Artykuł metodologiczny

Posiewy tkankowe kory jajników bydła

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61668

⸱

14 stycznia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono hodowlę in vitro kory jajników bydła oraz wpływ żywieniowej diety Stair-step na mikrośrodowisko jajników. Fragmenty kory jajnikowej hodowano przez siedem dni i oceniano steroidy, cytokiny i stadia pęcherzyków. Leczenie dietą Stair-Step miało zwiększoną steroidogenezę, co spowodowało progresję pęcherzyków w hodowli.

Streszczenie

Rozwój pęcherzyka od stadium pierwotnego do antralnego jest dynamicznym procesem w korze jajnika, który obejmuje czynniki endokrynne i parakrynne z komórek somatycznych oraz komunikację komórka wzgórka - oocyt. Niewiele wiadomo na temat mikrośrodowiska jajników i tego, jak cytokiny i steroidy wytwarzane w otaczającym środowisku wpływają na progresję lub zatrzymanie pęcherzyków. Hodowla in vitro kory jajnikowej umożliwia rozwój pęcherzyków jajnikowych w znormalizowanym środowisku, które pozostaje podtrzymywane przez sąsiednie zrąb. Naszym celem było określenie wpływu diety Stair-Step na mikrośrodowisko jajników (rozwój pęcherzyków, produkcja steroidów i cytokin) poprzez hodowlę in vitro kory jajników bydła. Aby to osiągnąć, usunięto fragmenty kory jajnikowej z jałówek, które zostały poddane dwóm różnym schematom żywieniowym opracowanym przed okresem dojrzewania: Control (tradycyjny rozwój żywienia) i Stair-Step (karmienie i ograniczanie podczas rozwoju), które zostały pocięte na około 0,5-1 mm3 kawałki. Kawałki te zostały następnie przepuszczone przez serię płukań i umieszczone na wkładce do hodowli tkankowej, która jest umieszczana w studzience zawierającej pożywkę hodowlaną Waymouth. Korę jajnika hodowano przez 7 dni z codziennymi zmianami pożywki hodowlanej. Przeprowadzono sekcje histologiczne w celu określenia zmian stadium pęcherzyków przed i po hodowli, aby określić efekty odżywiania i wpływ hodowli bez dodatkowego leczenia. Pożywkę hodowlaną kory mózgowej łączono w ciągu kilku dni w celu zmierzenia steroidów, metabolitów steroidowych i cytokin. Stwierdzono tendencje do zwiększonego stężenia hormonów steroidowych w mikrośrodowisku jajników, co pozwoliło na progresję pęcherzyków w hodowlach kory jajnikowej Stair-Step versus Control. Technika hodowli kory jajnikowej pozwala na lepsze zrozumienie mikrośrodowiska jajników oraz tego, w jaki sposób zmiany w wydzielaniu hormonalnym mogą wpływać na progresję i wzrost pęcherzyków jajnikowych zarówno w przypadku leczenia in vivo, jak i in vitro. Ta metoda hodowli może również okazać się korzystna w testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych, które mogą poprawić progresję pęcherzyków jajnikowych u kobiet w celu promowania płodności.

Wprowadzenie

Kora jajnika reprezentuje zewnętrzną warstwę jajnika, w której zachodzi rozwój pęcherzyka1. Pęcherzyki pierwotne, początkowo zatrzymane w rozwoju, zostaną aktywowane, aby stać się pęcherzykami pierwotnymi, wtórnymi, a następnie antralnymi lub trzeciorzędowymi w oparciu o dane wejściowe parakrynne i gonadotropinowe1,2,3,4. Aby lepiej zrozumieć procesy fizjologiczne zachodzące w jajniku, hodowla tkankowa może być wykorzystana jako model in vitro, co pozwala na prowadzenie eksperymentów w kontrolowanym środowisku. W wielu badaniach wykorzystano hodowlę tkanki jajnika do badań nad technikami wspomaganego rozrodu, zachowaniem płodności i rakiem jajnika5,6,7. Posiew tkanki jajnikowej posłużył również jako model do badania toksyn rozrodczych, które uszkadzają zdrowie jajników i etiologię zaburzeń rozrodczych, takich jak zespół policystycznych jajników (PCOS)8,9,10,11. W związku z tym ten system hodowli ma zastosowanie do szerokiej gamy specjalności.

