Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

Podsumowanie

Podczas gdy zderzenia widełek replikacyjnych z adduktami DNA mogą powodować pęknięcia podwójnej nici, mniej wiadomo o interakcji między replikosomami a zmianami blokującymi. Zastosowaliśmy test ligacji zbliżeniowej, aby zobrazować te spotkania i scharakteryzować konsekwencje dla składu repliksome'owego.

Streszczenie

Znaczna ilość informacji jest obecna w odpowiedzi komórkowej na pęknięcia podwójnej nici (DSB), indukowane przez nukleazy, promieniowanie i inne czynniki niszczące DNA. Częściowo odzwierciedla to dostępność metod identyfikacji miejsc przerw oraz charakterystykę czynników rekrutowanych do DSB w tych sekwencjach. Jednak DSB pojawiają się również jako półprodukty podczas przetwarzania adduktów DNA utworzonych przez związki, które nie powodują bezpośrednio pęknięć i nie reagują w określonych miejscach sekwencji. W związku z tym w przypadku większości tych leków nieznane są technologie umożliwiające analizę interakcji wiązania z czynnikami odpowiedzi i białkami naprawczymi. Na przykład wiązania krzyżowe międzyniciowe DNA (ICL) mogą powodować pęknięcia po spotkaniach z widełkami replikacyjnymi. Chociaż powstają przez leki szeroko stosowane jako chemioterapeutyki przeciwnowotworowe, nie ma metodologii monitorowania ich interakcji z białkami replikacyjnymi.

Tutaj opisujemy naszą strategię śledzenia odpowiedzi komórkowej na zderzenia widełek z tymi trudnymi adduktami. Połączyliśmy antygen steroidowy z psoralenem, który tworzy zależne od fotoaktywacji ICL w jądrach żywych komórek. ICL wizualizowano za pomocą immunofluorescencji względem znacznika antygenowego. Znacznik może być również partnerem w teście ligacji zbliżeniowej (PLA), który informuje o bliskim związku dwóch antygenów. PLA wykorzystano do odróżnienia białek, które były ściśle związane ze znakowanymi ICL od tych, które nie były. Możliwe było zdefiniowanie białek replikomów, które zostały zachowane po spotkaniach z ICL i zidentyfikowanie innych, które zostały utracone. Podejście to ma zastosowanie do każdej struktury lub adduktu DNA, które można wykryć immunologicznie.

Wprowadzenie

Odpowiedź komórkowa na pęknięcia podwójnej nici jest dobrze udokumentowana dzięki kolejnym coraz skuteczniejszym metodom kierowania przerw do określonych miejsc genomowych^1,2,3. Pewność lokalizacji umożliwia jednoznaczną charakterystykę białek i innych czynników, które gromadzą się w tym miejscu i uczestniczą w odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), napędzając w ten sposób szlaki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i rekombinacji homologicznej (HR), które naprawiają pęknięcia. Oczywiście, wiele przerw jest wprowadzanych przez czynniki takie jak promieniowanie i związki chemiczne, które nie atakują określonych sekwencji⁴. Jednak dla nich dostępne są procedury, które mogą przekształcić końce w struktury nadające się do tagowania i lokalizacji^5,6. Przerwy są również wprowadzane przez procesy biologiczne, takie jak przegrupowanie immunoglobulin, a najnowsza technologia pozwala również na ich lokalizację⁷. Następnie można określić związek między odpowiadającymi czynnikami a tymi miejscami.

Przerwy pojawiają się również jako pośrednia konsekwencja adduktów tworzonych przez związki, które nie są nieodłącznymi łamaczami, ale zakłócają transakcje DNA, takie jak transkrypcja i replikacja. Mogą powstać jako cecha odpowiedzi komórkowej na te przeszkody, być może podczas naprawy lub dlatego, że prowokują strukturę podatną na atak nukleazy. Zazwyczaj fizyczny związek między przywodzeniem, pęknięciem i powiązaniem z czynnikami reagującymi jest wywnioskowany. Na przykład ICL są tworzone przez chemioterapeutyki, takie jak cisplatyna i mitomycyna C⁸ oraz jako produkt reakcji abasic sites⁹. ICL są dobrze znane jako silne bloki do replikacji widełek¹⁰, tym samym blokując widełki, które mogą zostać rozszczepione przez nukleazy¹¹. Wiązanie kowalencyjne między niciami jest często łagodzone przez szlaki, które mają obligatoryjne przerwy jako produkty pośrednie^12,13, co wymaga rekombinacji homologicznej w celu odbudowania replikacji fork¹⁴. W większości eksperymentów badacz śledzi reakcję czynników będących przedmiotem zainteresowania na pęknięcia, które powstają po zderzeniu widełek replikacyjnych z ICL. Ponieważ jednak nie ma technologii pozwalającej na lokalizację zmiany prowokacyjnej, można jedynie przypuszczać bliskość replikosmu i jego części składowych do ICL.

