Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61664

⸱

18 sierpnia 2020

 , 
1Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

W tym artykule

Podsumowanie

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Streszczenie

Techniki elektrofizjologii in vitro mierzą aktywność pojedynczej komórki z precyzyjną rozdzielczością elektryczną i czasową. Wycinki mózgu muszą być stosunkowo cienkie, aby prawidłowo uwidocznić i uzyskać dostęp do neuronów w celu zaciśnięcia łatki lub obrazowania, a badanie in vitro obwodów mózgowych jest ograniczone tylko do tego, co jest fizycznie obecne w ostrym wycinku. Aby utrzymać korzyści płynące z eksperymentów in vitro z plastrami przy jednoczesnym zachowaniu większej części jąder presynaptycznych, opracowaliśmy nowatorski preparat warstwowy. Ten "plasterek klinowy" został zaprojektowany do nagrań elektrofizjologii z klamrą krosową w celu scharakteryzowania różnorodnych, monofonicznych, napędzanych dźwiękiem danych wejściowych do neuronów przyśrodkowych oliwoślimakowych (MOC) w pniu mózgu. Neurony te otrzymują pierwotne aferentne, pobudzające i hamujące dane wejściowe z neuronów aktywowanych przez bodźce w uchu przeciwległym i odpowiadającym mu jądrze ślimakowym (CN). Zaprojektowano asymetryczny wycinek mózgu, który jest najgrubszy w domenie rostro-ogonowej na bocznej krawędzi jednej półkuli, a następnie przerzedza się w kierunku bocznej krawędzi przeciwnej półkuli. Ten plasterek zawiera, po grubej stronie, korzeń nerwu słuchowego przekazujący informacje o bodźcach słuchowych do mózgu, wewnętrzne obwody CN oraz zarówno disynaptyczne pobudzające, jak i trisynaptyczne hamujące szlaki aferentne, które zbiegają się w przeciwległych neuronach MOC. Zapis odbywa się z neuronów MOC po cienkiej stronie wycinka, gdzie są one wizualizowane za pomocą optyki DIC do typowych eksperymentów z zaciskiem krosowym. Bezpośrednia stymulacja nerwu słuchowego jest wykonywana, gdy wchodzi on do słuchowego pnia mózgu, co pozwala na wewnętrzną aktywność obwodu CN i plastyczność synaptyczną w synapsach przed neuronami MOC. Dzięki tej technice można naśladować aktywację obwodu in vivo tak ściśle, jak to możliwe w obrębie wycinka. To przygotowanie warstwy klinowej ma zastosowanie do innych obwodów mózgu, w których analizy obwodów skorzystałyby na zachowaniu łączności upstream i danych wejściowych dalekiego zasięgu, w połączeniu z technicznymi zaletami fizjologii plasterków in vitro.

Wprowadzenie

Obserwacja aktywności obwodów nerwowych jest idealnie wykonywana za pomocą natywnych bodźców sensorycznych i informacji zwrotnych, oraz nienaruszonej łączności między obszarami mózgu, in vivo. Jednak przeprowadzanie eksperymentów, które dają rozdzielczość funkcji obwodów nerwowych w jednej komórce, jest nadal ograniczone przez wyzwania techniczne w nienaruszonym mózgu. Podczas gdy elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa in vivo lub metody obrazowania wielofotonowego mogą być wykorzystywane do badania aktywności w nienaruszonym układzie nerwowym, interpretacja, w jaki sposób różne dane wejściowe integrują się lub pomiar podprogowych wejść synaptycznych pozostaje trudna. Zapisy in vivo całych komórek przezwyciężają te ograniczenia, ale są trudne do wykonania, nawet w obszarach mózgu, które są łatwo dostępne. Wyzwania techniczne związane z eksperymentami z rozdzielczością pojedynczych komórek są dodatkowo wzmacniane w niektórych populacjach neuronów, które znajdują się głęboko w mózgu, lub w populacjach rozproszonych przestrzennie, które wymagają narzędzi genetycznych do lokalizacji komórek in vivo (np. ekspresja genetyczna rodopsyny kanałowej w połączeniu z zapisem optrodowym) lub identyfikacji histochemicznej post hoc po znakowaniu miejsca rejestracji (np. za pomocą markerów specyficznych dla neurotransmisji). Neurony przyśrodkowe olivochlear (MOC), zlokalizowane dyfuzyjnie blisko brzusznej powierzchni pnia mózgu, cierpią z powodu powyższych ograniczeń1, co czyni je niezwykle trudno dostępnymi w eksperymentach in vivo.

Plastry mózgu (grubość ~100-500 μm) od dawna są używane do badania obwodów mózgu, w tym obwodów słuchowych pnia mózgu, ze względu na fizyczną segregację połączonych neuronów, które są zawarte w tym samym wycinku2,3,4,5,6,7,8,9. Eksperymenty z użyciem znacznie grubszych plastrów (>1 mm) zostały wykorzystane w innych laboratoriach, aby zrozumieć, w jaki sposób obustronne dane wejściowe integrują się w obszarach górnego kompleksu oliwkowego (SOC), w tym w przyśrodkowym górnym oliwce10,11. Wycinki te zostały przygotowane w taki sposób, że aksony nerwu słuchowego (AN) pozostały nienaruszone w wycinku i były stymulowane elektrycznie do zainicjowania uwalniania neuroprzekaźnika synaptycznego w CN, naśladując aktywność neuronów słuchowych pierwszego rzędu, gdy reagowałyby na dźwięk. Jedną z głównych wad tych grubych plastrów jest widoczność neuronów dla zapisów elektrofizjologicznych ("patchingu"). Łatanie staje się coraz trudniejsze, ponieważ liczne aksony w tym obszarze z wiekiem ulegają mielinizacji12,13,14,15, co sprawia, że tkanka jest optycznie gęsta i zasłania neurony nawet w typowym, cienkim wycinku mózgu. Naszym celem jest stworzenie preparatów in vitro, które bardziej przypominają łączność obwodową nagrań in vivo, ale z wysoką przepustowością i możliwościami nagrywania w wysokiej rozdzielczości wizualnie kierowanej elektrofizjologii patch-clamp w wycinkach mózgu.