U gryzoni całe płodowe lub okołoporodowe gonady były używane w eksperymentach z zakresu biologii rozrodu12,13,14,15. Jednak gonady od większych zwierząt gospodarskich nie mogą być hodowane jako całe narządy ze względu na ich duże rozmiary i potencjalną degenerację. W związku z tym kora jajników naczelnych bydła i innych niż ludzie jest cięta na mniejsze kawałki16,17,18. W wielu badaniach wyhodowano fragmenty małej kory jajnika w celu zbadania różnych czynników wzrostu w inicjacji pęcherzyków pierwotnych u zwierząt gospodarskich i naczelnych innych niż ludzie1,17,18,19. Zastosowanie posiewu kory jajnikowej wykazało również pierwotną inicjację pęcherzyków jajnikowych przy braku surowicy dla fragmentów kory bydła i naczelnych hodowanych przez 7 dni20. Yang i Fortune w 2006 roku potraktowali pożywkę hodowlaną kory jajników płodu różnymi dawkami testosteronu przez 10 dni i zaobserwowali, że stężenie testosteronu 10-7 M zwiększyło rekrutację pęcherzyków, przeżycie i zwiększoną progresję pęcherzyków we wczesnym stadium19. W 2007 roku, wykorzystując posiewy kory jajnikowej od płodów bydlęcych (5-8 miesięcy ciąży), Yang i Fortune opisali rolę czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA) w przejściu między pęcherzykami pierwotnymi a wtórnymi21. Ponadto nasze laboratorium wykorzystało posiewy kory jajnikowej, aby zademonstrować, w jaki sposób izoformy VEGFA (angiogenne, antyangiogenne i kombinacja) mogą regulować różne szlaki transdukcji sygnału przez receptor domeny kinazy (KDR), który jest głównym receptorem transdukcji sygnału, który wiąże VEGFA16. Informacje te pozwoliły lepiej zrozumieć, w jaki sposób różne izoformy VEGFA wpływają na szlaki sygnałowe w celu wywołania progresji lub zatrzymania pęcherzyków. Podsumowując, hodowla fragmentów kory jajnikowej in vitro z różnymi steroidami lub czynnikami wzrostu może być cennym testem pozwalającym określić wpływ na mechanizmy regulujące folikulogenezę. Podobnie zwierzęta, które rozwijają się w różnych reżimach żywieniowych, mogą mieć zmienione mikrośrodowisko jajników, co może sprzyjać lub hamować folikulogenezę wpływającą na dojrzałość reprodukcyjną samic. Dlatego naszym celem w obecnym manuskrypcie jest przedstawienie techniki hodowli kory bydła i ustalenie, czy istnieją różnice w mikrośrodowiskach jajników po hodowli in vitro kory bydlęcej od jałówek karmionych dietą kontrolną lub schodkową pobraną w wieku 13 miesięcy, jak opisano wcześniej16.

