Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

16.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61691

⸱

10 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular Biology and Pathology "Nicolae Simionescu"

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Streszczenie

Transdukcja adenowirusowa ma tę zaletę, że powoduje silną i przejściową indukcję ekspresji interesującego genu do szerokiej gamy typów komórek i narządów. Jednak technologia rekombinowanego adenowirusa jest pracochłonna, czasochłonna i kosztowna. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół wykorzystujący system pAdEasy do uzyskiwania oczyszczonych cząstek adenowirusa, które mogą indukować silną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w transdukowanych komórkach. Zaletą tej ulepszonej metody jest szybsze przygotowanie i obniżenie kosztów produkcji w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Vogelsteina. Główne etapy technologii adenowirusowej to: (1) rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183; 2) opakowania cząstek adenowirusowych; (3) amplifikacja adenowirusa w komórkach AD293; 4) oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej; oraz (5) miareczkowanie wirusa i badania funkcjonalne adenowirusa. Ulepszenia w stosunku do oryginalnej metody polegają na: (i) rekombinacji w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) selekcja rekombinowanych klonów metodą "ujemnej" i "dodatniej" reakcji PCR; (iii) transfekcja komórek AD293 przy użyciu systemu transfekcji K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącanie siarczanem amonu cząstek wirusa uwalnianych przez komórki AD293 w pożywce do hodowli komórkowych; oraz (v) oczyszczanie wirusa przez jednoetapowe ultrawirowanie w nieciągłym gradionym gradiacji chlorku cezu. Silną ekspresję interesującego genu (w tym przypadku GFP) uzyskano w różnych typach transdukowanych komórek (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) z różnych źródeł (ludzkich, bydlęcych, mysich). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

Wprowadzenie

Adenowirusy są wirusami nieotoczkowymi zawierającymi nukleokapsyd oraz dwuniciowy liniowy genom DNA1,2,3. Adenowirusy mogą infekować szeroki zakres typów komórek, a infekcja ta nie zależy od aktywnego podziału komórek gospodarza. Po infekcji adenowirus wprowadza swoje DNA genomowe do jądra komórki gospodarza, gdzie pozostaje ono epichromosomalne i jest transkrybowane wraz z genami gospodarza. Dzięki temu uzyskuje się minimalne potencjalne ryzyko mutagenezy insercyjnej lub regulacji onkogenów4,5,6. Genom adenowirusowy nie replikuje się wraz z genomem gospodarza, przez co geny adenowirusowe ulegają rozcieńczeniu w dzielącej się populacji komórek. Do zalet transdukcji adenowirusowej należą: (i) wysoki poziom ekspresji transgenu; (ii) zmniejszone ryzyko związane z integracją wirusowego DNA z genomem gospodarza dzięki ekspresji episomalnej; (iii) możliwość transdukcji szerokiej gamy dzielących się i niedzielących się typów komórek. Większość adenowirusów stosowanych w badaniach biomedycznych jest niereplikacyjna ze względu na brak regionu E17,8,9. Do ich produkcji wymagana jest linia komórkowa dostarczająca sekwencję E1 (np. HEK293). Ponadto, w celu umożliwienia insercji transgenu do genomu wirusowego, usunięto region nieistotny dla cyklu życiowego wirusa (E3); w niektórych adenowirusach usunięto również inne regiony (E2 i E4), jednak w takich przypadkach zgłaszano obniżoną wydajność produkcji adenowirusów oraz niską ekspresję transgenu7.

W niniejszej pracy przedstawiamy ulepszony protokół konstrukcji, pakowania i oczyszczania adenowirusów przy użyciu systemu AdEasy. Ulepszenia te pozwoliły na szybsze i bardziej ekonomiczne pakowanie adenowirusów w porównaniu z oryginalną metodą opracowaną przez Bert Vogelsteina2,10, dzięki następującym zaletom: (i) rekombinacji w pAdEasy-1 zawierającym BJ5183 poprzez chemiczną transformację bakterii; (ii) selekcji klonów rekombinowanych za pomocą PCR; (iii) transfekcji komórek AD293 z wykorzystaniem systemu transfekcyjnego K2 do pakowania adenowirusów; (iv) wytrącania cząsteczek adenowirusowych z pożywki hodowlanej po pakowaniu i amplifikacji wirusa; (v) oczyszczania adenowirusów za pomocą jednokrotniej ultrawirówkowej centrifugacji w gradiencie chlorku cezu (CsCl).

Protokół produkcji adenowirusów z wykorzystaniem systemu AdEasy (Rysunek 1) obejmuje następujące etapy:

(1) Rekombinacja pAdTrack-GFP z pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183
(2) Pakowanie cząsteczek adenowirusowych
(3) Amplifikacja adenowirusa
(4) Oczyszczanie cząsteczek adenowirusowych z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej
(5) Miareczkowanie adenowirusa.

