Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Streszczenie

Transdukcja adenowirusowa ma tę zaletę, że powoduje silną i przejściową indukcję ekspresji interesującego genu do szerokiej gamy typów komórek i narządów. Jednak technologia rekombinowanego adenowirusa jest pracochłonna, czasochłonna i kosztowna. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół wykorzystujący system pAdEasy do uzyskiwania oczyszczonych cząstek adenowirusa, które mogą indukować silną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w transdukowanych komórkach. Zaletą tej ulepszonej metody jest szybsze przygotowanie i obniżenie kosztów produkcji w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Vogelsteina. Główne etapy technologii adenowirusowej to: (1) rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183; 2) opakowania cząstek adenowirusowych; (3) amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293; 4) oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej; oraz (5) miareczkowanie wirusa i badania funkcjonalne adenowirusa. Ulepszenia w stosunku do oryginalnej metody polegają na: (i) rekombinacji w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) selekcja rekombinowanych klonów metodą "ujemnej" i "dodatniej" reakcji PCR; (iii) transfekcja komórek AD293 przy użyciu systemu transfekcji K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącanie siarczanem amonu cząstek wirusa uwalnianych przez komórki AD293 w pożywce do hodowli komórkowych; oraz (v) oczyszczanie wirusa przez jednoetapowe ultrawirowanie w nieciągłym gradionym gradiacji chlorku cezu. Silną ekspresję interesującego genu (w tym przypadku GFP) uzyskano w różnych typach transdukowanych komórek (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) z różnych źródeł (ludzkich, bydlęcych, mysich). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

Wprowadzenie

Adenowirusy to wirusy bezotoczkowe zawierające nukleokapsyd i dwuniciowy liniowy genom DNA^1,2,3. Adenowirusy mogą infekować szeroki zakres typów komórek, a infekcja nie jest zależna od aktywnego podziału komórek gospodarza. Po zakażeniu adenowirus wprowadza swoje genomowe DNA do jądra komórkowego gospodarza, gdzie pozostaje epichromosomalny i jest transkrybowany wraz z genami gospodarza. W ten sposób osiągnięto minimalne potencjalne ryzyko mutagenezy insercyjnej lub regulacji onkogenów^4,5,6. Genom adenowirusa nie jest replikowany razem z genomem gospodarza, a zatem geny adenowirusa są rozcieńczane w dzielącej się populacji komórek. Wśród zalet transdukcji adenowirusowej są: (i) wysoki poziom ekspresji transgenu; (ii) zmniejszone ryzyko związane z integracją DNA wirusa z genomem gospodarza ze względu na ekspresję episomalną; (iii) transdukcja szerokiej gamy typów komórek dzielących się i niedzielących. Większość adenowirusów stosowanych w badaniach biomedycznych jest niereplikacyjna i nie ma regionu E1 class<="xref">7^,8,9. Do ich produkcji potrzebna jest linia komórkowa dostarczająca sekwencję E1 (taka jak HEK293). Poza tym region nieistotny dla cyklu życiowego wirusa (E3) został usunięty, aby umożliwić wprowadzenie transgenu do genomu wirusa; inne regiony (E2 i E4) były dalej deleczowane w niektórych adenowirusach, ale w tych przypadkach odnotowano zmniejszoną wydajność produkcji adenowirusa i niską ekspresję transgenu⁷.

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół do konstruowania, pakowania i oczyszczania adenowirusów za pomocą systemu AdEasy. Ulepszenia te pozwoliły na upakowanie adenowirusa w szybszy i bardziej ekonomiczny sposób w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Vogelsteina^2,10, ze względu na następujące zalety: (i) rekombinację w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) wybór rekombinowanych klonów metodą PCR; (iii) transfekcja komórek AD293 przy użyciu systemu transfekcji K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącanie cząstek adenowirusa z pożywki hodowlanej po upakowaniu i amplifikacji wirusa; (v) oczyszczanie adenowirusowe za pomocą jednoetapowego ultrawirowania gradientowego chlorku cezu (CsCl).

Protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu AdEasy (Rysunek 1) składa się z następujących kroków:

(1) Rekombinacja pAdTrack-GFP z pAdEasy-1 w BJ5183 bacteria
(2) Pakowanie cząstek adenowirusa
(3) Amplifikacja adenowirusa
(4) Oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej
(5) Miareczkowanie adenowirusa.

Rycina 1: Technologia produkcji adenowirusa. Główne etapy technologii adenowirusowej to: (1) Rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183. Wybrane rekombinowane plazmidy są amplifikowane w bakteriach DH5α, a następnie oczyszczane; (2) Pakowanie cząstek adenowirusa w komórkach AD293, które wytwarzają białka adeno-E1; (3) Amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293; (4) Oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej przez ultrawirowanie na gradionym gradiencie gęstości CsCl; (5) Miareczkowanie adenowirusa i badanie funkcjonalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tym protokole przedstawiliśmy technologię produkcji adenowirusa, który może indukować ekspresję GFP w komórkach gospodarza. GFP jest już wstawiony do szkieletu wektora wahadłowego pAdTrack-CMV (Addgene #16405), pod drugim promotorem CMV i jest używany jako gen reporterowy (Rysunek 1). Z tego powodu oznaczyliśmy tutaj wektor pAdTrack-CMV jako pAdTrack-GFP i oceniliśmy wyrażenie GFP w celach informacyjnych. Oprócz ekspresji GFP, system może być używany do nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, który może zostać sklonowany w wielu miejscach klonowania pAdTrack-CMV. Gen lub minigen sklonowany w pAdTrack-CMV jest zwykle bardziej wydajny w indukcji ekspresji w porównaniu z klasą cDNA¹¹. Dane wykazały silną ekspresję GFP w transdukowanych komórkach (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) z różnych źródeł (ludzkich, bydlęcych, mysich). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

Protokół

Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Ogólnie rzecz biorąc, adenowirusy są klasyfikowane jako organizmy o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i dlatego wszystkie manipulacje muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przez przeszkoloną osobę, noszącą sprzęt chroniący przed zagrożeniem biologicznym (w tym rękawice, maskę na twarz do aerozoli biologicznych, fartuch laboratoryjny itp.). Wszystkie materiały stałe skażone adenowirusem muszą być dezynfekowane 10% roztworem wybielacza przez 30 minut i sterylizowane w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C i 1 barze. W zależności od wprowadzonego genu, utworzony adenowirus może mieć niebezpieczny potencjał i może być klasyfikowany do innych poziomów bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie eksperymentalne