Dlatego naszym następnym krokiem było określenie mikrośrodowiska jajników u tych jałówek, które zostały opracowane z różnymi dietami żywieniowymi. Oceniliśmy korę jajnikową jałówek karmionych dietą Stair-Step lub Control. Jałówkom kontrolnym podawano dietę podtrzymującą w ilości 97,9 g/kg0,75 przez 84 dni. Dieta Stair-Step została rozpoczęta w wieku 8 miesięcy i zawierała dietę o ograniczonym żywieniu w ilości 67,4 g/kg0,75 przez 84 dni. Po pierwszych 84 dniach, podczas gdy jałówki z grupy kontrolnej nadal otrzymywały 97,9 g/kg0,75, jałówkom mięsnym Stair-Step zaoferowano 118,9 g/kg0,75 przez kolejne 68 dni, po czym poddano je owariektomii w wieku 13 miesięcy16 w celu zbadania zmian w stadiach pęcherzykowych i morfologii przed i po hodowli. Przeprowadziliśmy również badania różnic w steroidach, metabolitach steroidowych, chemokinach i cytokinach wydzielanych do pożywki korowej. Steroidy i inne metabolity mierzono w celu ustalenia, czy leczenie przeprowadzone in vivo i/lub in vitro miało bezpośredni wpływ na żywotność i produktywność tkanek. Zmiany w mikrośrodowisku jajników przed i po posiewie dostarczyły obrazu środowiska endokrynologicznego i folikulogenezy przed posiewem oraz tego, jak posiew lub leczenie podczas hodowli wpływają na progresję lub zatrzymanie pęcherzyków.

Jajniki zostały pobrane po przeprowadzeniu owariektomii w Amerykańskim Centrum Badań nad Zwierzętami Mięsnymi (USMARC) zgodnie z ich procedurami IACUC od jałówek kontrolnych i schodkowych w wieku 13 miesięcy16, oczyszczone sterylnym buforem fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) przemyte 0,1% antybiotykiem w celu usunięcia krwi i innych zanieczyszczeń, przycięte nadmiar tkanki i przetransportowane do laboratorium Fizjologii Rozrodu Uniwersytetu Nebraska-Lincoln (UNL) UNL w 37°C23. W UNL fragmenty kory jajnikowej pocięto na małe kwadratowe kawałki (~0,5-1 mm3; Rysunek 1) i hodowane przez 7 dni (Rysunek 2). Histologię przeprowadzono na szkiełkach hodowlanych kory mózgowej przed i po hodowli w celu określenia etapów pęcherzyków włosowych16,24 (Rysunek 3 i Rysunek 4) oraz białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wskazywać na zwłóknienie (Picro-Sirus Red, PSR; Rysunek 5). Pozwoliło to na określenie wpływu reżimów żywieniowych in vivo na stadia pęcherzykowe i umożliwiło porównanie 7 dni kory jajnikowej na stadia pęcherzykowe i progresję pęcherzyków. W całej hodowli pożywka była zbierana i zmieniana codziennie (około 70% pożywki było zbierane każdego dnia; 250 μl / studzienkę), tak aby codzienne hormony/cytokiny/chemokiny mogły być oceniane lub łączone przez dni w celu uzyskania średnich stężeń. Steroidy, takie jak androstendion (A4) i estrogen (E2), można gromadzić przez 3 dni i oceniać za pomocą testu radioimmunologicznego (RIA; Rysunek 6) i łączone przez 4 dni na zwierzę i oznaczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (HPLC-MS)24,25 (Tabela 1). Macierze cytokin wykorzystano do oceny stężeń cytokin i chemokiny w hodowli kory jajników w pożywce26 (Tabela 2). Przeprowadzono testy reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w celu określenia ekspresji genów dla określonych szlaków transdukcji sygnału, jak wykazano wcześniej16. Wszystkie steroidy, cytokiny, stadium pęcherzykowe i markery histologiczne dostarczają obrazu mikrośrodowiska jajników i wskazówek co do zdolności tego mikrośrodowiska do promowania "normalnej" lub "nieprawidłowej" folikulogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Jajniki pozyskano z U. S. Meat Animal Research Center16. Jak stwierdzono wcześniej16, wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Animal Care and Use Committee) w U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt hodowlanych w badaniach i nauczaniu rolnictwa. Jajniki przetransportowano do Laboratorium Reprodukcyjnego Uniwersytetu Nebraska-Lincoln, gdzie zostały poddane obróbce i hodowli.