Schemat procesu edycji genów; rekombinacja plazmidu pAdTrack-GFP, pakowanie, amplifikacja, oczyszczanie.
Rycina 1: Technologia produkcji adenowirusa. Główne etapy technologii adenowirusowej obejmują: (1) Rekombinację pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183. Wyselekcjonowane plazmidy rekombinowane są amplifikowane w bakteriach DH5α, a następnie oczyszczane; (2) Pakowanie cząstek adenowirusowych w komórkach AD293, które produkują białka adeno-E1; (3) Amplifikację adenowirusa w komórkach AD293; (4) Oczyszczanie cząstek adenowirusowych z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości CsCl; (5) Miareczkowanie adenowirusa i testy funkcjonalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszym protokole zaprezentowano technologię produkcji adenowirusa, który może indukować ekspresję GFP w komórkach gospodarza. GFP jest już wstawione w szkielet wektora wahadłowego pAdTrack-CMV (Addgene #16405), pod drugim promotorem CMV i służy jako gen reporterowy (Rysunek 1). Z tego powodu w niniejszej pracy wektor pAdTrack-CMV oznaczono jako pAdTrack-GFP i w celach demonstracyjnych oceniono ekspresję GFP. Poza ekspresją GFP system ten może być wykorzystany do nadekspresji genu zainteresowania, który można sklonować w miejscach wielokrotnego klonowania (MCS) wektora pAdTrack-CMV. Gen lub minigen sklonowany w pAdTrack-CMV jest zazwyczaj bardziej efektywny w indukcji ekspresji w porównaniu z cDNA11. Dane wykazały silną ekspresję GFP w przetransdukowanych komórkach (takich jak hepatocyty, komórki śródbłonka) pochodzących z różnych źródeł (ludzkiego, bydlęcego, mysiego). Transfer genów za pośrednictwem adenowirusów stanowi jedno z głównych narzędzi w rozwoju nowoczesnych terapii genowych.

Protokół

Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Generalnie adenowirusy są klasyfikowane jako organizmy poziomu biosafety level 2, w związku z czym wszystkie manipulacje muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przez przeszkoloną osobę, w stroju ochronnym przeciwko zagrożeniom biologicznym (w tym rękawiczkach, masce ochronnej przeciwko aerozolom biologicznym, fartuchu laboratoryjnym itp.). Wszystkie materiały stałe zanieczyszczone adenowirusem należy zdezynfekować 10% roztworem wybielacza przez 30 min, a następnie poddać autoklawowaniu przez 30 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 1 bar. W zależności od wprowadzonego genu, stworzony adenowirus może wykazywać niebezpieczny potencjał i może zostać zaklasyfikowany do innych poziomów bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Do manipulacji z adenowirusami należy używać oddzielnej komory z laminarnym przepływem powietrza oraz oddzielnego inkubatora dla każdego typu adenowirusa. Do pakowania i amplifikacji wirusów należy stosować kolby T z nakrętkami z filtrem; należy w miarę możliwości unikać przeprowadzania eksperymentów transdukcji w wentylowanych szalkach Petriego.
  2. Po każdym użyciu należy opróżnić komorę do hodowli komórkowych i naświetlać ją promieniowaniem UV przez 15 min.
  3. Należy okresowo autoklawować pipetownik, pipety i inne przybory. Jeśli to możliwe, hodowlę komórek do pakowania adenowirusów (komórki AD293) oraz komórek wykorzystywanych w eksperymentach transdukcji należy prowadzić w oddzielnym laboratorium/komorze do hodowli komórkowych. Partie różnych adenowirusów amplifikowanych w tym samym czasie powinny zostać sprawdzone pod kątem kontaminacji krzyżowej za pomocą PCR.
  4. Przygotować następujące roztwory:
    1. Przygotować pożywkę SOB (Super Optimal Broth): 20 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl (stężenie końcowe 10 mM), 2,5 mL 1 M KCl (stężenie końcowe 2,5 mM) i H2O do objętości 1 L. Po autoklawowaniu w 121 °C dodać następujące sterylne roztwory: 5 mL 1 M MgCl2 i 5 mL 1 M MgSO4.
    2. Przygotować pożywkę SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression): do 1 L sterylnej pożywki SOB dodać następujące sterylne roztwory: 20 mL 1 M glukozy, 5 mL 1 M MgCl2 i 5 mL 1 M MgSO4.
    3. Przygotować roztwór do precypitacji: rozpuścić 29,5 g octanu potasu w 60 mL H2O, dodać 11,5 mL kwasu octowego i uzupełnić H2O do 100 mL.
    4. Przygotować bufor do resuspensji: 95 mL 20% glukozy, 5 mL 1 M Tris-Cl pH 8, 4 mL 0,5 M EDTA pH 8 i dodać H2O do 200 mL.
    5. Przygotować roztwór do lizy: 4,8 mL 8,3 M NaOH, 10 mL 20% SDS i H2O do 200 mL.