Nasze laboratorium bada fizjologię neuronów słuchowego układu odprowadzającego, w tym neuronów MOC. Te neurony cholinergiczne dostarczają odprowadzające sprzężenie zwrotne do ślimaka, modulując aktywność zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC)16,17,18,19,20. Wcześniejsze badania wykazały, że modulacja ta odgrywa rolę w kontroli wzmocnienia w klasie cochlea21,22,23,24,25,26 i ochronie przed urazami akustycznymi27,28,29,30,31,32,33. U myszy neurony MOC są rozproszone w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego (VNTB) w słuchowym pniu mózgu1. Nasza grupa wykorzystała linię myszy ChAT-IRES-Cre skrzyżowaną z linią myszy reporterowej tdTomato, aby celować w neurony MOC w wycinkach pnia mózgu w oświetleniu epifluorescencyjnym. Wykazaliśmy, że neurony MOC otrzymują aferentne hamujące dane wejściowe z ipsilateralnego jądra przyśrodkowego ciała trapezoidalnego (MNTB), które jest z kolei pobudzane przez aksony z globularnych komórek krzaczastych (GBC) w przeciwległym jądrze ślimaka (CN)34,35,36,37,38. Dodatkowo, neurony MOC prawdopodobnie otrzymują pobudzające dane wejściowe z komórek T-gwiaździstych w przeciwległym CN39,40,41. Podsumowując, badania te pokazują, że neurony MOC otrzymują zarówno bodźce pobudzające, jak i hamujące pochodzące z tego samego (przeciwległego) ucha. Jednak neurony presynaptyczne i ich aksony zbiegające się na neuronach MOC nie są wystarczająco blisko siebie, aby były w pełni nienaruszone w typowym preparacie koronalnym. Aby zbadać, w jaki sposób integracja wejść synaptycznych z neuronami MOC wpływa na ich wzorce wypalania potencjału czynnościowego, koncentrując się na nowo opisanym hamowaniu, opracowaliśmy preparat, w którym możemy stymulować różne aferenty do neuronów MOC z jednego ucha w najbardziej fizjologicznie realistyczny sposób, ale z technicznymi korzyściami eksperymentów in vitro z wycinkami mózgu.

Plasterek klinowy to zmodyfikowany preparat z grubym plasterkiem przeznaczony do badania integracji obwodów w neuronach MOC (schematyzowany w Rysunek 1A). Na grubej stronie plastra klin zawiera odcięte aksony nerwu słuchowego (zwanego dalej "korzeniem nerwu słuchowego"), które wchodzą do pnia mózgu z obwodu i synapsy w CN. Korzeń nerwu słuchowego może być stymulowany elektrycznie w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników i aktywacji synaptycznej komórek w pełni nienaruszonego CN42,43,44,45,46. Ten format stymulacji ma kilka zalet dla analizy obwodów. Po pierwsze, zamiast bezpośrednio stymulować aksony T-gwiaździste i GBC, które dostarczają aferentny wkład do neuronów MOC, stymulujemy AN, aby umożliwić aktywację wewnętrznych obwodów obfitujących w CN. Obwody te modulują wyjście neuronów CN do ich celów w całym mózgu, w tym neuronów MOC46,47,48,49,50,51. Po drugie, polisynaptyczna aktywacja obwodów aferentnych od AN przez CN przed neuronami MOC pozwala na bardziej naturalny czas aktywacji i plastyczność w tych synapsach, tak jak miałoby to miejsce in vivo podczas stymulacji słuchowej. Po trzecie, możemy zmieniać nasze wzorce stymulacji, aby naśladować aktywność AN. Wreszcie, zarówno pobudzające, jak i hamujące projekcje monofoniczne do neuronów MOC są nienaruszone w wycinku klina, a ich integrację można zmierzyć w neuronie MOC z precyzją elektrofizjologii patch-clamp. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat aktywacji zapewnia bardziej nienaruszony obwód neuronom MOC w porównaniu z typowym preparatem do wycinków mózgu. Ten wycinek klina pnia mózgu może być również używany do badania innych obszarów słuchowych, które otrzymują hamujące dane z ipsilateral MNTB, w tym bocznej górnej oliwki, górnego jądra oliwkowego i przyśrodkowego górnego oliwki oliwkowej10,11,52,53,54,55,56. Poza naszym specyficznym przygotowaniem, ta metoda krojenia może być stosowana lub modyfikowana do oceny innych systemów z korzyściami płynącymi z utrzymania łączności danych wejściowych dalekiego zasięgu i poprawy wizualizacji neuronów dla różnych technik elektrofizjologii lub obrazowania w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Ten protokół wymaga użycia sceny wibratomicznej lub platformy, którą można przechylić o około 15°. Tutaj używamy dostępnego na rynku 2-częściowego stolika magnetycznego, w którym "stolik" to metalowy dysk z zakrzywionym dnem umieszczony we wklęsłej magnetycznej "podstawie sceny". Stolik można następnie przesunąć, aby dostosować kąt cięcia. Koncentryczne okręgi na podstawie stolika służą do powtarzalnego szacowania kąta. Stolik i podstawa stolika są umieszczone w komorze krojenia, gdzie można również obracać magnetyczną podstawę stolika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowania eksperymentalne

UWAGA: Szczegóły dotyczące przygotowania plastrów, w tym roztwór do krojenia, temperatura krojenia, temperatura inkubacji plastrów i aparatura (itp.) są specyficzne dla przygotowania pnia mózgu wykonanego w tym eksperymencie. Szczegóły inkubacji plastrów mogą być zmieniane w zależności od doświadczenia laboratoryjnego.

  1. Przygotuj wewnętrzne roztwory do mocowania kropek.
    1. Przygotować roztwór cęgowy napięcia zawierający (w mM) 76 Cs-metanosulfonianu, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na 2-fosfokreatyna, 5 QX-314 i 0,01 hydrazydu Alexa Fluor-488. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą CsOH.
    2. Przygotować bieżący roztwór cęgowy zawierający (w mM) 125 K-glukonian, 5 KCl, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na 2-fosfokreatynę i 0,01 hydrazydu Alexa Fluor-488. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH.
  2. Przygotuj 100 ml 4% agaru, dodając 4 g agaru do 100 ml gorącej (prawie wrzącej) wody. Umieść na rozgrzanej płytce mieszającej, aby utrzymać temperaturę i mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Wlać do plastikowych szalek Petriego o średnicy 100 mm na głębokość około 1 cm i ostudzić. Wstaw do lodówki, aż będzie potrzebny.
  3. Przygotować 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego w mM: 124 NaCl, 1,2 CaCl2, 1,3MgSO4, 5 KCl, 26NaHCO3, 1,25 KH2PO4 i 10 dekstrozy. Bąbelkować karbogenem (5% CO2 / 95% O2 ) przez co najmniej 10 minut, a następnie w razie potrzeby dostosować końcowe pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Utrzymuj natlenienie i pH roztworu, bulgocząc w sposób ciągły karbogenem przez cały czas trwania eksperymentu.
  4. Przygotuj 200 ml roztworu do krojenia, dodając 1 mM kwasu kynureninowego do ACSF. Sonikować roztwór w sonikującej łaźni wodnej przez 10 minut, aż do rozpuszczenia kwasu kynureninowego. Ciągle bulgotać karbogenem i umieszczać na lodzie.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z kwasem kynureniowym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  5. Zamontuj odpowiednie ostrze w wibratomie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Schłodź komorę do krojenia wibratomu, otaczając ją lodem.

