Artykuł metodologiczny

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61685

⸱

13 marca 2021

 ,  , 
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

W tym artykule

Podsumowanie

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Streszczenie

Zastosowanie krystalografii makromolekularnej neutronów (NMX) szybko się rozwija, a większość struktur została określona w ciągu ostatniej dekady, dzięki nowym liniom badawczym NMX, które zostały zbudowane, oraz zwiększonej dostępności oprogramowania do udoskonalania struktur. Jednak źródła neutronów dostępne obecnie dla NMX są znacznie słabsze niż równoważne źródła krystalografii rentgenowskiej. Pomimo postępów w tej dziedzinie, do badań dyfrakcji neutronów zawsze będą potrzebne znacznie większe kryształy, szczególnie z tendencją do badania coraz większych makrocząsteczek i kompleksów. Dalsze ulepszenia metod i oprzyrządowania dostosowanego do hodowli większych kryształów są zatem konieczne, aby zastosowanie NMX mogło się rozwijać.

W tej pracy wprowadzamy racjonalne strategie i stół do wzrostu kryształów (OptiCrys) opracowany w naszym laboratorium, który łączy obserwację w czasie rzeczywistym za pomocą kamery wideo zamontowanej pod mikroskopem z precyzyjną automatyczną kontrolą roztworów krystalizacyjnych (np. stężenie strącacza, pH, dodatek, temperatura). Następnie pokazujemy, w jaki sposób ta kontrola temperatury i składu chemicznego ułatwia poszukiwanie optymalnych warunków krystalizacji przy użyciu modelowych białek rozpuszczalnych. Dokładna znajomość diagramu faz krystalizacji ma kluczowe znaczenie dla wyboru pozycji wyjściowej i ścieżki kinetycznej dla każdego eksperymentu krystalizacji. Pokazujemy, w jaki sposób racjonalne podejście może kontrolować wielkość i liczbę generowanych kryształów w oparciu o znajomość wielowymiarowych diagramów fazowych.

Wprowadzenie

Zrozumienie zależności między strukturą a funkcją białek i mechanizmu szlaków fizjologicznych często opiera się na znajomości pozycji atomów wodoru (H) i sposobu przenoszenia ładunku w obrębie białka1,2. Ponieważ atomy wodoru słabo rozpraszają promieniowanie rentgenowskie, ich położenie można określić tylko za pomocą danych dyfrakcji rentgenowskiej o bardzo wysokiej rozdzielczości (>1 A)3,4. I odwrotnie, krystalografia neutronów może być wykorzystana do uzyskania dokładnego położenia atomów wodoru w makrocząsteczkach biologicznych, ponieważ atomy wodoru i deuteru (H2, izotop wodoru) mają długości rozpraszania mniej więcej równe wielkości tlenu, azotu i węgla5. Jednak strumień neutronów z dostępnych źródeł neutronów jest słabszy niż z wiązek promieniowania rentgenowskiego, więc często musi być kompensowany dla2,3. Można to osiągnąć poprzez wymianę H naH2 i/lub zwiększenie objętości kryształów w celu zmniejszenia niespójnego rozpraszania wodorów i zwiększenia stosunku sygnału do szumu obrazów dyfrakcyjnych.

Istnieją różne podejścia do krystalizacji (odpowiedni schematyczny diagram fazowy jest pokazany w Rysunek 1) do uzyskiwania dużych i wysokiej jakości kryształów zarówno dla rentgenowskiej, jak i neutronowej krystalografii bio-makromolekularnej6. W dyfuzji pary kropelka przygotowana z mieszaniny białka i roztworu krystalizacyjnego jest równoważona w czasie, poprzez odparowanie wody lub innych lotnych substancji, w zbiorniku zawierającym wyższe stężenie środka strącającego tego samego roztworu krystalizacyjnego. Wzrost stężenia białka i środka strącającego w kropelce prowadzi do przesycenia wymaganego do spontanicznego zarodkowania, po którym następuje wzrost kryształów w tych jądrach6,7. Chociaż dyfuzja pary wodnej jest najczęściej stosowaną techniką hodowli kryształów4, procesu krystalizacji nie można precyzyjnie kontrolować8. W metodzie dyfuzji swobodnej granicy faz roztwór krystalizacyjny dyfunduje do stężonego roztworu białkowego, bardzo powoli kierując układ w kierunku przesycenia. Tę metodę można uznać za metodę wsadową z powolnym tempem mieszania6,9,10,11,12. W metodzie wsadowej białko jest szybko mieszane z roztworem krystalizacyjnym, co prowadzi do szybkiego przesycenia, a co za tym idzie równomiernego zarodkowania z wieloma kryształami3,7. Metoda ta stanowi około jednej trzeciej wszystkich struktur zdeponowanych obecnie w Banku Danych o Białkach. Metoda dializy jest również stosowana do hodowli wysokiej jakości i dobrze dyfrakcyjnych kryształów białkowych. W metodzie dializy cząsteczki środka strącającego dyfundują ze zbiornika przez półprzepuszczalną membranę do oddzielnej komory z roztworem białka. Kinetyka równowagi zależy od różnych czynników, takich jak temperatura, wielkość porów błony oraz objętość i stężenie próbek białek i czynników krystalizacji6.

Diagramy faz krystalizacji mogą być używane do opisywania różnych stanów białka w funkcji różnych zmiennych fizycznych lub chemicznych3. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, każdą technikę krystalizacji można zobrazować jako wykorzystującą inną trajektorię kinetyczną, aby dotrzeć do stref zarodkowania i metastabilności takiego diagramu6,10,13. Dostarcza to informacji o rozpuszczalności białek i stężeniu białka, przy którym obserwuje się równowagę termodynamiczną między kryształem a roztworem, znajdując w ten sposób optymalne warunki do zarodkowania i wzrostu3,14. Na dwuwymiarowym diagramie fazowym stężenie białka jest wykreślane jako funkcja jednej zmiennej, a pozostałe zmienne są utrzymywane na stałym poziomie15. Na takim diagramie fazowym, gdy stężenie białka jest poniżej krzywej rozpuszczalności, roztwór znajduje się w obszarze nienasyconym i nie zachodzi zarodkowanie ani wzrost kryształów. Powyżej tej krzywej znajduje się strefa przesycenia, w której stężenie białka jest wyższe niż granica rozpuszczalności3,14. Jest ona dalej podzielona na trzy regiony: strefę metastabilną, strefę spontanicznego zarodkowania i strefę opadów. W strefie metastabilnej przesycenie nie jest wystarczające, aby zarodkowanie nastąpiło w rozsądnym czasie, ale może nastąpić wzrost zaszczepionych kryształów. Agregacja i opady są preferowane w strefie opadów, gdzie przesycenie jest zbyt wysokie14,15.

Gdy zostanie osiągnięte wystarczające przesycenie do spontanicznego zarodkowania, pojawią się pierwsze jądra10. Wzrost kryształów prowadzi do zmniejszenia stężenia białka aż do osiągnięcia granicy rozpuszczalności. Dopóki przesycenie pozostaje w pobliżu krzywej rozpuszczalności, nie będzie znaczącej zmiany wielkości kryształów. Wykazano jednak, że zmiany temperatury i składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego (na przykład stężenie środka strącającego) wpływają na rozpuszczalność białek i mogą prowadzić do zainicjowania dalszego wzrostu kryształów8,13,16.

Ponieważ dializa jest korzystna dla wzrostu kryształów dobrej jakości, stanowisko do krystalizacji OptiCrys zilustrowane w Rysunek 2, zostało zaprojektowane i opracowane w naszym laboratorium w celu kontrolowania krystalizacji w sposób w pełni zautomatyzowany8. W tym celu zostało napisane oprogramowanie z LabVIEW, które umożliwia kontrolę i monitorowanie temperatury zestawu do dializy w zbiorniku przepływowym w kontakcie z elementami Peltiera, za pośrednictwem sterownika elektronicznego i agregatu chłodniczego. To samo oprogramowanie automatycznie reguluje również skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego (na przykład wymianę środków krystalizacyjnych) za pomocą wielokanałowego systemu fluidycznego. Dodatkowo kamera cyfrowa i mikroskop odwrócony służą do wizualizacji i rejestracji procesu krystalizacji. Dostępne są dwie komory krystaliczne o objętości 15 μl i 250 μl do hodowli kryształów do różnych celów. Ponieważ proces krystalizacji jest odwracalny, badanie przesiewowe pod kątem różnych warunków jest możliwe przy użyciu zaledwie kilku mikrolitrów roztworu białkowego, o ile próbka nie jest uszkodzona8. W rezultacie, zastosowanie tej metody minimalizuje ilość użytego materiału białkowego.