1. Do manipulacji adenowirusem należy używać oddzielnego kaptura do hodowli komórkowej oraz oddzielnego inkubatora dla każdego typu adenowirusa. Stosować kolby T z nasadkami filtrującymi do pakowania i amplifikacji wirusa; Unikaj w jak największym stopniu eksperymentów z transdukcją na wentylowanych płytkach Petriego.
2. Opróżnij kaptur do hodowli komórkowych po każdym użyciu i wystawiaj go na działanie promieniowania UV przez 15 minut.
3. Okresowo autoklawuj przyrząd do pipet, pipety i inne przybory. Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić hodowlę w oddzielnym laboratorium/kapturze komórek do pakowania adenowirusowego (komórki AD293) oraz komórek, które mają być użyte w eksperymentach transdukcji. Partie różnych adenowirusów amplifikowanych w tym samym okresie powinny być sprawdzone pod kątem zanieczyszczenia krzyżowego metodą PCR.
4. Przygotuj następujące rozwiązania.
   1. Przygotuj podłoże SOB (Super Optimal Broth): 20 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl (10 mM stężenie końcowe), 2,5 ml 1 M KCl (2,5 mM stężenie końcowe), i H₂O do 1 L. Po autoklawowaniu w temperaturze 121 °C dodać następujące sterylne roztwory: 5 ml 1 M MgCl₂ i 5 ml 1 M MgSO₄.
   2. Przygotuj pożywkę SOC (Super Optimal bulion with Catabolit repression): w 1 L sterylnego SOB dodaj następujące sterylne roztwory: 20 ml 1 M glukozy, 5 ml 1 M MgCl₂ i 5 ml 1 M MgSO₄.
   3. Przygotować roztwór do wytrącania: rozpuścić 29,5 g octanu potasu w 60 ml_H2O, dodać 11,5 ml kwasu octowego i_H2Odo 100 ml.
   4. Przygotować bufor do rekompozycji: 95 ml 20% glukozy, 5 ml 1 M Tris-Cl pH 8, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8 i dodać_H2Odo 200 ml.
   5. Przygotuj roztwór do lizy: 4,8 ml 8,3 M NaOH, 10 ml 20% SDS i H₂O do 200 ml.