2. Usunięcie mózgu z nienaruszonym korzeniem nerwu słuchowego do stymulacji

UWAGA: Myszy do tych eksperymentów uzyskano poprzez skrzyżowanie transgenicznych myszy ChAT-IRES-Cre na tle C57BL/6J z myszami reporterowymi tdTomato (Ai14). Myszy używane do histologii i elektrofizjologii miały początek po usłyszeniu (P14-P23), czyli około P12 u myszy. Neurony wyrażające tdTomato w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego (VNTB) zostały wcześniej scharakteryzowane jako neurony MOC w tej linii myszy57.

  1. Poddać zwierzę eutanazji (np. uduszenie CO2 ) i odciąć głowę zwierzęciu przy użyciu zatwierdzonych procedur instytucjonalnych.
  2. Za pomocą żyletki przetnij skórę w linii środkowej czaszki od nosa do tyłu szyi. Oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.
  3. Za pomocą małych nożyczek wykonaj nacięcie w czaszce przez linię środkową, zaczynając od podstawy (koniec ogonowy w pobliżu rdzenia kręgowego) czaszki i kontynuując w kierunku nosa.
  4. Na szwie lambda wykonaj nacięcia w czaszce od linii środkowej, bocznie w kierunku ucha po obu stronach. Oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg.
  5. Zaczynając od końca rostralnego, delikatnie unieś mózg z czaszki za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej lub kleszczy. Przetnij nerw wzrokowy i kontynuuj delikatną pracę mózgu do tyłu, odsłaniając powierzchnię brzuszną.
  6. Przetnij nerwy trójdzielne, ściskając je drobnymi kleszczami w pobliżu brzusznej powierzchni pnia mózgu.
    UWAGA: Zrób to ostrożnie, ponieważ nerw przedsionkowo-ślimakowy leży tuż poniżej i musi być nienaruszony do ewentualnej stymulacji.
  7. Umieść preparat na szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym roztworem do krojenia. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie bąbelkuj karbogenem.
  8. Przytnij nerw twarzowy blisko pnia mózgu i odsłoń nerw przedsionkowo-ślimakowy.
  9. Za pomocą cienkich kleszczy wepchnij końcówki w otwór, w którym nerw przedsionkowo-ślimakowy wychodzi z czaszki, tak daleko, jak to możliwe, i ściśnij nerw, aby go przeciąć, pozostawiając korzeń nerwowy przyczepiony do pnia mózgu. Powtórz to po drugiej stronie.
  10. Gdy oba korzenie nerwowe są wolne, usuń opony mózgowe i naczynia krwionośne z brzusznej powierzchni pnia mózgu w pobliżu ciała trapezu.
  11. Uwolnij mózg całkowicie od czaszki, ściskając pozostałe nerwy czaszkowe i tkankę łączną, dbając o zachowanie pozostałego rdzenia kręgowego, jeśli to możliwe.

3. Zablokuj i zamontuj mózg na scenie (dysk magnetyczny)

  1. Przygotuj powierzchnię mózgu do utrwalenia się do etapu, blokując mózg na poziomie skrzyżowania wzrokowego.
    1. Z powierzchnią brzuszną do góry, ustabilizuj mózg za pomocą narzędzia, aby delikatnie unieruchomić rdzeń kręgowy, aby mózg nie przechylił się podczas następnego kroku.
    2. Na poziomie skrzyżowania wzrokowego użyj otwartych kleszczy, aby stworzyć płaszczyznę do blokowania mózgu poprzez włożenie przez mózg do dna naczynia. Włóż kleszcze pod kątem około 20° od pionu, tak aby końcówki wychodziły z grzbietowej powierzchni ogonowej mózgu do skrzyżowania wzrokowego.
    3. Przetnij wzdłuż kleszczy za pomocą żyletki.
  2. Przyklej mózg do powierzchni sceny.
    1. Przygotuj mały blok (~1 cm3) 4% agaru dla wsparcia mózgu.
    2. Umieść małą kroplę kleju na scenie i rozprowadź ją w prostokąt, aby można było przykleić zarówno mózg, jak i blok agaru.
    3. Za pomocą kleszczy ostrożnie unieś mózg i delikatnie przetrzyj nadmiar płynu za pomocą krawędzi ręcznika papierowego. Umieść zablokowaną powierzchnię na kleju, powierzchnia brzuszna będzie skierowana w stronę ostrza podczas krojenia.
    4. Delikatnie dociśnij blok agaru do grzbietowej powierzchni mózgu, aby podeprzeć go podczas krojenia i zapewnić prawidłowe ustawienie mózgu (tj. kąt).

4. Pokrój mózg, aby utworzyć plasterek klinowy

UWAGA: Przygotuj wycinek mózgu za pomocą wibratomu, który ma korzeń nerwu ślimakowego po grubej stronie i przyśrodkowe neurony olivocochlear (MOC) oraz jądro przyśrodkowe ciała trapezoidalnego (MNTB) po cienkiej stronie.