2. Rekombinacja wektora wirusowego pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1 w bakteriach BJ5183

  1. Linearyzacja pAdTrack-GFP i oczyszczanie zlinearyzowanego plazmidu.
    1. Przygotować w lodzie następującą mieszaninę do trawienia:
      10 µg pAdTrack-GFP
      5 µL 10x bezbarwnego buforu
      2 µL Pme I
      H2O do uzyskania końcowej objętości 50 µL.
    2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
    3. Inaktywować w temperaturze 65 °C przez 20 min.
    4. Sprawdzić wydajność trawienia pAdTrack-GFP za pomocą Pme I: na żelu agarozowym 0,8% przeprowadzić elektroforezę 1 µg trawionego plazmidu równolegle z 1 µg plazmidu nietrawionego.
  2. Izolacja i oczyszczanie DNA
    UWAGA: Kroki 1-6 należy przeprowadzić w dygestorium.
    1. Do mieszaniny po trawieniu dodać taką samą objętość fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i odwracać probówkę do uzyskania homogenicznej mieszaniny.
    2. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę wodną do probówki zbiorczej.
    3. Do dolnej fazy organicznej dodać taką samą objętość fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i wymieszać w wstrząsarku typu vortex.
    4. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę do tej samej probówki zbiorczej.
    5. Do fazy wodnej zebranej w probówce zbiorczej dodać taką samą objętość chloroformu i wymieszać w vortexie.
    6. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g, a następnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki zbiorczej.
    7. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu oraz 2 objętości zimnego 100% etanolu i wymieszać w vortexie.
    8. Inkubować przez 1 godzinę w -70 °C lub przez noc w -20 °C.
    9. Odmrozić próbkę w lodzie i wirować przez 10 min przy 16 200 x g i 4 °C.
    10. Usunąć nadsącz i dodać 750 µL 75% etanolu.
    11. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g i 4 °C, a następnie usunąć nadsącz.
    12. Krótko wirować probówkę, aby usunąć cały nadsącz, i osuszyć osad w dygestorium. Nie suszyć osadu DNA zbyt długo, ponieważ jest on trudny do rozpuszczenia.
    13. Rozpuścić osad w 15 µL H2O.
    14. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru (np. Nanodrop).
  3. Transformacja bakterii AdEasier-1 plazmidem pAdTrack-GFP
    UWAGA: Na tym etapie zachodzi rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1.
    1. Przygotować chemicznie kompetentne bakterie AdEasier-1 (BJ5183 zawierające pAdEasy-1, Addgene #16399), korzystając z komercyjnego zestawu do transformacji, zgodnie z instrukcjami producenta. Alikwoty 100 µL kompetentnych bakterii przechowywać w -80 °C.
    2. Odmrozić alikwot kompetentnych bakterii AdEasier-1 w lodzie i dodać 1 µg oczyszczonego pAdTrack-GFP trawionego Pme I. Wymieszać delikatnie, stukując probówką o dłoń (nie mieszać za pomocą pipety). Inkubować przez 10 min w lodzie.
    3. Dodać 900 µL pożywki SOC i inkubować przez 1 godzinę w 37 °C z wytrząsaniem.
    4. Wirować w mikrocentry fudze przez 5 min przy 600 x g.
    5. Usunąć 900 µL nadsączu, wymieszać osad z nadsączem i wysiać transformowane bakterie na płytki z agarem LB z kanamycyną.
    6. Inkubować przez ok. 16 godzin w 37 °C (nie przekraczać 18 godzin).
  4. Selekcja potencjalnych klonów pozytywnych za pomocą PCR
    1. Podzielić wykałaczki na pół i wysterylizować połówki wykałaczek w autoklawie.
    2. Pobrać małe, półprzezroczyste kolonie za pomocą sterylnych połówek wykałaczek.
    3. Krótko obrócić połówkę wykałaczki z bakteriami w 10 µL wody (w probówce do PCR), a następnie umieścić połówkę wykałaczki w probówce Eppendorf 1,5 mL zawierającej 100 µL pożywki SOC z kanamycyną. Inkubować przez 4-6 godzin w 37 °C, w czasie gdy klony są testowane za pomocą „negatywnego” i „pozytywnego” PCR.
    4. Inkubować probówki do PCR zawierające 10 µL wody z bakteriami przez 5 min w 95 °C w celu uzyskania próbki bakteryjnej, a następnie przeprowadzić równolegle „negatywny” i „pozytywny” PCR.
    5. PCR „negatywny” – w celu sprawdzenia integralności pAdTrack-GFP: przygotować w lodzie następującą mieszaninę do PCR negatywnego.
      5 µL próbki bakteryjnej
      0,1 µL startera Forward (4631 F: 5’-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 µL startera Reverse (5616 R: 5’-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
      0,1 µL dNTP 10 mM
      3 µL buforu 5x
      1,5 µL MgCl2 25mM
      0,1 µL polimerazy GoTaq
