Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61689

⸱

27 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Podczas gdy zderzenia widełek replikacyjnych z adduktami DNA mogą powodować pęknięcia podwójnej nici, mniej wiadomo o interakcji między replikosomami a zmianami blokującymi. Zastosowaliśmy test ligacji zbliżeniowej, aby zobrazować te spotkania i scharakteryzować konsekwencje dla składu repliksome'owego.

Streszczenie

Znaczna ilość informacji jest obecna w odpowiedzi komórkowej na pęknięcia podwójnej nici (DSB), indukowane przez nukleazy, promieniowanie i inne czynniki niszczące DNA. Częściowo odzwierciedla to dostępność metod identyfikacji miejsc przerw oraz charakterystykę czynników rekrutowanych do DSB w tych sekwencjach. Jednak DSB pojawiają się również jako półprodukty podczas przetwarzania adduktów DNA utworzonych przez związki, które nie powodują bezpośrednio pęknięć i nie reagują w określonych miejscach sekwencji. W związku z tym w przypadku większości tych leków nieznane są technologie umożliwiające analizę interakcji wiązania z czynnikami odpowiedzi i białkami naprawczymi. Na przykład wiązania krzyżowe międzyniciowe DNA (ICL) mogą powodować pęknięcia po spotkaniach z widełkami replikacyjnymi. Chociaż powstają przez leki szeroko stosowane jako chemioterapeutyki przeciwnowotworowe, nie ma metodologii monitorowania ich interakcji z białkami replikacyjnymi.

Tutaj opisujemy naszą strategię śledzenia odpowiedzi komórkowej na zderzenia widełek z tymi trudnymi adduktami. Połączyliśmy antygen steroidowy z psoralenem, który tworzy zależne od fotoaktywacji ICL w jądrach żywych komórek. ICL wizualizowano za pomocą immunofluorescencji względem znacznika antygenowego. Znacznik może być również partnerem w teście ligacji zbliżeniowej (PLA), który informuje o bliskim związku dwóch antygenów. PLA wykorzystano do odróżnienia białek, które były ściśle związane ze znakowanymi ICL od tych, które nie były. Możliwe było zdefiniowanie białek replikomów, które zostały zachowane po spotkaniach z ICL i zidentyfikowanie innych, które zostały utracone. Podejście to ma zastosowanie do każdej struktury lub adduktu DNA, które można wykryć immunologicznie.

Wprowadzenie

Odpowiedź komórkowa na pęknięcia podwójnej nici jest dobrze udokumentowana dzięki kolejnym coraz skuteczniejszym metodom kierowania przerw do określonych miejsc genomowych1,2,3. Pewność lokalizacji umożliwia jednoznaczną charakterystykę białek i innych czynników, które gromadzą się w tym miejscu i uczestniczą w odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), napędzając w ten sposób szlaki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) i rekombinacji homologicznej (HR), które naprawiają pęknięcia. Oczywiście, wiele przerw jest wprowadzanych przez czynniki takie jak promieniowanie i związki chemiczne, które nie atakują określonych sekwencji4. Jednak dla nich dostępne są procedury, które mogą przekształcić końce w struktury nadające się do tagowania i lokalizacji5,6. Przerwy są również wprowadzane przez procesy biologiczne, takie jak przegrupowanie immunoglobulin, a najnowsza technologia pozwala również na ich lokalizację7. Następnie można określić związek między odpowiadającymi czynnikami a tymi miejscami.