2. Rekombinacja wektora wirusowego pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 u bakterii BJ5183

1. Linearyzacja pAdTrack-GFP i oczyszczanie zlinearyzowanego plazmidu.
   1. Przygotuj następującą mieszankę do trawienia na lodzie:
      10 μg pAdTrack-GFP
      5 μL 10x bezbarwnego bufora
      2 μL Pme I
      H₂O do końcowej objętości 50 μl.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w łaźni wodnej.
   3. Dezaktywować w temperaturze 65 °C przez 20 min.
   4. Sprawdź efektywność trawienia pAdTrack-GFP za pomocą Pme I: uruchom 1 μg strawionego plazmidu równolegle z 1 μg niestrawionego plazmidu na 0,8% żelu agarozowym.
2. Izolacja i oczyszczanie DNA
   UWAGA: Kroki 1-6 należy wykonać w dygestorium.
   1. Dodać równą objętość fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) na mieszaninę wytrawiania i odwracać probówkę, aż mieszanina stanie się jednorodna.
   2. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę wodną do probówki zbiorczej.
   3. Dodać równą objętość fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) na dolną fazę organiczną i odwirować.
   4. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę do tej samej probówki zbiorczej.
   5. Dodać równą objętość chloroformu do fazy wodnej zebranej w probówce zbiorczej i odwirować.
   6. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki zbiorczej.
   7. Dodaj 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2 objętości zimnego 100% etanolu i wir.
   8. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -70 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
   9. Rozmrozić próbkę na lodzie i odwirować ją przez 10 minut w temperaturze 16 200 x g i temperaturze 4 °C.
   10. Usunąć supernatant i dodać 750 μl 75% etanolu.
   11. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g i temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
   12. Krótko obrócić rurkę, aby usunąć cały supernatant i wysuszyć granulat w kapturze. Nie susz osadu DNA przez długi czas, ponieważ jest trudny do rozpuszczenia.
   13. Rozpuścić osad w 15 μl_H2O.
   14. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru (np. Nanodrop).
3. Transformacja bakterii AdEasier-1 za pomocą pAdTrack-GFP
   UWAGA: Na tym etapie następuje rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1.
   1. Przygotuj kompetentne chemicznie bakterie AdEasier-1 (BJ5183 zawierające pAdEasy-1, Addgene #16399), używając komercyjnego zestawu do transformacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać podwielokrotności 100 μl kompetentnych bakterii w temperaturze -80 °C.
   2. Rozmrozić porcję kompetentnych bakterii AdEasier-1 na lodzie i dodać 1 μg oczyszczonego, strawionego Pme I-digested pAdTrack-GFP. Delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę (nie pipetować mieszaniny). Inkubować przez 10 minut na lodzie.
   3. Dodać 900 μl pożywki SOC i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
   4. Mikrofugetacja przez 5 min przy 600 x g.
   5. Usunąć 900 μl supernatantu, wymieszać osad i supernatant, a następnie zasiać przekształcone bakterie na płytkach LB-agar z kanamycyną.
   6. Inkubować przez ~16 godzin w temperaturze 37 °C (nie przekraczać 18 godzin).
4. Selekcja możliwych dodatnich klonów metodą PCR
   1. Podziel wykałaczki na dwie połówki i wysterylizuj połówki wykałaczek przez autoklawowanie.
   2. Podnieś małe i półprzezroczyste kolonie za pomocą sterylnych półwykałaczek.
   3. Krótko obróć połówkę wykałaczki z bakteriami w 10 μl wody (w probówce do PCR), a następnie umieść połówkę wykałaczki w 1,5 ml probówce Eppendorfa zawierającej 100 μl pożywki SOC z kanamycyną. Inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C, podczas gdy klony są testowane metodą "ujemnego" i "pozytywnego" testu PCR.
   4. Inkubować probówki PCR zawierające 10 μl wody z bakteriami przez 5 minut w temperaturze 95 °C w celu uzyskania próbki bakteryjnej i przeprowadzić równolegle "ujemny" i "pozytywny" PCR.
   5. "Negatywny" PCR - w celu sprawdzenia integralności pAdTrack-GFP: Przygotuj następującą mieszankę PCR do ujemnego wyniku PCR na lodzie.
      5 μl próbki bakteryjnej
      0,1 μl startera Forward (4631 F: 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 μl odwróconego startera (5616 R: 5'-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
      0,1 μl dNTP 10 mM
      3 μL 5x bufor
      1,5 μL MgCl₂ 25mM
      0,1 μl polimerazy GoTaq
      H₂O do końcowej objętości 15 μL
      UWAGA: Kontrola pozytywna, w której matryca DNA jest wektorem pAdTrack-GFP, musi być uwzględniona.
   6. "Pozytywny" PCR - w celu zbadania obecności interesującego genu. Użyj specjalnych starterów dla wstawionego genu i przygotuj mieszankę jak w poprzednim kroku. Startery stosowane w GFP były następujące:
      F: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      Nr kat.: 5'-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
   7. Uruchom równolegle "ujemny" i "pozytywny" PCR. Program PCR trwa: 5 min, 95 °C; 40 cykli następujących kroków: 30 sekund, 95 °C; 30 sekund, 68 °C; 1 min, 72 °C; wydłużenie końcowe: 10 min, 72 °C.
      UWAGA: Dostosuj temperaturę wyżarzania do amplifikacji interesującego genu.
   8. Oceń produkty PCR na 1% żelu agarozowym i dokonaj wyboru klonów.
   9. Rozważ do dalszego przetwarzania klony, które nie dają produktów PCR dla "ujemnego PCR" i specyficzny produkt PCR po "dodatnim PCR".
5. Hoduj kultury bakteryjne wybranych rekombinowanych klonów
   1. Rozcieńczyć kultury przypuszczalnie dodatnich klonów (wynik w kroku 2.4.3.) w 4 ml pożywki SOC z kanamycyną i inkubować je przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.
6. Izolacja plazmidowego DNA z bakterii AdEasier-1 (Miniprep z wykorzystaniem lizy alkalicznej)
   1. Przenieść 1,5 ml kultury bakteryjnej do probówek mikrowirówek, odwirować przez 1 minutę przy 16 200 x g i usunąć supernatant.
   2. Przenieś kolejne 1,5 ml kultury bakteryjnej do tej samej probówki, powtórz wirowanie i usuń supernatant.
   3. Dodać 200 μl buforu do reprodukcji (50 mM glukozy, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
   4. Dodać 200 μl roztworu do lizy (0,2 N NaOH, 1% SDS), delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.
   5. Dodać 200 μl roztworu strącającego (60 ml 5 M octanu potasu, 11,5 ml lodowatego kwasu octowego, dodać_H2Odo 100 ml) i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.
   6. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g.
   7. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, dodać 500 μl izopropanolu, wymieszać i inkubować przez 20 minut na lodzie.
   8. Wirować przez 15 minut przy 16 200 x g i dodać 500 μl 75% etanolu.
   9. Wirować przez 10 minut przy 16 200 x g i usunąć supernatant.
   10. Wirować przez 3 minuty przy 16 200 x g, usunąć supernatant i dodać 15 μl_H2O.
7. Amplifikacja, izolacja i ponowne testowanie zrekombinowanych plazmidów
   1. Transformacja bakterii DH5α z DNA wyizolowanym z komórek AdEasier-1.
      1. Przygotuj kompetentne bakterie DH5α za pomocą komercyjnego zestawu do transformacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Rozmrozić 100 μl kompetentnych bakterii DH5α na lodzie, dodać rekombinowane DNA i inkubować 10 minut na lodzie. Następnie zasiaj bakterie na płytkach LB-agar z kanamycyną.
      3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      4. Zebrać kilka kolonii i wyhodować każdą z nich w 2 ml pożywki LB z kanamycyną, w temperaturze 37 °C, przez noc, potrząsając.
   2. Wyizolować DNA (Miniprep przy użyciu lizy alkalicznej) i ponownie zawiesić otrzymane DNA w 25 μL H₂O.
   3. Potwierdź dodatnie klony przez trawienie enzymatyczne.
      1. Przygotuj następującą mieszankę na lodzie:
         5 μl rekombinowanego DNA
         1,5 μl 10x bezbarwnego buforu
         0,5 μl Hind III lub Pst I
         H₂O do końcowej objętości 15 μL
      2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
         UWAGA: Jako kontrolę, należy również przetrawić plazmidy pAdTrack-GFP i pAdEasy-1.
      3. W każdej próbce dodaj 3 μl bufora ładującego Sx6 z RNazą A (jeśli RNaza A nie jest obecna w miniprep).
      4. Uruchom strawione fragmenty DNA na 1% elektroforezie w żelu agarozowym.
         UWAGA: Wzorzec trawienia dodatniego klonu zawiera większość fragmentów strawionego plazmidu pAdEasy, ujawniając rekombinację pAdEasy z wektorem pAdTrack. Interesujący gen powinien być potwierdzony przez trawienie enzymami restrykcyjnymi używanymi do klonowania.
   4. Przygotowanie plazmidowego DNA (klasy transfekcyjnej) do pakowania adenowirusa.
      1. Wyhoduj 200 ml kultury bakterii z dodatniego klonu, aby wyizolować plazmidowe DNA.
      2. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu do plasmid DNA Midiprep (np. Qiagen Plasmid Midi Kit) zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Pakowanie cząsteczek adenowirusa

1. Dzień 1. Zasiej komórki AD293
   1. Umyj komórki AD293 PBS i inkubuj je z 0,125% trypsyną przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
   2. Zbierz komórki w zimnym podłożu z surowicą.
   3. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
   4. Zawiesić komórki w pożywce z surowicą i wysiać komórki w kolbie o gęstości ~2 x 10⁶/T25. Najlepiej użyć kolby z filtrem.
2. Dzień 1. Trawienie rekombinowanego DNA za pomocą Pac I
   1. Przygotuj następującą mieszankę:
      6 μl rekombinowanego DNA (1 μg/μL)
      2 μl Pac I
      2,5 μl 10x bezbarwnego buforu
      _H2Odo końcowej objętości 25 μL
   2. Inkubować przez 3 godziny (lub noc) w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywować enzym w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
   3. Wytrącanie DNA etanolem: dodać 2,5 μl (1/10 v/v) 3 M octanu sodu i 2-3 objętości 100% etanolu. Inkubacja przez 30 minut w temperaturze -70 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
   4. Wirować przy 16 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w sterylnej wodzie.
3. Dzień 2: Transfekcja komórek AD293 przy użyciu odczynnika K2
   1. Dodać 40 μl Mnożnika K2 na komórki, dwie godziny przed transfekcją.
   2. Przygotuj roztwory A i B:
      Roztwór A: Dodać 6 μg Pac l-linearyzowanego DNA do 260 μl Opti-MEM.
      Roztwór B: Dodać 21,6 μl odczynnika K2 do 248,4 μl Opti-MEM.
   3. Dodać roztwór A na roztwór B i delikatnie wymieszać pipetując.
   4. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj kroplami mieszankę A i B do komórek.
4. Dzień 3-11: Monitorowanie ekspresji GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
   UWAGA: W mikroskopii fluorescencyjnej komórki powinny wydawać się zielone i powinny stopniowo się odklejać.
5. Dzień 11: Zbierz cząstki adenowirusa F1
   1. Zbierz oderwane komórki i pożywkę do probówki o pojemności 50 ml, zeskrob przylegające komórki i dodaj je do tej samej probówki.
   2. Wirować przez 5 minut przy 400 x g, zebrać supernatant do nowej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml PBS.
   3. Rozbijanie komórek
      1. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej.
      2. Wykonać trzy cykle zamrażania/rozmrażania (zamrażanie w ciekłym azocie lub w temperaturze -80 °C / rozmrażanie w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 7 minut).
      3. Przepuścić uszkodzone komórki przez igłę strzykawki 23 G trzy razy.
   4. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 9 600 x g przez 12 minut.
   5. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 50 ml z zebranym podłożem.