Opracowaliśmy strategię umożliwiającą analizę powiązań białek z kowalencyjnymi adduktami niespecyficznymi dla sekwencji, zilustrowaną tutaj za pomocą ICL. W naszym systemie są one wprowadzane przez psoralen, fotoaktywny produkt naturalny stosowany od tysięcy lat jako środek terapeutyczny na choroby skóry¹⁵. Nasze podejście opiera się na dwóch ważnych cechach psoralensów. Pierwszym z nich jest wysoka częstotliwość tworzenia się usieciowania, która może przekraczać 90% adduktów, w przeciwieństwie do mniej niż 10% tworzonych przez popularne związki, takie jak cisplatyna lub mitomycyna C^8,16. Drugim jest dostępność związku do koniugacji bez utraty zdolności do sieciowania. Kowalencyjnie połączyliśmy psoralen trimetylowy z digoksygeniną (Dig), od dawna uznanym znacznikiem immunologicznym. Umożliwia to wykrycie adduktów psoralenu w genomowym DNA poprzez barwienie immunologiczne znacznika Dig i wizualizację za pomocą konwencjonalnej immunofluorescencji¹⁷.

Ten odczynnik został zastosowany, w naszej poprzedniej pracy, do analizy spotkań widełek replikacyjnych z ICL za pomocą testu opartego na włóknach DNA¹⁶. W ramach tych prac odkryliśmy, że replikacja może być kontynuowana po nienaruszonym ICL. Było to zależne od kinazy ATR, która jest aktywowana przez stres replikacyjny. Ponowne uruchomienie replikacji było nieoczekiwane, biorąc pod uwagę strukturę helikazy replikacyjnej CMG. Składa się z hetero-heksameru MCM (M), który tworzy przesunięty pierścień z przerwami wokół nici matrycowej do syntezy nici wiodącej, która jest zablokowana przez białka kompleksu GINS (G, składającego się z PSF1, 2, 3 i SLD5) i CDC45 (C)¹⁸. Propozycja, że replikacja może zostać wznowiona po stronie ICL dystalnie w stosunku do strony zderzenia replikomu, przemawiała za zmianą struktury replikomu. Aby odpowiedzieć na pytanie, które składniki znajdowały się w odpowiedzi w momencie spotkania z ICL, opracowaliśmy opisane tutaj podejście. Wykorzystaliśmy znacznik Dig jako partnera w testach ligacji zbliżeniowej (PLA)¹⁹, aby zbadać ścisły związek ICL z białkami klasy replisome20.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Dzień 1
   1. Płytki hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm należy wstępnie potraktować roztworem kleju komórkowego.
   2. Płytki w naczyniach poddanych obróbce na dzień przed zabiegiem. Komórka powinna aktywnie się dzielić i zlewać w 50–70% w dniu eksperymentu.
      UWAGA: Komórki HeLa zostały użyte w tym eksperymencie z Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1x penicyliną / streptomycyną. Nie ma ograniczeń dla przylegających linii komórkowych. Jednak nieprzylegające komórki muszą zostać odwirowane na szkiełkach i utrwalone przed analizą za pomocą PLA.
2. Dzień 2
   1. Przygotować roztwór podstawowy digoksygeniny trimetylopsoralenu (Dig-TMP) przez ponowne zawieszenie zamrożonej podwielokrotności wcześniej zsyntetyzowanego Dig-TMP w 1:1 EtOH:H₂O. Oznaczyć stężenie, mierząc OD przy 250 nm 100-krotnego rozcieńczenia (w_H2O) rozpuszczonego Dig-TMP. Współczynnik ekstynkcji Dig-TMP wynosi 25 000. Przed każdym użyciem sprawdzić stężenie, mierząc OD przy 250 nm i obliczyć stężenie podstawowe: Abs x 100 x 10⁶/25 000 = stężenie (w μM). Ogólnie rzecz biorąc, roztwór podstawowy wynosi około 3 mM. Roztwór można przechowywać w temperaturze –20 °C przez około miesiąc.
      UWAGA: Dig-TMP musi być wcześniej zsyntetyzowany chemicznie, zgodnie z procedurą opisaną tutaj. Refluks 4'-chlorometylo-4,5',8-trimetylopsoralen z 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminą w toluenie pod azotem przez 12 godzin. Usunąć rozpuszczalnik i odzyskać produkt 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioksatrydeki)]aminometylo-4,5',8-trimetylopsoralenu metodą chromatografii w żelu krzemionkowym. Sprzężać produkt z estrem digoksygeniny NHS w dimetyloformamidzie i trietyloaminie w temperaturze 50 °C przez 18 godzin. Usunąć rozpuszczalnik i oczyścić pozostałość za pomocą preparatywnej cienkowarstwowej chromatografii z żelem krzemionkowym. Elute w paśmie produktu chloroform: metanol: mieszanina 28% wodorotlenku amonu (8:1:0,1). Odparować rozpuszczalniki i rozpuścić osad w 50% EtOH:_H2O.
   2. Dodać materiał wyjściowy Dig-TMP w 50% EtOH:_H2O do pożywki do hodowli komórkowej do końcowego stężenia 5 μM. Doprowadzić pożywkę do 37 °C. Odessać pożywkę z płytek, dodać wstępnie ogrzaną pożywkę zawierającą Dig-TMP i umieścić płytki w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) na 30 minut, aby umożliwić wyrównanie Dig-TMP.
   3. Podczas inkubacji komórek należy wstępnie ogrzać pojemnik UV (patrz Tabela materiałów) do 37 °C.
   4. Umieść płytki we wstępnie ogrzanym pudełku UV i wystawiaj komórki na działanie dawki 3 J/^cm2 światła UVA przez 5 minut w tym eksperymencie. Płytki umieszczono na termobloku utrzymywanym w temperaturze 37 °C podczas napromieniania. Oblicz czas za pomocą wzoru:
      