1. Przygotowanie wymaganych pożywek

  1. Pożywka Waymouth MB 752/1
    1. Napełnić butelkę do hodowli tkanek o pojemności 1 L 900 mL wody sterylnej. Podczas delikatnego mieszania wody na mieszadle magnetycznym, stopniowo dodawać pożywkę w proszku. Po rozpuszczeniu pożywki dodać 2,24 g wodorowęglanu sodu, a następnie 1,25 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Za pomocą pH-metru ustawić pH w zakresie 7,25-7,35. Dodać wodę sterylną do uzyskania końcowej objętości 1 L.
    2. Przenieść butelkę do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodać siarczan penicyliny i streptomycyny w stężeniu 0,1% v/v pożywki. Przefiltrować pożywkę za pomocą filtra nakrętkowego o rozmiarze porów 0,22 µm i powierzchni 33,2 cm2 do butelek 500 mL.
    3. Przelać przefiltrowaną pożywkę do kilku stożkowych probówek 50 mL. Do każdej 50 mL alikwotu pożywki dodać 0,5 mL mieszaniny Insulin-Transferrin-Selenium.
    4. Owinąć probówki stożkowe oraz butelkę zapasową z pożywką folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Pożywka ta jest światłoczuła.
      UWAGA: Pożywka Waymouth może być przechowywana do 1 miesiąca.
  2. Pożywka Leibovitz's L-15 (LB-15)
    UWAGA: Pożywka LB-15 jest stosowana do oczyszczania tkanek w przygotowaniu do hodowli.
    1. Napełnić butelkę do hodowli tkanek o pojemności 1 L 900 mL wody sterylnej. Podczas delikatnego mieszania wody sterylnej na mieszadle magnetycznym, stopniowo dodawać przygotowaną pożywkę w proszku. Za pomocą pH-metru ustawić pH w zakresie 7,25-7.35. Dodać wodę sterylną do uzyskania końcowej objętości 1 L.
    2. Przenieść butelkę do komory z laminarnym przepływem powietrza. Przygotować 1 L pożywki LB-15 z 0,1% antybiotyku (patrz Tabela materiałów). Przefiltrować pożywkę do dwóch butelek do hodowli tkanek o pojemności 500 mL, używając filtra nakrętkowego o rozmiarze porów 0,22 µm i powierzchni 33,2 cm2 do butelek 500 mL. Owinąć butelki folią aluminiową, ponieważ pożywka LB-15 jest światłoczuła, i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywka LB-15 może być przechowywana do 1 miesiąca.
  3. Bufor fosforanowo-solny (PBS)
    1. Przygotować PBS w laboratorium lub zakupić sterylny PBS bez wapnia i magnezu (Tabela materiałów). Aby przygotować PBS w laboratorium, rozpocząć od 800 mL wody destylowanej i dodać do niej 8 g chlorku sodu (NaCl). Następnie dodać 0,2 g chlorku potasu (KCl), 1,44 g fosforanu sodu dwuzasadowego (Na2HPO4) oraz 0,24 g fosforanu potasu dwuzasadowego (KH2PO4). Ustawić pH na ok. 7,4 i uzupełnić całkowitą objętość do 1 L. Zsterylizować roztwór w autoklawie.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować 1 L PBS z 0,1% antybiotyku (patrz Tabela materiałów).

2. Protokół hodowli kory jajnika

UWAGA: Jajniki pobrano od jałówek USMARC urodzonych wiosną w wieku 13 miesięcy. Jajniki dokładnie wypłukano, a całą krew oraz inne płyny usunięto za pomocą PBS zawierającego antybiotyk (0,1%), a następnie przetransportowano w temperaturze 37 °C23 do Laboratorium Reprodukcji Uniwersytetu Nebraska-Lincoln (UNL, oddalonego o 1,5 h). (Uwagi dotyczące temperatury jajników podczas transportu znajdują się w sekcji Dyskusja)