4. Amplifikacja adenowirusa

UWAGA: Jeśli komórki AD293 nie osiągnęły wymaganej konfluencji, porcje zasobów adenowirusowych (lizat uzyskany z komórek produkujących wirusa), które mają być użyte do infekcji, mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.

1. Przygotuj cząstki adenowirusa F2.
   1. Zasiać komórki AD293 w kolbie T75 (5 x 10⁶ komórek/kolbę).
   2. Zainfekuj ~ 90% zlewających się komórek AD293 za pomocą cząstek adenowirusa F1: dodaj homogenat komórkowy i pożywkę z kolby T25 na komórki wyhodowane w kolbie T75.
   3. Monitoruj ekspresję GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
   4. Zbierz komórki produkujące wirusa, gdy ~90% transdukowanego AD293 zostanie odłączone (~ 5^dzień po transdukcji). Przechowywać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 4 °C.
   5. Rozbić komórki (podobnie jak te dla F1) w 1 ml PBS.
2. Przygotuj cząstki adenowirusa F3.
   1. Zainfekuj ~ 90% konfluentnych komórek AD293 wysianych w kolbie T175 cząstkami adenowirusa F2 i pożywką do hodowli komórkowej z cząstek adenowirusa F2.
   2. Zbierz komórki (~5 dni po transdukcji).
   3. Rozbij komórki (podobnie jak te dla F1) w 2 ml PBS.
3. Przygotuj cząstki adenowirusa F4.
   1. Zainfekuj 5 kolb T175 zawierających ~ 90% zlewających się komórek AD293 cząstkami adenowirusa F3 i pożywką do hodowli komórkowych.
   2. Zbierz komórki (~5 dni po transdukcji).
   3. Rozbij komórki (podobnie jak te dla F1) w 3 ml PBS.
4. Przygotuj cząstki adenowirusa F5.
   1. Zainfekuj 25 kolb T175 zawierających ~ 90% zlewających się komórek AD293 za pomocą zapasu adenowirusa F4 i pożywki do hodowli komórkowych.

5. Oczyszczanie adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej

1. Pobieranie komórek wytwarzających wirusa i pożywki hodowlanej.
   1. Zbierz komórki AD293 F5 po 5 dniach od transdukcji.
   2. Przechowywać pożywkę w sterylnej butelce w celu wytrącenia cząstek adenowirusa.
      UWAGA: Pożywkę należy przechowywać w lodówce do czasu oczyszczenia adenowirusa.
   3. Odwirować komórki w temperaturze 400 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 ^oC.
   4. Zawiesić końcowy osad w 5 ml 10 mM Tris HCl, pH 8 z 2 mM MgCl₂.
   5. Zawiesinę rozdzielić w probówkach o pojemności 1,5 ml.
   6. Rozbij komórki (podobnie jak te dla F1): trzy cykle zamrażania/rozmrażania.
      UWAGA: Jeśli ultrawirowania nie można przeprowadzić natychmiast, należy przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
   7. Przepuścić zawiesinę komórek przez igłę strzykawki 23G trzy razy.
   8. Odwirować homogenat przy stężeniu 9 600 g przez 12 minut.
   9. Zachowaj supernatant do oczyszczenia adenowirusa przez ultrawirowanie w gradiencie CsCl
   .
2. Wytrącanie się adenowirusa uwolnionego w pożywce hodowlanej.
   1. Przynieś butelkę z zapisaną pożywką do hodowli komórkowych o temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 121 g siarczanu amonu do każdych 500 ml pożywki do hodowli komórkowych (nasycenie roztworu powinno wynosić między 40 - 42%).
   3. Dokładnie wymieszaj, aż siarczan amonu całkowicie się rozpuści.
   4. Inkubować przez minimum 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Wirować przy 1600 x g, przez 15 minut, w temperaturze 22 ^oC i zachować osad.
   6. Zawiesić osad w 4 ml 10 mM Tris HCl pH 8 z 2 mM MgCl₂; zawiesinę tę należy natychmiast oczyścić przez ultrawirowanie gradientowe CsCl.
      UWAGA: Jeśli etapu oczyszczania nie można następnie wykonać, dializuj ponownie zawieszony osad przez noc w stosunku do 10mM Tris HCl, pH 8 z 2mM MgCl₂.
3. Oczyszczanie adenowirusa przez ultrawirowanie.
   1. Przygotować nieciągły gradient CsCl w rurkach polipropylenowych dla wirnika SW41Ti. Dodać 3 ml 765 mg/ml CsCl (wysoka gęstość: 1,4 g/l) na dno probówki. Powoli dodaj 3 ml 288,5 mg/ml CsCl (niska gęstość: 1,2 g/l) na wierzch pierwszej warstwy CsCl.
   2. Delikatnie nałożyć 3 - 4 ml zawiesiny cząstek adenowirusa uwolnionej z komórek lub wytrąconej z pożywki do hodowli komórkowej (jak opisano wcześniej) na wierzch gradientu.
   3. Napełnij rurki olejem mineralnym i włóż rurki do zimnych wiader SW41Ti.
   4. Zrównoważ rurki. Upewnij się, że wypełnione rurki polipropylenowe są załadowane symetrycznie do wirnika. Umieść wirnik w ultrawirówce.
   5. Wirować przy 210 000 x g i 4 °C, przez 18 godzin, bez hamulca.
   6. Umieść probówki ultrawirówki na stojaku z czarnym papierem z tyłu, aby uzyskać opaski.
   7. Wyrzuć przezroczystą górną fazę, resztki komórek i górny pasek do pojemnika na odpady z roztworem wybielającym.
   8. Zbierz najniższy prążek zawierający kompletnego adenowirusa (~700 μL - 1 ml) w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml i trzymaj go na lodzie.
   9. Wstępnie zwilżyć kasetę dializacyjną w buforze do dializy (10 mM bufor Tris-Cl, pH 8, 2 mM MgCl₂).
   10. Wstrzyknąć oczyszczonego adenowirusa do kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml.
   11. Dializować przez noc w 10 mM buforze Tris-Cl pH 8, 2 mM MgCl₂ (zmienić bufor dializacyjny 3 - 4 razy).
   12. Zebrać materiał adenowirusowy z kasety dializacyjnej w porcjach 10 - 100 μl.
   13. Dodać sacharozę do 4% stężenia końcowego do podwielokrotności wirusa (w celu krioprotekcji).
   14. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

