Artykuł metodologiczny

Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61677

⸱

6 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, 3Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Streszczenie

Patologiczna angiogeneza naczyniówkowa, istotna cecha zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, prowadzi do upośledzenia wzroku i ślepoty. Testy proliferacji komórek śródbłonka (EC) z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC) lub izolowanych pierwotnych EC siatkówki są szeroko stosowane w modelach in vitro do badania angiogenezy siatkówki. Jednak wyizolowanie czystych mysich komórek śródbłonka siatkówki jest technicznie trudne, a EC siatkówki mogą mieć inne reakcje proliferacyjne niż komórki śródbłonka naczyniówki i różne interakcje komórka/komórka. Opracowano wysoce powtarzalny test kiełkowania naczyniówki ex vivo jako model proliferacji mikronaczyniówkowej naczyniówki. Model ten obejmuje interakcję między naczyniówką naczyniówkową (EC, makrofagi, perycyty) a nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Mysie eksplantaty RPE / naczyniówka / twardówki są izolowane i inkubowane w ekstrakcie z błony podstawowej o obniżonym czynniku wzrostu (BME) (dzień 0). Pożywka jest zmieniana co drugi dzień, a kiełkowanie naczyniówki określa się ilościowo w 6 dniu. Obrazy poszczególnych eksplantatów naczyniówki są wykonywane za pomocą mikroskopu z odwróconą fazą, a obszar kiełkowania jest oznaczany ilościowo za pomocą półautomatycznej wtyczki makro do oprogramowania ImageJ opracowanego w tym laboratorium. Ten powtarzalny test kiełkowania naczyniówki ex vivo może być wykorzystany do oceny związków do potencjalnego leczenia oraz do badań nad chorobami mikronaczyniowymi w celu oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Wprowadzenie

Dysregulacja angiogenezy naczyniówkowej jest związana z neowaskularnym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD)1. Naczyniówka to łożysko mikronaczyniowe znajdujące się pod nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Wykazano, że zmniejszony przepływ krwi w naczyniówce jest związany z progresją AMD2. Skomplikowany związek między śródbłonkiem naczyniowym, RPE, makrofagami, perycytami i innymi komórkami jest odpowiedzialny za homeostazę tkanki3,4,5. W związku z tym powtarzalny test modelujący mikrośrodowisko naczyniówki ma kluczowe znaczenie dla badania neowaskularnego AMD.

Testy angiogenezy ex vivo i hodowle komórek śródbłonka in vitro mogą uzupełniać badania nad zachowaniem mikronaczyń krwionośnych in vivo, do testowania nowych leków i do badań patogenezy. Komórki śródbłonka, takie jak ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC), ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), izolowany pierwotny mózg zwierzęcia lub EC siatkówki są często wykorzystywane w badaniach in vitro do badań nad angiogenezą oka6,7,8. W szczególności HRMEC są szeroko stosowane jako model neowaskularyzacji naczyniówki in vitro (CNV)9 poprzez ocenę proliferacji śródbłonka, migracji, tworzenia kanalików i przecieku naczyniowego w celu oceny interwencji6,10. Jednak EC w hodowli są ograniczone jako model CNV ze względu na brak interakcji z innymi typami komórek występującymi w naczyniówce oraz dlatego, że większość EC stosowanych w tych testach nie pochodzi z naczyniówki. Mysie naczyniówkowe EC są trudne do wyizolowania i utrzymania w hodowli.

Test pierścienia aorty jest powszechnie stosowany jako model proliferacji makronaczyń krwionośnych. Kiełki naczyniowe z eksplantatów aorty obejmują EC, perycyty i makrofagi11. Test pierścienia aorty dobrze modeluje angiogenezę dużych naczyń krwionośnych12,13,14. Ma jednak ograniczenia jako model neowaskularyzacji naczyniówki, ponieważ pierścienie aorty są tkanką makronaczyniową pozbawioną charakterystycznego środowiska mikronaczyniówkowego, a kiełki z dużych naczyń mogą różnić się od kiełków z sieci naczyniowniczych zaangażowanych w patologię mikrokrążenia. Niedawno grupa opublikowała test siatkówki ex-vivo15,16. Chociaż nadaje się do neowaskularnej choroby siatkówki, nie jest tak odpowiedni do neowaskularyzacji naczyniówki, jak widać w AMD.

