Artykuł metodologiczny

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

DOI:

10.3791/61680

⸱

20 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkrypcja genów jest kluczowym procesem w biologii komórki i pozwala komórkom interpretować i reagować na wewnętrzne i zewnętrzne sygnały. Tradycyjne metody populacji masowej (Northern blot, PCR i RNAseq), które mierzą poziomy mRNA, nie są w stanie dostarczyć informacji na temat zmienności odpowiedzi między komórkami. Precyzyjna wizualizacja i kwantyfikacja pojedynczych komórek i alleli jest możliwa dzięki hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA (smFISH). RNA-FISH wykonuje się poprzez hybrydyzację docelowych RNA ze znakowanymi sondami oligonukleotydowymi. Można je obrazować w trybie średnio/wysokoprzepustowym, a dzięki potokom analizy obrazu dostarczają danych ilościowych zarówno na temat dojrzałych, jak i powstających RNA, a wszystko to na poziomie pojedynczej komórki. Etapy fiksacji, przenikania, hybrydyzacji i obrazowania były optymalizowane w laboratorium przez wiele lat przy użyciu opisanego tutaj systemu modelowego, co skutkuje udaną i solidną analizą pojedynczych komórek znakowania smFISH. Głównym celem przygotowania i przetwarzania próbek jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów charakteryzujących się wysokim stosunkiem sygnału do szumu, aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich i zapewnić dokładniejsze dane. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący proces od przygotowania próbki do analizy danych w połączeniu z sugestiami i krokami optymalizacji w celu dostosowania do konkretnych próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkrypcja i translacja genów to dwa główne procesy związane z centralnym dogmatem biologii, przechodząc od sekwencji DNA do RNA do białka1. W tym badaniu skupiamy się na produkcji informacyjnego RNA (mRNA) podczas transkrypcji. Powstająca cząsteczka RNA zawiera zarówno niekodujące introny, jak i kodujące egzony. Introny są kotranskrypcyjnie splicowane, zanim mRNA przemieści się do cytoplazmy w celu translacji na rybosomach2,3.

Tradycyjnie, pomiar mRNA jest wykonywany w dużych populacjach komórek (setki do milionów) za pomocą klasycznych testów, takich jak RT-qPCR lub Northern blotting. Chociaż metody te są bardzo skuteczne, są ograniczone, ponieważ nie zapewniają wglądu w zmienność między komórkami (heterogeniczność fenotypowa), identyfikację liczby alleli aktywnych transkrypcyjnie i, co być może ważniejsze, brakuje informacji przestrzennych. Niedawno technologie obejmujące cały genom pozwalające na sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (RNAseq) zaczęły wypełniać lukę między metodami obrazowania a sekwencjonowaniem4. Jednak RNAseq cierpi ze względu na stosunkowo niską skuteczność wykrywania, a etapy przetwarzania powodują całkowitą utratę informacji przestrzennej5. Chociaż sekwencja RNAseq pojedynczej komórki może dostarczyć informacji na temat heterogeniczności fenotypowej w populacji komórek izogenicznych, hybrydyzacja in situ fluorescencji RNA (RNA-FISH) może ułatwić pełniejsze badanie ekspresji genów docelowych na poziomie przestrzennym i na podstawie allelu po allelu6,7.

RNA FISH to technika, która pozwala na wykrywanie i lokalizację docelowych cząsteczek RNA w stałych komórkach. W przeciwieństwie do wcześniejszych, pracochłonnych metod, obecny stan techniki RNA-FISH wykorzystuje dostępne na rynku sondy kwasów nukleinowych, które są komplementarne do docelowych sekwencji RNA, a sondy te hybrydyzują ze swoimi celami za pomocą parowania zasad Watsona-Cricka8. Wczesne techniki hybrydyzacji in situ obejmowały podobny protokół ustanowiony przez Galla i Pardue w 1969 roku, gdy próbka była przetwarzana za pomocą sond kwasów nukleinowych, które specyficznie hybrydyzowały do docelowego RNA9. Pierwotnie test wykonywano przy użyciu detekcji radioaktywnej lub kolorymetrycznej; jednak w latach 80. XX wieku rozwój protokołów fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do DNA FISH, a później RNA FISH, otworzył drogę w kierunku bardziej czułego wykrywania i potencjału multipleksowania10,11.