  1. Przygotowanie tkanki jajnika w komorze z laminarnym przepływem powietrza (Rycina 1).
    1. Zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. Umieścić na blacie świeżą podkładkę chłonną. Należy upewnić się, że wentylator komory został włączony na pół godziny przed sekcją wraz z lampą UV w celu sterylizacji zawartości komory, w tym podkładki chłonnej, oraz upewnić się, że zastosowano odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE).
    2. Przygotować szalki Petriego (60 x 15 mm) do płukania tkanek. Wymagane są trzy szalki do płukania w PBS, trzy do PBS z antybiotykiem oraz trzy do płukania w LB-15. Dodatkowa szalka Petriego z pokrywką zawierająca LB-15 zostanie wykorzystana do końcowego umieszczenia fragmentów tkanek po płukaniu.
    3. Napełnić każdą szalkę Petriego około 10 mL odpowiedniego płynu, PBS lub LB-15.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Układ płytek do płukania jajnika i fragmentów kory w komorze z laminarnym przepływem powietrza. (A) PBS stosowany do płukania jajnika podczas usuwania fragmentów kory. (B) Płukania w roztworze PBS z antybiotykami, przez które przenoszone są fragmenty kory. (C) Fragmenty kory jajnika są płukane czterokrotnie w LB-15 przed przeniesieniem do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu końcowego płukania w LB-15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Wyjąć przygotowane podłoża Waymouth oraz LB-15 z lodówki i ogrzać do temperatury pokojowej.
  2. Wszystkie narzędzia należy poddać autoklawowaniu, aby zapewnić ich sterylizację przed użyciem.
  3. Utrzymywać jajniki w temperaturze 37°C °C do momentu, aż kora jajnika będzie gotowa do pobrania.
  4. Za pomocą pęsety z ząbkowanymi końcówkami należy uchwycić jajnik i dokładnie wypłukać w pierwszej szalce Petriego wypełnionej buforem PBS. Następnie jajnik należy przenieść do drugiej szalki z buforem PBS i ponownie dokładnie oczyścić.
    UWAGA: Jajnik pozostanie w drugim płukaniu w roztworze PBS podczas usuwania pasków kory jajnika.
  5. Za pomocą pęsety z ząbkami należy unieruchomić jajnik i przekroić go na pół. W tym momencie kora jajnika oddzieli się od rdzenia. Używając linijki, należy upewnić się, że z powierzchni jajnika usunięto nie więcej niż 1–2 mm głębokości względem rdzenia.16Oddziel przekroje poprzeczne kory jajnika od rdzenia, a następnie wytnij 3–4 cienkie paski kory jajnika (Rycina 2) skalpelem (ostrze skalpela nr 11; rękojeść nr 3), a następnie umieścić paski w trzeciej szalce Petri wypełnionej buforem PBS.
    UWAGA: Na tym etapie można pobrać dodatkową tkankę kory jajnika do ekstrakcji RNA lub utrwalić i pobrać ją do badań histologicznych w celu analizy początkowych, niehodowanych fragmentów kory. Podczas usuwania pasków kory jajnika należy unikać obszarów z widocznymi pęcherzykami antralnymi lub ciałami żółtymi. Należy również unikać pobierania tkanki rdzenia. Histologia rdzenia jest bardzo odmienna, co wykazano we wcześniejszych badaniach.16Jeśli kora jajnika nie zostanie nacięta na głębokość większą niż 1–2 mm, rdzeń nie powinien zostać pobrany. Wyraźna histologia pozwala na wyznaczenie punktów orientacyjnych pomiędzy korą a rdzeniem.