Przerwy pojawiają się również jako pośrednia konsekwencja adduktów tworzonych przez związki, które nie są nieodłącznymi łamaczami, ale zakłócają transakcje DNA, takie jak transkrypcja i replikacja. Mogą powstać jako cecha odpowiedzi komórkowej na te przeszkody, być może podczas naprawy lub dlatego, że prowokują strukturę podatną na atak nukleazy. Zazwyczaj fizyczny związek między przywodzeniem, pęknięciem i powiązaniem z czynnikami reagującymi jest wywnioskowany. Na przykład ICL są tworzone przez chemioterapeutyki, takie jak cisplatyna i mitomycyna C8 oraz jako produkt reakcji abasic sites9. ICL są dobrze znane jako silne bloki do replikacji widełek10, tym samym blokując widełki, które mogą zostać rozszczepione przez nukleazy11. Wiązanie kowalencyjne między niciami jest często łagodzone przez szlaki, które mają obligatoryjne przerwy jako produkty pośrednie12,13, co wymaga rekombinacji homologicznej w celu odbudowania replikacji fork14. W większości eksperymentów badacz śledzi reakcję czynników będących przedmiotem zainteresowania na pęknięcia, które powstają po zderzeniu widełek replikacyjnych z ICL. Ponieważ jednak nie ma technologii pozwalającej na lokalizację zmiany prowokacyjnej, można jedynie przypuszczać bliskość replikosmu i jego części składowych do ICL.

Opracowaliśmy strategię umożliwiającą analizę powiązań białek z kowalencyjnymi adduktami niespecyficznymi dla sekwencji, zilustrowaną tutaj za pomocą ICL. W naszym systemie są one wprowadzane przez psoralen, fotoaktywny produkt naturalny stosowany od tysięcy lat jako środek terapeutyczny na choroby skóry15. Nasze podejście opiera się na dwóch ważnych cechach psoralensów. Pierwszym z nich jest wysoka częstotliwość tworzenia się usieciowania, która może przekraczać 90% adduktów, w przeciwieństwie do mniej niż 10% tworzonych przez popularne związki, takie jak cisplatyna lub mitomycyna C8,16. Drugim jest dostępność związku do koniugacji bez utraty zdolności do sieciowania. Kowalencyjnie połączyliśmy psoralen trimetylowy z digoksygeniną (Dig), od dawna uznanym znacznikiem immunologicznym. Umożliwia to wykrycie adduktów psoralenu w genomowym DNA poprzez barwienie immunologiczne znacznika Dig i wizualizację za pomocą konwencjonalnej immunofluorescencji17.