  1. Umieść dysk magnetyczny z dołączonym mózgiem na podstawie stolika i umieść go w komorze krojenia z brzuszną powierzchnią mózgu skierowaną w stronę ostrza.
  2. Napełnij komorę lodowatym roztworem do krojenia i bąbelkuj karbogenem.
  3. Opuść ostrze do roztworu i pokrój plastry doogonowo do obszaru zainteresowania, aby upewnić się, że plastry są symetryczne. Jeśli plasterki wydają się asymetryczne, lekko przechyl stół montażowy, aby uzyskać symetrię.
    UWAGA: Prędkości ostrza w zakresie 0,05-0,10 mm/s były skuteczne w krojeniu zdrowych plastrów i mogą się różnić w zależności od wieku zwierzęcia i regionu mózgu.
  4. Gdy plastry są symetryczne, przesuń stolik o ~15° (co odpowiada około 3 koncentrycznym pierścieniom na podstawie stolika) w jedną stronę.
    UWAGA: Odsuń scenę od korzenia nerwu słuchowego, który chcesz zachować w plasterku.
  5. Kontynuuj ostrożne krojenie, aż korzeń nerwu słuchowego znajdzie się blisko powierzchni po jednej stronie, a nerw twarzowy będzie widoczny na powierzchni po drugiej stronie.
  6. Przesuń stolik z powrotem o 15° do pierwotnej pozycji.
  7. Odsuń ostrze od tkanki i obróć stage podstawa o 90° tak, aby boczna krawędź cienkiej strony była skierowana w stronę ostrza. Opuść ostrze o kilkaset mikronów, a następnie powoli zbliż ostrze do krawędzi tkanki. Powtarzaj to, aż ostrze dotknie bocznej krawędzi. Opuść ostrze do żądanej grubości cienkiej krawędzi plastra, tutaj dodatkowe dwieście mikronów.
    UWAGA: Otrzymany plaster ma idealnie grubość ~300 mm na poziomie jądra brzusznego korpusu trapezowego (VNTB) po stronie, po której będzie miało miejsce zaciśnięcie łatki.
  8. Odsuń ostrze z powrotem od tkanki i obróć podstawę stopnia z powrotem tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana w jego stronę.
  9. Wykonaj cięcie, które wyznacza powierzchnię rostralną wycinka klina. Przenieś plasterek na kawałek papieru interfejsowego (1 cm2) powierzchnią ogonową w dół. Przenieść plaster do komory inkubacyjnej lub innego odpowiedniego aparatu do inkubacji w celu odzysku (30 min w temperaturze 35 °C).
    UWAGA: Nerw twarzowy powinien być widoczny na obu półkulach wycinka na powierzchni rostralnej (patrz Rysunek 1B).

5. Konfiguracja i rejestracja elektrofizjologii

  1. Umieść plasterek klinowy w komorze nagrywającej i zabezpiecz plasterek harfą lub systemem stabilizującym. Perfaktorować tkankę w sposób ciągły z szybkością 7-10 ml/min ciepłym (35 °C) ACSF z bąbelkami karbogenu.
  2. Zidentyfikuj genetycznie znakowane neurony MOC w VNTB za pomocą epifluorescencji z filtrami emisyjnymi 561 nm do nagrań typu patch-clamp. Odwróć plasterek, jeśli nie ma komórek, które można potencjalnie załatać.
  3. Korzystając z optyki DIC, skup się na korzeniu nerwu słuchowego na grubej stronie plastra i użyj mikromanipulatora, aby przesunąć bipolarną elektrodę stymulującą wolfram w dół do korzenia nerwu słuchowego i delikatnie w powierzchnię tkanki.
    UWAGA: Elektrody ssące były używane w eksperymentach stymulacji nerwów słuchowych w innych laboratoriach. Elektrody ze szkła Theta lub metody stymulacji optycznej mogą być stosowane, jeśli ma to zastosowanie do innych specyficznych preparatów.
  4. Przesuń pole widzenia z powrotem do VNTB, aby wybrać neuron MOC, który ma być celem elektrofizjologii klamry krosowej.
  5. Napełnij pipetę rejestracyjną roztworem wewnętrznym odpowiednim do proponowanego eksperymentu.
  6. Łatka i zapis z neuronu MOC w konfiguracji całej komórki. W razie potrzeby skompensuj pojemność membrany i rezystancję szeregową.
  7. Dostosuj amplitudę stymulacji elektrycznej korzenia nerwu słuchowego, aby uzyskać spójne zdarzenia postsynaptyczne w neuronie MOC.
    UWAGA: Może być konieczne przesunięcie elektrody stymulacyjnej.
  8. Uruchom odpowiednie protokoły stymulacji, aby zaobserwować wywołane prądy synaptyczne w MOC (cęgi napięciowe) lub wzorce potencjału czynnościowego (cęgi prądowe).
    UWAGA: Preparat do cięcia klinów może być używany z dowolnymi typowymi narzędziami do zaciskania plastrów, takimi jak luźne zapisy plastrów, farmakologia, optogenetyka, obrazowanie wapnia, odblokowywanie neuroprzekaźników itp.

6. Histological confirmation jąder pnia mózgu

UWAGA: Odbywa się to za pomocą barwienia krezylofioletowego, w stałym, ponownie pociętym kawałku klina. Metoda ta pozwala na wizualizację jąder, które znajdują się w wycinku.

  1. Po przygotowaniu plasterka klinowego, zanurz plasterek w utrwalaczu (4% PFA w PBS) na noc. Opłucz plasterek 3x przez 10 minut w PBS (temperatura pokojowa na shakerze), a następnie umieść w 30% sacharozie w PBS na noc w temperaturze 4 °C w celu krioochrony.
  2. Ponownie wyciąć plaster na mikrotomie do zamrażania (40-70 mm) i zebrać skrawki seryjne na płytce 24-dołkowej w PBS.
  3. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Umieść slajdy w wózku ślizgowym.
  4. Przygotuj roztwory fioletu krezylowego
    1. Przygotować 1% octan fioletu krezylowego, mieszając 5 g octanu fioletu krezylowego w 500 ml dH2O
    2. Przygotować bufor octanowy, przygotowując najpierw 90 ml roztworu A (540 ml lodowatego kwasu octowego + 89,46 ml dH2O) i 10 ml roztworu B (136 mg octanu sodu w 10 ml dH2O). Połączyć roztwór A i roztwór B, uzyskując bufor octanowy.
    3. Połączyć 1% octanu fioletu krezylowego z buforem octanowym 1:1, aby uzyskać 0,5% fioletu krezylowego w buforze octanowym . Przefiltruj przed użyciem.
    4. Przygotować 95% i 70% etanol, rozcieńczając 100% etanol o odpowiednich objętościachdH2O
  5. Wykonaj protokół barwienia fioletem krezylowym. Przesuwać wózek szkiełkowy przez tacki z roztworami, osuszając nadmiar roztworu na ręczniku papierowym między tacami: ksylen – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanolu – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% roztwór fioletu krezylowego – częste monitorowanie 8-14 minut, aż barwienie jądrowe stanie się ciemnofioletowe; dH2O – 3 min; 70% etanolu – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – dwukrotne zanurzanie ślizgów; ksylen – 5 min; Ksylen: 25 min do momentu montażu.
    UWAGA: Ksylenów należy używać tylko pod wyciągiem.
  6. Zdejmuj szkiełka z ksylenu pojedynczo i natychmiast umieszczaj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego. Pozostaw podłoże montażowe do wyschnięcia (na noc).
  7. Sekcje obrazów.

