M CaCl2, 2 MMgSO4, 30 mM HEPES, insuliny (1 μg/ml) i 0,06 mM kwasu askorbinowego o pH dostosowanym do 7,3. Dostosuj osmolarność do 310-330 osmol za pomocą osmometru.
    3. Wypreparuj hipokampy z całego mózgu za pomocą dwóch szpatułek i pokrój (400 μm) za pomocą rozdrabniacza tkanek. Oddzielić plastry za pomocą dwóch kleszczyków i przenieść do 30-milimetrowych wkładek do hodowli komórkowych na 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką hodowlaną (950 μl) pod wkładkami.
  2. Organtypowe kultury bakterii w warstwach należy przechowywać w inkubatorze do hodowli tkankowych (35°C, 5% CO2 ) i zmieniać pożywki do hodowli plastrów co dwa dni.

2. Przygotowanie plazmidu

  1. Przygotuj plazmid dla interesującego Cię genu.
    1. Subklonuj gen białka zielonej fluorescencji (EGFP) do wektora pCAG.
    2. Oczyść plazmid pCAG-EGFP za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn i rozpuść w roztworze wewnętrznym, który składa się z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu zawierającej 140 mM K-metanosulfonianu, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 i 10 mM HEPES, dostosowanego do pH 7,3 za pomocą KOH (stężenie plazmidu: 0,1 μg / μL).

3. Przygotowanie pipet szklanych

  1. Pociągnij pipety ze szkła borokrzemianowego (4,5 – 8 MΩ) na ściągaczu do mikropipet (Rysunek 1A).
    UWAGA: Szklane pipety używane do nagrań z użyciem zacisków krosowych dla całych komórek są idealne do elektroporacji.
  2. Piecz szklane pipety przez noc w temperaturze 200°C w celu sterylizacji.
  3. Sprawdź rozmiar końcówki pipety pod mikroskopem preparacyjnym, aby w przybliżeniu określić opór elektryczny.
    1. Opcjonalnie: Sprawdź rezystancję pipety, podłączając pipetę do elektrody elektroporacyjnej i za pomocą mikromanipulatora wmanewruj końcówkę pipety w sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy sterylizowany filtrem (aCSF) zawierający (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, gazowanej 5% CO2 / 95% O2 do pH 7,4. Potwierdź rzeczywistą rezystancję za pomocą odczytu na elektroporatorze.
      UWAGA: Im ostrzejsza końcówka pipety, tym większy opór elektryczny. Rezystancja pipety powinna być mniejsza niż 10 MΩ. Szklane pipety o wysokiej rezystancji pipet (Rysunek 1B) często zapychają końcówkę podczas wielokrotnej elektroporacji.

4. Konfiguracja urządzenia do elektroporacji

  1. Zainstaluj elektroporator na standardowym stanowisku do elektrofizjologii całych komórek, wyposażonym w pionowy mikroskop zamontowany na ruchomym stole z mikromanipulatorem i pompą perystaltyczną.
  2. Zamontuj stopień główny elektroporatora na mikromanipulatorze i podłącz parę głośników do elektroporatora. Podłącz elektroporator do pedału nożnego, który może być użyty do wysłania impulsu, gdy będzie gotowy.
    UWAGA: Po włączeniu głośniki emitują dźwięk, który jest wskaźnikiem oporu elektrycznego na elektrodzie. Umożliwia to określenie względnych zmian oporności bez odwracania uwagi od zabiegu.