      H2O do uzyskania końcowej objętości 15 µL
      UWAGA: Należy uwzględnić kontrolę pozytywną, w której matrycą DNA jest wektor pAdTrack-GFP.
    6. PCR „pozytywny” – w celu sprawdzenia obecności genu docelowego. Użyć starterów specyficznych dla wstawionego genu i przygotować mieszaninę jak w poprzednim kroku. Dla GFP użyto następujących starterów:
      F: 5’-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5’-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
    7. Przeprowadzić równolegle PCR „negatywny” i „pozytywny”. Program PCR: 5 min, 95 °C; 40 cykli następujących etapów: 30 s, 95 °C; 30 s, 68 °C; 1 min, 72 °C; elongacja końcowa: 10 min, 72 °C.
      UWAGA: Dostosować temperaturę przyłączania (annealing) dla amplifikacji genu docelowego.
    8. Ocenić produkty PCR na 1% żelu agarozowym i dokonać selekcji klonów.
    9. Do dalszej obróbki wybrać klony, które nie dają produktów w „PCR negatywnym”, a dają specyficzny produkt w „PCR pozytywnym”.
  5. Hodowla kultur bakteryjnych wybranych klonów rekombinowanych
    1. Kultury domniemanych klonów pozytywnych (uzyskanych w kroku 2.4.3.) rozcieńczyć w 4 mL pożywki SOC z kanamycyną i inkubować przez noc w 37°C z wytrząsaniem.
  6. Izolacja plazmidowego DNA z bakterii AdEasier-1 (Miniprep z wykorzystaniem lizy alkalicznej)
    1. Przenieść 1,5 mL kultury bakteryjnej do probówek do mikrocentry fugi, wirować przez 1 min przy 16 200 x g i usunąć nadsącz.
    2. Przenieść kolejne 1,5 mL kultury bakteryjnej do tej samej probówki, powtórzyć wirowanie i usunąć nadsącz.
    3. Dodać 200 µL buforu do resuspensji (50 mM glukozy, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
    4. Dodać 200 µL roztworu do lizy (0,2 N NaOH, 1% SDS), wymieszać delikatnie odwracając probówkę.
    5. Dodać 200 µL roztworu do precypitacji (60 mL 5 M octanu potasu, 11,5 mL octu lodowatego, uzupełnić H2O do 100 mL) i wymieszać delikatnie odwracając probówkę.
    6. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g.
    7. Przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrocentry fugi, dodać 500 µL izopropanolu, wymieszać i inkubować przez 20 min w lodzie.
    8. Wirować przez 15 min przy 16 200 x g i dodać 500 µL 75% etanolu.
    9. Wirować przez 10 min przy 16 200 x g i usunąć nadsącz.
    10. Wirować przez 3 min przy 16 200 x g, usunąć nadsącz i dodać 15 µL H2O.
  7. Amplifikacja, izolacja i ponowne testowanie rekombinowanych plazmidów
    1. Transformacja bakterii DH5α DNA wyizolowanym z komórek AdEasier-1.
      1. Przygotować kompetentne bakterie DH5α, korzystając z komercyjnego zestawu do transformacji, zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Odmrozić 100 µL kompetentnych bakterii DH5α w lodzie, dodać rekombinowane DNA i inkubować przez 10 min w lodzie. Następnie wysiać bakterie na płytki z agarem LB z kanamycyną.
      3. Inkubować przez noc w 37 °C.
      4. Pobrać kilka kolonii i hodować każdą w 2 mL pożywki LB z kanamycyną w 37 °C przez noc z wytrząsaniem.
    2. Wyizolować DNA (Miniprep z wykorzystaniem lizy alkalicznej) i resuspendować otrzymane DNA w 25 µL H2O.
    3. Potwierdzić klony pozytywne za pomocą trawienia enzymatycznego.
      1. Przygotować w lodzie następującą mieszaninę:
        5 µL rekombinowanego DNA
        1,5 µL 10x bezbarwnego buforu
        0,5 µL Hind III lub Pst I
        H2O do uzyskania końcowej objętości 15 µL
      2. Inkubować w 37 °C przez 30 min.
        UWAGA: Jako kontrolę należy strawić również plazmidy pAdTrack-GFP i pAdEasy-1.
      3. Do każdej próbki dodać 3 µL buforu do ładowania Sx6 z RNazą A (jeśli RNaza A nie jest obecna w buforach do miniprepu).
      4. Przeprowadzić elektroforezę fragmentów strawionego DNA na 1% żelu agarozowym.
        UWAGA: Wzorzec trawienia klonu pozytywnego obejmuje większość fragmentów strawionego plazmidu pAdEasy, co wskazuje na rekombinację pAdEasy z wektorem pAdTrack. Gen docelowy powinien zostać wykazany po trawieniu enzymami restrykcyjnymi użytymi do klonowania.
    4. Przygotowanie plazmidowego DNA (klasy transfekcyjnej) do pakowania adenowirusów.
      1. Wyhodować 200 mL kultury bakterii z klonu pozytywnego w celu izolacji plazmidowego DNA.
      2. Wyizolować plazmidowe DNA, korzystając z komercyjnego zestawu do Midiprep DNA plazmidowego (np. Qiagen Plasmid Midi Kit), zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Pakowanie cząsteczek adenowirusowych