7. Znakowanie biocytyny do śledzenia aksonów w żywych, nieutrwalonych tkankach

  1. Przygotuj plasterek klina jak powyżej (kroki 2-4).
  2. Przenieś plasterek na papier interfejsowy (~1 cm2). Pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj CN na grubej stronie plasterka.
  3. Ostrożnie usuń nadmiar ACSF z obszaru otaczającego plasterek, przekręcając róg bibuły, aby odciągnąć ACSF od tkanki. Zapobiega to rozprzestrzenianiu się biocytyny na otaczające obszary wycinka, co mogłoby prowadzić do wychwytu do komórek poza CN.
  4. Za pomocą cienkich kleszczy wybierz mały kryształ biocytyny i umieść go na powierzchni CN. Delikatnie wciśnij kryształ w tkankę, aby ułatwić kontakt z neuronami i późniejszy wychwyt do somatów. Powtórz ten krok, aby pokryć żądany obszar zainteresowania, w tym przypadku regiony CN zawierające neurony T-gwiaździste i GBC.
  5. Umieść plaster w komorze inkubacyjnej. Pozostawić plaster do inkubacji przez 2-4 godziny w temperaturze 35 °C, aby umożliwić pobieranie i transport biocytyny. Po inkubacji opłucz plasterek w ACSF, aby usunąć wszelkie cząsteczki biocytyny.
  6. Umieść plasterek w utrwalaczu (4% PFA w PBS) na noc. Płukać 3x przez 10 min w PBS.
  7. Cryoprotect plastrować w 30% sacharozie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy plasterek opadnie.
  8. Wyciąć tkankę w celu wytworzenia przekrojów poprzecznych na mikrotomie zamrażającym na głębokości 70-100 mm.
  9. Przetwarzaj tkankę przy użyciu standardowych metod immunohistochemicznych za pomocą fluorescencyjnie sprzężonej streptawidyny.
    UWAGA: Dodatkowe immunohistochemie można przeprowadzić na sekcjach, jeśli jest to pomocne do znakowania presynaptycznych ciał komórkowych, aksonów, receptorów lub innych cząsteczek synaptycznych ważnych dla wizualizacji obwodu (tj. Etapy przeciwciał pierwotnych nie powinny negatywnie wpływać na wtórną wizualizację biocytyny).
  10. Zobrazuj tkankę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie histologiczne skrawka klinowego
Na potrzeby naszego badania funkcji neuronów pnia słuchowego, preparat skrawka klinowego został zaprojektowany tak, aby zawierał korzeń nerwu słuchowego oraz CN po stronie przeciwległej do neuronów MOC, z których prowadzono rejestrację (przykład skrawka pokazano na Rysunku 1B). Wstępne badanie histologiczne preparatu jest istotne w celu potwierdzenia, że skrawek zawiera jądra niezbędne do aktywacji obwodów oraz że projekcje aksonal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura krojenia, zwana wycinkiem klinowym, jest skuteczna w utrzymywaniu nienaruszonych presynaptycznych obwodów neuronalnych, ale z dostępnością eksperymentów z wycinkami mózgu w celu analizy funkcji neuronów. Należy zachować dużą ostrożność w kilku początkowych krokach, aby zmaksymalizować użyteczność przygotowania do analizy obwodu. Wymiary klina należy potwierdzić za pomocą badania histologicznego, które jest integralną częścią potwierdzenia, że zarówno jądra presynaptyczne, jak i ich wypustki aksona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Preparaty eksperymentalne
Agar, proszekFisher ScientificBP14235004% blok agarowy stosowany do stabilizacji tkanki mózgowej podczas sekcji wibratomu
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorofor stosowany w roztworze wewnętrznym w celu potwierdzenia udanej łatki neuronowej MOC
Geny równowagi analitycznej Scientific (Intramalls)AV114Chemikalia do ważenia
Dwustronna żyletkaTed Pella121-6Ostrze do cięcia wibratomu
Kwas kynureninowy (5g)Sigma AldrichK3375-5GPlasterkowanie Dodatek ACSF stosowany w celu zmniejszenia aktywności neuronów podczas preparowania i krojenia w celu poprawy zdrowia tkanek do zaciskania łat
Miernik pHFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Tester pH roztworu
Plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm X 20 mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Przygotowanie agaru
Mieszanie Płyta grzejnaFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Ogrzewanie dla 4% Przygotowanie
Rozwarstwienie i krojenie
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGSubstancja chemiczna używana do śledzenia aksonów (sprzężona ze Streptawidyną 488)
Mikroskop preparacyjnyAmscopeSM-1BNDo precyzyjnego preparowania podczas usuwania mózgu
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11252-20Narzędzie do preparowania drobnych kleszczy
Pęseta ekonomiczna #3WPI501976Kleszcze do preparowania
Szklana szalka Petriego 150mm średnica x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747ENaczynie preparacyjne
Papier interfejsowy (membrana PCTE 203 x 254 mm 10um)Thomas Scientific1220823Inkubacja plastrów/aplikacja biocytyny
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome do cięcia plastrów klinowych
Nożyczki MayoRobozRS-6872Narzędzie
do preparowaniaOstrza jednosieczne ze stali węglowejFisher Scientific (Intramalls)12-640Żyletka do preparacji
Tarcza do próbek, orientującaLeica14048142068Specjalistyczny stolik wibratomisowy do powtarzalnego przechylania
SpoonulaFisherSci14-375-10Narzędzie do preparowania
Super GlueNewegg15187Służy do klejenia tkanki do etapu
wibratomuVannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Narzędzie
Elektrofizjologia
A1R Pionowy mikroskop konfokalnyNikon InstrumentsElektrofizjologia i mikroskop obrazowy, może być dowolnym mikroskopem zgodnym z elektrofizjologią
Elektroda ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 1,1 mm, długości 10 cmSutter InstrumentBF150-110-10Szkło do pipet z mocowaniem krosowym
Wypełniacz elektrod MicroFilWPICMF20GNapełniacz do pipet z elektrodą krosową
Podgrzewacz roztworu w liniiWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BGrzałka systemu perfuzyjnego Slice
Systemy Multi-MicromanipulatorInstrumenty SutterMPC-200 z MP285Mikromanipulatory do zacisku krosowego i umieszczania elektrod stymulacyjnych
Ściągacz do pipet poziomych P-1000 do mikropipet szklanychInstrumenty SutterFG-P1000Ściągacz do pipet z zaciskiem krosowym
Wzmacniacz krosowy i oprogramowanieHEKAEPC-10 / Patchmaster DalejMoże to być dowolny wzmacniacz/oprogramowanie
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC26GSlice "kąpiel" podczas nagrywania
Komora nagraniowa HarfaWarner Instruments640253Stabilizuje plasterek podczas nagrywania elektrofizjologii
Slice Inkubacja CustomBuild Podgrzewana, natleniona komora trzymająca plastry podczas rekonwalescencji po krojeniu
Jednostka izolacji bodźcówA.M.P.I.Iso-FlexStimulus do elektrofizjologii
Strzykawka 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Elektrofizjologia obsługa płynów perfuzyjnych
Regulator temperaturyWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CRegulator temperatury systemu perfuzji
Slice Rurka 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Elektrofizjologia obsługa płynów perfuzyjnych
Koncentryczna mikroelektroda bipolarna TugstenWPITM33CCINSElektroda stymulująca do elektrofizjologii
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histologia, zbieranie plastrów i barwienie immunologiczne
Alexa Fluor 488 StreptawidynaJackson Immuno labs016-540-084Przeciwciało wtórne do wizualizacji biocytyny
Wytrząsarka orbitalna CorningWytrząsarka CLS6780FP Sigmadomieszania immunohistochemicznego
Octan fioletu krezylowegoSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GBarwnik komórkowy do histologii
Jednorazowe ostrza mikrotomuFisher Scientific22-210-052Przesuwne ostrze mikrotomu
Filtr-strzykawka Nalgene 4mm Octan celulozy 0,2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34AFiltr strzykawkowy do napełniania pipet rejestrujących roztworem wewnętrznym
Fluoromount-G Medium do montażu ślizgowegoFisher ScientificOB100-01Immunohistochemia fluorescencja montaż medium
szklane szkiełko naczynie barwiące ze stojakiemFisher Scientific ( Intramalls)08-812Komora do barwienia Cresyl Violet
Microm HM450 Mikrotom przesuwnyThermoFisher910020Mikrotom do zamrażania do histologii
Okulary nakrywkowe mikroskopu: Prostokąty 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DSzklana osłona przesuwna histochemiczna
Nośnik montażowy Permount FisherScientificSP15-100Montaż sekcji Cresyl violet średnie
Slajdy SuperfrostFisher Scientific22-034980Szkiełka histologiczne
agaru do preparacjiJednostka izolacyjna