Z poprzednich prac8, jest oczywiste, że podczas procesu wzrostu kryształów, obserwacje in situ muszą być przeprowadzane w regularnych odstępach czasu. Mogą one trwać od kilku sekund do kilku dni, w zależności od obserwowanego zdarzenia (opady, zarodkowanie lub wzrost kryształów).

Optymalizacja wzrostu kryształów za pomocą OptiCrys opiera się na wykresach fazowych stężenia temperatury-strącacza. W przypadku białek, których rozpuszczalność jest bezpośrednią funkcją temperatury, możliwe jest zastosowanie reżimu wysalania18. W tym miejscu zwiększenie siły jonowej roztworu, którą można uwidocznić za pomocą diagramów faz strącających białko, zmniejsza rozpuszczalność białka. Podobnie, białka o odwrotnej rozpuszczalności mogą korzystać z reżimu solenia18. Zarodkowanie zachodzi w strefie zarodkowania, w pobliżu strefy metastabilnej, a wzrost kryształów odbywa się następnie w strefie metastabilnej diagramu fazowego, aż stężenie białka osiągnie granicę rozpuszczalności. Jak pokazano na Rysunek 3A, przy stałym składzie chemicznym temperatura może zostać obniżona, aby utrzymać roztwór krystalizacyjny w strefie metastabilnej, aby zapobiec nowemu zarodkowaniu. Kryształy rosną do momentu osiągnięcia drugiej równowagi kryształ/roztwór, a następnie nie obserwuje się dalszego wzrostu wielkości kryształów. Temperaturę obniża się kilkakrotnie, aż kryształy osiągną pożądany rozmiar. W Rysunek 3B, przy stałej temperaturze, zwiększanie stężenia środka strącającego utrzymuje roztwór w strefie metastabilnej. Proces ten można następnie powtórzyć kilka razy, aby uzyskać duże kryształy. Zmiana temperatury i manipulowanie warunkami roztworu krystalizacyjnego, poprzez kontrolowanie poziomów przesycenia, to dwa potężne narzędzia do rozdzielania zarodkowania i wzrostu kryształów, które są precyzyjnie i automatycznie kontrolowane przez OptiCrys5,8,14.

Przykłady kryształów białek wyhodowanych przez kontrolowaną temperaturę lub kontrolowaną temperaturę i stężenie opadów krystalizacji, jak również uzyskane dane dotyczące dyfrakcji względnej są dostępne w literaturze i PDB. Wśród nich są ludzka γ-krystalina E, PA-IIL lektyna, drożdżowa nieorganiczna pirofosfataza, oksydaza moczanowa, ludzka anhydraza węglanowa II, kinaza YchB i dehydrogenaza mleczanowa5,14,17,18.

Chociaż OptiCrys został skomercjalizowany przez NatX-ray, istnieje wiele laboratoriów, które nie mają dostępu do tego instrumentu ani do oferowanego przez niego podejścia seryjnego. Alternatywą dla tej techniki jest użycie dostępnych na rynku plastikowych przycisków do mikrodializy o różnych pojemnościach. Za ich pomocą można ręcznie regulować i zmieniać temperaturę i skład chemiczny. Kontrola przycisków do mikrodializy nie może być wykonana in situ i musi być wykonana ręcznie za pomocą mikroskopu optycznego. Kontrolę temperatury można osiągnąć, przechowując próbkę w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą bez wibracji. Niezbędne jest utrzymanie stałej temperatury, aby zapewnić powtarzalność eksperymentów z krystalizacją. Znaczne wahania temperatury mogą również prowadzić do uszkodzenia lub zniszczenia kryształów5.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół opisujący przygotowanie próbki i użycie oprogramowania kontrolnego do wzrostu dużych, wysokiej jakości kryształów odpowiednich do krystalografii białek neutronowych. Ta procedura krok po kroku została zaprojektowana tak, aby wykorzystać diagram faz krystalizacji w celu wybrania pozycji wyjściowej i ścieżki kinetycznej w celu kontrolowania wielkości i jakości generowanych kryształów. Dodatkowo przedstawiono szczegółowy protokół hodowli kryształów za pomocą przycisków do mikrodializy, który wykorzystuje te same przesłanki do uzyskania dużych, wysokiej jakości kryształów.

Protokół

1. Metoda dializy z przyciskami mikrodializy

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przygotować roztwór białkowy, rozpuszczając 30 mg lizozymu białka jaja kurzego w postaci liofilizowanego proszku w 1 ml buforu CH3COONa (100 mM octanu sodu, pH 4) w celu otrzymania roztworu o końcowym stężeniu 30 mg·mL-1.
    2. Odwirować próbkę o masie 13 000 × g przez 10 minut w temperaturze 277 K. Proces ten pomaga usunąć wszelkie agregaty przed rozpoczęciem procesu krystalizacji.
    3. Sprawdzić absorbancję próbki przy długości fali 280 nm i obliczyć stężenie białka, stosując równanie Beera-Lamberta (A = εcl).
      UWAGA: Zgodnie z równaniem Beera-Lamberta, absorbancja elektronowa (A) jest wprost proporcjonalna do stężenia (c, mg·mL-1) substancji absorbującej przy stałej długości ścieżki optycznej (l, cm). Gradientem tej liniowej zależności jest molowy współczynnik ekstynkcji (ε, dla lizozymu przy 280 nm wynosi 2,64 mL·mg−1·cm−1)19. Łańcuchy boczne aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan i fenyloalanina) oraz wiązania dwusiarczkowe między resztą cysteiny mają silną absorbancję przy ~280 nm wynikającą z dozwolonych spektroskopowo przejść π – π*. Ponieważ większość białek zawiera te reszty, stężenie białka można zazwyczaj łatwo obliczyć, mierząc absorbancję przy 280 nm, biorąc pod uwagę wiedzę na temat współczynnika ekstynkcji.
    4. Przygotuj roztwory krystalizacyjne, jak pokazano na Rysunek 4. Przefiltruj wszystkie roztwory podstawowe za pomocą filtrów miliporowych 0,22 μm przed przygotowaniem roztworu krystalizacyjnego.
  2. Wzrost kryształów
    1. Przeciąć celulozową membranę dializacyjną o odpowiedniej masie cząsteczkowej (6-8 kDa) i zanurzyć ją w wodzie destylowanej.
      UWAGA: Krążki membranowe do dializy są dostępne w handlu dla przycisków do mikrodializy, ale jeśli używany jest przewód do dializy, nie zapomnij przyciąć krawędzi w celu oddzielenia dwóch warstw membrany od rurki, aby mieć tylko membrany jednowarstwowe.
    2. Napełnij studzienki 24-dołkowej tacy 2 ml roztworu krystalizacyjnego w tej samej kolejności, jak pokazano na Rysunek 4.
      UWAGA: Jeśli używane są przyciski o większych objętościach (np. 200 μl), należy napełnić probówki o pojemności 50 ml roztworem krystalizacyjnym o stężeniu co najmniej 5 ml, aby zapewnić wydajną wymianę.
    3. Dodaj/odpipetuj 35 μl roztworu lizozymu do komory przycisku do mikrodializy, jak pokazano na rysunku Rysunek 5A.
      UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w zamkniętym przycisku do dializy o pojemności 30 μl, należy dodać dodatkową objętość (objętość martwą) 5 μl dodatkowego białka, co oznacza łącznie 35 μl próbki białka. Ta dodatkowa próbka białka tworzy lekko wypukły kształt na górze komory, jak pokazano na Rysunek 5B, co zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
    4. Weź aplikator o odpowiednim rozmiarze i umieść elastyczny O-ring na jego końcu (Rysunek 5C). Następnie umieścić membranę, uprzednio lekko przetartą/osuszoną za pomocą kawałka papieru bez włókien, na komorze przycisku do dializy. Uważaj, aby nie wsypać kurzu do komory podczas nakładania papieru. Ustawić membranę dializacyjną na miejscu, przenosząc elastyczny O-ring z aplikatora do rowka przycisku do dializy (Rysunek 5C).
      UWAGA: Krytycznym momentem obsługi jest zamocowanie membrany dializacyjnej na górze komory dializacyjnej poprzez przeniesienie elastycznego O-ringu z aplikatora do rowka przycisku dializy. Wszystkie ruchy muszą być idealnie zsynchronizowane, aby uniknąć zamykania pęcherzyków powietrza z próbką w komorze białkowej. Warto poćwiczyć rozciąganie elastycznego O-ringu przed jego nałożeniem, aby poznać jego sztywność, użyć pęsety do przytrzymania części membrany podczas jej aplikacji i przeprowadzić pierwsze eksperymenty testowe z białkiem modelowym.
    5. Przenieś przycisk do studzienki lub do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pęsety (Rysunek 5D).
    6. Przykryj studzienkę szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie dociskając je do smaru, aby uszczelnić studzienkę (Rysunek 5E).
      UWAGA: Jeśli na wierzchu studzienek nie ma tłuszczu, należy go dodać przed rozpoczęciem eksperymentu lub użyć kawałka taśmy zamiast szklanego szkiełka nakrywkowego. Zasada krystalizacji białek za pomocą przycisków do mikrodializy jest zilustrowana na Rysunek 5.
    7. Przechowywać próbkę w temperaturze 293 K w inkubatorze termoregulowanym. W zależności od zastosowanych warunków białka i krystalizacji mogą być konieczne różne temperatury.
      UWAGA: Ta sama siatka warunków krystalizacji pokazana w Rysunek 4 (pozwalający na zmianę stężenia strącacza) może być przesiewana w funkcji temperatury. W takim przypadku ta sama płytka krystalizacyjna musi zostać odtworzona, a każda kopia musi zostać umieszczona w inkubatorze regulowanym w innej temperaturze. Wymaga to posiadania do dyspozycji kilku inkubatorów termoregulowanych bez wibracji.
    8. Sprawdź tacę lub probówki pod kątem kryształów (Rysunek 4) i rób notatki regularnie, zazwyczaj codziennie, aby rozróżnić, co jest w każdej tacy. Dobre notatki są niezbędne, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich i odróżnić kurz od kryształów.