  6. Pokrój paski kory jajnika podczas trzeciego płukania w roztworze PBS na małe, kwadratowe kawałki (~0,5–1 mm)3) za pomocą ostrza skalpela nr 21. Pod szalkami Petriego należy umieścić linijkę, aby zapewnić podobną wielkość i grubość wycinanych fragmentów, co pozwoli na uzyskanie jednorodnych kawałków kory jajnika. Podczas wycinania fragmentów skalpelem, paski należy stabilizować pęsetą.
    UWAGA: Liczba wyciętych fragmentów tkanki zależy od eksperymentu. Cztery fragmenty kory jajnika to minimalna ilość tkanki niezbędna do hodowli. Inne metody zapewnienia odpowiedniej długości i głębokości obejmują zastosowanie specjalistycznych krojarzy.26 lub docięte z tworzywa sztucznego elementy jako szablony27.
  7. Przemyć fragmenty kory jajnika w trzech kolejnych szalkach Petriego z PBS z dodatkiem antybiotyku. Do przenoszenia fragmentów między poszczególnymi etapami płukania należy użyć pęsety z zakrzywioną końcówką.
  8. Przenieść fragmenty kory przez serię przemyć w roztworze LB-15 i umieścić w końcowej szalce Petri wypełnionej LB-15. Na pokrywce należy zapisać identyfikator zwierzęcia oraz stronę jajnika (lewa lub prawa).
    UWAGA: Fragmenty kory jajnika należy całkowicie zanurzyć w każdym roztworze piorącym, aby zapewnić dokładne oczyszczenie.
  9. Z każdego jajnika należy pobrać cztery fragmenty kory jajnika i utrwalić je do badania histologicznego w dniu zerowym. Dodatkowe fragmenty można również gwałtownie zamrozić w celu izolacji RNA. Pozostałe fragmenty tkanki zostaną wykorzystane do hodowli. Po każdym pobraniu tkanki należy przetrzeć narzędzia sekcyjne 70% etanolem.
  10. Przygotuj komorę z laminarnym przepływem powietrza do kończego przemywania tkanek i przygotowania hodowli. Przed umieszczeniem w komorze zdezynfekuj materiały 70% etanolem. Podczas pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza stosuj techniki aseptyczne.
  11. Przenieść całą korę jajnika przeznaczoną do hodowli do komory bezpieczeństwa biologicznego i wypłukać ją ponownie w szalce Petriego wypełnionej podłożem LB-15.
  12. W 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek nanieść pipetą 350 µL podłoża Waymouth na dołek.
  13. Za pomocą pęsety umieść niepowlekane inserty do studniek hodowlanych w każdej studience. Upewnij się, że pod podstawą insertu nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ mogłoby to doprowadzić do wyschnięcia tkanki. Pożywka musi stykać się z insertami, aby mogła zostać wchłonięta i otoczyć fragmenty kory jajnika.
  14. Ostrożnie umieść cztery fragmenty kory jajnika na siatce każdego insertu (Rycina 2). Pinceta może przebić siatkę, jeśli fragmenty tkanki nie zostaną umieszczone z należytą ostrożnością. Fragmenty tkanki nie powinny stykać się ze sobą ani ze ścianką wkładu.
  15. Inkubować tkankę w temperaturze 37°C °C z 5% CO216.
    UWAGA: Inni stosowali wartość 38,8 °C28Nie zaobserwowano jednak różnic w integralności tkanki ani w zdolności pęcherzyków do rozwoju w 37 °tkanki C ani żadne inne39,30Zatem na tym etapie każda z tych temperatur powinna sprzyjać powodzeniu eksperymentu. Inni autorzy stosowali 400 µL pożywki. Obie ilości są dopuszczalne, o ile zachowany zostanie stały poziom, a  tkankę zanurza się częściowo, aby zapewnić odpowiednie napięcie powierzchniowe umożliwiające hydratację tkanki (pożywka otaczająca fragmenty kory jajnika). Puste dołki wypełnia się 500 µL sterylnej wody, aby pomóc ograniczyć parowanie z pozostałych dołków.