5. Przygotowanie do elektroporacji

  1. Przenieś wkładki do kultur plastrowych z płytek 6-dołkowych na 3-centymetrowe szalki Petriego załadowane 900 μl pożywki hodowlanej i przechowuj w stołowym inkubatorze CO2 do momentu przygotowania do przeprowadzenia elektroporacji.
    1. Wstępnie inkubować świeże wkładki hodowlane z pożywką hodowlaną w plastrach (1 ml) przez co najmniej 30 minut na 3,5 cm szalce Petriego w celu wyhodowania plastrów po elektroporacji.
  2. Oczyść i przygotuj zestaw do elektroporacji.
    1. Wypełnij linie 10% wybielaczem przez 5 minut, aby wysterylizować rurkę i komorę przed rozpoczęciem eksperymentu na cały dzień.
    2. Przetapiaj linie dejonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut, aby całkowicie spłukać.
    3. Wykonaj fuzję linii za pomocą sterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 mM tetrodotoksyny (TTX).
      UWAGA: TTX minimalizuje toksyczność komórkową i śmierć z powodu nadmiernego pobudzenia interneuronów10.
  3. Ustaw parametry impulsu elektroporatora: amplituda –5 V, impuls prostokątny, ciąg 500 ms, częstotliwość 50 Hz i szerokość impulsu 500 μs.
  4. Napełnij szklaną pipetę 5 μl roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid.
    1. Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z końcówki pipety, kilkakrotnie przesuwając i delikatnie stukając w końcówkę.
    2. Sprawdzić, czy końcówka nie jest uszkodzona, wizualizując ją pod mikroskopem preparacyjnym lub powtarzając krok 3.3.1 w celu sprawdzenia oporu pipety.
      UWAGA: Jeśli końcówka jest uszkodzona, szklaną pipetę należy wyrzucić i powtórzyć ten krok z nową szklaną pipetą przygotowaną wcześniej w kroku 3.
  5. Mocno przymocuj końcówkę pipety do elektrody i włącz głośniki. Zapisz odczyt (rezystancję pipety) elektroporatora, gdy końcówka zetknęła się z medium aCSF.
  6. Przeciąć membranę wkładki hodowlanej za pomocą ostrego ostrza i wyizolować jedną kulturę plasterkową. Ostrożnie przenieś kulturę plastrów do komory elektroporacyjnej za pomocą ostrych kleszczy kątowych i utrwal jej położenie za pomocą kotwicy do plastrów.
    1. Nie należy trzymać kultury plastrów poza inkubatorem dłużej niż 30 minut, aby zapobiec skutkom ubocznym, takim jak zmiany w zdrowiu neuronów lub funkcji12.

6. Interesujące ogniwa elektroporacyjne

  1. Zastosować nadciśnienie w pipecie ustami lub za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ciśnienie 0,2 - 0,5 ml) podłączonej do rurki.
  2. Użyj trójwymiarowego pokrętła mikromanipulatora, aby manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów.
  3. Wybierz komórkę docelową i zbliż się do niej, utrzymując nadciśnienie, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie, widoczne pod mikroskopem.
  4. Wykonuj cykle ciśnieniowe.
    1. Szybko zastosuj łagodne podciśnienie doustnie, tak aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie, na co wskazuje wizualnie membrana sięgająca nieco do końcówki pipety. Obserwuj wzrost (~2,5x początkowy opór) oporu pipety, nasłuchując wzrostu tonu dochodzącego z głośników. Szybko ponownie zastosuj nadciśnienie, aby wgłębienie ponownie się uformowało.
    2. Natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe bez przerwy, a następnie utrzymuj podciśnienie przez 1 s.
      UWAGA: Przerwy między cyklami, wywieranie zbyt dużego nacisku lub zbyt długie utrzymywanie podciśnienia może spowodować znaczne uszkodzenie ogniwa i spowodować śmierć ogniwa podczas elektroporacji.
  5. Szybko pulsuj elektroporatorem raz za pomocą pedału nożnego, gdy ton z głośników osiągnie stabilny wierzchołek wysokości, wskazując szczytową rezystancję elektryczną. Nie czekaj na szczytową rezystancję dłużej niż 1 s przed wysłaniem impulsu.
    UWAGA: Nie zaobserwowaliśmy żadnej elektroporacji poza celem podczas korzystania z tego protokołu10. Transfekcji poddano tylko te komórki, które miały kontakt ze szklaną pipetą podczas cykli ciśnieniowych. Umieszczenie pipety w pobliżu innych neuronów nie powoduje transfekcji genu.
  6. Delikatnie wycofaj pipetę na około 100 μm z kuwety bez wywierania nacisku.
  7. Ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu zarejestrowanego w kroku 5.5, a następnie zbliż się do następnej komórki.
    1. Usunąć potencjalne zatkania, sygnalizowane wizualnie lub przez znacznie zwiększoną (o >15% wyższą) rezystancję pipety po elektroporacji, stosując nadciśnienie.
      UWAGA: Jeśli nie ma widocznego zatkania, a opór jest nadal znacznie wyższy, wyrzuć pipetę i użyj nowej. Średnio pipeta może być używana do maksymalnie 20 zdarzeń elektroporacji, jeśli użytkownik jest ostrożny10.
  8. Po elektroporacji przenieś kulturę plastrów na świeżą wkładkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 35°C w inkubatorze przez okres do 3 dni.