6. Miareczkowanie adenowirusa

1. Dzień 1: Posiewanie komórek
   1. Zasiaj komórki AD293 o gęstości 2,5 × 10⁵ komórek na dołek (na 12-dołkowej płytce hodowlanej) w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej, jak pokazano na Rysunek 2. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w każdym dołku w celu dokładnego określenia miana.

Rysunek 2: Konstrukcja płytki miareczkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Dzień 2: Transdukcja komórek
   1. Odłącz komórki od jednej studzienki za pomocą trypsyny i policz je. Zwróć uwagę na tę liczbę, ponieważ zostanie ona użyta do obliczenia miana wirusa.
   2. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia (1/10⁴; 1/10⁵; 1/10⁶; 1/10⁷) materiału wirusowego w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej w następujący sposób:
   3. 1/10³: rozcieńczenie materiału wirusowego - dodać 2 μl wirusa do 1998 μl kompletnej pożywki.
   4. 1/10⁴: Rozcieńczyć 1/10³ w stosunku 1:10, rozcieńczając 120 μl do 1080 μl kompletnej pożywki (A).
   5. 1/10⁵: Rozcieńczyć B w stosunku 1:10, rozcieńczając 120 μl A do 1080 μl kompletnej pożywki (B).
   6. 1/10⁶: Rozcieńczyć C w stosunku 1:10, rozcieńczając 120 μl B do 1080 μl kompletnej pożywki (C).
   7. 1/10⁷: Rozcieńczyć D w stosunku 1:10, rozcieńczając 120 μl C do 1080 μl kompletnego podłoża (D).
      UWAGA: Przygotuj 3 probówki z każdym rozcieńczeniem (A, B, C, D) do przeprowadzenia eksperymentu w trzech egzemplarzach.
   8. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z dołków i dodaj przygotowane roztwory wirusa, jak pokazano na Rysunek 2.
3. Dzień 3: Monitorowanie ekspresji GFP
   1. Sprawdź studzienki pod kątem obecności zielonych komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
4. Dzień 4: Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek GFP-dodatnich
   1. Przygotuj i oznacz dwanaście probówek o pojemności 1,5 ml.
   2. Zebrać pożywkę do hodowli komórkowych (wraz z odłączonymi komórkami) do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie.
   3. Dodaj 200 μl trypsyny do każdej studzienki.
   4. Inkubować płytkę przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .
   5. Zebrać komórki w tych samych probówkach Eppendorfa z pożywką do hodowli komórkowych. Trzymaj probówki na lodzie.
   6. Granulować komórki w temperaturze 400 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
   7. Usunąć supernatant i utrzymać probówki na lodzie.
   8. Zawiesić osad w 250 μl PBS + 2% FBS; trzymać probówki na lodzie.
   9. Przenieść zawiesinę komórek w probówkach lub płytce do cytometrii przepływowej.
   10. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym, rejestrując fluorescencję komórek wykazujących ekspresję GFP.
       Obliczanie miana: Próbki z 5 - 20% komórkami dodatnimi w wyniku GFP z populacji rodzicielskiej powinny być brane pod uwagę do obliczenia miana wirusa przy użyciu następującego wzoru:
       Miano (TU/ml) = D x F/100 x C/V
       D = współczynnik rozcieńczenia
       F = procent komórek dodatnich / 100
       C = liczba komórek / well
       V = objętość inokulum wirusa

7. Transdukcja adenowirusowa komórek docelowych i badanie indukowanej ekspresji białka

1. Dzień 1: Wysiewanie komórek
   1. Zasiej komórki docelowe, upewniając się, że są równomiernie rozprowadzone w studzienkach.
2. Dzień 2: Transdukcja komórek
   1. Odłącz komórki docelowe od jednej studzienki i policz je.
   2. Oblicz odpowiednią objętość zawiesiny adenowirusowej wymaganą do transdukcji komórek z pożądaną liczbą zakaźnych cząstek na komórkę.
   3. Dodaj odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do komórek docelowych.
3. Dzień 3: Usunięcie zawiesiny wirusa i sprawdzenie ekspresji GFP
   1. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą cząstki adenowirusa świeżą pożywką.
   2. Sprawdź ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy oryginalny protokół Vogelsteina, aby osiągnąć szybszą i bardziej efektywną produkcję adenowirusa. Po pierwsze, zaktualizowaliśmy metodologię, aby uzyskać łatwiejszy wybór rekombinantów. Po rekombinacji klony bakteryjne BJ5183 zostały przetestowane za pomocą "ujemnego PCR" w celu oceny integralności pAdTrack-GFP jako wskaźnika braku rekombinacji (Figura 3A) lub przez "pozytywny PCR" w celu zidentyfikowania interesującego genu, zasymilowanego w naszym przypadku z GFP (Rysunek 3B). Zarówno w "negatywnych", jak i "pozytywnych" PCR użyliśmy pAdTrack-GFP jako szablonu kontrolnego, który dał pasmo 986 pz dla integralności pAdTrack (Rysunek 3A, linia 1) i pasmo 264 pz dla GFP (Rysunek 3B, linia 3). Startery użyte do "ujemnego PCR" zostały zaprojektowane do amplifikacji fragmentu 986 pz zawierającego miejsce PmeI w pAdTrack-GFP. Ten fragment DNA jest drastycznie powiększony po rekombinacji i nie ulega amplifikacji w dodatnich rekombinowanych klonach. Ujemne klony do rekombinacji, w których pAdTrack-GFP pozostały nienaruszone, są reprezentowane w Rysunek 3A, pasy 3, 4 i 6. Startery wyżarzają sekwencje DNA przylegające do miejsca rekombinacji. Potencjalne dodatnie klony rekombinowane (Rysunek 3A, linie 2 i 5) wyrażone GFP, jak pokazano w Rysunek 3B, linia 1 i 2. Plazmidowe DNA z tych klonów wyizolowano i wykorzystano do transformacji DH5α w celu uzyskania większej ilości DNA. Te wstępnie wybrane rekombinowane plazmidy amplifikowane w DH5α zostały następnie przetestowane przez trawienie enzymatyczne. W Rysunek 3C-E ilustruje wyniki trawienia enzymatycznego jednego rekombinowanego-dodatniego klonu trawionego enzymami restrykcyjnymi Hind III, PstI, BamHI (Rysunek 3C, D, E pas 2). Wzorce trawienia HindIII i PstI rekombinowanego klonu były podobne do tych uzyskanych dla pAdEasy-1, ponieważ HindIII i PstI przecięły plazmid pAdEasy-1 odpowiednio 24 i 25 razy, (Rysunek 3C i D, pas 3); HindIII przeciął raz, a PstI przeciął cztery razy wektor pAdTrack-GFP (Rysunek 3C i D, pas 1). BamHI przeciął dwukrotnie wektor pAdEasy-1 (Rysunek 3C, linia 3) i raz pAdTrack-GFP (Rysunek 3C, linia 1).

