Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem tego protokołu jest zbadanie możliwości zastosowania najnowszego wariantu komplementacji rozszczepionej lucyferazy do zademonstrowania heterologicznych kompleksów tworzonych przez nukleotydowe transportery cukru (NST). Te wielobłonowe białka rezydujące w ER i Golgiego przenoszą cytoplazmatycznie syntetyzowane cukry nukleotydowe przez błony organelli, aby dostarczyć enzymy, które pośredniczą w glikozylacji z ich substratami. NST występują jako dimery i/lub wyższe oligomery. Zgłaszano również heterologiczne interakcje między różnymi NST. Aby sprawdzić, czy technika ta nadaje się do badania zjawiska heteromeryzacji NST, przetestowaliśmy ją w porównaniu z kombinacją dwóch NST rezydentnych przez Golgiego, które, jak wykazano wcześniej, łączą się na kilka innych sposobów. Test komplementacji lucyferazy wydaje się być szczególnie odpowiedni do badania interakcji między białkami błonowymi rezydującymi w Golgiego, ponieważ nie wymaga wysokich poziomów ekspresji, które często powodują błędną lokalizację białek i zwiększają ryzyko wyników fałszywie dodatnich.
Wprowadzenie
Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół sprawdzający obecność heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego w przejściowo transfekowanych komórkach ludzkich przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Procedura została najszerzej przetestowana pod kątem nukleotydowych transporterów cukrów (NST), ale udało nam się również uzyskać pozytywne wyniki dla innych białek błonowych typu III rezydujących w Golgiego, których N- i/lub C-końce są skierowane w stronę cytoplazmy.
Nasza grupa badawcza bada rolę NST w glikozylacji makromolekuł. NST to białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego i/lub ER z końcami N i C skierowanymi w stronę cytoplazmatyczną błony organellarnej1. Uważa się, że NST przenoszą cukry aktywowane nukleotydami przez błony organelli, aby dostarczać glikozylotransferazy wraz z ich substratami. NST tworzą dimery i/lub wyższe oligomery2,3,4,5,6,7,8,9,10. Co więcej, odnotowano również heterologiczne interakcje między różnymi NST6,11. Wykazano również, że NST tworzą kompleksy z funkcjonalnie powiązanymi enzymami glikozylacji12,13,14. Szukaliśmy alternatywy dla obecnie stosowanej techniki, podejścia FRET opartego na obrazowaniu czasu życia fluorescencji (FLIM), do badania interakcji NST i funkcjonalnie powiązanych białek rezydentnych Golgiego, więc zdecydowaliśmy się przetestować test komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Pozwoliło nam to zidentyfikować nową interakcję między NST a funkcjonalnie powiązanym enzymem glikozylacji9.
Najnowsza modyfikacja testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy, NanoBiT, jest używana w protokole przedstawionym tutaj15. Polega ona na odtworzeniu enzymu lucyferazy (np. NanoLuc) z dwóch fragmentów - dużego, określanego jako duży BiT lub LgBiT, białko o masie 17,6 kDa, i mały, złożony tylko z 11 aminokwasów, określany jako mały BiT lub SmBiT. Dwa interesujące białka są łączone z komplementarnymi fragmentami i ulegają przejściowej ekspresji w ludzkiej linii komórkowej. Jeśli te dwa białka fuzyjne oddziałują na siebie, luminescencja jest wytwarzana in situ po dodaniu substratu przepuszczalnego dla komórek. Te dwa fragmenty zostały zoptymalizowane tak, aby kojarzyły się z minimalnym powinowactwem, chyba że zostaną połączone przez interakcję między białkami będącymi przedmiotem zainteresowania, z którymi są połączone.
Ogólnie rzecz biorąc, metody oparte na bioluminescencji mają pewne zalety w porównaniu z tymi opartymi na fluorescencji. Sygnały bioluminescencyjne mają wyższy stosunek sygnału do szumu, ponieważ luminescencja tła jest znikoma w porównaniu z sygnałem pochodzącym z lucyferazy16. W przeciwieństwie do tego, podejścia oparte na fluorescencji zwykle cierpią ze względu na stosunkowo wysokie tło spowodowane zjawiskiem autofluorescencji. Poza tym bioluminescencja jest mniej szkodliwa dla analizowanych komórek niż fluorescencja, ponieważ w pierwszym przypadku nie ma potrzeby wzbudzania próbki. Z tych powodów bioluminescencyjne podejścia do badania IPP in vivo konkurują z powszechnie stosowanymi metodami fluorescencyjnymi, takimi jak Förster Resonance Energy Transfer (FRET) lub Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nasz protokół opiera się na odnoszeniu luminescencji uzyskanej dla interesującej nas kombinacji białek do luminescencji uzyskanej dla kombinacji kontrolnej. Do tych ostatnich zalicza się jedno z badanych białek, które jest połączone z większym fragmentem oraz białko kontrolne (np. HaloTag), połączone z mniejszym fragmentem. To ostatnie jest białkiem pochodzenia bakteryjnego, od którego nie oczekuje się, że będzie wchodzić w interakcje z żadnym z białek ssaków. Użycie tego białka jako kontroli stwarza ograniczenia dla topologii par białek rezydujących w Golgiego, które mają być analizowane. Ponieważ w komórkach ssaków białko to jest syntetyzowane w cytoplazmie, oba interesujące białka powinny mieć co najmniej jeden ogon cytoplazmatyczny.