2. Proces wzrostu kryształów za pomocą OptiCrys

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przygotować roztwór białkowy i błonę dializacyjną zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
    2. Przygotować roztwory podstawowe NaCl (4 M) i CH3COONa pH 4 (1 M) i przefiltrować je do probówek o pojemności 50 ml.
    3. Dodać roztwór białka (15 μl lizozymu z 30 mg·mL-1) do komory dializacyjnej zestawu do dializy z przepływowym zbiornikiem o kontrolowanej temperaturze. Patrz Rysunek 6, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji dializ z przepływowym zbiornikiem o kontrolowanej temperaturze. OptiCrys posiada dwie komory dializacyjne, minimalna objętość to 15 μL, a maksymalna to 250 μL.
    4. Przykryj komorę nadkomorową membraną do dializy i przymocuj membranę za pomocą elastycznego O-ringu (Rysunek 6B).
      UWAGA: Ta konfiguracja różni się od przycisków do mikrodializy, w których każda komora jest uszczelniona bezpośrednio membraną do dializy. W komorze przepływowej membrana dializy jest zamiast tego przymocowana do komory nadmiernej, co umożliwia montaż kryształów bez jej usuwania. W tym celu nadkomorę można po prostu odkręcić od zbiornika.
    5. Odwróć komorę nadmierną i umieść ją na górze komory dializy. Powoli i delikatnie dociśnij go, aby usunąć całe powietrze uwięzione między dwoma częściami i uniknąć pęcherzyków w komorze (Rysunek 6C). Praktyka z białkiem modelowym może być korzystna podczas treningu, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i utraty próbki.
    6. Zamocuj zbiornik na swojej pozycji, delikatnie przykręcając go do górnej części komory, ponownie uważając, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Zbyt mocne dokręcenie zbiornika może również spowodować powstawanie pęcherzyków w komorze krystalizacji (Rysunek 6D).
    7. Dodaj roztwór krystalizacyjny i przykryj komorę zbiornika hermetyczną nakrętką. (Rysunek 6G). Maksymalna objętość zbiornika wynosi 1 ml.
    8. Przenieś ten zespół i włóż go do mosiężnego wspornika. Podpora ta styka się z elementami Peltiera, które służą do kontroli temperatury.
    9. Jak pokazano na rysunku Rysunek 6, hermetyczna nasadka jest wyposażona w okienko optyczne, które umożliwia oświetlenie górnej części komory dializy. Umieść źródło światła (Rysunek 2) na oknie, aby światło mogło przejść przez komorę.
    10. Komora zbiornika może być podłączona do pompy, aby mogła działać jako komórka o ciągłym przepływie. Podłącz rurkę na górze probówek o pojemności 50 ml, które zawierają roztwory podstawowe i wodę destylowaną, do zaworu obrotowego, jak pokazano na Rysunek 7.
      UWAGA: Jeśli automatyczne przygotowanie i zmiana roztworów krystalizacyjnych nie są pożądane podczas eksperymentu, należy pominąć krok 2.1.10. W takim przypadku należy przygotować roztwór krystalizacyjny i ręcznie napełnić zbiornik.
  2. oprogramowanie
    1. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie Croissance cristalline [Crystal growth]. To oprogramowanie sterujące jest napisane za pomocą LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) i oferuje przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny. Zawiera 4 różne interfejsy graficzne (Accueil [Witamy], Paramétrage [Ustawienia], Essai [Test] i Konserwacja [Konserwacja]) (Rysunek 8).
      UWAGA: Tłumaczenia z języka francuskiego podano w nawiasach.
    2. Wybierz widok Konserwacja, klikając przycisk, jak pokazano na rysunku Rysunek 8. Ten widok jest obecnie najczęściej używany i pozwala użytkownikom kontrolować większość parametrów podczas eksperymentu.
      UWAGA: Po kliknięciu w widok Maintenance pojawi się nowe okno z różnymi sekcjami do sterowania parametrami takimi jak temperatura czy światło. W Rysunek 8 różne części tego widoku są pokazane za pomocą strzałek i ramek. W poniższych krokach pokażemy, w jaki sposób każdy parametr jest kontrolowany za pomocą oprogramowania.
    3. Sekcja Régulateur de température [Regulator temperatury] umożliwia kontrolę i monitorowanie temperatury. Kliknij na przycisk numer jeden (1) w Rysunek 8, aby go włączyć.
      UWAGA: Zakres temperatur w OptiCrys wynosi 233.0 – 353.0 ± 0.1 K.
    4. Ustaw temperaturę w sekcji odbiorcy [wartość zadana] i naciśnij enter ( Rysunek 8(2)). Pod tym przyciskiem znajduje się wykres z 2 śladami (czerwonym i żółtym). Czerwony ślad pokazuje temperaturę końcową (zamówioną), a żółty ślad pokazuje aktualną temperaturę. Jak pokazano na Rysunek 8(2), temperatura jest ustawiona na 20 °C.
      UWAGA: Aby wyhodować kryształ, jak wyjaśniono w sekcji dotyczącej wzrostu kryształów, należy wybrać wiele temperatur. Aby zmienić temperaturę, dodaj każdą nową temperaturę w sekcji odbiorcy [wartość zadana] i naciśnij przycisk Enter na klawiaturze.
    5. Włącz światło, zwiększając jasność z sekcji Lumières [Światła] w Rysunek 8. Zakresy jasności od 0 do 100, "0" oznacza, że światło jest wyłączone, a przy "100" światło jest ustawione na maksymalną intensywność i jasność. Zwiększając światło, w sekcji Mikroskopu, można zajrzeć do wnętrza komory dializowej. Podczas eksperymentu jasność w komórce może się zmieniać; Dostosuj parametry, aby uzyskać wyraźną wizualizację wnętrza komory dializowej. Powiększenie można również zwiększyć lub zmniejszyć za pomocą przycisków + i – przed "zoomem", aby uzyskać lepszy viewing.
    6. Po prawej stronie sekcji Mikroskop znajduje się kilka sekcji do przechowywania istotnych informacji dla każdego eksperymentu krystalizacji. Każdy użytkownik może utworzyć folder do przechowywania informacji o warunkach krystalizacji, nazwach białek i odcięciu masy cząsteczkowej użytej membrany do dializy (Rysunek 8(3)).
    7. Użytkownik może zdefiniować nazwę eksperymentu, po prostu wpisując ją w Nom Dossier [nazwa folderu]. Kliknięcie na przycisk Dossier [Folder] (pokazany z zieloną ramką w Rysunek 8) otwiera nowe okno. W tym oknie pojawi się plik tekstowy, który zawiera wszystkie informacje zdefiniowane dla eksperymentu. Ponadto obrazy ze znacznikiem czasu są zapisywane w tym folderze do przyszłego przetwarzania.
    8. W sekcji NB Images (Obrazy NB) wybierz liczbę zdjęć, które mają zostać wykonane w trakcie eksperymentu. Określ liczbę obrazów w panelu po prawej stronie wraz z żądanym odstępem czasu między nimi (np. min, godzina, dzień). Rysunek 8 pokazuje konfigurację oprogramowania do rejestrowania zerowych obrazów w ciągu minuty.
      UWAGA: Użyj sekcji Pompe [Pompa] do mieszania roztworów podstawowych i wstrzykiwania roztworu krystalizacyjnego do komory zbiornika. Zobacz sekcję 2.1.10 i Rysunek 7, aby wyjaśnić zasadę działania systemu mieszania płynów.
    9. Stężenia wejściowe roztworów podstawowych w Etape 1 [Krok 1]: zapasy roztworów. Do eksperymentu z krystalizacją w następnej sekcji zostaną użyte NaCl 4 M i CH3COONa 1 M pH 4.
      UWAGA: Stężenia roztworów podstawowych podane są w jednostkach molowych.
    10. Określ końcowe stężenie każdego roztworu. Na przykład 0,75 M dla NaCl i 0,1 M dlaCH3, COONa, pH 4. Wprowadź je do końcowej sekcji stężenia (Rysunek 8) w Etape 2 [Krok 2]: roztwór à préparer [roztwór do przygotowania]. Naciśnij przycisk Oblicz [obliczenia], który jest pokazany czerwoną ramką w Rysunek 8. Ostateczna objętość każdego roztworu podstawowego, który zostanie użyty do mieszania, zostanie wyświetlona w panelu objętości przed każdym panelem stężenia.
    11. Naciśnij przycisk Lancer préparation [Przygotowanie do startu] (Rysunek 8). Jak pokazano na rysunku Rysunek 7, zawór obrotowy pobiera każdy roztwór podstawowy i wstrzykuje go do rurki mieszającej za pomocą przełącznika.
    12. Po przygotowaniu roztworu krystalizacyjnego kliknij na przycisk Entrée solution [Wprowadzenie roztworu] w Etapie 3 [Krok 3]: Strumień sekcji pompy (żółta ramka w Rysunek 8). Przełącznik zmienia się, aby wstrzyknąć nowy roztwór krystalizacyjny z rurki mieszającej do komory zbiornika. Aby zatrzymać proces wymiany, naciśnij przycisk Arrêt distribution [Zatrzymanie dystrybucji].
      UWAGA: Obserwuj proces krystalizacji podczas eksperymentu i modyfikuj parametry, takie jak temperatura, roztwór krystalizacyjny i powiększenie, w odpowiednim interfejsie graficznym oprogramowania nadzorującego. Korzystając z oprogramowania, nie ma potrzeby zdejmowania hermetycznej nasadki ani komory przepływowej podczas eksperymentu, więc jedyną zmienną będzie ta, którą użytkownik zmienia za pomocą oprogramowania.
  3. Duży przyrost kryształów
    1. Dodać 15 μl lizozymu o stężeniu 30 mg·mL-1 do komory dializacyjnej (Rysunek 6A).
      UWAGA: Przygotować próbkę białka zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
    2. Zmontuj zestaw do dializy w zbiorniku przepływowym z kontrolowaną temperaturą, jak opisano w sekcji 2.1 i Rysunek 6.