  1. Dzień 1. Wysiew komórek AD293
    1. Przemyć komórki AD293 roztworem PBS i inkubować z 0,125% trypsyną przez 2-5 min w temperaturze 37 °C.
    2. Zebrać komórki do zimnego pożywki z surowicą.
    3. Wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
    4. Resuspendować komórki w pożywce z surowicą i wysiać komórki z gęstością ~2 x 106/kolbę T25. Zaleca się stosowanie kolby z filtrem.
  2. Dzień 1. Trawienie rekombinowanego DNA za pomocą Pac I
    1. Przygotować następującą mieszaninę:
      6 µL rekombinowanego DNA (1 µg/µL)
      2 µL Pac I
      2,5 µL 10x bezbarwnego buforu
      H2O do końcowej objętości 25 µL
    2. Inkubować przez 3 h (lub przez noc) w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywować enzym w temperaturze 65 °C przez 20 min.
    3. Wytrącanie DNA etanolem: dodać 2,5 µL octanu sodu 3 M (1/10 v/v) oraz 2-3 objętości 100% etanolu. Inkubować przez 30 min w temperaturze -70 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
    4. Wirować przy 16 200 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C i resuspendować osad w sterylnej wodzie.
  3. Dzień 2: Transfekcja komórek AD293 przy użyciu odczynnika K2
    1. Dodać 40 µL K2 Multiplier do komórek na dwie godziny przed transfekcją.
    2. Przygotować roztwory A i B:
      Roztwór A: dodać 6 µg DNA zlinearyzowanego za pomocą Pac I do 260 µL Opti-MEM.
      Roztwór B: dodać 21,6 µL odczynnika K2 do 248,4 µL Opti-MEM.
    3. Dodać roztwór A do roztworu B i delikatnie wymieszać za pomocą pipety.
    4. Inkubować mieszaninę przez 20 min w temperaturze pokojowej. Dodać kroplowo mieszaninę A i B do komórek.
  4. Dzień 3-11: Monitorowanie ekspresji GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    UWAGA: Komórki powinny wykazywać zieloną fluorescencję w mikroskopii i powinny stopniowo odrywać się od podłoża.
  5. Dzień 11: Zbiór adenowirusowych cząsteczek F1
    1. Zebrać oddzielone komórki oraz pożywkę do probówki 50 mL, zdrapać komórki przylegające i przenieść je do tej samej probówki.
    2. Wirować przez 5 min przy 400 x g, zebrać nadsącz do nowej probówki i resuspendować osad komórkowy w 0,5 mL PBS.
    3. Rozbicie komórek
      1. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do mikrocentryfugi.
      2. Przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania (zamrażać w ciekłym azocie lub w temperaturze -80 °C / rozmrażać w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 7 min).
      3. Przepuścić rozbite komórki przez igłę strzykawki 23 G trzy razy.
    4. Usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 9 600 x g przez 12 min.
    5. Przenieść nadsącz do probówki 50 mL z zebraną pożywką.

4. Amplifikacja adenowirusa

UWAGA: Jeśli komórki AD293 nie osiągnęły wymaganej konfluencji, alikwoty zapasów adenowirusa (lizatu otrzymanego z komórek produkujących wirusa), które mają zostać wykorzystane do infekcji, można przechowywać w temperaturze -80 °C.