Ten odczynnik został zastosowany, w naszej poprzedniej pracy, do analizy spotkań widełek replikacyjnych z ICL za pomocą testu opartego na włóknach DNA16. W ramach tych prac odkryliśmy, że replikacja może być kontynuowana po nienaruszonym ICL. Było to zależne od kinazy ATR, która jest aktywowana przez stres replikacyjny. Ponowne uruchomienie replikacji było nieoczekiwane, biorąc pod uwagę strukturę helikazy replikacyjnej CMG. Składa się z hetero-heksameru MCM (M), który tworzy przesunięty pierścień z przerwami wokół nici matrycowej do syntezy nici wiodącej, która jest zablokowana przez białka kompleksu GINS (G, składającego się z PSF1, 2, 3 i SLD5) i CDC45 (C)18. Propozycja, że replikacja może zostać wznowiona po stronie ICL dystalnie w stosunku do strony zderzenia replikomu, przemawiała za zmianą struktury replikomu. Aby odpowiedzieć na pytanie, które składniki znajdowały się w odpowiedzi w momencie spotkania z ICL, opracowaliśmy opisane tutaj podejście. Wykorzystaliśmy znacznik Dig jako partnera w testach ligacji zbliżeniowej (PLA)19, aby zbadać ścisły związek ICL z białkami klasy replisome20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Dzień 1
    1. Przygotować naczynia hodowlane z szklanym dnem o średnicy 35 mm, traktując je roztworem adhezyjnym dla komórek.
    2. Wysiać komórki do przygotowanych naczyń na dzień przed traktowaniem. W dniu eksperymentu komórki powinny aktywnie się dzielić i osiągać 50–70% konfluencji.
      UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano komórki HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1x penicylinę/streptomycynę. Nie ma ograniczeń co do linii komórkowych adherentnych. Jednak komórki nieadherentne muszą zostać odwirowane na preparaty i utrwalone przed analizą metodą PLA.
  2. Dzień 2
    1. Przygotować roztwór zapasowy digoksygeniny trimetylopsoralenu (Dig-TMP), resuspensując zamrożoną alykwotę wcześniej zsyntetyzowanego Dig-TMP w mieszaninie EtOH:H2O w stosunku 1:1. Określić stężenie, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 250 nm dla 100-krotnego rozcieńczenia (w H2O) rozpuszczonego Dig-TMP. Współczynnik ekstynkcji Dig-TMP wynosi 25 000. Weryfikować stężenie, mierząc OD przy 250 nm przed każdym użyciem i obliczyć stężenie zapasowe: Abs x 100 x 106/25 000 = stężenie (w µM). Zazwyczaj roztwór zapasowy ma stężenie około 3 mM. Roztwór można przechowywać w temperaturze –20 °C przez około miesiąc.
      UWAGA: Dig-TMP musi zostać zsyntetyzowany chemicznie wcześniej, zgodnie z opisaną tutaj procedurą. Prowadzić cofanie 4'-chlormetylu-4,5',8-trimetylopsoralenu z 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanodiaminą w toluenie w atmosferze azotu przez 12 h. Usunąć rozpuszczalnik i odzyskać produkt 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioksatrideka)] aminometylu-4,5',8-trimetylopsoralen za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym. Połączyć produkt z estrem NHS digoksygeniny w dimetyloformamidzie i trietyloaminie w temperaturze 50 °C przez 18 h. Usunąć rozpuszczalnik i oczyścić pozostałość za pomocą preparatywnej cienkowarstwowej chromatografii na żelu krzemionkowym. Eluować prążek produktu mieszaniną chloroform:metanol: 28% wodorotlenek amonu (8:1:0,1). Odparować rozpuszczalniki i rozpuścić osad w 50% EtOH:H2O.
    2. Dodać zapas Dig-TMP w 50% EtOH:H2O do pożywki hodowli komórkowej do stężenia końcowego 5 µM. Doprowadzić pożywkę do temperatury 37 °C. Odessać pożywkę z płytek, dodać uprzednio ogrzaną pożywkę zawierającą Dig-TMP i umieścić płytki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min, aby umożliwić wyrównanie stężeń Dig-TMP.
    3. Podczas inkubacji komórek uprzednio ogrzać komorę UV (patrz Tabela materiałów) do 37 °C.
    4. Umieścić płytki w ogrzanej komorze UV i naświetlać komórki dawką 3 J/cm2 światłem UVA przez 5 min (dla tego eksperymentu). Podczas naświetlania płytki znajdowały się na bloku termostatycznym utrzymywanym w temperaturze 37 °C. Obliczyć czas ekspozycji według wzoru:
      Wzór na dawkę UV: Intensywność UV (µW/cm²) × Czas ekspozycji (sek); równanie procesu fotonicznego.
    5. Odessać pożywkę za pomocą pipety, dodać świeżą, ogrzaną pożywkę i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 h.
    6. Usunąć pożywkę i delikatnie przemyć naczynia raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS).
    7. Usunąć PBS i dodać 0,1% formaldehydu (FA) w PBS na 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Zapobiega to odrywaniu się komórek podczas wstępnego traktowania buforem CSK-R (bufor do ekstrakcji cytoszkieletu zawierający RNazę, opisany w punkcie 1.2.9.), który jest wymagany do usunięcia elementów cytoplazmatycznych i zmniejszenia tła w metodzie PLA.
    8. Odessać FA i przemyć naczynia raz PBS.
    9. Dodać bufor CSK-R i inkubować przez 5 min w RT, aby usunąć cytoplazmę [bufor CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 300 µg/mL RNazy A]. Odessać bufor, dodać świeży CSK-R i inkubować przez 5 min w RT.
      UWAGA: Zapas buforu CSK można przechowywać w temperaturze 4 °C, dodając Triton X i RNazę A bezpośrednio przed użyciem.
    10. Przemyć trzykrotnie PBS.
    11. Utrwalić komórki 4% formaldehydem w PBS przez 10 min w RT.
    12. Przemyć komórki PBS. Powtórzyć ten krok trzy razy.
    13. Dodać zimny 100% metanol i inkubować przez 20 min w temperaturze -20 °C.
    14. Przemyć komórki trzykrotnie PBS. Na tym etapie komórki można przechowywać w PBS w komorze wilgotnej w temperaturze 4 °C do tygodnia.
    15. Inkubować komórki w 80 µL 5 mM TritonX-100 przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    16. Inkubować komórki z 100 µL 5 mM EDTA w PBS uzupełnionym o 1 µL 100 mg/mL RNazy A przez 30 min w temperaturze 37 °C.
    17. Przemyć komórki trzykrotnie PBS.
    18. Przechowywać komórki w buforze blokującym (5% BSA i 10% surowicy koziej w PBS) w komorze wilgotnej przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Test ligacji bliskości (proximity ligation assay)