Dalszy rozwój RNA FISH doprowadził do możliwości wykrywania i ilościowego oznaczania pojedynczych cząsteczek RNA (smFISH)12,13. Detekcja bezpośrednia to metoda, w której same sondy są znakowane fluoroforami. Wyzwaniem związanym z projektem smFISH jest to, że istnieje potrzeba wystarczającej liczby sond hybrydyzujących/celu, aby ułatwić wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych jako wyraźnych, ograniczonych dyfrakcją plam. Aby rozwiązać ten problem, można użyć zestawu krótkich jednoniciowych oligonukleotydów DNA komplementarnych do różnych regionów docelowego RNA8,12,14. Wiązanie wielu sond zwiększa lokalną gęstość fluoroforu, dzięki czemu RNA jest widoczne jako wyraźna plamka o wysokiej intensywności pod mikroskopią fluorescencyjną. Ta metoda jest korzystna, ponieważ wiązanie oligonukleotydów poza celem w puli zestawu sond można odróżnić od prawdziwego sygnału plamki RNA poprzez ilościową analizę rozmiaru i intensywności plamki w celu rozróżnienia między prawdziwym sygnałem a fałszywym wiązaniem oligonukleotydowym, ułatwiając w ten sposób dokładniejszą analizę poprzez zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich12.

Alternatywnymi metodami wykrywania mRNA są klasyczna metoda translacji nicków oparta na klonach BAC oraz niedawno opracowany system rozgałęzionego DNA. W metodzie klonowania BAC, translacji nacięcia, DNA, które ma być znakowane, jest nacinane enzymatycznie i nowy nukleotyd jest dodawany do odsłoniętego końca 3'. Aktywność polimerazy DNA I dodaje znakowany nukleotyd, w wyniku czego powstaje pożądana sonda15,16. Technika rozgałęzionego DNA obejmuje sondy oligonukleotydowe, które hybrydyzują w parach z celami RNA, a sondy te są amplifikowane przy użyciu wielu cząsteczek wzmacniających sygnał. Ta metoda może znacznie poprawić stosunek sygnału do szumu, ale wzmocnienie może zniekształcić dokładną ocenę ilościową, ponieważ plamki fluorescencyjne mogą być bardzo różne pod względem wielkości i intensywności17.

Jako modelowy system dla tego protokołu, który jest w pełni wykorzystany w ramach udziału NIEHS Superfund Research Program do ilościowego określenia skutków substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną w Galveston Bay/Houston Ship Channel, użyliśmy linii komórkowej raka piersi MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym (ER) leczonej przez noc agonistą ER, 17β-estradiolu (E2)7, 18,19. E2 reguluje wiele genów docelowych ER, w tym prototypowy gen docelowy ER, GREB17,20,21,22. Opisany tutaj protokół smFISH wykorzystuje zestaw dwóch zestawów sond separowanych spektralnie, których celem jest GREB1; jeden, który hybrydyzuje z eksonami, a drugi z intronami, co pozwala na pomiar zarówno dojrzałego, jak i powstającego RNA7. Następnie używamy mikroskopii epifluorescencyjnej połączonej z dekonwolucją, aby zobrazować próbki znakowane smFISH, a następnie stosujemy procedury analizy obrazu w celu ilościowego określenia liczby aktywnych alleli i dojrzałych RNA na komórkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapewnić optymalne wyniki, część tego protokołu dotycząca mokrego laboratorium wymaga standardowych środków ostrożności wolnych od RNaz na wszystkich etapach. Na przykład zdecydowanie zaleca się stosowanie filtrowanych końcówek do pipet, sterylnych naczyń i wolnych od RNaz. Sugeruje się również stosowanie inhibitorów RNazy, takich jak kompleksy rybonukleozydów wanadylu, szczególnie w przypadku docelowych RNA o niskiej liczebności.