    3. Przygotować roztwór krystalizujący. Nie zapomnij przefiltrować wszystkich roztworów podstawowych przed przygotowaniem próbki za pomocą filtrów 0,22 μm. W tym eksperymencie roztwór krystalizacyjny zawiera 0,75 M NaCl i 0,1 MCH3COONa pH 4. Można to dodać ręcznie lub za pomocą komory zbiornika i układu pompowania, jak opisano w sekcjach 2.2.10 do 2.2.12.
    4. Ustawić temperaturę na 295 K, jak wyjaśniono w sekcjach 2.2.3 i 2.2.4 i pokazano na rysunku 8. W warunkach początkowych równowaga między komorą dializacyjną a zbiornikiem zostanie osiągnięta po około 90 minutach, a pierwsze widoczne jądra pojawią się po 22 godzinach.
    5. Pozwól kryształom rosnąć, dopóki nie zaobserwuje się już widocznych zmian w rozmiarze kryształów (Rysunek 9, panel 1).
      UWAGA: Aby określić czas zarodkowania i zmierzyć zmiany wielkości kryształów, zapisuj obrazy co 15 lub 20 minut, co daje odpowiednio 4 lub 3 obrazy na godzinę w sekcji Obrazy NB. Do obserwacji in situ denaturacji, agregacji i wytrącania białek lub rozpuszczania kryształów lub zarodkowania wymagane jest zwykle od kilku sekund do kilkudziesięciu minut. Jednak w przypadku wzrostu kryształów zakres ten wynosi od kilku minut do kilku godzin.
    6. Po trzech dniach obniż temperaturę do 291 K, aby wznowić wzrost kryształów. Utrzymuj stałą temperaturę i pozwól kryształowi się rozwinąć (Rysunek 9, panel 2). Na tym etapie eksperymentu wystarczy rejestrować obrazy co 2 godziny i sprawdzać co 10 do 12 godzin wszelkie zmiany w wielkości kryształów. Eksperyment można kontynuować, jeśli nie zaobserwuje się zmiany w wielkości kryształów.
      UWAGA: W zależności od stężeń białka i środka strącającego w roztworze krystalizacyjnym oraz objętości użytego białka, czas potrzebny do osiągnięcia równowagi dla każdego etapu może się różnić.
    7. Zmniejsz temperaturę do 288 K, aby wznowić wzrost kryształów. W warunkach eksperymentalnych prezentowanego tutaj przypadku, jeden dzień wystarcza aby osiągnąć równowagę (Rysunek 9, panel 3).
    8. Sprawdź rozmiar kryształów i utrzymuj stałą temperaturę tak długo, jak długo kryształ będzie rósł.
    9. Po 4 dniach zmniejsz temperaturę do 275 K, aby wznowić wzrost kryształów (Rysunek 9, panel 4).
      – W warunkach eksperymentalnych przedstawionego przypadku, po około 10 dniach otrzymany zostanie kryształ o wielkości 500 μm w jednym wymiarze (Rysunek 9).
  4. Kontrolowanie rozmiaru kryształu
    1. Przygotować roztwór białkowy i zestaw do dializy zbiornikowej o kontrolowanej temperaturze, jak opisano w sekcjach 2.3.1 i 2.3.2.
    2. Przygotować roztwory krystalizacyjne o stężeniu 0,9 M NaCl i 0,1 MCH3COONa pH 4.
    3. Ustaw temperaturę na 291 K i pozwól kryształom rosnąć. W warunkach początkowych pierwsze zdarzenie zarodkowania rozpocznie się po około godzinie, a liczne kryształy będą rosły w komorze dializacyjnej przez trzy godziny (Rysunek 10, kroki: 1 i 2). Nagrywaj obrazy co 20 minut, aby sprawdzić rozmiar kryształów podczas procesu wzrostu.
      UWAGA: Optymalizacja warunków krystalizacji ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania większości końcowych właściwości generowanych kryształów. Temperaturę i skład chemiczny roztworów krystalizacyjnych można zmienić w celu rozpuszczenia i ponownego wyhodowania kryształów o jednolitej wielkości. Należy również zauważyć, że próbka białka nie jest spożywana w takim eksperymencie, ponieważ warunki można odwrócić, aby ponownie rozpuścić próbkę, o ile nie jest ona denaturowana. Rozpuszczając kryształy poprzez zmianę temperatury i utrzymując stały skład chemiczny, kontynuuj eksperyment w następujący sposób:
    4. Gdy kryształy wyrosną w temperaturze 291 K, można je rozpuścić, aby ponownie wyhodować mniej, ale więcej kryształów. Zwiększaj temperaturę stopniowo przez 20 minut, aż osiągniesz 313 K. Rozpuszczenie wszystkich kryształów w komorze dializowej zajmuje około godziny (Rysunek 10, kroki: 3-5). Nagrywaj obrazy co 5 do 15 minut, aby monitorować proces rozpuszczania.
      UWAGA: Wiele białek jest wrażliwych na wysokie temperatury. Upewnij się, że pracujesz w zakresie temperatur, w którym białko jest stabilne, aby uniknąć uszkodzeń/denaturacji. Oprócz rozpuszczalności białek, temperatura wpływa również na roztwór buforowy. Na przykład pH buforu może zmieniać się wraz z temperaturą, zwłaszcza w buforze Tris. W takim przypadku kluczowe jest ustawienie pH zgodnie z temperaturą, w której przeprowadzany jest eksperyment18. Należy również zauważyć, że rozpuszczanie białek trwa znacznie mniej czasu (od kilku minut do kilku godzin) w porównaniu ze wzrostem kryształów białka (od kilku godzin do kilku dni). Ogólnie rzecz biorąc, podczas rozpuszczania kryształów temperatura wzrasta stopniowo i powoli (z zachowaniem krótkiego całkowitego czasu rozpuszczania), głównie w przypadku częściowego rozpuszczenia kryształów, aby uniknąć wzrostu mozaiki kryształów. Kiedy kryształy rosną, temperatura może szybko spaść (w mniej niż minutę) do ustawionej temperatury (z zachowaniem długiego całkowitego czasu wzrostu). Regularne monitorowanie komory krystalizacyjnej poprzez rejestrowanie obrazów jest wskazane, aby zapobiec uszkodzeniu białka i pomóc w określeniu optymalnego czasu rozpuszczania lub wzrostu kryształów dla każdego badanego białka.
    5. Po rozpuszczeniu wszystkich kryształów ustaw temperaturę na 295 K, aby zainicjować drugie zdarzenie zarodkowania (Rysunek 10, kroki: 6,7). Rejestruj obrazy co 5 minut, aby monitorować drugi proces zarodkowania. Na tym etapie pierwsze jądra pojawiają się po około 18 minutach.
      UWAGA: W tej temperaturze roztwór znajdzie się w strefie zarodkowania, w pobliżu strefy metastabilnej. W efekcie w komorze krystalizacji pojawi się tylko kilka jąder.
    6. Kontynuuj eksperyment, powtarzając proces optymalizacji opisany w sekcji 2.3 dla hodowli większych kryształów. Całkowity czas trwania eksperymentu przedstawiony w Rysunek 10 to tylko kilka dni.
      UWAGA: Jeśli w fazie zarodkowania kryształy pojawiają się w różnym czasie, w komorze krystalizacyjnej uzyskuje się kryształy o różnych rozmiarach. W takim przypadku wzrost temperatury (w przypadku białek o bezpośredniej rozpuszczalności) będzie skutkował szybszym rozpuszczeniem mniejszych kryształów. W zależności od efektu dojrzewania kinetycznego, dodatkowe białko (uzyskane z rozpuszczenia) może być następnie wykorzystane do wzrostu większych kryształów.
      Rozpuszczając kryształy w stałej temperaturze poprzez zmianę składu chemicznego roztworu krystalizującego, kontynuuj eksperyment w następujący sposób:
      Możliwe jest również rozpuszczenie wyhodowanych wcześniej kryształów poprzez zmianę składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego podczas eksperymentu w celu ponownego wyhodowania populacji kryształów o jednakowej wielkości w nowych warunkach.
    7. Przygotować roztwór białkowy (2.3.1), zestaw do dializy w zbiorniku przepływowym o kontrolowanej temperaturze (2.1) i roztwór krystalizacyjny (2.4.2), jak opisano powyżej. W warunkach początkowych w strefie zarodkowania daleko od strefy metastabilnej, w komorze krystalizacyjnej pojawią się liczne małe kryształy, które zaczną rosnąć (Rysunek 11, kroki: 1,2).
    8. Po trzech godzinach, gdy w komorze krystalizacyjnej widocznych jest wiele średniej wielkości kryształów (Rysunek 11, krok: 3), stopniowo zmniejszaj stężenie NaCl (0,9 M) do zera. W tym celu należy przygotować nowy roztwór krystalizacyjny zawierający tylko roztwór buforowy o 0,1 MCH3COONa pH 4. Użyj układu pompowego, aby wymienić go na roztwór krystalizacyjny w komorze zbiornika. Postępować zgodnie z krokami od 2.2.10 do 2.2.12 w celu przygotowania i wstrzyknięcia nowego roztworu do komory zbiornika. Dzięki temu nowemu rozwiązaniu, podczas wymiany roztworów, stężenie NaCl w komorze spada do momentu, gdy końcowy roztwór w komorze zbiornika zawiera nie więcej niż 0,1 M CH, 3, COONa, pH 4 i nie zawiera NaCl. Rób zdjęcia co 10 minut, aby zarejestrować proces rozpuszczania.
    9. Pozwól kryształom całkowicie się rozpuścić (Rysunek 11, kroki: 4,5). Czas rozpuszczania w tym eksperymencie wynosi około dwóch godzin. Jak wspomniano wcześniej, czas rozpuszczania zależy od układu białkowego, warunków krystalizacji i objętości użytej komory dializowej. Niezbędna jest regularna obserwacja komory krystalizacyjnej (patrz rozdział Mikroskop) oraz rejestrowanie obrazów i notatek podczas eksperymentu.
    10. Gdy wszystkie kryształy wewnątrz komory zostaną rozpuszczone (Rysunek 11, krok: 5), ponownie użyj systemu pompowania, aby przygotować nowy roztwór krystalizacyjny, wstrzykując NaCl o niższym stężeniu niż poprzedni (0,75 M NaCl w 0,1 M CH3COONa pH 4).
    11. Wstrzyknąć nowy roztwór do komory zbiornika (Rysunek 11, kroki: 6,7) i powtórzyć proces optymalizacji wzrostu krystalizacji zgodnie z opisem w sekcji 2.3. Zostanie wygenerowana jednolita populacja większych kryształów. Wyniki pokazane w Rysunek 11 zostały uzyskane po kilku dniach.