   5. Odessać pożywkę za pomocą pipety, dodać świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 1 godzinę.
   6. Usuń podłoże i delikatnie umyj naczynia solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   7. Usuń PBS i dodaj 0,1% formaldehydu (FA) do PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zapobiega to odklejaniu się komórek podczas wstępnej obróbki CSK-R (bufor do ekstrakcji cytoszkieletu zawierający RNazę, opisanej w 1.2.9) wymaganej do ekstrakcji elementów cytoplazmatycznych i redukcji tła PLA.
   8. Odessać FA i raz umyć naczynia PBS.
   9. Dodać bufor CSK-R i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia cytoplazmy [bufor CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 300 μg/ml RNazy A]. Odessać bufor, dodać świeży CSK-R i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zapas buforu CSK może być przechowywany w temperaturze 4 °C, a Triton X i RNaseA dodawane bezpośrednio przed użyciem.
   10. Umyć trzykrotnie PBS.
   11. Utrwal komórki za pomocą 4% formaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   12. Umyj komórki PBS. Wykonaj ten krok trzy razy.
   13. Dodać zimny 100% metanol i inkubować przez 20 minut w temperaturze -20 °C.
   14. Umyj komórki trzykrotnie PBS. W tym momencie komórki mogą być przechowywane w PBS w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
   15. Inkubować komórki w 80 μl 5 mM TritonX-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   16. Inkubować komórki ze 100 μl 5 mM EDTA w PBS uzupełnionym 1 μl 100 mg/ml RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   17. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
   18. Przechowywać komórki w buforze blokującym (5% BSA i 10% surowicy koziej w PBS) w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Test ligacji zbliżeniowej

UWAGA: Wykonaj test ligacji zbliżeniowej w dniu 3.