  1. Przygotowanie cząsteczek adenowirusowych F2.
    1. Wysiać komórki AD293 w kolbie T75 (5 x 106 komórek/kolbę).
    2. Zainfekować komórki AD293 przy konfluencji ~90% za pomocą cząsteczek adenowirusowych F1: dodać homogenat komórkowy oraz pożywkę z kolby T25 do komórek hodowanych w kolbie T75.
    3. Monitorować ekspresję GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    4. Zebrać komórki produkujące wirusa, gdy ~90% przetransdukowanych komórek AD293 oddzieli się od podłoża (~ 5ty dzień po transdukcji). Przechowywać pożywkę hodowlaną w temperaturze 4 °C.
    5. Zniszczyć komórki (w sposób analogiczny do komórek F1) w 1 mL PBS.
  2. Przygotowanie cząsteczek adenowirusowych F3.
    1. Zainfekować komórki AD293 wysiane w kolbie T175 przy konfluencji ~90% cząsteczkami adenowirusowymi F2 oraz pożywką z hodowli cząsteczek adenowirusowych F2.
    2. Zebrać komórki (~5 dni po transdukcji).
    3. Zniszczyć komórki (w sposób analogiczny do komórek F1) w 2 mL PBS.
  3. Przygotowanie cząsteczek adenowirusowych F4.
    1. Zainfekować 5 kolb T175 zawierających komórki AD293 przy konfluencji ~90% cząsteczkami adenowirusowymi F3 oraz pożywką hodowlaną.
    2. Zebrać komórki (~5 dni po transdukcji).
    3. Zniszczyć komórki (w sposób analogiczny do komórek F1) w 3 mL PBS.
  4. Przygotowanie cząsteczek adenowirusowych F5.
    1. Zainfekować 25 kolb T175 zawierających komórki AD293 przy konfluencji ~90% zapasem cząsteczek adenowirusowych F4 oraz pożywką hodowlaną.

5. Oczyszczanie adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej

  1. Zbiór komórek produkujących wirusa i pożywki hodowlanej.
    1. Zebierz komórki AD293 linii F5 po 5 dniach od transdukcji.
    2. Przelej pożywkę do sterylnej butelki w celu wytrącenia cząstek adenowirusa.
      UWAGA: Przechowuj pożywkę w lodówce do momentu oczyszczania adenowirusa.
    3. Wiruj komórki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 oC.
    4. Resuspenduj końcowy osad w 5 mL 10 mM Tris HCl, pH 8 z 2 mM MgCl2.
    5. Rozdziel zawiesinę do probótek 1,5 mL.
    6. Zniszcz komórki (analogicznie jak w przypadku F1): poprzez trzy cykle zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: Jeśli ultrawirowanie nie może zostać przeprowadzone natychmiast, przechowuj próbki w temperaturze -80 °C.
    7. Przepuść zawiesinę komórkową trzy razy przez igłę strzykawki 23G.
    8. Wiruj homogenat przy 9 600 x g przez 12 min.
    9. Zabezpiecz nadsącz do oczyszczania adenowirusa metodą ultrawirowania w gradiencie CsCl.
  2. Wytrącanie adenowirusa uwolnionego do pożywki hodowlanej.
    1. Dostosuj temperaturę butelki z zabezpieczoną pożywką komórkową do temperatury pokojowej.
    2. Dodaj 121 g siarczanu amonu na każde 500 mL pożywki komórkowej (stężenie roztworu powinno wynosić od 40% do 42%).
    3. Mieszaj ostrożnie do całkowitego rozpuszczenia siarczanu amonu.
    4. Inkubuj przez minimum 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Wiruj przy 1600 x g przez 15 min w temperaturze 22 oC i zbierz osad.
    6. Resuspenduj osad w 4 mL 10 mM Tris HCl pH 8 z 2 mM MgCl2; zawiesinę tę należy niezwłocznie oczyścić metodą ultrawirowania w gradiencie CsCl.
      UWAGA: Jeśli etap oczyszczania nie może być wykonany bezpośrednio, dializuj resuspendowany osad przez noc przeciwko 10 mM Tris HCl, pH 8 z 2 mM MgCl2.
  3. Oczyszczanie adenowirusa metodą ultrawirowania.
    1. Przygotuj nieciągły gradient CsCl w probówkach polipropylenowych do rotora SW41Ti. Dodaj 3 mL CsCl o stężeniu 765 mg/mL (wysoka gęstość: 1,4 g/L) na dno probówki. Powoli dodaj 3 mL CsCl o stężeniu 288,5 mg/mL (niska gęstość: 1,2 g/L) na pierwszą warstwę CsCl.
    2. Ostrożnie nałóż 3–4 mL zawiesiny cząstek adenowirusa uwolnionych z komórek lub wytrąconych z pożywki komórkowej (jak opisano wcześniej) na wierzch gradientu.
    3. Wypełnij probówki olejem mineralnym i umieść je w schłodzonych koszyczkach SW41Ti.
    4. Zrównoważ probówki. Upewnij się, że wypełnione probówki polipropylenowe są załadowane symetrycznie do rotora. Umieść rotor w ultrawirowarce.
    5. Wiruj przy 210 000 x g i 4 °C przez 18 godzin, bez hamowania.
    6. Umieść probówki z ultrawirowarki na statywie z czarną kartką papieru w tle, aby uwidocznić prążki.
    7. Usuń przeźroczystą fazę górną, szczątki komórkowe oraz górny prążek do pojemnika na odpady z roztworem wybielającym.
    8. Zbierz najniższy prążek zawierający kompletny adenowirus (~700 µL – 1 mL) do sterylnej probówki 1,5 mL i przechowuj go w lodzie.
    9. Nawilż kasetę dializacyjną w buforze do dializy (bufor Tris-Cl 10 mM pH 8, 2 mM MgCl2).
    10. Wstrzyknij oczyszczony adenowirus do kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki 2 mL.
    11. Dializuj przez noc przeciwko buforowi Tris-Cl 10 mM pH 8, 2 mM MgCl2 (wymień bufor do dializy 3–4 razy).
    12. Zbierz zapas adenowirusa z kasety dializacyjnej w aliquotach 10–100 μL.
    13. Dodaj sacharozę do stężenia końcowego 4% do aliquotów wirusa (w celu krioprotekcji).
    14. Przechowuj aliquoty w temperaturze -80 °C.