PacI wyciąłem fragment 4,5 kb z rekombinowanego plazmidu (Rysunek 3F, linia 2), fragment 2863 pz z pAdTrack-GFP (Rysunek 3F, linia 1) i zlinearyzowałem wektor pAdEasy-1 (Rysunek 3F, ścieżka 3). Drabina DNA jest reprezentowana w Rysunek 3C-F, na pasach 4. Rekombinowany plazmid trawiono za pomocą Pac I w celu dalszego wykorzystania do transfekcji AD293.

Rysunek 3: Rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1. Plazmidy uzyskane po rekombinacji pAdTrack-GFP i pAdEasy-1 przetestowano metodą "ujemnego" PCR pod kątem integralności pAdTrack-GFP (A). Nierekombinowane klony zostały udowodnione przez obecność pasma 986 pz odpowiadającego sekwencji amplifikowanej z plazmidu pAdTrack-GFP (A, pasy 3, 4 i 6). Uzyskano również klony potencjalnie dodatnie dla rekombinacji (A, pasy 2 i 5). Gdy wektor pAdTrack-GFP został użyty jako szablon, uzyskano pasmo 986 bp dla pAdTrack-GFP (A, tor 1). Potencjalnie dodatnie rekombinowane klony przetestowano pod kątem ekspresji GFP za pomocą "pozytywnego" PCR (B); pasmo 264 pz pojawia się zarówno dla potencjalnie zrekombinowanych klonów (B, pas 1 i 2), jak i dla plazmidu pAdTrack-GFP. DNA z jednego potencjalnego rekombinowanego klonu przetestowano za pomocą enzymu restrykcyjnego HindIII, PstI, BamHI i PacI (C-F, tory 2). W grupie kontrolnej wektor pAdEasy-1 (C-F, tory 3) i plazmid pAdTrack-GFP (C-F, tory 1) były trawione tymi samymi enzymami. Drabina DNA jest reprezentowana na pasie C-F 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pakowanie i amplifikacja adenowirusa zostały przeprowadzone w komórkach AD293. Cząstki adenowirusa (AdV-GFP) oczyszczono z lizatu komórkowego AD293, a także z pożywki do hodowli komórkowych, skąd zostały uwolnione przez zakażone komórki. Aby zagęścić adenowirusa znajdującego się w pożywce do hodowli komórkowej, cząstki wytrącono siarczanem amonu, a następnie ponownie zawieszono w 10 mM Tris HCl pH 8 z 2 mM MgCl₂, tym samym buforem, który jest używany do lizy komórek. Następnie cząstki adenowirusa z lizatu komórkowego i z pożywki hodowlanej oczyszczono za pomocą nieciągłego wirowania gradientowego CsCl. Po ultrawirowaniu uzyskano silne pasmo oczyszczonego AdV-GFP, jak pokazano na Rysunek 4.

Rysunek 4: Oczyszczanie adenowirusowe przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie CsCl. Homogenat komórkowy i adenowirus wytrącony z pożywki poddano ultrawirowaniu na nieciągłym gradiencie utworzonym przez roztwory CsCl o niskiej i dużej gęstości. W obu przypadkach stwierdzono silne prążki GFP-adenowirusa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby określić miano wirusa wyrażone w jednostkach transdukcyjnych na jeden ml (TU/mL), komórki AD293 zostały zainfekowane seryjnymi rozcieńczeniami AdV-GFP. Po 48 godzinach zakażone komórki wykazywały ekspresję GFP, w odwrotnej korelacji ze współczynnikiem rozcieńczenia zawiesiny wirusa. Zaobserwowano to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP-dodatnich określono za pomocą cytometrii przepływowej (Ryc. 5). Aby obliczyć miano, wzięto pod uwagę rozcieńczenie wirusa, które wywołało 5 - 20% komórek GFP-dodatnich (Rysunek 5C). Zazwyczaj uzyskujemy miano wirusa ~10¹⁰ (TU/ml) dla GFP-adenowirusa.

Poniżej podajemy przykład obliczenia miana adenowirusa dla konkretnej partii adenowirusa, w której 300000 komórek (C) zostało transdukowanych 1 ml roztworu adenowirusowego (V), przy współczynniku rozcieńczenia 10⁶ (D), dla którego uzyskano 6% komórek GFP-dodatnich (F):

Miano (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 10⁶ x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 10¹⁰ TU/ml

Rycina 5: Ocena miana adenowirusa. Komórki AD293 zostały zakażone różnymi rozcieńczeniami adenowirusa. Czterdzieści osiem godzin później komórki obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia procentu komórek GFP dodatnich indukowanych przez różne rozcieńczenia adenowirusa (AD). Aby ustalić bramkę dla cytometrii przepływowej, przeanalizowano również komórki nietransdukowane (E). Miano obliczone dla współczynnika rozcieńczenia 10⁶, gdy 6% komórek było GFP dodatnich, wynosiło 1,8 x^{10 10} TU/ml. Dla paneli A-E, bary: 100μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby przetestować potencjał transdukcji przygotowanego adenowirusa, użyto czterech linii komórkowych: ludzkich komórek śródbłonka (EA.hy926), komórek śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC), mysich hepatocytów (Hepa 1-6) i mysich mezenchymalnych komórek zrębu (MSC). Komórki śródbłonka (EA.hy926 i BAEC) transdukowano za pomocą 25 TU/komórkę, hepatocyty transdukowano za pomocą 5 TU/komórkę, a MSC transdukowano za pomocą 250 TU/komórkę.