Wyniki

W sekcjach 2.3 i 2.4 przedstawiono trzy przykłady zoptymalizowanego wzrostu kryształów, demonstrujące sposób wykorzystania instrumentu oraz projekt eksperymentalny służący do hodowli dużych kryształów. W tym pokazie wykorzystaliśmy lizozym jako białko modelowe, choć eksperymenty dotyczące wzrostu kryształów zostały z powodzeniem przeprowadzone z wieloma innymi systemami białkowymi przy użyciu tej metody (patrz wyżej). Dzięki zastosowaniu i opanowaniu zaprezentowanego tutaj protokołu można go dostosować do innych kandydackich białek.

W sekcji 2.3 wykazaliśmy, że uznane racjonalne strategie krystalizacji mogą być korzystne w hodowli kryształów o objętościach rozpraszania wystarczających do neutronowej krystalografii białek. Tutaj demonstrujemy, że zaproponowane strategie racjonalnej optymalizacji pozwalają również na generowanie jednorodnej populacji kryształów o dowolnym określonym rozmiarze wymaganym dla dalszych metod wyznaczania struktury.

Te dwa eksperymenty mają na celu podkreślenie znaczenia diagramów fazowych w kontrolowaniu nukleacji i wzrostu kryształów. W niniejszej pracy kontrola temperatury oraz składu chemicznego roztworów krystalizacyjnych w połączeniu z monitorowaniem procesu krystalizacji w czasie rzeczywistym służą do badania jakościowego diagramu fazowego. Dzięki tej metodzie nukleację i wzrost kryształów można w sposób racjonalny optymalizować w sposób odwracalny. Zastosowanie takiego podejścia seryjnego pozwala również zmniejszyć ilość białka oraz czas potrzebny na kontrolę wielkości i jakości kryształów.