Test kiełkowania naczyniówki przy użyciu mysiego RPE, naczyniówki i eksplantowanej tkanki twardówki został opracowany w celu lepszego modelowania CNV. Tkankę można łatwo wyizolować z oczu myszy (lub innych gatunków)17. Test ten pozwala na powtarzalną ocenę potencjału pro- i antyangiogennego związków farmakologicznych oraz ocenę roli specyficznych szlaków w neowaskularyzacji naczyniówki przy użyciu tkanek pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych myszy i kontrolnych18. Ten test kiełkowania naczyniówki był przywoływany w wielu późniejszych publikacjach9,10,18,19,20. W tym miejscu przedstawiono metodę związaną z zastosowaniem tego testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie (numer protokołu ARCH 19-04-3913R).

1. Przygotowanie

  1. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (10000 j./ml) oraz 5 ml i 10 ml dostępnych w handlu suplementów do 500 ml kompletnej klasycznej pożywki z surowicą. Porcja 50 ml pożywki początkowo.
    UWAGA: Nie zwracaj pożywki z powrotem do magazynu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Umieść porcję kompletnego klasycznego podłoża na lodzie.
  3. Użyj 70% etanolu do czyszczenia mikroskopu preparacyjnego, kleszczy i nożyczek.
  4. Przygotuj dwie szalki do hodowli komórkowych (10 cm), jedną pod mikroskopem preparacyjnym, drugą na lodzie; do każdej pożywki wlej 10 ml kompletnej klasycznej pożywki.

2. Etapy eksperymentalne (Rysunek 1)

  1. Uśmierc myszy C57BL / 6J około pourodzeniowego (P) 20 za pomocą 75-100 mg / kg ketaminy i 7,5 -10 mg / kg ksylazyny wstrzykiwanej dootrzewnowo. Trzymaj oczy w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie przed preparacją.
  2. Usuń tkankę łączną (tkankę mięśniową i tłuszczową) oraz nerw wzrokowy na oku.
  3. Użyj mikronożyczek, aby przyciąć obwodowo 0,5 mm za rąbkiem rogówki. Usuń kompleks rogówki/tęczówki, ciało szkliste i soczewkę.
  4. Wykonaj nacięcie 1 mm prostopadle do krawędzi cięcia w kierunku nerwu wzrokowego i odetnij obwodową opaskę o szerokości 1 mm. Oddziel centralne i peryferyjne regiony kompleksu. Użyj kleszczy, aby odkleić siatkówkę od kompleksu RPE/naczyniówki/twardówki.
  5. Utrzymuj obwodową opaskę naczyniówki w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie; odizoluj drugie oko i powtórz proces, aby przeciąć drugą prążek.
  6. Pokrój okrągłą opaskę na 6 ~ równych kwadratowych kawałków (~ 1 mm x 1 mm).
    UWAGA: Nigdy nie dotykaj żadnej krawędzi.
  7. Rozmrozić podstawowy ekstrakt błonowy (BME) zgodnie z instrukcją producenta. Dodać 30 μl/basenik BME do środka każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropla BME tworzy wypukłą kopułę na dnie płytki, nie dotykając krawędzi.
    UWAGA: Rozmrozić BME przez noc w lodówce. BME powinien znajdować się na lodzie w dowolnym momencie po rozmrożeniu.
  8. Umieść tkankę na środku BME.
    UWAGA: Nie spłaszczaj eksplantatu naczyniówki; ogólnie rzecz biorąc, pozwól tkance rozszerzać się w BME. Orientacja tkanki (twardówka do góry lub do dołu) nie ma wpływu na wynik eksperymentu.
  9. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby żel stężał.
  10. Dodać 500 μl kompletnego klasycznego podłoża/dołka.
  11. Zmieniaj klasyczną pożywkę co drugi dzień (500 μL). Kiełkowanie naczyniówki można zaobserwować po 3 dniach pod mikroskopem.
    UWAGA: W przypadku leczenia czynnikiem wzrostu głodz tkankę przez 4 godziny. Rozcieńczyć badany związek w pożywce o obniżonym współczynniku wzrostu (zwiększenie 1:200 zamiast 1:50).