6. Miareczkowanie adenowirusa

  1. Dzień 1: Wysiewanie komórek
    1. Wysiej komórki AD293 z gęstością 2,5 × 105 komórek na dołek (w 12-dołkowej płytce hodowlanej) w 1 mL kompletnej pożywki wzrostowej, zgodnie z Rysunkiem 2. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozprowadzone w każdym dołku w celu dokładnego oznaczenia miana.

Tabela liczenia komórek; eksperyment z rozcieńczeniem; transdukcja roztworami A-D; stężenie: 10^4-10^7
Rycina 2: Projekt płytki do miareczkowania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Dzień 2: Transdukcja komórek
    1. Odczepić komórki z jednej studniki za pomocą trypsyny i je policzyć. Zapisać tę liczbę, ponieważ zostanie ona wykorzystana do obliczenia miana wirusa.
    2. Wykonać rozcieńczenia seryjne (1/104; 1/105; 1/106; 1/107) zapasu wirusa w 1 mL kompletnej pożywki wzrostowej w następujący sposób:
    3. 1/103: rozcieńczenie zapasu wirusa – dodać 2 μL zapasu wirusa do 1998 μL kompletnej pożywki.
    4. 1/104: wykonać rozcieńczenie 1:10 z 1/103, rozcieńczając 120 μL do 1080 μL kompletnej pożywki (A).
    5. 1/105: wykonać rozcieńczenie 1:10 z B, rozcieńczając 120 μL z A do 1080 μL kompletnej pożywki (B).
    6. 1/106: wykonać rozcieńczenie 1:10 z C, rozcieńczając 120 μL z B do 1080 μL kompletnej pożywki (C).
    7. 1/107: wykonać rozcieńczenie 1:10 z D, rozcieńczając 120 μL z C do 1080 μL kompletnej pożywki (D).
      UWAGA: Przygotować 3 probówki dla każdego rozcieńczenia (A, B, C, D), aby przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach.
    8. Usunąć pożywkę z hodowli komórkowych ze studni i dodać przygotowane rozcieńczenia wirusa, zgodnie z Rysunkiem 2.
  2. Dzień 3: Monitorowanie ekspresji GFP
    1. Sprawdzić studnie pod kątem obecności zielonych komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
  3. Dzień 4: Analiza cytometryczna komórek GFP-dodatnich
    1. Przygotować i oznakować dwanaście probówek o pojemności 1,5 mL.
    2. Zebrać pożywkę z hodowli komórkowych (wraz z odczepionymi komórkami) do probówek 1,5 mL i przechowywać je w lodzie.
    3. Dodać 200 μL trypsyny do każdej studni.
    4. Inkubować płytkę przez 2–3 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2.
    5. Zebrać komórki do tych samych probówek Eppendorf z pożywką do hodowli komórkowych. Probówki przechowywać w lodzie.
    6. Zwirować komórki z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    7. Usunąć nadsącz; probówki przechowywać w lodzie.
    8. Resuspendować osad w 250 μL PBS + 2% FBS; probówki przechowywać w lodzie.
    9. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek lub na płytkę do cytometrii przepływowej.
    10. Przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym, rejestrując fluorescencję komórek wykazujących ekspresję GFP.
      Obliczanie miana: Do obliczenia miana wirusa za pomocą poniższego wzoru należy przyjąć próbki, w których od 5% do 20% komórek populacji wyjściowej jest GFP-dodatnich:
      Miano (TU/mL) = D x F/100 x C/V
      D = czynnik rozcieńczenia
      F = procent komórek dodatnich / 100
      C = liczba komórek / studnię
      V = objętość inokulatu wirusowego