1. Hodowla komórkowa i konfiguracja eksperymentalna

  1. Utrzymuj przylegające komórki raka piersi MCF-7 (ATCC #HTB-22) w kolbie do hodowli tkankowej T75 z wolnym od czerwieni fenolowej (wymagane tylko do eksperymentów stymulacji hormonalnej) Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1 nM pirogronianu sodu, 50 I.U./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
  2. Umieść trawione kwasem, pokryte poli-D-lizyną okrągłe szkiełka nakrywkowe (o grubości od 0,16 do 0,19 mm, średnicy 12 mm) w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Użyj 1 M HCl do wytrawienia kwasem szkiełek nakrywkowych i pokryj roztworem 1 mg/ml poli-D-lizyny rozpuszczonej w sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca++ i Mg++) zgodnie ze standardowymi protokołami.
  3. Usunąć pożywkę wzrostową z komórek i przemyć raz 5 ml sterylnego PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca++ i Mg++). Odłącz komórki MCF-7 za pomocą 2-3 ml 0,25% roztworu Trypsin-EDTA. Po odłączeniu komórek zneutralizuj 0,25% roztwór trypsyny-EDTA z równą objętością pożywki wzrostowej.
  4. Przenieść komórki w zawiesinie pożywki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, wirować w temperaturze 391 x g przez 1 minutę, aby wydzielić granulki. Ostrożnie wyjąć pożywkę ze stożkowej probówki, nie naruszając osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki zabiegowej.
    UWAGA: Pożywka zabiegowa to DMEM wolny od czerwieni fenolowej uzupełniony 5% FBS pozbawionym węgla drzewnego i dekstranu, 2 mM L-glutaminy, 1 nM pirogronianu sodu, 50 j.m./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. Pożywka ta jest niezbędna do eksperymentów stymulacji hormonów steroidowych, ponieważ składnik surowicy jest w dużej mierze pozbawiony sterydów przez węgiel drzewny usuwający pożywkę i ma zmniejszone czynniki wzrostu poprzez dializę.
  5. Wysiewać komórki na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce w ilości od 60 000 do 70 000 komórek na studzienkę w 500 μl pożywki do traktowania. W tym eksperymencie zbieżność komórek powinna wynosić około 70-80% na początku leczenia. Zoptymalizuj gęstość wysiewu komórek w zależności od typu komórki, szybkości wzrostu i długości eksperymentu, aby uniknąć konfluencji, która komplikuje analizę obrazu.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze obrazowanie i analizę obrazu, unikaj zlepiania się komórek. W tym celu należy dokładnie wymieszać porcję komórek, odpipetowując (lub krótko wirując) komórki kilka razy przed dozowaniem do studzienek. Przed umieszczeniem posianych komórek z powrotem w inkubatorze, pozostawienie komórek w kapturze do hodowli tkankowej na około 20 minut pomaga zmniejszyć zlepianie się komórek.
  6. Inkubować komórki przez co najmniej dwa dni przed zabiegami, aby zapewnić synchronizację cyklu komórkowego i redukcję tła z powodu wszelkich cząsteczek sygnałowych, które pozostają w ogołoconej/dializowanej surowicy pożywki wzrostowej.
  7. Po 48-godzinnej inkubacji w pożywce zabiegowej potraktuj komórki MCF-7 10 nM 17β-estradiolem (E2) i kontrolą nośnika (DMSO), rozcieńczonymi w pożywce zabiegowej przez 24 godziny. Leczenie to wykorzystuje nasyconą dawkę E2 w celu wywołania maksymalnej odpowiedzi. Przeprowadzenie eksperymentów w czasie i zależności między dawką a reakcją w celu empirycznego określenia warunków dla różnych docelowych genów, modeli komórkowych i rodzajów leczenia. Jako przykład zobacz naszą ostatnią publikację7.