3. Komputerowa metoda kwantyfikacji SWIFT-Choroid17 (Rysunek 2)

UWAGA: Użyto komputerowej metody pomiaru powierzchni pokrytej przez naczynia uprawowe. Przed kwantyfikacją potrzebna jest wtyczka makr do oprogramowania ImageJ (więcej informacji można znaleźć w informacjach dodatkowych).

  1. Otwórz obraz kiełkowania naczyniówki za pomocą ImageJ i zaznacz "Obraz | Rodzaj| 8-bitowy" ze skalą szarości.
  2. Przejdź do "Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast (Ctrl/shift/C)" i zoptymalizuj kontrast.
  3. Użyj funkcji magicznej różdżki, aby obrysować i usunąć z obrazu tkankę naczyniówki, która znajduje się w środku pędów (za pomocą skrótu "F1") (Rysunek 2A,B).
    UWAGA: Ustaw współczynnik tolerancji magicznej różdżki na 20-30%.
  4. Usuń tło obrazu za pomocą bezpłatnych narzędzi do zaznaczania (Rysunek 2C). Przejdź do "Obraz | Dostosuj | Próg (Ctrl/shift/T)". Użyj funkcji progowej, aby zdefiniować pędy mikronaczyniowe na tle i na obrzeżach (Rysunek 2D).
  5. Kliknij "F2", a pojawi się podsumowanie. Zapisz obraz wybranego obszaru, klikając "Zapisz". Zapisz w tym samym folderze, co oryginalny obraz, aby móc z niego skorzystać w przyszłości.
  6. Po zmierzeniu grupy próbek skopiuj nagranie do analizy danych.
    UWAGA: Możliwe jest również zmierzenie powierzchni (μm²) za pomocą opcji "Analizuj | Ustaw skalę" przy użyciu obrazów z paskami skali.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie dziennego wzrostu wypustek naczyniówki

Wypreparowaliśmy naczyniówkę wraz z twardówką, osadziliśmy je w BME i hodowaliśmy przez 6 dni (Rycina 1). Kiełkowanie naczyń naczyniówki u myszy C57BL/6J od 3. do 6. dnia badano za pomocą mikroskopu i ilościowo określono przy użyciu SWIFT-Choroid, półautomatycznej metody kwantyfikacji w programie ImageJ. W reprezentatywnym przypadku powierzchnia kiełkowania naczyniówki (naczynia rozrastające się z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test kiełkowania naczyniówki pomaga w badaniach nad neowaskularnym AMD 9,10,18,19,20. Eksplantaty naczyniówki można wyizolować zarówno od myszy, jak i szczurów i ludzi17,21. Eksplant naczyniówki obejmuje EC, makrofagi i perycyty17. W tym teście interakcja między EC naczyniówki a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji finansowych. Metoda komputerowa jest dostępna bezpłatnie dla instytucji akademickich za pośrednictwem autorów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty z Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship i Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; to BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Fundacja Massachusetts Lions Eye (LEHS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Ekstrakt z błony bazowej (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Naczynie do hodowli komórkowychNEST70400110cm
Kompletna klasyczna pożywka z serum i systemami CultureBoostCell4Z0-500
Alkohol etylowy 200 ProofPharmco111000200stosować przez 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MikroskopZEISSAxio Observer Z1
Penicylina/StreptomycynaGIBCO1514010000 U/ml
Płytka do hodowli tkankowej (24-dołkowa)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamina)AKORN59399-114-10

Bibliografia

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939(2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552(2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470(2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Angiogeneza naczyni wkowatest ex vivonab onek barwnikowy siatk wkiekstrakt z b ony podstawnejanaliza w programie ImageJproliferacja mikronaczyniowazwyrodnienie plamki zwi zane z wiekiemnokaut FFAR4przesiew zwi zk w

Powiązane artykuły