Bibliografia

  1. Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
  2. Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior olivary neurons: An in vitro study. Journal of Neuroscience. 14, 1701-1709 (1994).
  3. Kotak, V. C., Sanes, D. H. Long-lasting inhibitory synaptic depression is age- and calcium-dependent. Journal of Neuroscience. 20 (15), 5820-5826 (2000).
  4. Smith, A. J., Owens, S., Forsythe, I. D. Characterisation of inhibitory and excitatory postsynaptic currents of the rat medial superior olive. The Journal of Physiology. 529 (3), 681-698 (2000).
  5. Scott, L. L., Mathews, P. J., Golding, N. L. Posthearing developmental refinement of temporal processing in principal neurons of the medial superior olive. Journal of Neuroscience. 25 (35), 7887-7895 (2005).
  6. Fischl, M. J., Combs, T. D., Klug, A., Grothe, B., Burger, R. M. Modulation of synaptic input by GABAB receptors improves coincidence detection for computation of sound location. Journal of Physiology. 590 (13), 3047-3066 (2012).
  7. Clause, A., et al. The Precise Temporal Pattern of Prehearing Spontaneous Activity Is Necessary for Tonotopic Map Refinement. Neuron. 82 (4), 822-835 (2014).
  8. Oertel, D. Use of brain slices in the study of the auditory system: Spatial and temporal summation of synaptic inputs in cells in the anteroventral cochlear nucleus of the mouse. Journal of the Acoustical Society of America. 78 (1), 328-333 (1985).
  9. Hermann, J., Pecka, M., Von Gersdorff, H., Grothe, B., Klug, A. Synaptic transmission at the calyx of held under in vivo-like activity levels. Journal of Neurophysiology. 98 (2), 807-820 (2007).
  10. Jercog, P. E., Svirskis, G., Kotak, V. C., Sanes, D. H., Rinzel, J. Asymmetric excitatory synaptic dynamics underlie interaural time difference processing in the auditory system. PLoS Biology. 8 (6), 1000406(2010).
  11. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. A mechanistic understanding of the role of feedforward inhibition in the mammalian sound localization circuitry. Neuron. 78 (5), 923-935 (2013).
  12. Sinclair, J. L., et al. Sound-evoked activity influences myelination of brainstem axons in the trapezoid body. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8239-8255 (2017).
  13. Wang, J., et al. Myelination of the postnatal mouse cochlear nerve at the peripheral-central nervous system transitional zone. Frontiers in Pediatrics. 1, 5-8 (2013).
  14. Long, P., Wan, G., Roberts, M. T., Corfas, G. Myelin development, plasticity, and pathology in the auditory system. Developmental Neurobiology. 78 (2), 80-92 (2018).
  15. Leão, R. M., et al. Presynaptic Na+ channels: Locus, development, and recovery from inactivation at a high-fidelity synapse. Journal of Neuroscience. 25 (14), 3724-3738 (2005).
  16. Fex, J. Efferent Inhibition in the Cochlea Related to Hair-Cell dc Activity: Study of Postsynaptic Activity of the Crossed Olivocochlear Fibres in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (3), 666-675 (1967).
  17. Mountain, D. C. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science. 210 (4465), 71-72 (1980).
  18. Siegel, J. H., Kim, D. O. Efferent neural control of cochlear mechanics? Olivocochlear bundle stimulation affects cochlear biomechanical nonlinearity. Hearing Research. 6 (2), 171-182 (1982).
  19. Guinan, J. J. Cochlear efferent innervation and function. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 18 (5), 447-453 (2010).
  20. Elgoyhen, A. B., Katz, E. The efferent medial olivocochlear-hair cell synapse. Journal of Physiology-Paris. 106 (1-2), 47-56 (2012).
  21. Galambos, R. Suppression of auditory nerve activity by stimulation of efferent fibers to cochlea. Journal of Neurophysiology. 19 (5), 424-437 (1956).
  22. Desmedt, J. E. Auditory-Evoked Potentials from Cochlea to Cortex as Influenced by Activation of the Efferent OlivoCochlear Bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 34 (9), 1478-1496 (1962).
  23. Wiederhold, M. L., Kiang, N. Y. S. Effects of Electric Stimulation of the Crossed Olivocochlear Bundle on Single Auditory-Nerve Fibers in the Cat. The Journal of the Acoustical Society of America. 48 (4), 950-965 (1970).
  24. Wiederhold, M. L., Peake, W. T. Efferent Inhibition of Auditory-Nerve Responses: Dependence on Acoustic-Stimulus Parameters. Journal of the Acoustical Society of America. 40 (6), 1427-1430 (1966).
  25. Geisler, D. C. Hypothesis on the function of the crossed olivocochlear bundle. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1908-1909 (1974).
  26. Guinan, J. J., Gifford, M. L. Effects of electrical stimulation of efferent olivocochlear neurons on cat auditory-nerve fibers. III. Tuning curves and thresholds at CF. Hearing Research. 37 (1), 29-45 (1988).
  27. Rajan, R. Involvement of cochlear efferent pathways in protective effects elicited with binaural loud sound exposure in cats. Journal of Neurophysiology. 74 (2), 582-597 (1995).
  28. Rajan, R. Effect of electrical stimulation of the crossed olivocochlear bundle on temporary threshold shifts in auditory sensitivity. II. Dependence on the level of temporary threshold shifts. Journal of Neurophysiology. 60 (2), 569-579 (1988).
  29. Reiter, E. R., Liberman, M. C. Efferent-mediated protection from acoustic overexposure: Relation to slow effects of olivocochlear stimulation. Journal of Neurophysiology. 73 (2), 506-514 (1995).
  30. Taranda, J., et al. A point mutation in the hair cell nicotinic cholinergic receptor prolongs cochlear inhibition and enhances noise protection. PLoS Biology. 7 (1), 1000018(2009).