UWAGA: Przeprowadź test przybliżonej ligacji (proximity ligation assay) w dniu 3.

  1. Barwienie przeciwciałami
    1. Przygotować 40 μL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na płytkę: dodać odpowiednią objętość przeciwciał pierwszorzędowych w celu uzyskania pożądanego rozcieńczenia (przeciwciała mysie anty-Digoksygenina oraz królicze przeciwko komponentowi replisomu, takiemu jak MCM5, CDC45, PSF1 lub pMCM2; rozcieńczenia określone w Tabeli Materiałów) do buforu blokującego (aby osiągnąć objętość końcową 24 μL). Pomieszać przez delikatne opukiwanie i pozostawić na 20 min w RT. Przygotować mieszaninę główną (master mix) dla wielu próbek i wymieszać przez opukiwanie przed naniesieniem do dołków.
    2. Dodać 40 μL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do centrum dołka i inkubować w komorze wilgotnej przez 1 h w 37 °C. Podczas barwienia pozwolić sondom PLA i buforowi blokującemu ogrzać się do temperatury pokojowej.
    3. Przemyć komórki PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 w 1X PBS] w RT. Powtórzyć ten krok trzy razy.
    4. Podczas płukania przygotować 40 μL roztworu sond PLA na płytkę (sondy PLA składają się z przeciwciała wtórnego rozpoznającego IgG mysie lub królicze, kowalencyjnie powiązanego z oligonukleotydem PLUS lub MINUS): 8 μL sondy PLA anty-mysie-PLUS + 8 μL sondy PLA anty-królicze-MINUS + 24 μL buforu blokującego. Wymieszać i pozostawić na 20 min w RT. Przygotować mieszaninę główną dla wielu próbek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków. Nanieść roztwór na środek dołka w płytce.
    5. Odessać ostatni płuczący roztwór, dodać 40 μL roztworu sond PLA do centrum dołka i inkubować w komorze wilgotnej przez 1 h w 37 °C.
    6. Przemyć trzy razy w buforze A po 10 min każdy, na platformie skośnej w RT. Podczas płukania doprowadzić mieszaninę ligacyjną do temperatury RT.
  2. Ligacja i amplifikacja
    1. Przygotować 40 μL mieszaniny ligacyjnej na płytkę: 8 μL (5x) zapasu ligacyjnego + 31 μL wody destylowanej + 1 μL ligazy. Przygotować mieszaninę główną dla wielu płytek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków.
    2. Dodać 40 μL roztworu ligacyjnego do każdej płytki i inkubować w komorze wilgotnej przez 30 min w 37 °C.
    3. Przemyć komórki 3x buforem A, po 2 min każdy, na platformie skośnej w RT.
    4. Przygotować 40 μL roztworu amplifikacyjnego na płytkę: 8 μL (5x) zapasu amplifikacyjnego + 31,5 μL wody destylowanej + 0,5 μL polimerazy DNA. Przygotować mieszaninę główną dla wielu próbek i dobrze wymieszać przed naniesieniem do dołków.
    5. Dodać 40 μL roztworu amplifikacyjnego do każdej płytki i inkubować w komorze wilgotnej w 37 °C przez 100 min.
    6. Odessać roztwór amplifikacyjny i przemyć buforem B. Wykonać 6 płukań po 10 min każde, na platformie skośnej w RT.
    7. Przemyć raz 0,01x buforem B przez 1 min w RT.
    8. Odessać bufor B i inkubować płytki z przeciwciałami wtórnymi, Alexa Fluor 488 anty-mysie IgG oraz Alexa Fluor 568 anty-królicze IgG w roztworze blokującym przy odpowiednich rozcieńczeniach w buforze blokującym, w komorze wilgotnej, przez 30 min w 37 °C lub przez noc w 4 °C.
    9. Przemyć komórki trzy razy PBS-T, po 10 min każde na platformie skośnej w RT.
    10. Odessać PBS-T i zamontować w medium montującym z DAPI. Zamontowane płytki można obrazować natychmiast lub przechowywać w 4 °C w ciemności nie dłużej niż przez 4 dni przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie i kwantyfikacja