Oto przykład, jak obliczono objętość zawiesiny adenowirusowej potrzebnej do zakażenia 3 x 10⁶ komórek za pomocą 25 TU/komórkę, przy użyciu zawiesiny adenowirusowej o sile 1,8 x^{10 10} TU/ml.

Dla 1 komórki .............. 25 TU
3 x 10⁶ komórek .............. x TU x=75 x 10⁶ TU
Jeśli wirus zawiera
1,8 x 10¹⁰ TU .............. 1 ml
75 x 10⁶ TU .............. y mL y= 4,2 x ^10-3 ml = 4,2 μl wirusa

Czterdzieści osiem godzin po transdukcji, komórki zostały przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na Rysunek 6, ludzkie lub bydlęce komórki śródbłonka były transdukowane z dobrą wydajnością (~50%) dla 25 TU/komórkę (Rysunek 6 EA.hy926 i BAEC). Mysie hepatocyty (Hepa 1-6) były skutecznie transdukowane przez adenowirusa przy niskiej ilości cząstek adenowirusa (5 TU/komórkę), ale są również wrażliwe na adenowirusa, ponieważ zarejestrowano wyższy odsetek martwych komórek (komórki PI-dodatnie) (~16%) w porównaniu z innymi typami komórek. Mezenchymalne komórki zrębowe były najtrudniejsze do transdukcji (Ryc. 6), ze względu na brak specyficznych receptorów adenowirusowych (dane niepublikowane).

Rycina 6: Zakaźność adenowirusa i indukcja ekspresji GFP w transdukowanych komórkach. Ludzkie komórki śródbłonka (EA.hy926), komórki śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC), mysie hepatocyty (Hepa 1-6) i mysie mezenchymalne komórki zrębu (MSC) były transdukowane wskazaną ilością adenowirusa. GFP wykryto za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP dodatnich przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki PI-dodatnie oznaczone za pomocą cytometrii przepływowej wykazują śmiertelność komórek określoną przez transdukcję wirusa. Komórki EA.hy926, komórki śródbłonka aorty bydlęcej i komórki Hepa 1-6 były silnie transdukowane przez adenowirusa, a wydajność transdukcji wahała się od 41 do 52%. W przypadku MSC większa ilość wirusa (250 TU/komórki) indukowała tylko 27% dodatnich GFP w transdukowanych komórkach. Słupki: 100μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Rekombinowane adenowirusy są wszechstronnym narzędziem do dostarczania i ekspresji genów 12,13,14. Aby wywołać silną ekspresję białka przez transdukcję adenowirusa, sekwencja kodująca genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wprowadzana do genomu adenowirusa. System adenowirusowy AdEasy, opracowany w laboratorium Vogelsteina, składa się z plazmidu szkieletowego (pAdEasy-1) zawierającego większość genomu serotypu 5 adenowirusa typu dzikiego oraz wektora wahadłowego (pAdTrack), przeznaczonego do klonowania genów ^2,10. Delecja genów adenowirusowych E1 (odpowiedzialnych za składanie zakaźnych cząstek wirusa) i E3 (kodujących białka zaangażowane w unikanie odporności gospodarza) stworzyła przestrzeń w genomie adenowirusa, w którą można wprowadzić gen o wielkości 6,5-7,5 kb ^2,3. Ten rozmiar jest wystarczający dla wielu genów, zwłaszcza dla tych z krótszymi intronami 15,16,17. Są również badacze donoszący o produkcji adenowirusów przenoszących cDNA transgenu 18,19,20. Uzyskaliśmy jednak niższą wydajność ekspresji transgenu dla adenowirusów przenoszących cDNA niż dla ich odpowiedników przenoszących gen lub mini-gen (dane nie pokazane).

Ulepszając i dostosowując poprzednie metody 2,10,14,18,21, technologia produkcji adenowirusów wymaga krótszego czasu, niższych kosztów i mniejszego wysiłku. Pełnowymiarowe DNA adenowirusowe uzyskuje się w wyniku rekombinacji między wektorem czółenkowym a plazmidem pAdEasy-1 w homologicznym szczepie E. coli podatnym na rekombinację, BJ5183. Protokół zakłada transformację chemiczną komórek AdEasier-1 (bakterie BJ5183 zawierające pAdEasy-1). Technika ta nie wymaga elektroporatora, który może nie być dostępny w niektórych laboratoriach, jest bardzo prosta, zwiększa wydajność rekombinacji i skraca czas niezbędny do uzyskania kompetentnych komórek i przeprowadzenia transformacji. Wstępna selekcja rekombinowanych klonów przeprowadzana metodą PCR dodatkowo skraca czas i ułatwia całą procedurę. Podobną procedurę zastosował Zhao i współpracownicy²², jednak w protokole zoptymalizowaliśmy sekwencje starterów.

Do pakowania i amplifikacji GFP-adenowirusa użyto pochodnej linii komórkowej HEK293, a mianowicie komórek AD293, które są bardziej przylegające do płytki hodowlanej. Inne linie komórkowe powszechnie stosowane do produkcji adenowirusa to: 911, 293FT, pTG6559 (pochodna A549), PER. C6 (pochodna HER), GH329 (pochodna HeLa), N52. E6 oraz HeLa-E1 23,24,25,26. W naszych rękach nie uzyskano poprawy produkcji adenowirusa po użyciu 911 komórek (dane nie pokazane). Transfekcja komórek AD293 rekombinowanym plazmidem przy użyciu odczynnika K2 znacznie zwiększyła skuteczność etapu pakowania wirusa. Po wyprodukowaniu adenowirusa do ~70% adenowirusa nadal znajduje się w komórkach i jest uwalniane w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Zwiększanie liczby cykli nie jest odpowiednie, ponieważ niszczy adenowirusa.