figure-protocol-2
Rycina 2: Fragmenty kory jajnika i płytka hodowlana. (A) Wycinanie paska z kory jajnika. (B) Linijka i fragment kory pokazane obok siebie. (C) Cztery fragmenty kory (~0,5-1 mm3) spoczywające na wkładce w pożywce hodowlanej w płytce. (D) Podnoszenie wkładki w celu zebrania pożywki hodowlanej z dołka. Codziennie należy zebrać i wymienić całą pożywkę hodowlaną (250 µL), aby utrzymać odpowiednie pH. Z każdego dołka każdego dnia uzyskuje się około 250 µL (około 70% początkowej pożywki hodowlanej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Zbieranie pożywki

  1. Codziennie przez 7 dni wymieniaj pożywkę do hodowli kory jajnika. Wymiana pożywki powinna odbywać się w odstępach jak najbliższych 24 h, aby zapobiec gwałtownym zmianom pH i barwy pożywki. Przed wymianą podgrzej pożywkę Waymouth do 37 °C. Każdego dnia z każdej studni uzyskuje się około 250 µL (około 70% początkowej objętości pożywki do hodowli).
  2. Podczas wymiany pożywki użyj pęsety, aby delikatnie wyciągnąć wkład z studni. Zebraną pożywkę Waymouth przelej do probówek 0,5 mL (około 250 µL /dzień). Umieść wkład z powrotem w studni i dodaj 350 µL świeżej pożywki do hodowli, dozując ją w przestrzeń między ścianką wkładu a studnią.
    UWAGA: Wymieniaj większość pożywki codziennie, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do pomiaru wszystkich steroidów, cytokin i chemokin niezbędnych do określenia mikrośrodowiska jajnika. Ponadto codzienna wymiana pożywki jest istotna, aby zapobiec dużym wahaniom pH (wskazywanym przez zmianę barwy) w pożywce. Wokół fragmentów kory jajnika pozostawiono krople pożywki, aby zapewnić ich stałe nawilżenie. Nie zaobserwowano żadnych problemów z hodowaną tkanką w wyniku wymiany 70% pożywki.
  3. Zebraną pożywkę z hodowli tkankowej przechowuj w temperaturze -20 °C.

4. Obrazowanie i przetwarzanie końcowe

  1. Po 7 dniach hodowli w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, należy obrazować fragmenty kory jajnika za pomocą mikroskopu sekcyjnego z dołączoną kamerą i oprogramowaniem do obrazowania komputerowego.
    UWAGA: W celu uzyskania najlepszej jakości obrazów zazwyczaj najlepiej wykorzystać ciemnię.
  2. Po obrazowaniu utrwalić dwa fragmenty kory jajnika z każdej studni w płynie Bouina do badań histologicznych oraz zamrozić gwałtownie dwa fragmenty kory jajnika w ciekłym azocie w celu pozyskania RNA do cDNA. Powtórzyć ten krok dla wszystkich studni z tkanką. Zebrać pożywkę z 7 dni i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Pozostawić fragmenty kory jajnika zanurzone w płynie Bouina (kwas pikrykowy 750 mL, lodowaty kwas octowy 50 mL i formalina 37%–40% 250 mL) przez około 1,5 h, a następnie przemyć trzykrotnie 70% etanolem. Tkankę należy pozostawić w 70% etanolu i wymieniać roztwór codziennie, aż przestanie on być żółty.
    UWAGA: Można stosować inne utrwalacze niż płyn Bouina, a także paraformaldehyd. W tym doświadczeniu zastosowano płyn Bouina, ponieważ pozwala on na uzyskanie optymalnej morfologii. Jeśli do innych analiz wymagana jest większa ilość tkanki, z każdego zwierzęcia można pobrać dodatkowe studnie z pożywką i fragmenty kory jajnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza procedura hodowli kory jajnika bydła może być wykorzystana do wyznaczenia szerokiego zakresu danych dotyczących hormonów, cytokin oraz analiz histologicznych z niewielkich fragmentów jajnika. Barwienia, takie jak hematoksylina i eozyna (H&E), można wykorzystać do określenia morfologii jajnika poprzez etapowanie pęcherzyków16,23,31 (Rycina 3). W skrócie, pęcherzyki sklasyfikowano ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaletą hodowli kory jajnikowej in vitro, opisaną w tym manuskrypcie, jest to, że pęcherzyki rozwijają się w znormalizowanym środowisku z sąsiednim zrębem otaczającym pęcherzyki. Komórki somatyczne i oocyt pozostają nienaruszone, a komunikacja międzykomórkowa jest odpowiednia jako model in vivo. Nasze laboratorium odkryło, że 7-dniowy system hodowli dostarcza reprezentatywnych danych dotyczących folikulogenezy i steroidogenezy w leczeniu kory jajników. Inne protokoły hodowli tkanek jajnika mają albo stosunkowo krótkie okr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 dla ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. Przyznanie przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Hatch NEB26-202/W3112 Akcesje #1011127 do ASC, Akcesje Hatch–NEB ANHL #1002234 do ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award za letnie finansowanie CMS.