To podejście może być szczególnie przydatne do wstępnego badania IPP. Może stać się metodą z wyboru, gdy białka fuzyjne będące przedmiotem zainteresowania ulegają ekspresji na poziomach, które są po prostu niewystarczające do zastosowania innych podejść. Podobnie, test komplementacji rozszczepionej lucyferazy może być najlepszą opcją, jeśli interesujące białka ulegają ekspresji na wysokich poziomach, ale wpływa to niekorzystnie na ich lokalizację subkomórkową lub jest znane z wymuszania interakcji niespecyficznych. Ponieważ mniejszy fragment ma tylko 11 aminokwasów, test komplementacji rozszczepionej lucyferazy może być zastosowany, gdy użycie większych znaczników jest niemożliwe. Wreszcie, można go wykorzystać do dalszego potwierdzania danych uzyskanych za pomocą innych technik, jak w przedstawionym tu przypadku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generowanie plazmidów ekspresyjnych
- Zbadaj topologię błony białek będących przedmiotem zainteresowania za pomocą narzędzia do przewidywania topologii.
- Zaprojektuj strategię klonowania tak, aby większe i mniejsze fragmenty były zwrócone w stronę cytoplazmy po wprowadzeniu białek fuzyjnych do błon Golgiego. Jeśli, tak jak w przedstawionym tutaj przypadku, zarówno N-, jak i C-końce interesujących białek są zorientowane cytoplazmatycznie, oznacz białka na osiem możliwych sposobów (patrz Rysunek 1B). Jeśli N- lub C-koniec jednego lub obu białek będących przedmiotem zainteresowania jest zorientowany świetliście, należy wykluczyć go z tagowania.
- Subklonować interesujące nas geny do odpowiednich wektorów ekspresyjnych (patrz Spis materiałów), postępując zgodnie ze standardowymi protokołami klonowania.
UWAGA: Zaleca się przetestowanie wszystkich możliwych orientacji, ponieważ niektóre opcje oznaczania mogą nie działać z powodu niewystarczającej bliskości, nieoptymalnej orientacji lub ograniczeń przestrzennych.
2. Przejściowa transfekcja plazmidów ekspresyjnych do komórek
- Zbierz przylegający HEK293T hodowli komórkowej przez trypsynizację i ponownie zawieś komórki w dedykowanej kompletnej pożywce wzrostowej. Umieść komórki (2 x 104/100 μl/dołek) na przezroczystej, białej płytce 96-dołkowej. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby.
UWAGA: Staraj się używać tylko wewnętrznych 60 dołków płyty, aby zminimalizować przesunięcia termiczne i uniknąć parowania przez noc. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płytek pokrytych poli-D-lizyną, takich jak te wskazane w Tabeli Materiałów, w przeciwnym razie komórki mogą się oderwać podczas kolejnych etapów mycia. - Hodować komórki przez noc w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ).
- Następnego dnia należy przetoczyć transfekcję komórek pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych otrzymanych w punkcie 1.1.
- Rozcieńczyć plazmidy ekspresyjne w podłożu bez surowicy (patrz tabela materiałów) do 6,25 ng / μl dla każdego konstruktu.
- Dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów w odpowiednim stosunku lipidów do DNA i inkubować zgodnie z instrukcją producenta.
- Dodać 8 μl mieszaniny lipid:DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość talerza, delikatnie obracając. Powoduje to transfekcję obu konstruktów ekspresji przy 50 ng/dołku.
- Hodować komórki przez 20-24 godziny w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ).
UWAGA: Hodowla komórek przez dłuższy czas może skutkować wyższymi poziomami ekspresji białka fuzyjnego, co może sprzyjać niespecyficznemu skojarzeniu między fragmentami.
3. Średnia wymiana
- Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę 100 μl pożywki wolnej od surowicy w każdym dołku. Upewnij się, że ogniwa nie odczepiły się po wymianie nośnika.
UWAGA: Ten krok należy wykonać 2-3 godziny przed dodaniem roztworu roboczego furimazyny. Odstawienie surowicy minimalizuje tło spowodowane autoluminescencją furimazyny.