2. Przygotowanie

  1. Aby przygotować bufor utrwalający, rozcieńczyć oczyszczony, monomeryczny formaldehyd (sprzedawany przez dostawców mikroskopii elektronowej jako 16% paraformaldehydu) do 4% w sterylnym PBS Ca++/Mg++ (sól fizjologiczna buforowana fosforanami plus Ca++ i Mg++). Dodać kompleksy rybonukleozydowe wanadylu (VRC) do buforu utrwalającego, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM, aby opóźnić degradację RNA.
    1. Obliczyć całkowitą ilość bufora utrwalającego w oparciu o zapotrzebowanie na 300-500 μl utrwalacza na studzienkę 24-dołkowej płytki wielodołkowej. Przechowuj 4% formaldehydu na lodzie, aż będzie to wymagane na etapie utrwalania.
      UWAGA: Aktualizuj bufor fiksacji dla każdego eksperymentu.
      UWAGA: Formaldehyd to teratogen, który jest wchłaniany przez skórę. Używaj tej substancji chemicznej w dygestorium wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  2. Na etapie przepuszczalności przygotuj 70% etanol w wodzie wolnej od nukleaz. Alternatywną opcją jest 0,5% Triton-X100 w sterylnym PBS Ca++/Mg++ plus 2 mM VRC. Obliczyć całkowitą ilość potrzebnego buforu przepuszczalności, wykorzystując 500 μl buforu na studzienkę.
  3. Aby przygotować 9 ml buforu hybrydyzacyjnego, dodaj 2 ml podstawowego 50% siarczanu dekstranu i 1 ml 20x buforu SSC (solny cytrynian sodu) do 6 ml wody wolnej od nukleaz. Wirować, aby dokładnie wymieszać bufor hybrydyzacyjny. Bufor ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  4. Istnieje pięć oddzielnych etapów mycia, które wymagają 2x buforu cytrynianu sodu (SSC). Obliczyć końcową objętość potrzebnego buforu 2x SSC, przewidując 500 μl buforu na szkiełko nakrywkowe na etap płukania. Rozcieńczyć wymaganą ilość 20x buforu SSC w wodzie wolnej od nukleaz. Jako dodatkowy środek ostrożności można dodać 2 mM VRC do etapów prania. Bufor ten może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania etapów przetwarzania.

3. Fiksacja dla RNA FISH

  1. Po zabiegu należy usunąć pożywkę ze studzienek i przemyć raz sterylnym, zimnym PBS Ca++/Mg++. Jeśli stosowany jest model komórkowy o niskiej przyczepności, nie należy używać próżni do zasysania cieczy; Użyj pipetowania ręcznego, aby ostrożnie usunąć media z boku studzienki i pominąć początkowy etap mycia. Dodać 500 μl buforu utrwalającego przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Jeśli próbka jest podatna na degradację RNA, do etapu płukania w tym momencie należy użyć sterylnego PBS z 2 mM VRC.
  2. Usuń utrwalacz i wyrzuć go do odpadów chemicznych zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Umyj komórki dwukrotnie zimnym sterylnym PBS Ca++/Mg++ przez 3 minuty.
  3. Usuń PBS i dodaj 500 μl 70% etanolu do każdej studzienki. Uszczelnij płytkę 24-dołkową folią z tworzywa sztucznego pokrytego parafiną. Umieścić na rotatorze w temperaturze 4 °C na co najmniej cztery godziny. Najlepiej pozostawić próbki na noc w 70% etanolu. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane przez okres do tygodnia w 70% etanolu.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować 0,5% Triton-X100 w PBS z roztworem VRC 2 mM. Próbki inkubować w 500 μl tego buforu przepuszczalnego przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. W przypadku korzystania z tego bufora przenikania, protokół nie może zostać wstrzymany w tym momencie i musi być kontynuowany przez etap hybrydyzacji.