Autorzy chcieliby wyrazić swoje uznanie dla Dr. Roberta Cushmana, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE, aby podziękować mu za dostarczenie jajników w poprzedniej publikacji, które następnie zostały wykorzystane w obecnej pracy jako dowód koncepcji w walidacji tej techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 Ostrze ScapelSwann-Morton 303Ostrze Szpulki
#21 Ostrze ScapelSwann-Morton 307Scaple Blade
500 ml Filtr górny do butelkiCorning430514Filtr górny do butelek 0,22 i mikro; m por dla medium filtracyjnego
Test AbsoluteIDQ Sterol17BiocratesZestaw Sterol17Próbki są wysyłane do Biocrates, a panele steroidowe są uruchamiane, a wyniki są zwracane 
Zestaw RIA z podwójnym przeciwciałem androstendionuMPBio7109202RIA do oznaczania androstendionu z pożywki hodowlanej
Belgijski zestaw do oznaczania A4 Źródło DIA KIP0451RIA do oznaczania androstendionu z pożywki hodowlanej
Bydlęca tablica cytokin Q3RayBiotechQAB-CYT-3-1Zestaw cytokin do oznaczania cytokin z pożywki
hodowlanej Oprogramowanie Sens Standard 1.3Oprogramowanie do obrazowaniaOlympus7790
Insulina-Transferyna-Selen-XGibco ThermoFisher Scientific5150056Dodatek do pożywki
hodowlanejLeibovitz's L-15 MediumGibco ThermoFisher Scientific4130039Służy do mycia tkanek na czystym stole oraz w kabinie bezpieczeństwa biologicznego 
Mikroskop OlympusSZX16używany do obrazowania fragmentów kultur tkankowych 
Kamera mikroskopowa Kamera mikroskopowa OlympusDP71służy do obrazowania fragmentów kultur tkankowych 
Wkładki do hodowli komórkowych Millicell 0,4 i mikro; m, 12,mm ŚrednicaMillipore SigmaPICM01250Wkładki, które pozwalają tkance opierać się o podłoże bez zanurzania się w nim
Płytka Multiwell 24-dołkowaFalcon353047Płytka służąca do przechowywania meduim, wkładek i tkanek
Szalka Petriego 60 x 15 mmFalcon351007szalka Petriego używana do mycia etapów przed hodowlą
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS 1X)Corning21-040- CVUżywany do mycia tkanek
SAS Wersja 9.3SAS Institute 9.3 TS1M2Oprogramowanie do analizy statystycznej 
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10Krajalnica do tkanek do przygotowania cienkich, jednolitych odcinków świeżej tkanki
Waymouth MB 752/1 MediumSigma-AldrichW1625Podłoże używane do hodowli tkankowych
Mikroskop dysekcyjny

Bibliografia

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114(2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683(2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21(2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114(2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura kory jajnikarozw j p cherzykaanaliza hormon w steroidowychpomiar produkcji cytokinwk adka do hodowli tkankowejpod o e Waymouthasekcjonowanie histologiczneradiimmunometryczne oznaczanie aktywno ci RIAokre lanie stadium rozwoju p cherzykamikro rodowisko jajnika

Powiązane artykuły