W trakcie rutynowego procesu produkcji adenowirusa w pożywce do hodowli komórkowej uwalniane są liczne cząsteczki wirusa. Odrzucenie tej pożywki do hodowli komórkowych podczas pobierania zakażonych komórek AD293 spowodowałoby istotną utratę wirusa. Zoptymalizowaliśmy protokół opisany przez Schagena i współpracowników, aby oczyścić cząstki adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej poprzez wytrącanie siarczanem amonu²⁷. Metoda ta charakteryzuje się wyższą skutecznością w odzyskiwaniu adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej w porównaniu z metodą z użyciem glikolu polietylenowego²⁸. Wytrącony adenowirus należy natychmiast oczyścić przez ultrawirowanie lub przechowywać w lodówce przez kilka dni, ale tylko po dializie, w celu usunięcia nadmiaru soli. Utrzymywanie osadu dłużej niż kilka godzin bez dializy jest szkodliwe dla wirusa.

Oczyszczanie cząstek adenowirusa za pomocą ultrawirowania wykonanego w jednym kroku zmniejsza manipulację bulionem adenowirusowym i ułatwia procedurę w porównaniu z protokołami wykorzystującymi kolejne etapy ultrawirowania^14,29. Dializa oczyszczonego adenowirusa jest konieczna w celu usunięcia chlorku cezu, który może dalej wpływać na transdukcję. W protokole użyliśmy buforu Tris zawierającego MgCl₂, ale nie sacharozę do dializy, ponieważ wymaga on ogromnej, nieuzasadnionej ilości sacharozy, która jest potrzebna w inny sposób jako środek konserwujący do zamrażania. W ten sposób dodaliśmy sacharozę później, bezpośrednio do zapasów adenowirusowych przygotowanych do zamrożenia. Aby uniknąć częstego zamrażania i rozmrażania oczyszczonego adenowirusa, zaleca się porcjowanie zapasów adenowirusa i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C. Miano adenowirusa oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę gen reporterowy GFP i procent transdukowanych komórek dla określonego rozcieńczenia wirusa. Metoda ta jest szybsza w porównaniu z klasycznym testem płytki nazębnej i jest bardziej wiarygodna w porównaniu z oceną białek kapsydu (za pomocą różnych metod, takich jak ELISA lub cytometria przepływowa), która nie ujawnia zdolności do infekcji cząstek adenowirusa. Jednak kwantyfikacja oparta na teście ELISA, Q-PCR lub test płytki nazębnej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów są metodami alternatywnymi, szczególnie przydatnymi do miareczkowania adenowirusów, które nie zawierają znacznika fluorescencyjnego.

Biorąc pod uwagę, że adenowirusy pAdTrack pochodzą z ludzkich adenowirusów serotypu 5, który jest rozpoznawany przez wirusa Coxsackie i receptory adenowirusa (CAR), wykazaliśmy zdolność adenowirusa GFP do transdukcji komórek pochodzenia ludzkiego (komórki śródbłonka), ale także komórek innego pochodzenia: bydlęcego (komórki śródbłonka) i mysiego (mezenchymalne komórki zrębu i hepatocyty). Dane wykazały, że adenowirus GFP może indukować wysoki poziom ekspresji transgenu.

Podsumowując, zoptymalizowaliśmy tę pracochłonną technologię, aby skrócić czas, koszty i wysiłek potrzebny do uzyskania cząsteczek adenowirusa. Przygotowany adenowirus jest w stanie infekować różne typy komórek i indukować ekspresję interesującego genu. Protokół ten może być stosowany w różnych eksperymentach, ponieważ transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

SKRÓTY: AdV-GFP, cząstki adenowirusowe; BAEC, komórki śródbłonka aorty bydlęcej; CsCl, chlorek cezu; GFP, białko zielonej fluorescencji; MSC, mezenchymalne komórki zrębowe; TU, jednostki przetwornikowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa AD293	Agilent Technologies	240085
Ogniwa AdEasier-1	Addgene	16399
Agaroza I (do elektroforezy)	Thermo Scientific	17850
Siarczan amonu	Sigma	A4418
Sól sodowa ampicyliny	Sigma	A0166
BamH I	Thermo Scientific	FD0054
Płytki do hodowli komórkowych 100 mm	Eppendorf	30702115
Chlorek cezu	Sigma	L4036
Bakterie DH5alpha	Thermo Scientific	18265017
DMEM (GlutaMAX, 4,5g/L D-Glukoza)	Gibco	3240-027
EA.hy926 komórki	ATCC	CRL-2922
EDTA	Sigma	E5134
Etanol (99,8%)	Roth	5054.2
Płodowa surowica bydlęca Sigma		F7524
Kolby T25, T75, T175	Eppendorf
Glukoza	Sigma	G7021
Hepa 1-6 mysie hepatocyty	ATCC	CRL-1830
Hind III	Thermo Scientific	FD0504
Siarczan Kanamycyny	Thermo Scientific 15160054
System transfekcji K2	Biontex	T060-5.0
LB średni	Formedium	LBx0102
LB-agar	Formedium	LBx0202
Mix & Go E. coli Zestaw transformacyjny	Zymo Research	T3001
Midori Green Zaawansowane barwienie DNA	Nippon Genetics Europe	MG-04
NaOH	Sigma	S8045
Opti-MEM	Thermo Scientific	31985070
Pac I	Thermo Scientific	FD2204
pAdEasy-1	Addgene	16400
pAdTrack-CMV	Addgene	16405
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (24:24:1)	Invitrogen	15593-031
Polimeraza GoTaq	Promega	M3005
Pme I (Mss I)	Thermo Scientific	FD1344
Octan potasu	VWR Chemicals	43065P
Pst I	Thermo Scientific	FD0614
Qiagen Midi Zestaw przygotowawczy	Qiagen	12125
Skrobak do komórek	TPP	99003
SDS	Thermo Scientific	28365
Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66330
Pirogronian sodu	SIGMA	P5280-100G
Strzykawka z 23G neeedle	B Braun	464BR
Tris HCl	Sigma	1185-53-1
Trypan niebieski	Roth	CN76.1
Probówki 50ml	TPP	91050
Ultra-Clear Probówki (14x89 mm)	do redlic Beckman Coulter	344059
(chłodzona)	Sigma Sartorius	3-19KS
HeraeusFresco 17 Mikrowirówka	Thermo Scientific	75002420
Ultrawirówka z rotorem SW41Ti	Beckman Coulter	Optima L-80 XP
Breed Hood Pipety	Thermo Scientific	Class II
(0-2&mikro; l, 1-10 i mikro; l, 2-20&mikro; l, 10-100 i mikro; l, 20-200 i mikro; l, 100-1000 i mikro; l)	Termostat grzewczy Thermo Scientific
suchym blokiem	Biosan	TDB-120
Thermocycle	SensoQuest	012-103
Łaźnia wodna	Memmert	WNB 14