W metodzie dializy roztwór białka jest oddzielony od roztworu krystalizacyjnego za pomocą membrany półprzepuszczalnej6 (Rysunek 5). Membrana dializacyjna ta pozwala na przenikanie przez nią małych cząsteczek, takich jak dodatki, bufor i jony, ale nie makrocząsteczek, takich jak białka6,20. Ta właściwość umożliwia modyfikację roztworu krystalizacyjnego w trakcie trwania eksperymentu6. Wymiana roztworu może być przeprowadzana ręcznie, na przykład w guzikach do mikrodializy, lub w sposób zautomatyzowany przy użyciu urządzenia opracowanego w tym celu, OptiCrys8.

W pierwszej serii eksperymentów do krystalizacji lizozymu z białka jaja kurzego wykorzystano guziki do mikrodializy. Guziki do mikrodializy zanurzono w roztworach krystalizacyjnych o różnych stężeniach soli. W tym prostym eksperymentcie z siatką krystalizacji jedyną zmienną jest stężenie czynnika wytrącającego, podczas gdy temperatura pozostaje stała (293 K). Jak pokazano na Rysunku 4, niewielkie różnice w stężeniu soli wywołują zmianę w rozmiarze i liczbie obserwowanych kryształów, co pozwala na badanie wykresu fazowego krystalizacji. Na Rysunku 4, panel 1, roztwór krystalizacyjny zawiera 0.7 M NaCl i w guzikach pojawiła się ograniczona liczba większych kryształów. Poprzez zwiększenie stężenia soli z 0.7 do 1.2 M wzrasta przesycenie, a roztwór w strefie nukleacji oddala się od strefy metastabilnej (Rysunek 4, panele 1–6). W rezultacie liczba kryształów wzrasta, a ich rozmiar maleje.

W pierwszym eksperymencie z wykorzystaniem w pełni zautomatyzowanego urządzenia umożliwiającego krystalizację dializacyjną z kontrolą temperatury, OptiCrys (Rysunek 9), eksperyment wzrostu kryształów został dostosowany w celu wygenerowania dużych kryształów. Eksperyment rozpoczęto w temperaturze początkowej 295 K, stosując roztwór krystalizacyjny zawierający 0,75 M NaCl oraz 0,1 M bufor octanowy pH 4. W tych warunkach eksperymentalnych roztwór krystalizacyjny osiągnął strefę nukleacji w sąsiedztwie strefy metastabilnej na wykresie fazowym (Rysunek 9, strzałka 1). W rezultacie w pierwszej fazie eksperymentu powstało tylko kilka zarodków. Aby dalej powiększać wybrane kryształy (pokazane na Rysunku 9), proces optymalizacji wzrostu kryształów skierowano w stronę strefy metastabilnej poprzez zmianę temperatury natychmiast po osiągnięciu stanu równowagi między kryształem a roztworem.

Za każdym razem, gdy osiągnięto stan równowagi między kryształem a roztworem, obniżano temperaturę — najpierw do 291 K, następnie do 288 K i ostatecznie do 275 K, aby utrzymać roztwór krystalizacyjny w strefie metastabilnej. Wynikiem tego eksperymentu jest pojedynczy duży kryształ, odpowiedni zarówno do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej, jak i neutronowej.

W przypadku większości białek precyzyjny ilościowy wykres fazowy (lub choćby wykres jakościowy) nie został jeszcze opracowany ze względu na brak urządzeń eksperymentalnych zdolnych do dokładnego pomiaru stężenia białka (lub po prostu do obserwacji/wykrywania procesu krystalizacji w czasie rzeczywistym) podczas eksperymentów krystalizacyjnych18. W rezultacie często nie jest możliwe zaprojektowanie eksperymentu w taki sposób, aby krystalizacja rozpoczynała się w optymalnym obszarze wykresu fazowego, w pobliżu strefy metastabilnej.

W związku z tym, przed przystąpieniem do eksperymentu poświęconego hodowli kryształu o dużej objętości, należy przeprowadzić badanie optymalizacji krystalizacji. W badaniu tym niezbędne jest zastosowanie zmian temperatury (przy stałym składzie chemicznym) z jednej strony oraz zmian składu chemicznego (przy stałej temperaturze) z drugiej, aby zidentyfikować strefę metastabilną i określić optymalne warunki do rozpoczęcia eksperymentu hodowli dużego kryształu.

W tym celu przedstawiono dwa inne eksperymenty, które zostały zaprojektowane w celu zademonstrowania odwracalności procesów w doświadczeniach krystalizacji dializacyjnej kontrolowanej temperaturowo z użyciem OptiCrys w odniesieniu do nukleacji, wzrostu kryształów, rozpuszczania i ponownego wzrostu. Przepływ pracy optymalizacji wzrostu kryształów był kontrolowany w taki sposób, aby wyhodować jednorodną populację mniejszej liczby większych kryształów lysozymu, stosując zmienność temperatury lub stężenia czynnika wytrącającego.

W drugim eksperymencie z użyciem OptiCrys skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego pozostawał stały przez cały czas trwania badania (0,9 M NaCl w 0,1 M CH3COONa pH 4) przy zmiennej temperaturze. Temperaturę początkową ustawiono na 291 K. Wyniki tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 10. Ze względu na wysokie przesycenie, w komorze krystalizacyjnej pojawiła się duża liczba małych kryształów (Rysunek 10, panele 1 i 2). Zgodnie z koncepcją bezpośredniej rozpuszczalności białek, poprzez stopniowe zwiększanie temperatury do 313 K, wszystkie kryształy uległy rozpuszczeniu (Rysunek 10, panele 3, 4 i 5). Ostatecznie, poprzez obniżenie temperatury do 295 K, w sąsiedztwie strefy metastabilnej zainicjowano drugą nukleację, co pozwoliło na kontrolowane powstanie mniejszej liczby jąder krystalizacji. Dalszy wzrost kryształów doprowadził do jednorodnego wygenerowania populacji większych kryształów (Rysunek 10, panel 7).

Jak pokazano na Rysunku 11, zmianę składu chemicznego roztworu krystalizacyjnego przy stałej temperaturze 291 K można również wykorzystać do uzyskania jednorodnej populacji większych kryształów. Podobnie jak w poprzednim eksperymencie, warunki początkowe wynosiły 0,9 M NaCl w 0,1 M CH3COONa pH 4. Następnie stężenie NaCl stopniowo obniżano z 0,9 M do zera, aby rozpuścić kryształy (Rysunek 11, panele 4 i 5). W tym momencie NaCl został całkowicie zastąpiony roztworem buforowym 0,1 M CH3COONa pH 4. Zmniejszenie stężenia soli utrzymuje roztwór w strefie niedosycenia na wykresie fazowym, co prowadzi do rozpuszczenia kryształów. Następnie do komory zbiornika wstrzyknięto nowy roztwór krystalizacyjny o niższej sile jonowej, zawierający 0,75 M NaCl w 0,1 M CH3COONa pH 4. Przy tym stężeniu precypitantu pierwsze zarodki pojawiły się (Rysunek 11, panel 6) po 90 minutach. Liczba powstałych kryształów była mniejsza, a kryształy osiągnęły większą objętość (Rysunek 11, panel 7) niż poprzednio.