  31. Maison, S. F., Usubuchi, H., Liberman, C. M. Efferent feedback minimizes cochlear neuropathy from moderate noise exposure. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5542-5552 (2013).
  32. Tong, H., et al. Protection from noise-induced hearing loss by Kv2. 2 potassium currents in the central medial olivocochlear system. Journal of Neuroscience. 33 (21), 9113-9121 (2013).
  33. Boero, L. E., et al. Enhancement of the medial olivocochlear system prevents hidden hearing loss. Journal of Neuroscience. 38 (34), 7440-7451 (2018).
  34. Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. Journal of Neurophysiology. 63 (5), 1169-1190 (1990).
  35. von Gersdorff, H., Borst, J. G. G. Short-term plasticity at the calyx of held. Nature Reviews Neuroscience. 3 (1), 53-64 (2002).
  36. Smith, P. H., Joris, P. X., Carney, L. H., Yin, T. C. T. Projections of physiologically characterized globular bushy cell axons from the cochlear nucleus of the cat. Journal of Comparative Neurology. 304 (3), 387-407 (1991).
  37. Kuwabara, N., DiCaprio, R. A., Zook, J. M. Afferents to the medial nucleus of the trapezoid body and their collateral projections. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 684-706 (1991).
  38. Friauf, E., Ostwald, J. Divergent projections of physiologically characterized rat ventral cochlear nucleus neurons as shown by intra-axonal injection of horseradish peroxidase. Experimental Brain Research. 73 (2), 263-284 (1988).
  39. De Venecia, R. K., Liberman, M. C., Guinan, J. J., Brown, M. C. Medial olivocochlear reflex interneurons are located in the posteroventral cochlear nucleus: A kainic acid lesion study in guinea pigs. Journal of Comparative Neurology. 487 (4), 345-360 (2005).
  40. Darrow, K. N., Benson, T. E., Brown, M. C. Planar multipolar cells in the cochlear nucleus project to medial olivocochlear neurons in mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1365-1375 (2012).
  41. Brown, M. C., De Venecia, R. K., Guinan, J. J. Responses of medial olivocochlear neurons: Specifying the central pathways of the medial olivocochlear reflex. Experimental Brain Research. 153 (4), 491-498 (2003).
  42. Wang, Y., Manis, P. B. Synaptic transmission at the cochlear nucleus endbulb synapse during age-related hearing loss in mice. Journal of Neurophysiology. 94 (3), 1814-1824 (2005).
  43. Golding, N. L., Robertson, D., Oertel, D. Recordings from slices indicate that octopus cells of the cochlear nucleus detect coincident firing of auditory nerve fibers with temporal precision. Journal of Neuroscience. 15 (4), 3138-3153 (1995).
  44. Ferragamo, M. J., Golding, N. L., Oertel, D. Synaptic inputs to stellate cells in the ventral cochlear nucleus. Journal of Neurophysiology. 79 (1), 51-63 (1998).
  45. Oertel, D. Synaptic responses and electrical properties of cells in brain slices of the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 3 (10), 2043-2053 (1983).
  46. Xie, R., Manis, P. B. Radiate and planar multipolar neurons of the mouse anteroventral cochlear nucleus: Intrinsic excitability and characterization of their auditory nerve input. Frontiers in Neural Circuits. 11, 1-17 (2017).
  47. Wu, S., Oertel, D. Inhibitory circuitry in the ventral cochlear nucleus is probably mediated by glycine. The Journal of Neuroscience. 6 (9), 2691-2706 (1986).
  48. Xie, R., Manis, P. B. Target-specific IPSC kinetics promote temporal processing in auditory parallel pathways. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1598-1614 (2013).
  49. Wickesberg, R. E., Oertel, D. Delayed, frequency-specific inhibition in the cochlear nuclei of mice: A mechanism for monaural echo suppression. Journal of Neuroscience. 10 (6), 1762-1768 (1990).
  50. Campagnola, L., Manis, P. B. A map of functional synaptic connectivity in the mouse anteroventral cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2214-2230 (2014).
  51. Doucet, J. R., Ryugo, D. K. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. Journal of Comparative Neurology. 385 (2), 245-264 (1997).
  52. Kopp-Scheinpflug, C., et al. The sound of silence: Ionic mechanisms encoding sound termination. Neuron. 71 (5), 911-925 (2011).
  53. Alamilla, J., Gillespie, D. C. Maturation of Calcium-Dependent GABA, Glycine, and Glutamate Release in the Glycinergic MNTB-LSO Pathway. PLoS One. 8 (9), 0075688(2013).
  54. Spangler, K. M., Warr, W. B., Henkel, C. K. The projections of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body in the cat. Journal of Comparative Neurology. 238 (3), 249-262 (1985).
  55. Kramer, F., et al. Inhibitory glycinergic neurotransmission in the mammalian auditory brainstem upon prolonged stimulation: Short-term plasticity and synaptic reliability. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-22 (2014).
  56. Roberts, M. T., Seeman, S. C., Golding, N. L. The relative contributions of MNTB and LNTB neurons to inhibition in the medial superior olive assessed through single and paired recordings. Frontiers in Neural Circuits. 8, 1-14 (2014).
  57. Torres Cadenas, L., Fischl, M. J., Weisz, C. J. C. Synaptic Inhibition of Medial Olivocochlear Efferent Neurons by Neurons of the Medial Nucleus of the Trapezoid Body. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 40 (3), 509-525 (2020).
  58. Brown, M. C., Mukerji, S., Drottar, M., Windsor, A. M., Lee, D. J. Identification of inputs to olivocochlear neurons using transneuronal labeling with pseudorabies virus (PRV). JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (5), 703-717 (2013).
  59. Morest, D. K. The collateral system of the medial nucleus of the trapezoid body of the cat, its neuronal architecture and relation to the olivo-cochlear bundle. Brain Research. 9 (2), 288-311 (1968).