4. Przygotowanie roztworu roboczego furimazyny
- Tuż przed pomiarem zmieszać 1 objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego (rozcieńczenie 20-krotne).
UWAGA: Całkowita objętość roztworu roboczego furimazyny, który ma być przygotowany, zależy od liczby pojedynczych studzienek, które mają być analizowane (roztwór roboczy furimazyny dodaje się do pożywki do hodowli komórkowych w stosunku 1:5, dlatego do każdej studzienki uprzednio wypełnionej 100 μl pożywki bez surowicy należy dodać 25 μl roztworu roboczego furimazyny). - Dodać roztwór roboczy furimazyny do wyznaczonych studzienek (25 μl/studzienkę). Delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (np. 15 s przy 300-500 obr./min).
5. Pomiar luminescencji
- Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
- W przypadku doświadczeń, które mają być przeprowadzone w temperaturze 37 °C, należy zrównoważyć płytkę przez 10-15 minut we wskazanej temperaturze.
- Wybierz studnie, które mają zostać przeanalizowane.
- Odczyt luminescencji z czasem integracji 0,3 s. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie 2 godziny.
6. Analiza danych
- Obliczyć wartości średnie i odchylenia standardowe dla wszystkich badanych i kontrolnych kombinacji.
- Analizuj dane za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA z wieloma porównaniami.
- Obliczyć wartości zmiany krotności, dzieląc średnią luminescencję uzyskaną dla interesujących kombinacji przez średnią luminescencję uzyskaną dla odpowiednich kontroli ujemnych. Oceń wyniki.
UWAGA: Proponowane tu podejście do analizy danych zakłada, że oddziaływanie można stwierdzić, jeśli luminescencja uzyskana dla badanej kombinacji jest statystycznie istotnie wyższa od luminescencji uzyskanej dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej i jednocześnie stosunek tych dwóch wartości przekracza 10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby uzyskać najbardziej wiarygodne dane w tym podejściu, należy przetestować wszystkie możliwe kombinacje (patrz Rycina 1). Równolegle należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola pozytywna powinna składać się z dwóch białek, o których wiadomo, że oddziałują ze sobą, z czego jedno jest połączone z większym fragmentem, a drugie z mniejszym fragmentem. Kontrola negatywna w idealnym przypadku powinna składać się z dwóch nieoddziałujących ze sobą białek błonowych typu III, oznaczon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół umożliwiający wykazanie heterologicznych kompleksów utworzonych między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego, takimi jak NST, przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Proponowane podejście do analizy i interpretacji danych polega na powiązaniu luminescencji uzyskanej dla interesującej nas kombinacji białek z luminescencją uzyskaną dla odpowiedniej kombinacji kontrolnej, która składa się z jednego z białek będących przedmiotem zainteresowani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem nr 2016/23/D/NZ3/01314 z Narodowego Centrum Nauki (NCN), Kraków, Polska.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
2
trypsyny-EDTAkomórkowa ssakówdo hodowli komórkowychCOlinii komórkowej
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% roztwór | |||
| Przylegająca linia | |||
| BioCoat Poli-D-Lizyna 96-dołkowa biała/przezroczysta płaska płytka z płaskim dnem Mikropłytka poddana działaniu TC, z pokrywką | Corning | 356651 | |
| Wirówka | |||
| Suplementy do hodowli komórkowych (inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, L-glutamina, penicylina, streptamycyna) | |||
| Inkubator | |||
| Plazmidy ekspresyjne kodujące interesujące białka nieoznaczone fragmentami NanoBiT Odczynnik | |||
| do transfekcji FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (lub inny czytnik mikropłytek luminescencyjnych) | Promega | GM3000 | |
| Pożywka wzrostowa dedykowana do zastosowanej | |||
| Materiały i odczynniki do standardowego klonowania molekularnego (bakterie, polimeraza termostabilna, enzymy restrykcyjne, ligaza DNA, materiały i odczynniki do oczyszczania kwasów nukleinowych) | |||
| System startowy NanoBiT MCS | Promega | N2014 | Zestaw ten zawiera wektory umożliwiające znakowanie badanych białek fragmentami NanoBiT w różnych orientacjach, a także plazmid kontrolny kodujący białko HaloTag połączone z SmBiT i parą plazmidów kontroli pozytywnej. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | Zestaw zawiera furimazynę, która jest substratem umożliwiającym detekcję aktywności NanoLuc w żywych komórkach oraz dedykowany bufor do rozcieńczania. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, bez czerwieni fenolowej | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Oprogramowanie do analizy danych (np. GraphPad Prism) | |||
| Termocykler |
Bibliografia
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275(2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