1. Barwienie przeciwciałami
   1. Przygotować 40 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na płytkę: Dodać odpowiednią objętość przeciwciał pierwszorzędowych, aby uzyskać pożądane rozcieńczenie (mysia antydigoxigenina i przeciwciało królicze przeciwko składnikowi replikosomowemu, takiemu jak MCM5, CDC45, PSF1 lub pMCM2, rozcieńczenia określone w tabeli materiałów) do buforu blokującego (aby osiągnąć końcową objętość 24 μl). Wymieszać przez stuknięcie i odstawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek i wymieszać przez stukanie przed nałożeniem do studzienek.
   2. Dodać 40 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do środka studzienki i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Podczas barwienia pozwól, aby sondy PLA i bufor blokujący ogrzały się do temperatury pokojowej.
   3. Umyj komórki za pomocą PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 w 1X PBS] w temperaturze RT. Wykonaj ten krok trzy razy.
   4. Podczas mycia przygotuj 40 μl roztworu sondy PLA na naczynie (sondy PLA składają się z przeciwciała drugorzędowego rozpoznającego IgG królika lub myszy, kowalencyjnie połączonego z oligonukleotydem PLUS lub MINUS): 8 μL sondy PLA anti mouse-PLUS + 8 μL sondy PLA przeciwciała anty królika-MINUS + 24 μL buforu blokującego. Wymieszać i odstawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek i dobrze wymieszać przed nałożeniem do studzienek. Umieść roztwór na środku studzienki na talerzu.
   5. Usunąć ostatnie płukanie, dodać 40 μl roztworu sondy PLA do środka studzienki i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   6. Myć w buforze A trzykrotnie, po 10 minut każdy, na uchylnej platformie w temperaturze RT. Podczas prania przynieś mieszankę do podwiązywania do RT.
2. Podwiązanie i amplifikacja
   1. Przygotować 40 μl mieszanki do ligacji na płytkę: 8 μl (5x) bulionu do ligacji + 31 μl wody destylowanej + 1 μl ligazy. Przygotuj mieszankę wzorcową dla wielu płytek i dobrze wymieszaj przed nałożeniem do dołków.
   2. Dodać 40 μl roztworu do ligacji do każdej płytki i inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Myj komórki 3x z buforem A, każda przez 2 minuty, na uchylnej platformie w temperaturze pokojowej.
   4. Przygotuj 40 μl roztworu amplifikacyjnego na naczynie: 8 μl (5x) bulionu do amplifikacji + 31,5 μl wody destylowanej + 0,5 μl polimerazy DNA. Przygotuj mieszankę wzorcową dla wielu próbek i dobrze wymieszaj przed nałożeniem do studzienek.
   5. Dodać 40 μl roztworu amplifikacyjnego do każdej płytki i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 100 minut.
   6. Odessać roztwór wzmacniający i przemyć buforem B. Wykonać 6 płukań przez 10 minut na uchylnej platformie w temperaturze pokojowej.
   7. Przemyć raz 0,01x buforem B przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   8. Odessać bufor B i inkubować płytki z przeciwciałami drugorzędowymi, anty-mysimi IgG Alexa Fluor 488 i anty-króliczymi IgG Alexa Fluor 568 w roztworze blokującym w odpowiednich rozcieńczeniach w buforze blokującym, w wilgotnej komorze, przez 30 minut w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   9. Umyj komórki trzy razy za pomocą PBS-T, po 10 minut każdy na uchylnej platformie w temperaturze pokojowej.
   10. Zassać PBS-T i zamontować w medium montażowym za pomocą DAPI. Zamontowane płyty można natychmiast zobrazować lub przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności nie dłużej niż 4 dni przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie i kwantyfikacja

1. Wykonaj obrazowanie w mikroskopie epifluorescencyjnym lub konfokalnym (jeśli pożądane jest obrazowanie 3D, pokryj co najmniej 3 μm w 15 stosach). Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach i zobrazuj wystarczającą liczbę pól, aby wykonać co najmniej 100 obserwacji na próbkę lub warunek. Obrazuj wszystkie pola i próbki, w tym kontrolki, przy użyciu tych samych ustawień ekspozycji.
2. Określ ilościowo za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Spis materiałów, aby zapoznać się z oprogramowaniem open source i komercyjnym, które jest w stanie przeprowadzić tę analizę na jednym lub wielu obrazach płaskich).
   1. Segmentowanie jąder komórkowych na podstawie barwienia DAPI. Wykonaj detekcję jądrowych kropek PLA. Przypisz kropki PLA do odpowiadającego im jądra. Eksportuj kropki PLA dla każdego jądra jako plik csv (patrz Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2).
3. Analiza statystyczna (patrz Spis materiałów, aby zapoznać się z sugerowanym oprogramowaniem open source i komercyjnym).
   1. Sprawdź, czy próbki mają rozkład normalny za pomocą testu Shapiro-Wilka.
   2. Określ, czy istnieje znacząca różnica między dwiema próbkami, używając testu Studenta-t (jeśli spełnione jest założenie rozkładu normalnego) lub testu sumy rang Wilcoxona (jeśli dla próbki naruszone jest założenie rozkładu normalnego).
4. Wizualizacja danych: Generuj wykresy punktowe w połączeniu z wykresami pudełkowymi, aby zwizualizować rozkład danych, medianę (Q₂), 25⁽Q₁) i 75 percentyl dla różnych próbek (patrz tabela materiałów, aby zapoznać się z sugerowanym oprogramowaniem open source i komercyjnym).

4. 3D wyświetlanie interakcji pMCM2: ICL

1. Obraz płytek PLA na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem, przy użyciu obiektywu olejowego Plan Fluor 60x/1,25 z aperturą numeryczną. Zdobądź 16 stosów o grubości 1,6 mm i wygeneruj rekonstrukcję 3D za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).