  1. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego (jeśli wymagane jest obrazowanie 3D, obejmij obszar co najmniej 3 µm w 15 warstwach). Przeprowadź eksperymenty w trzech powtórzeniach i wykonaj obrazy wystarczającej liczby pól, aby uzyskać co najmniej 100 obserwacji na próbkę lub warunek. Wszystkie pola i próbki, w tym kontrole, obrazuj przy użyciu tych samych ustawień ekspozycji.
  2. Kwantyfikację przeprowadź za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o darmowym i komercyjnym oprogramowaniu umożliwiającym przeprowadzenie tej analizy dla obrazów pojedynczych lub wielopłaszczyznowych).
    1. Wyodrębnij jądra komórkowe na podstawie barwienia DAPI. Wykonaj detekcję kropek PLA w jądrach. Przypisz kropki PLA do odpowiadających im jąder. Eksportuj wyniki liczby kropek PLA na jądro do pliku csv (patrz Plik uzupełniający 1 oraz Plik uzupełniający 2).
  3. Analiza statystyczna (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o sugerowanym darmowym i komercyjnym oprogramowaniu).
    1. Zweryfikuj, czy próbki wykazują rozkład normalny za pomocą testu Shapiro-Wilka.
    2. Ustal, czy istnieje istotna różnica między dwiema próbkami, stosując test t Studentowi (jeśli spełnione jest założenie o rozkładzie normalnym) lub test sum rang Wilcoxona (jeśli założenie o rozkładzie normalnym dla próbki nie jest spełnione).
  4. Wizualizacja danych: Wygeneruj wykresy punktowe połączone z wykresami pudełkowymi, aby zwizualizować rozkład danych, medianę (Q2) oraz 25.th (Q1) i 75.th percentyl dla różnych próbek (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o sugerowanym darmowym i komercyjnym oprogramowaniu).

4. Trójwymiarowa wizualizacja oddziaływań pMCM2: ICL

  1. Wykonaj obrazowanie płytek PLA za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym, używając obiektywu olejowego Plan Fluor 60x/1.25 z aperturą numeryczną. Pozyskaj 16 stosów obrazów obejmujących 1,6 mm i wygeneruj rekonstrukcję 3D przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

PLA Dig-TMP z białkami replisomu
Struktura Dig-TMP jest przedstawiona na Rysunku 1. Szczegóły syntezy, w której trimetylpsoralen został sprzężony poprzez łącznik glikolowy z digoksygeniną, były omawiane wcześniej17,21. Inkubacja komórek z tym związkiem, a następnie naświetlanie światłem o długości fali 365 nm (UVA), fotoaktywuje związek i indukuje reakcję sieciowania. Nieco ponad 90% adduktów to ICL