  60. Warr, B. W. Fiber degeneration following lesions in the multipolar and globular cell areas in the ventral cochlear nucleus of the cat. Brain Research. 40 (2), 247-270 (1972).
  61. Osen, K. K. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. Journal of Comparative Neurology. 136 (4), 453-483 (1969).
  62. Cant, N. B., Morest, D. K. The bushy cells in the anteroventral cochlear nucleus of the cat. A study with the electron microscope. Neuroscience. 4 (12), 1925-1945 (1979).
  63. Cant, N. B., Morest, D. K. Organization of the neurons in the anterior division of the anteroventral cochlear nucleus of the cat. Light-microscopic observations. Neuroscience. 4 (12), 1909-1923 (1979).
  64. Lauer, A. M., Connelly, C. J., Graham, H., Ryugo, D. K. Morphological Characterization of Bushy Cells and Their Inputs in the Laboratory Mouse (Mus musculus) Anteroventral Cochlear Nucleus. PLoS One. 8 (8), 1-16 (2013).
  65. Harrison, J. M., Warr, W. B. A study of the cochlear nuclei and ascending auditory pathways of the medulla. Journal of Comparative Neurology. 119 (3), 341-379 (1962).
  66. Robertson, D., Gummer, M. Physiological and morphological characterization of efferent neurones in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 20 (1), 63-77 (1985).
  67. Bledsoe, S. C., et al. Ventral cochlear nucleus responses to contralateral sound are mediated by commissural and olivocochlear pathways. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 886-900 (2009).
  68. Zhou, J., Zeng, C., Cui, Y., Shore, S. Vesicular glutamate transporter 2 is associated with the cochlear nucleus commissural pathway. JARO - Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (4), 675-687 (2010).
  69. Kuenzel, T. Modulatory influences on time-coding neurons in the ventral cochlear nucleus. Hearing Research. 384, 107824(2019).
  70. Cant, N. B., Gaston, K. C. Pathways connecting the right and left cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 313-326 (1982).
  71. Feliciano, M., Saldana, E., Mugnaini, E. Direct projections from the rat primary auditory neocortex to nucleus sagulum, paralemniscal regions, superior olivary complex and cochlear nuclei. Auditory Neuroscience. 1 (3), 287-308 (1995).
  72. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Evidence for direct cortical innervation of medial olivocochlear neurones in rats. Hearing Research. 144 (1-2), 65-72 (2000).
  73. Schofield, B. R., Coomes, D. L. Pathways from auditory cortex to the cochlear nucleus in guinea pigs. Hearing Research. 216-217 (1-2), 81-89 (2006).
  74. Meltzer, N. E., Ryugo, D. K. Projections from auditory cortex to cochlear nucleus: A comparative analysis of rat and mouse. Anatomical Record - Part A Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (4), 397-408 (2006).
  75. Schofield, B. R., Cant, N. B. Descending auditory pathways: Projections from the inferior colliculus contact superior olivary cells that project bilaterally to the cochlear nuclei. Journal of Comparative Neurology. 409 (2), 210-223 (1999).
  76. Thompson, A. M., Schofield, B. R. Afferent projections of the superior olivary complex. Microscopy Research and Technique. 51 (4), 330-354 (2000).
  77. Woods, C. I., Azeredo, W. J. Noradrenergic and serotonergic projections to the superior olive: Potential for modulation of olivocochlear neurons. Brain Research. 836 (1-2), 9-18 (1999).
  78. Mulders, W. H. A. M., Robertson, D. Morphological relationships of peptidergic and noradrenergic nerve terminals to olivocochlear neurones in the rat. Hearing Research. 144 (1-2), 53-64 (2000).
  79. Thompson, A. M., Thompson, G. C. Light microscopic evidence of serotoninergic projections to olivocochlear neurons in the bush baby (Otolemur garnettii). Brain Research. 695 (2), 263-266 (1995).
  80. Wang, X., Robertson, D. Substance P-induced inward current in identified auditory efferent neurons in rat brain stem slices. Journal of Neurophysiology. 80 (1), 218-229 (1998).
  81. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. Journal of Neurophysiology. 93 (1), 557-569 (2005).
  82. Galambos, R., Davis, H. The response of single auditory-nerve stimulation. Journal of Neurophysiology. 6 (1), 39-57 (1943).
  83. Sachs, M. B., Abbas, P. J. Rate versus level functions for auditory-nerve fibers in cats: Tone-burst stimuli. Journal of the Acoustical Society of America. 56 (6), 1835-1847 (1974).
  84. Zhang, X., Heinz, M. G., Bruce, I. C., Carney, L. H. A phenomenological model for the responses of auditory-nerve fibers: I. Nonlinear tuning with compression and suppression. The Journal of the Acoustical Society of America. 109 (2), 648-670 (2001).
  85. Zilany, M. S. A., Bruce, I. C., Carney, L. H. Updated parameters and expanded simulation options for a model of the auditory periphery. The Journal of the Acoustical Society of America. 135 (1), 283-286 (2014).
  86. Franken, T. P., Smith, P. H., Joris, P. X. In vivo whole-cell recordings combined with electron microscopy reveal unexpected morphological and physiological properties in the lateral nucleus of the trapezoid body in the auditory brainstem. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-20 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Elektrofizjologia skrawków mózguneurony przyśrodkowej oliwkowo-ślimakowekorzeń nerwu słuchowegoobwody jądra ślimakowegotechnika krojenia wibratomempatch-clamp z optyką DICanaliza plastyczności synaptycznejzachowanie łączności presynaptycznejin vitro obwód neuronalny
Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.