Schemat fazowy krystalizacji białek z krzywą rozpuszczalności; metody dializy i dyfuzji pary.
Rycina 1: Schematyczny diagram fazowy. Trajektorie kinetyczne dla trzech technik krystalizacji przedstawiono w reżimie wysalania. Każda metoda osiąga nukleację i krystalizację w inny sposób, co obrazują różne ścieżki kinetyczne na diagramie fazowym prowadzące do stref nukleacji i metastabilności. Krzywa rozpuszczalności oddziela obszary niedosycenia i przesycenia. Przesycenie podzielono na trzy strefy: metastabilną, nukleacji oraz precypitacji. W strefie nukleacji zachodzi spontaniczna nukleacja, natomiast w strefie metastabilnej następuje wzrost kryształów. Rycina ta została opracowana na podstawie pracy Junius et al.8 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przepływowej celi dializacyjnej z diodą LED, mikroskopem wideo, chłodzeniem Peltiera, układem płynowym; spektroskopia.
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie stanowiska do krystalizacji (OptiCrys).Źródło światła LED znajduje się nad przepływową celą dializacyjną z kontrolą temperatury. Mikroskop odwrócony oraz kamera cyfrowa są wskazane czerwoną strzałką w prawym górnym rogu obrazu. Czerwony okrąg reprezentuje miejsce prowadzenia przewodów chłodziarki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dwuwymiarowy wykreś fazowy krystalizacji, krzywa rozpuszczalności, strefy; temperatura, stężenie czynnika precypitującego.
Rysunek 3: Schematyczny dwuwymiarowy wykres fazowy krystalizacji białka w funkcji temperatury (A) oraz stężenia czynnika precypitującego (B). (A) W przypadku białka o rozpuszczalności bezpośredniej, obniżanie temperatury utrzymuje roztwór krystalizacyjny w strefie metastabilnej. Zmiany temperatury można powtarzać wielokrotnie, aby kontrolować proces wzrostu kryształów, aż do uzyskania kryształów o pożądanej objętości. (B) Zmiana stężenia roztworu czynnika precypitującego może być również wykorzystana do utrzymania roztworu krystalizacyjnego w strefie metastabilnej w celu wzrostu kryształów. Rysunek ten został zaadaptowany z publikacji Junius et al.8 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu krystalizacji przy różnych stężeniach NaCl i w roztworze buforu NaOAc o pH 4.
Rysunek 4: Kryształy lizozymu otrzymane metodą dializy. Eksperyment przeprowadzono w stałej temperaturze 293 K w 0,1 M buforze octanu sodu o pH 4. Zwiększenie stężenia NaCl z 0,7 M do 1,2 M zwiększa szybkość nukleacji i prowadzi do powstania większej liczby kryształów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces krystalizacji białek; schemat metody dializy z zestawem do mikrodializy, pierścieniem O i membraną.
Rycina 5: Przegląd procesu krystalizacji białek metodą dializy.(A) Po dodaniu białka do komory przycisku dializacyjnego, (B) na górze komory tworzy się kształt kopuły. (C) Aplikator służy do przeniesienia pierścienia O do rowka przycisku dializacyjnego w celu unieruchomienia membrany dializacyjnej. (D) Przycisk dializacyjny jest gotowy do zanurzenia w roztworze w zbiorniku. (E) Roztwór krystalizacyjny przenika przez membranę półprzepuszczalną, a wewnątrz komory zaczynają tworzyć się kryształy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu dializy: o-ring, nadkomora, membrana dializacyjna w procesie rozdzielania cieczy.
Rycina 6: Schematyczny widok układu do dializy przepływowej z kontrolą temperatury. (A) Próbka białka jest dodawana do komory dializacyjnej. (B) Membrana dializacyjna jest mocowana do nadkomory za pomocą o-ringu przy użyciu aplikatora. (C) Nadkomora zostaje obrócona i zamocowana na górze komory dializacyjnej. Białe strzałki wskazują miejsca rozmieszczenia śrub w nadkomorze. (D) Komora zbiornika jest obracana zgodnie z ruchem wskazówek zegara (E) i mocowana na górze nadkomory. (F) Komora zbiornika jest przykryta szczelną zatyczką z złączami do systemu pompowego, a (G) ogniwo przepływowe jest umieszczane w mosiężnym wsporniku. Rycina ta została opracowana na podstawie pracy Junius et al.8 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu chromatograficznego przedstawiający drogę przepływu cieczy, detektory i kolumny z próbkami do analizy.
Rycina 7: Przygotowanie i wtryskiwanie roztworu krystalizacyjnego do zbiornika przez układ płynowy (A). Probówki zawierające sól i wodę są podłączone do kontrolera ciśnienia/próżni (B) oraz do zaworu obrotowego (C). Wykorzystując ciśnienie, kontroler ciśnienia/próżni tworzy stały przepływ cieczy z probówek do zaworu obrotowego. Każda ciecz, przechodząc przez przepływomierz (D) i przełącznik, jest wtryskiwana do rurki mieszającej (F). Po dodaniu wszystkich cieczy do rurki mieszającej, przełącznik po odpowiedniej modyfikacji wtryskuje końcowy roztwór z rurki mieszającej do zbiornika (G). Ciecz przepływa przez układ w kierunku strzałek na schemacie oznaczonych w kolejności rosnącej (od 1 do 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kontroli krystalizacji; system mikroskopowy; ustawienia temperatury, stężenia, narzędzie analityczne.
Rycina 8: Widok konserwacji w oprogramowaniu nadzorującym. Widok ten służy do kontrolowania różnych parametrów, takich jak temperatura, światło, roztwór krystalizacyjny i powiększenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat krystalizacji białka z zależnością stężenia od temperatury; obejmuje cztery etapy wzrostu kryształów.
Rysunek 9: Wykres fazowy w funkcji temperatury (wybrane obrazy należy śledzić w kolejności rosnącej). Pojedynczy duży kryształ lysozymu uzyskano poprzez systematyczną zmianę temperatury z 295 K do 275 K. Na każdym etapie wzrost kryształu zostaje zatrzymany po osiągnięciu krzywej rozpuszczalności. Obniżenie temperatury poprzez utrzymywanie roztworu w strefie metastabilnej ponownie inicjuje wzrost kryształu. Obrazy mają różne stopnie powiększenia. Rysunek ten został zaadaptowany z pracy Junius et al.8,18 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Krystalizacja białek, wykres fazowy, nukleacja, strefy metastabilne, wykres temperatura/stężenie.
Rysunek 10: Optymalizacja wzrostu kryształów przy stałym składzie chemicznym przy użyciu kontroli temperatury (wybrane obrazy należy śledzić w kolejności rosnącej). Rozpoczęcie procesu nukleacji w strefie nukleacji w 291 K, z dala od strefy metastabilnej, prowadzi do powstania licznych kryształów. Następnie zwiększenie temperatury do 313 K powoduje rozpuszczenie kryształów, aż w komorze dializacyjnej nie będą widoczne żadne jądra krystalizacji. Na koniec obniżenie temperatury do 295 K ponownie uruchamia proces nukleacji, co prowadzi do powstania ograniczonej liczby większych kryształów. Rysunek został zaadaptowany z pracy Junius et al.8,18 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Proces krystalizacji białek; wykres fazowy stanu równowagi; wizualizacja stref nukleacji i precypitacji.
Rysunek 11: Optymalizacja wzrostu kryształów w stałej temperaturze przy zastosowaniu różnych stężeń czynnika precypitującego (wybrane obrazy należy śledzić w kolejności rosnącej). Zmniejszenie stężenia czynnika precypitującego z 0.9 M do 0 M powoduje rozpuszczenie kryształów uzyskanych podczas pierwszego zdarzenia nukleacji. Proces krystalizacji zostaje wznowiony poprzez wstrzyknięcie tego samego czynnika precypitującego, lecz o niższej sile jonowej, 0.75 M, co prowadzi do powstania kilku większych kryształów. Rysunek ten został zaadaptowany z pracy Junius et al.8,18 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Różne zmienne fizyczne, chemiczne i biologiczne wpływają na krystalizację białek, wpływając na rozpuszczalność białek21. Wśród tych zmiennych, temperatura i skład chemiczny roztworu krystalizacyjnego są tutaj wykorzystywane w połączeniu z techniką dializy w celu ulepszenia i wyhodowania dużych, wysokiej jakości kryształów biomakrocząsteczek do badań dyfrakcji neutronów. Wykorzystując wiedzę na temat diagramów fazowych, krystalizacja jest bardziej przewidywalna. Chociaż możliwe jest również badanie przesiewowe różnych warunków krystalizacji w podejściu szeregowym, głównym celem zastosowania przedstawionych racjonalnych podejść jest oddzielenie i kontrola kinetyki zarodkowania i wzrostu kryształów.

Podobnie jak w przypadku wszystkich badań krystalizacji, wysokiej jakości czyste i jednorodne próbki białek oraz bezpyłowe roztwory krystalizacyjne zwiększają wskaźnik powodzenia eksperymentu. Filtracja i odwirowanie roztworów są niezbędnymi krokami w opisanych protokołach. Znajomość właściwości fizykochemicznych badanych białek, takich jak masa cząsteczkowa (w celu wyboru odpowiedniej membrany do dializy), punkt izoelektryczny i rozpuszczalność białek, ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania eksperymentu optymalnego wzrostu kryształów. Należy również wziąć pod uwagę stabilność białek w różnych temperaturach lub przy użyciu różnych substancji chemicznych, aby zapobiec utracie próbki i zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu. Biorąc pod uwagę zakres temperatur OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K), za jego pomocą można krystalizować szeroki zakres białek. Warto jednak podkreślić, że białka, które są przede wszystkim termostabilne, takie jak białka ze źródeł ciepłolubnych, odniosłyby największe korzyści w kontrolowanych temperaturowo eksperymentach z wielkoobjętościowym wzrostem kryształów oferowanych przez ten instrument.