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż PLA jest bardzo potężną techniką, istnieją problemy techniczne, które należy rozwiązać, aby uzyskać jasne i powtarzalne wyniki. Przeciwciała muszą mieć wysokie powinowactwo i swoistość. Ponadto ważne jest, aby w jak największym stopniu zredukować niespecyficzne sygnały tła. Odkryliśmy, że błony i szczątki komórkowe przyczyniają się do tworzenia tła i usunęliśmy je w jak największym stopniu. Mycie zawierającymi detergent przed utrwaleniem i mycie metanolem po utrwaleniu pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program of the NIH, National Institute on Aging, United States (Z01-AG000746–08). J.H. jest wspierany przez National Natural Science Foundations of China (21708007 i 31871365).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 568, Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowoInvitrogenA-100111 na 1000
Płytki 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym 1,5MatTekP35-1.5-14-CNaczynia Microwell ze szklanym dnem 35 mm Szalka Petriego Microwell
Alexa Fluor 488, Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórneInvitrogenA-100011 na 1000
Surowica bydlęca albumina (BSA)SeraCare1900-0012Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało CDC45 (królik)Abcamab1267621 w 200
Klej komórkowyScience354240do roztworu cell-TAK
Mikroskop konfokalnyNikkonNikon TE2000 mikroskop z wirującym dyskiemwyposażony w oprogramowanie Volocity
Przeciwciało digoksygeniny (Dig) (mysz)Abcamab4201 na 200
Dig-TMPzsyntetyzowane w Odczynniki Seidman Lab
Duolink Amplification (5 razy;)Odczynniki DUO82010 Sigma-Aldrichnależy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Odczynniki do wykrywania in situ DuolinkDUO92007 Sigma-Aldrichnależy przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA MINUSSigma-AldrichDUO92004anty-mysi MINUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Duolink in situ oligonukleotydowa sonda PLA PLUSSigma-AldrichDUO92002anty-króliczek PLUS, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Bufor do płukania in situ Duolink ASigma-AldrichDUO82046Duolink, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Bufor do płukania in situ Duolink BSigma-AldrichDUO82048Duolink Wash Buffers, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni;
Mikroskop epifluorescencyjnyMikroskop ZeissAxiovert 200MWyposażony w pakiety oprogramowania Axio Vision (Zeiss, Niemcy)
Formaldehyd 16%Fisher ScientificPI28906do roztworu utrwalającego
Surowica koziaThermo31873Roztwór blokujący, odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy obrazuo otwartym kodzie źródłowymProfiler komórekdziała do analizy obrazów jednopłaszczyznowych
Wymagane oprogramowanie do analizy obrazu - wymagana licencjaBitplaneImarisCell Biology. Potrafi określić ilościowo kropki/jądra PLA w stosach obrazów (3D) i wykonać rekonstrukcje 3D
Ligaza (1 jednostka/μ l)Odczynniki DUO82029 Sigma-Aldrichnależy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Odczynnik do podwiązywania (5&razy;)Odczynniki DUO82009 Sigma-Aldrichnależy przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
Przeciwciało MCM2 (królik)Abcamab44611 na 200
Przeciwciało MCM5 (monoklonalne królika)AbcamAb759751 na 1000
MetanolLab ALLEYA2076wstępnie schłodzone w temperaturze -20° C przed użyciem
przeciwciało fosfoMCM2S108 (królik)Abcamab1092711 w 200
Polimeraza (10 jednostek /μ l)Odczynniki DUO82030 Sigma-Aldrichnależy przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Przedłuż złote podłoże montażowe z DAPIThermoFisher ScientificP36935
Przeciwciało PSF1 (królik)Abcamab1811121 na 200
RNAzy A 100 mg / mlQiagen19101muszą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danychopen sourceR studiodo generowania wykresów punktowych i pudełkowych
Oprogramowanie do analizy statystycznej i wizualizacji danych - wymagana licencjaOprogramowanie SystatSigmaplot V13
TMP (trioksalen)Sigma-AldrichT6137_1G
TritonX-100Sigma-AldrichT8787_250ML
Tween 20Sigma-AldrichP9416_100ML
UV boxPołudniowa Nowa Anglia UltrafioletWycofany. Zobacz komorę testową UV Opsytec jako możliwy zamiennik
Komora testowa UVOpsytecKOMORA TESTOWA UV BS-04
VE-821SelleckchemS8007końcowe stężenie wynosi 1&mikro; M
Life Odczynniki płuczące C Odczynniki Pakiet ggplot2

Bibliografia

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24(2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541(2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

Tagi

Zmiana z etykiet antygenowwi zania krzy owe mi dzy niciamitest ligacji w bliskim s siedztwiewizualizacja immunofluorescencyjnaanaliza wide ek replikacyjnychwykrywanie addukt w DNAinterakcje cyklu kom rkowegomikroskopia konfokalnaaktywacja kinazy ATR
Wizualizacja powtarzających się spotkań ze zmianą blokującą oznaczoną antygenem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.