4. Hybrydyzacja dla RNA FISH

  1. Usunąć bufor permeabilizacyjny i przemyć jednorazowo w 500 μl 2x buforu SSC plus 10% formamidu przez 5 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
  2. Przygotuj kompletny bufor hybrydyzacyjny. Obliczyć około 30 μl pełnego buforu hybrydyzacyjnego na szkiełko nakrywkowe. Dodaj formamid do buforu hybrydyzacyjnego, aby osiągnąć wymagany procent. Na przykład, jeśli potrzebne jest 500 μl kompletnego buforu hybrydyzacyjnego, to będzie on składał się z 450 μl wcześniej utworzonego buforu hybrydyzacyjnego plus 50 μl formamidu o jakości cząsteczkowej, aby osiągnąć 10% obj./obj. Krótko zawiruj, aby wymieszać.
    UWAGA: Formamid jest teratogenem, który jest wchłaniany przez skórę. Używaj tej substancji chemicznej w dygestorium wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  3. Rozcieńczyć sondy intronu GREB1 (znakowanego Atto 647N) i eksonu GREB1 (znakowanego Quasar 570) w stosunku 1:300 w buforze hybrydyzacyjnym. Wymieszać za pomocą pipetowania. Chroń ten bufor przed światłem i natychmiast zużyj.
    UWAGA: Sondy zostały zaprojektowane i wyprodukowane zgodnie z opisem w Stossi et al7. Sondy są zwykle dostarczane jako wysuszona pula sond oligonukleotydowych, która musi zostać rozpuszczona w buforze TE wolnym od RNAse, zgodnie z protokołem producenta14. Roztwór podstawowy dla tych sond wynosił zatem 12,5 μM; stężenie robocze sond wynosi 42 nM.
  4. Przygotuj komorę nawilżającą na etap hybrydyzacji przez noc. Połóż kawałek folii parafinowej z tworzywa sztucznego, nienaświetloną stroną do góry, na szklanej szalce Petriego oczyszczonej środkiem odkażającym powierzchnię w celu usunięcia RNaz. Nasącz dwa ręczniki papierowe sterylną wodą i umieść je wzdłuż krawędzi szalki Petriego, aby zapewnić wilgotność, ponieważ suszenie może zniszczyć określone etykietowanie.
  5. Podwielokrotność sond należy podzielić, umieszczając 30 μl sond w buforze hybrydyzacyjnym na czystej stronie folii z tworzywa sztucznego parafiny. Rozprowadzić podwielokrotności sond tak, aby szkiełka nakrywkowe nie stykały się ze sobą.
  6. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy delikatnie odwróć szkiełka nakrywkowe stroną do dołu na sondy w szklanej szalce Petriego. Unikaj pęcherzyków powietrza i nie wywieraj nacisku na szkiełka nakrywkowe.
    UWAGA: Nie należy wyrzucać płytki do hodowli tkankowej z buforem 2x SSC, ponieważ będzie ona potrzebna do kolejnych kroków.
  7. Uszczelnij szklaną szalkę Petriego folią parafinową z tworzywa sztucznego i przykryj płytkę folią, aby zapobiec ekspozycji na światło fluorofory. Inkubować przez noc, do 16 godzin, w temperaturze 37 °C na płaskiej, nieobracającej się powierzchni. Czas inkubacji może być różny empirycznie, jednak zalecane są minimum 4 godziny.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są podatne na przesuwanie się podczas inkubacji w buforze hybrydyzacyjnym, co może prowadzić do powstania suchych plam na szkiełku nakrywkowym i uszkodzenia próbki.

5. Przygotowanie próbek do obrazowania

  1. Następnego dnia usuń szkiełka nakrywkowe z komory nawilżania za pomocą kleszczy i umieść je z powrotem na płytce 24-dołkowej komórką do góry. Dodać 500 μl świeżego buforu 2x SSC plus 10% formamidu, aby wypłukać nadmiar sondy i niespecyficzną hybrydyzację.
    UWAGA: Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie 500 μl 2x buforu SSC plus 10% formamidu przez 15 minut każde w temperaturze 37°C na podgrzewanym rotatorze.
  3. Przeciwbarwić DNA za pomocą DAPI w stężeniu 1 μg/ml w buforze 2x SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
  4. Przemyć jeden raz 2x buforem SSC przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą nietwardniejących mediów montażowych po usunięciu nadmiaru bufora 2x SSC ręcznikiem papierowym i szybkim umyciu w wodzie wolnej od nukleaz w celu wyeliminowania nadmiaru soli. Na koniec uszczelnij szkiełka nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci.