7. Utrwalanie, barwienie i obrazowanie organtypowych kultur warstw hipokampa

  1. Utrwalić elektroporowane organotypowe kultury plastrów 2 – 3 dni po transfekcji za pomocą 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w 0,01 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (1x PBS) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć plastry utrwalacza i inkubować w 30% sacharozie w 0,1 M buforze fosforanowym (1x PB) przez 2 godziny.
  3. Umieść plastry na szkiełku szkiełkowym i zamroź je, kładąc szklankę na pokruszonym suchym lodzie. Rozmrozić plastry w temperaturze pokojowej i przenieść je na 6-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS.
  4. Wybarwić plastry mysimi przeciwciałami anty-GFP i króliczymi przeciwciałami anty-RFP w buforze GDB (0,1% żelatyny, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl i 32% 1x PB, pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj plastry z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy każdym praniu.
  6. Inkubować plastry z przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z anty-myszem Alexa 488 i przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym Alexa 594 w buforze GDB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować plastry z DAPI (4 μg/ml) w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj plastry z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy każdym praniu.
  8. Zamontuj plastry na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego i wykonaj obrazowanie fluorescencyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza elektroporacja jednokomórkowa jest zdolna do precyzyjnego dostarczania genów do wizualnie zidentyfikowanych neuronów pobudzających i hamujących. Poddaliśmy elektropostacji trzy różne typy komórek neuronalnych w trzech różnych punktach czasowych. Neurony wyrażające parwalbuminę (Pv) lub pęcherzykowy glutaminian typu 3 (VGT3) uwidoczniono poprzez skrzyżowanie linii Pvcre (JAX #008069) lub VGT3cre (JAX #018147) z linią reporterową TdTomato (wariant białka czerwonej fluorescencji) (Jax #007905), n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę elektroporacji, która z wysoką wydajnością i precyzją transfekuje zarówno neurony pobudzające, jak i hamujące. Nasz zoptymalizowany protokół elektroporacji zawiera trzy innowacyjne przełomowe rozwiązania, które pozwalają osiągnąć wysoce wydajną transfekcję genów. Nasza pierwsza modyfikacja polegała na zwiększeniu rozmiaru pipety w porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami 3,5,6. Ta zmiana umożliwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants (R01NS085215 dla K.F., T32 GM107000 i F30MH122146 dla A.C.). Autorzy dziękują Pani Naoe Watanabe za umiejętną pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Preparat plazmidowy
Zestaw do oczyszczania plazmiduQiagen12362
Organotypowy preparat do hodowli plastrów
6 dołkówGREINER BIO-ONE657160
Dumont #5/45 KleszczeFST#5/45Kątowe kleszcze preparacyjne do przygotowania organotypowych plastrów
Jednostka filtrująca kolbyMilliporeSCHVU02REFiltracja i przechowywanie pożywek hodowlanych
SpoiwoinkubatoraBD C150-UL
Rozdrabniacz tkanek McIlwainTED PELLA, INC.10180Rozdrabniacz tkanek do organotypowego przygotowania kultur plastrowych
Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mmMilliporePIHP03050Organotypowe wkładki do hodowli plastrów
OsmometerPrecision Systemspowlekane PTFE OSMETTE II
Cole-ParmerSK-06369-11
NożyczkiFST14958-09
Stereo MikroskopOlympusSZ61
Sterylny system filtracji próżniowejMilliporeSCGPT01REFiltracja i przechowywanie aCSF
Przygotowanie elektrody
Okulary kapilarneWarner Instruments640796
Ściągacz do mikropipetSutter PrzyrządP-1000Ściągacz
Spoiwodo piekarnikaBD (E2)
Ściągacz do włókienInstrument SutterFB330BŚciągacz
Elektroporacja jednokomórkowa i obrazowanie fluorescencyjne #1
3,5 mm Szalki Petriego FalconBD Falcon353001
Kamera CCD AirtableTMC63-7512E
Q ObrazowanieKamera Retiga-2000DC
System elektroporacjiUrządzenia molekularneAxoporator 800AElektroporator
System oświetlenia fluorescencyjnegoWcześniejszyLumen 200
Instrument SutterManipulatorMPC-385
Metamorf oprogramowaniemolekularneAkwizycja obrazu
Pompa perystaltycznaRaininDynamax, RP-2Pompa perfuzyjna
Stół przesuwnyLuigs & Głośnik Neuman240 XY
NieznanyGłośniki podłączone do elektroporatora
Mikroskop stereoskopowyInkubator stołowy OlympusSZ30
Thermo ScientificMIDI 40
OlympusBX61WI
strong>Fluorescence obrazowanie #2
All-in-One Mikroskop fluorescencyjnyKeyenceBZ-X710
Szpatułki manipulator Urządzenia Mikroskop pionowy <

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
  2. Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
  3. Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
  4. Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
  5. Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
  6. Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
  7. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904(2017).
  8. Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604(2017).
  9. Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603(2012).
  10. Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  12. Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
  13. Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817(2015).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
  16. Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
  17. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony hipokampa myszytransfekcja gen wneurony pobudzaj ce i hamuj cetechnika szklanej elektrodyACSF z tetrodotoksynkomora do elektroporacjimetoda cyklicznych zmian ci nienianeurony piramidowe obszaru CA1

Powiązane artykuły