Korzystając z komory dializacyjnej o małej objętości (w przypadku korzystania z OptiCrys) lub przycisków do mikrodializy oraz monitorując kilka temperatur i warunków krystalizacji (np. siatki stężenia strącania lub pH), możliwe jest uzyskanie informacji na temat lokalizacji granicy strefy metastabilnej (równowaga kinetyczna między strefami zarodkowania i metastabilnymi). Jest to nieocenione przy projektowaniu udanego eksperymentu z hodowlą kryształów, zwłaszcza w przypadku nowych kandydatów na białka w krystalizacji. Bez tych informacji eksperymenty mogą rozpocząć się od obszaru diagramu fazowego o wysokim przesyceniu, zbyt daleko od granicy strefy metastabilnej, aby łatwo kontrolować zarodkowanie kryształów. Chociaż można podjąć próbę rozpuszczenia osadu białkowego, na przykład poprzez zwiększenie temperatury w przypadku rozpuszczalności bezpośredniej, w przypadku białek o zmniejszonej termostabilności, utrzymywanie próbki w wysokiej temperaturze przez dłuższy okres czasu może sprawić, że wytrącanie się białka stanie się nieodwracalne. Tak więc najlepsza strategia polega na zastosowaniu warunków początkowych z niższym przesyceniem zlokalizowanych w pobliżu granicy metastabilności, gdzie można kontrolować zarodkowanie i uniknąć wytrącania białek. W związku z tym wstępne badanie przesiewowe krystalizacji zmniejsza ryzyko wytrącenia się białka w komorze dializacyjnej i zwiększa wskaźnik powodzenia eksperymentu.

Po zaprojektowaniu eksperymentu kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie komór dializacyjnych (OptiCrys) lub przycisków do mikrodializy. Zapobieganie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorze dializowej/przycisku dializacyjnym zwiększa szansę na pomyślną krystalizację, zwłaszcza w przypadku stosowania małych objętości. Obecność pęcherzyków powietrza w komorze dializacyjnej może również zmienić kinetykę procesu krystalizacji i zmniejszyć odtwarzalność eksperymentu (ponieważ powierzchnia kontaktu białka z roztworem została zmodyfikowana). Nie tylko białko, ale także roztwór krystalizacyjny może mieć wpływ na powodzenie eksperymentu. Używanie nowych probówek o pojemności 50 ml w systemie pompowania za każdym razem, gdy chce się rozpocząć nowy eksperyment i mycie rurek po każdym eksperymencie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i pozwala uniknąć tworzenia się kryształów soli w aparacie.

Stosowanie przycisków do mikrodializy jest alternatywą, gdy OptiCrys nie jest dostępny. Strategie optymalizacji krystalizacji i monitorowania wzrostu kryształów, o których mowa powyżej, muszą być realizowane ręcznie. Zazwyczaj wymaga to przebywania poza inkubatorem termoregulowanym, co może być problematyczne, gdy regulacja temperatury jest krytycznym krokiem w opisanej metodologii. Nie ułatwia to zmiany składu chemicznego roztworów krystalizacyjnych, ani monitorowania wzrostu kryształów za pomocą obrazowania, więc proces wzrostu kryształów nie może być kontrolowany w czasie rzeczywistym.

Znajomość diagramu fazowego jest podstawą korzystania ze stanowiska do krystalizacji OptiCris do systematycznego hodowania dużych, wysokiej jakości kryształów w sposób zautomatyzowany. Kontrola parametrów fizykochemicznych, takich jak temperatura, stężenie środka strącającego i pH podczas krystalizacji, przesuwa równowagę białko-roztwór po dobrze zdefiniowanej trajektorii kinetycznej na diagramie fazowym. Uzupełnieniem jest zastosowanie membrany dializacyjnej w celu dostosowania transportu masy i stworzenia kontrolowanego gradientu w komorze krystalizacyjnej, który wpływa na wielkość i jakość kryształów. Dlatego wykorzystanie zarówno danych termodynamicznych, jak i trajektorii kinetycznych jest niezbędne do kontrolowania procesu krystalizacji w celu wyhodowania kryształów wysokiej jakości. Dzięki OptiCris systematyczne diagramy fazowe w przestrzeni wielowymiarowej mogą być badane przy użyciu podejścia szeregowego przy użyciu znacznie mniejszej ilości materiału niż dotychczas. Aby zademonstrować tę metodologię, przedstawiamy tutaj studium przypadku z modelowym białkiem, lizozymem białka jaja kurzego. Stosując i opanowując przedstawiony tutaj protokół, można go dostosować do rzeczywistych systemów białkowych 5,14,17,18.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

MBS dziękuje za wsparcie ze strony LABEX VALO GRAL w ramach umowy z 2015 roku. NJ przyjmuje do wiadomości Międzynarodowy Program Badań Doktoranckich CEA (Irtelis) w celu uzyskania stypendium doktoranckiego. Autorzy potwierdzają finansowanie z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o grant Marii Skłodowskiej-Curie nr 722687. Autorzy są również wdzięczni dr Esko Oksanenowi (ESS, Lund) i dr Jean-Luc Ferrerowi (IBS, Grenoble) za pomocne rozmowy i spostrzeżenia. IBS potwierdza integrację z Interdyscyplinarnym Instytutem Badawczym w Grenoble (IRIG, CEA).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200 i mikro; l Przycisk do dializyHampton ResearchHR3-330Przycisk do dializy
24-dołkowe płytkiJena BioscienceCPL-132Płytka krystalizacyjna
2-przełącznikFLUIGENT2SW001Przełącznik
30 μ l Przycisk do dializyHampton ResearchHR3-324Przycisk do dializy
50 ml Probówki wirówkowe CorningSigma-AldrichCLS430828-500EAProbówki wirówkowe
Kwas octowySigma-AldrichS2889Chemiczny
lizozym białka jaja kurzegoSigma-AldrichL6876Liofilizowane białko w proszku
Dyski membranowe do dializy 6-8 kDaMWCO Spectrum132478Membrana do dializy
Rurka membranowa do dializy 6-8 kDa MWCOSpectrum132650TMembrana do dializy
MikrowirówkaEppendorfMinispinWirówka stołowa
Jednostka przepływowaFLUIGENTFLU-XLPrzepływomierz
FlowboardFLUIGENTFLBFlowboard
Mikroprzepływowy system kontroli przepływu EZFLUIGENTEZ-01000002Regulator ciśnienia/podciśnienia
MilliporeSigma 0,22 µ m strzykawka FiltryMilliporeGSWP047000,22 μ m Filtr wielkości porów
M-SwitchFLUIGENTMSW002Zawór obrotowy
OpticrysNatX-rayPRT008Ławka do krystalizacji
Silikonowane prowadnice okrągłeHampton ResearchHR3-231Szkiełka
szklane Chlorek sodu ≥ 99%Sigma-Aldrich746398Tablica rozdzielcza chemiczna
FLUIGENTSWB002Centrala
Inkubator termoregulowanyMemmertIPP30Inkubator termoregulowany

Bibliografia

  1. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  2. Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  3. Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  4. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  5. Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase. Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).
  6. Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).
  7. Chayen, N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques. REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).
  8. Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  9. Salemme, F. R. A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).
  10. Chayen, N. E., Saridakis, E. Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).
  11. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  12. Garciá-Ruiz, J. M. Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization. Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).
  13. Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).
  14. Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).
  15. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  16. Astier, J. P., Veesler, S. Using temperature to crystallize proteins: A mini-review. Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).
  17. Budayova-Spano, M., et al. A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).
  18. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).
  19. Grimsley, G. R., Pace, C. N. Spectrophotometric Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).
  20. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  21. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34 (3), 254-265 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Optymalizacja wzrostu kryszta wmetoda dializydializa z kontrol temperaturywykres fazowy krystalizacjiinstrument OptiCrysprzyciski do mikrodializyprzygotowanie roztworu bia kapomiar wielko ci kryszta wkontrola sk adu roztworu
Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.