6. Mikroskopia o wysokiej rozdzielczości i przetwarzanie obrazów

  1. Zobrazuj próbki pod mikroskopem epifluorescencyjnym o szerokim polu widzenia za pomocą obiektywu olejowego 60x lub 100x i kamery sCMOS. Zapoznaj się z tabelą materiałów dla konkretnego mikroskopu i obiektywu użytego w tym eksperymencie.
    1. Pełne obrazowanie należy wykonać zaraz po pełnym przetworzeniu próbek, aby uniknąć zależnej od czasu degradacji sygnału.
      UWAGA: W tym eksperymencie stosuje się olejek immersyjny o współczynniku załamania światła (RI) 1,516. Należy przeprowadzić badania empiryczne, aby dopasować RI oleju do określonych próbek, ponieważ niedopasowanie RI spowoduje aberracje funkcji rozrzutu punktowego, które wpłyną na dekonwolucję obrazu.
  2. Obrazy są rejestrowane z bocznym rozmiarem piksela 0,10827 μm.
  3. Zoptymalizuj ilość oświetlenia ze źródła światła (tj. procentową przepuszczalność) i czasy ekspozycji dla każdego kanału (filtry DAPI, TRITC, CY5 w tym konkretnym przykładzie) przy użyciu próbki, która ma mieć najwyższą intensywność (tj. kontrole pozytywne). W tym eksperymencie oczekuje się, że próbka potraktowana E2 będzie miała wyższą intensywność dla obu zestawów sond GREB1. Generalnie procentowa transmitancja dla sond intronów i eksonów GREB1 wynosi 50 – 100%, a czasy ekspozycji wahają się od 0,25 – 0,60 sekundy.
  4. Dodatkowo uzyskuj obrazy w warunkach, które pozwalają uniknąć fotowybielania i/lub nasycenia pikseli aparatu. Z naszego doświadczenia wynika, że różnica między tłem a intensywnością sygnału powinna być minimalna ~dziesięciokrotnie. Nasycenie kilku pikseli/pole może wystąpić z powodu niespecyficznych sygnałów w próbce (tj. brud na szkiełku nakrywkowym, agregacje sondy na zewnątrz komórki), które mogą być dopuszczalne, ale tylko wtedy, gdy nasycone obszary nie są uwzględnione w ocenie ilościowej.
  5. Aby ustawić akwizycję stosu z, skoncentruj się na próbce w kanale DAPI. Wybierz górną i dolną część stosu z w odległościach, w których jądra barwione DAPI stają się nieostre. Zastosowany przez nas rozmiar kroku z-stack wynosi 0,25 μm na plasterek, a całkowity z-stack powinien obejmować całą komórkę (około 10 μm w komórkach MCF-7). Jednak rozmiar kroku stosu z będzie się zmieniał w zależności od użytego celu i powinien być zgodny z kryterium próbkowania Nyquista.
    UWAGA: Introny są zwykle obecne tylko w jądrze; Jednak eksony znajdują się zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. W związku z tym ustawienie stosu z zgodnie z powyższym opisem spowoduje przechwycenie większości etykietowania intronów i eksonów, ponieważ stos z obejmuje całą komórkę.
  6. Zazwyczaj obrazuje się co najmniej 200 komórek do analizy ilościowej we wstępnych eksperymentach, aby uchwycić migawkę wielkości odpowiedzi i zmienności między komórkami.
  7. Niektóre zobrazowane komórki są wykluczone z końcowej analizy (tj. współczynnika rezygnacji), ponieważ zostaną odfiltrowane przez potok analizy (tj. komórki dotykające granicy obrazu, komórki apoptotyczne/mitotyczne).
    UWAGA: Podczas wybierania obszarów obrazu należy pamiętać o kilku czynnikach. Wybierz obszary z równomiernie rozłożonymi, nienakładającymi się komórkami, zgodnie z definicją fluorescencji jądrowej znakowanej DAPI. Dodatkowo staraj się wybierać obszary, które mają najmniejszą liczbę jąder wzdłuż krawędzi obszaru obrazu, aby uniknąć zliczania częściowych komórek. Zautomatyzowane, bezstronne obrazowanie jest zawsze preferowane w przypadku eksperymentów wymagających analizy statystycznej.
  8. Po akwizycji zdekonwolucjonuj obrazy za pomocą agresywnego algorytmu odtwórczego przy użyciu 10 cykli (tj. liczby iteracji). Generuj projekcje o maksymalnej intensywności do analizy obrazu (pomiń ten krok, jeśli wymagana jest konkretna analiza 3D). Zapisz wszystkie obrazy projekcyjne zgodnie z głębią bitową używanej kamery; w naszym przypadku zostały zapisane 16-bitowe obrazy w skali szarości TIFF. Obrazy RGB mają zmniejszoną głębię bitową, co powoduje utratę informacji; dlatego obrazy RGB nie nadają się do analizy obrazu.