Wyniki

PLA z Dig-TMP z białkami replikowymi
Struktura Dig-TMP jest pokazana w Rysunek 1. Szczegóły syntezy, w której psoralen trimetylowy był sprzężony przez łącznik glikolu z digoksygeniną, zostały omówione wcześniej^17,21. Inkubacja komórek ze związkiem, a następnie ekspozycja na światło 365 nm (UVA) fotoaktywuje związek i napędza reakcję sieciowania. Nieco ponad 90% adduktów to ICLs¹⁶. Znacznik...

Dyskusja

Chociaż PLA jest bardzo potężną techniką, istnieją problemy techniczne, które należy rozwiązać, aby uzyskać jasne i powtarzalne wyniki. Przeciwciała muszą mieć wysokie powinowactwo i swoistość. Ponadto ważne jest, aby w jak największym stopniu zredukować niespecyficzne sygnały tła. Odkryliśmy, że błony i szczątki komórkowe przyczyniają się do tworzenia tła i usunęliśmy je w jak największym stopniu. Mycie zawierającymi detergent przed utrwaleniem i mycie metanolem po utrwaleniu pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. Z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 568, Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo	Invitrogen	A-10011	1 na 1000
Płytki 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym 1,5	MatTek	P35-1.5-14-C	Naczynia Microwell ze szklanym dnem 35 mm Szalka Petriego Microwell
Alexa Fluor 488, Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne	Invitrogen	A-10001	1 na 1000
Surowica bydlęca albumina (BSA)	SeraCare	1900-0012	Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało CDC45 (królik)	Abcam	ab126762	1 w 200
Klej komórkowy	Science	354240	do roztworu cell-TAK
Mikroskop konfokalny	Nikkon	Nikon TE2000 mikroskop z wirującym dyskiem	wyposażony w oprogramowanie Volocity
Przeciwciało digoksygeniny (Dig) (mysz)	Abcam	ab420	1 na 200
Dig-TMP	zsyntetyzowane w Odczynniki Seidman Lab
Duolink Amplification (5 razy;)	Odczynniki DUO82010 Sigma-Aldrich		należy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Odczynniki do wykrywania in situ Duolink	DUO92007 Sigma-Aldrich		należy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anty-mysi MINUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anty-króliczek PLUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Bufor do płukania in situ Duolink A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Bufor do płukania in situ Duolink B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni;
Mikroskop epifluorescencyjny	Mikroskop Zeiss	Axiovert 200M	Wyposażony w pakiety oprogramowania Axio Vision (Zeiss, Niemcy)
Formaldehyd 16%	Fisher Scientific	PI28906	do roztworu utrwalającego
Surowica kozia	Thermo	31873	Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy obrazu	o otwartym kodzie źródłowym	Profiler komórek	działa do analizy obrazów jednopłaszczyznowych
Wymagane oprogramowanie do analizy obrazu - wymagana licencja	Bitplane	Imaris	Cell Biology. Potrafi określić ilościowo kropki/jądra PLA w stosach obrazów (3D) i wykonać rekonstrukcje 3D
Ligaza (1 jednostka/μ l)	Odczynniki DUO82029 Sigma-Aldrich		należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Odczynnik do podwiązywania (5&razy;)	Odczynniki DUO82009 Sigma-Aldrich		należy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Przeciwciało MCM2 (królik)	Abcam	ab4461	1 na 200
Przeciwciało MCM5 (monoklonalne królika)	Abcam	Ab75975	1 na 1000
Metanol	Lab ALLEY	A2076	wstępnie schłodzone w temperaturze -20° C przed użyciem
przeciwciało fosfoMCM2S108 (królik)	Abcam	ab109271	1 w 200
Polimeraza (10 jednostek /μ l)	Odczynniki DUO82030 Sigma-Aldrich		należy przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Przedłuż złote podłoże montażowe z DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
Przeciwciało PSF1 (królik)	Abcam	ab181112	1 na 200
RNAzy A 100 mg / ml	Qiagen	19101	muszą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danych	open source	R studio	do generowania wykresów punktowych i pudełkowych
Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danych - wymagana licencja	Oprogramowanie Systat	Sigmaplot V13
TMP (trioksalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Południowa Nowa Anglia Ultrafiolet		Wycofany. Zobacz komorę testową UV Opsytec jako możliwy zamiennik
Komora testowa UV	Opsytec	KOMORA TESTOWA UV BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	końcowe stężenie wynosi 1&mikro; M