7. Analiza obrazu

  1. Przeczytaj instrukcje i pobierz jupyter notebook z usługi GitHub (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Zainstaluj dystrybucję anakondy języka Python (https://www.anaconda.com/distribution/) w wersji 3.6 lub nowszej.
  3. Otwórz wiersz polecenia anakondy i wpisz polecenie instalacji, aby zainstalować Simple ITK dla anakondy (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Otwórz nawigatora anakondy i uruchom notatnik jupyter. Otworzy się przeglądarka internetowa pokazująca katalogi i pliki. Przejrzyj struktury katalogów, aby uzyskać dostęp do katalogu zawierającego pobrany notes jupyter z usługi GitHub.
  5. Otwórz notes i uruchom każdą komórkę, naciskając jednocześnie Shift i Enter.
  6. Postępuj zgodnie ze szczegółami każdej funkcji i kroku podanymi w notesie. W przypadku innego zestawu obrazów może być konieczna zmiana niektórych wartości parametrów.
    UWAGA: W skrócie, jądra są segmentowane od kanału DAPI za pomocą lokalnego progowania o rozmiarze bloku 251 pikseli, zostały wypełnione, a obiekty mniejsze niż 100 pikseli usunięte. Stykające się jądra zostały rozdzielone za pomocą algorytmu przełomowego. Maska jądrowa została następnie rozszerzona o 100 pikseli, a dział wodny został użyty do oddzielenia dotykających się obiektów, używając jąder jako basenów. Aby zidentyfikować RNA w stanie stacjonarnym (eksony), zastosowano progowanie Otsu; dla aktywnych alleli transkrypcyjnych (intron) najpierw zastosowano rozmycie Gaussa (sigma = 1), a następnie zastosowano próg maksymalnej entropii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować reakcje hormonalne za pomocą smFISH, jako przykład, wybraliśmy model receptora estrogenowego (ER) używany w testach o wysokiej przepustowości do określenia obecności substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną w katastrofach środowiskowych w kontekście udziału w programie badawczym NIEHS Superfund7. W tym eksperymencie przylegające komórki raka piersi MCF-7 leczono agonistą ER 17β-estradiolem (E2, 10 nM) lub nośnikiem (DMSO) przez 24 godziny. Zestawy sond separowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metodologia smFISH opiera się na wcześniej opublikowanych protokołach 7,12,14. W tym protokole wyjaśniamy krytyczne kroki, które zostały zoptymalizowane od mokrego laboratorium (w tym gęstość wysiewu, czas utrwalania, przepuszczalność i stężenie w sondzie), po obrazowanie i analizę obrazu, zapewniając pełny potok eksperymentalny dla laboratoriów zainteresowanych przeprowadzeniem analizy transkrypcji genów w pojedynczych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM, FS i MGM są finansowane przez NIEHS (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM i PKS są wspierane przez finansowane przez CPRIT Centrum Zaawansowanej Mikroskopii i Informatyki Obrazowej GCC (RP170719). Obrazowanie jest również wspierane przez Integrated Microscopy Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (DK56338 i CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center i John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
17 i beta; EstradiolSigma-AldrichE2257Numer CAS 50-28-2
Bufor Ambion SSC (20X), bez rnazyThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM z L-glutaminą i 4,5 g/l glukozyFisher ScientificMT10017CVwyprodukowany przez Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Bez pirogronianu sodu
Siarczan dekstranu, 50% roztwór sterylnySigma-Aldrich3730-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco Ca++/Mg++Corning21030CVProdukowane przez Calbiochem
Etanol, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture PlateCorning353047wyprodukowany przez Decon
Laboratories Płod Surowica bydlęca (FBS), 500 mlFisher Scientific50-753-2978Wyprodukowane przez Gemini Bio Products
GE Healthcare Mikroskop dekonwolucyjny DeltaVision LIVE o wysokiej rozdzielczościGE Healthcare
Woda hyklonowa, klasa biologii molekularnejOlejek immersyjny Fisher ScientificSH3053802
1.516GE Healthcare Nauki przyrodnicze29162940Wyprodukowane przez GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005ClWyprodukowany przez Corning
MCF-7 cellsATCCHTB-22
Molekularny formamidPromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObiektywOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Dystrybuowany przez VWR
Paraformaldehyd, 16% roztwór,mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences15710
Roztwór penicyny i streptomycynyFisher ScientificMT3001Clwyprodukowany przez Corning
Kompleks rybonukleozydu wanadyluVWR101229-716Wyprodukowano przez New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
Pirogronian sodu, 100 mMFisher Scientific11-360-070Wyprodukowane przez Gibco
Thermo Scientific Szkiełka nakrywkowe, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mlFisher ScientificBP151-100Wyprodukowane przez Fisher BioReagents
Roztwór trypsyny-EDTA 0,25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu 10 mlFisher ScientificNC9265087wyprodukowane przez Vector Laboratories

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNAsondy intronowo eksonowe GREB1traktowanie agonist receptora estrogenowegoszerokopolowa mikroskopia epifluorescencyjnapotok analizy obrazukontrastowanie DAPIp ukanie wod woln od nukleaz

Powiązane artykuły