7. Transdukcja komórek docelowych adenowirusami i badanie indukowanej ekspresji białka

  1. Dzień 1: Wysiewanie komórek
    1. Wysieć komórki docelowe, upewniając się, że są one równomiernie rozprowadzone w dołkach.
  2. Dzień 2: Transdukcja komórek
    1. Odłączyć komórki docelowe z jednego dołka i policzyć je.
    2. Obliczyć odpowiednią objętość zawiesiny adenowirusowej niezbędną do transdukcji komórek z pożądaną liczbą cząsteczek zakaźnych na komórkę.
    3. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny wirusowej do komórek docelowych.
  3. Dzień 3: Usunięcie zawiesiny wirusowej i kontrola ekspresji GFP
    1. Wymienić pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą cząsteczki adenowirusowe na świeżą pożywkę.
    2. Sprawdzić ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy oryginalny protokół Vogelsteina, aby uzyskać szybszą i bardziej efektywną produkcję adenowirusów. Po pierwsze, zrewidowaliśmy metodologię w celu ułatwienia selekcji rekombinantów. Po rekombinacji klony bakteryjne BJ5183 poddano testowi „negatywnego PCR”, aby ocenić integralność pAdTrack-GFP jako wskaźnik braku rekombinacji (Rysunek 3A), lub „pozytywnego PCR”, aby zidentyfikować geny zainteresowania, którym w naszym przypadku było GFP (Rysunek 3B). W obu typach PCR („negatywnym” i „pozytywnym”) jako matrycę kontrolną wykorzystano pAdTrack-GFP, co dało prążek 986 bp dla integralności pAdTrack (Rysunek 3A, ścieżka 1) oraz prążek 264 bp dla GFP (Rysunek 3B, ścieżka 3). Startery użyte do „negatywnego PCR” zaprojektowano tak, aby amplifikowały fragment o długości 986 bp zawierający miejsce PmeI w pAdTrack-GFP. Fragment ten ulega drastycznemu powiększeniu po rekombinacji i nie jest amplifikowany w pozytywnych klonach rekombinantycznych. Klony negatywne pod kątem rekombinacji, w których pAdTrack-GFP pozostał nienaruszony, przedstawiono na Rysunku 3A, ścieżki 3, 4 i 6. Startery wiążą się z sekwencjami DNA sąsiadującymi z miejscem rekombinacji. Potencjalne pozytywne klony rekombinantyczne (Rysunek 3A, ścieżki 2 i 5) wykazywały ekspresję GFP, co pokazano na Rysunku 3B, ścieżki 1 i 2. DNA plazmidowe z tych klonów wyizolowano i wykorzystano do transformacji DH5α w celu uzyskania większej ilości DNA. Te wstępnie wyselekcjonowane plazmidy rekombinantyczne namnożone w DH5α poddano następnie analizie poprzez trawienie enzymatyczne. Na Rysunku 3C-E przedstawiono wyniki trawienia enzymatycznego jednego pozytywnego klonu rekombinantycznego za pomocą enzymów restrykcyjnych Hind III, PstI i BamHI (Rysunek 3C, D, E, ścieżka 2). Wzory trawienia HindIII i PstI klonu rekombinantycznego były podobne do wzorów uzyskanych dla pAdEasy-1, ponieważ HindIII i PstI tną plazmid pAdEasy-1 odpowiednio 24 i 25 razy (Rysunek 3C i D, ścieżka 3); natomiast HindIII przeciął raz, a PstI cztery razy wektor pAdTrack-GFP (Rysunek 3C i D, ścieżka 1). BamHI przeciął wektor pAdEasy-1 dwa razy (Rysunek 3C, ścieżka 3) oraz pAdTrack-GFP jeden raz (Rysunek 3C, ścieżka 1).

PacI wycięła fragment o wielkości 4,5 kb z plazmidu rekombinowanego (Rysunek 3F, ścieżka 2), fragment o wielkości 2863 bp z pAdTrack-GFP (Rysunek 3F, ścieżka 1) oraz zlinearyzowała wektor pAdEasy-1 (Rysunek 3F, ścieżka 3). Drabina DNA przedstawiona jest na Rysunku 3C-F, w ścieżkach 4. Plazmid rekombinowany został poddany trawieniu enzymem PacI w celu dalszego wykorzystania do transfekcji komórek AD293.

Schematy selekcji PCR i trawienia enzymatycznego przedstawiające analizę plazmidów; żele elektroforetyczne z oznakowanymi rozmiarami prążków; użyte enzymy HindIII, PstI, BamHI, PacI.
Rycina 3: Rekombinacja pAdTrack-GFP z plazmidem pAdEasy-1. Plazmidy otrzymane po rekombinacji pAdTrack-GFP i pAdEasy-1 przebadano za pomocą „negatywnej” reakcji PCR pod kątem integralności pAdTrack-GFP (A). Klony nierekombinowane objawiły się obecnością prążka 986 bp odpowiadającego sekwencji namnożonej z plazmidu pAdTrack-GFP (A, ścieżki 3, 4 i 6). Uzyskano również klony potencjalnie pozytywne pod kątem rekombinacji (A, ścieżki 2 i 5). Gdy jako matrycy użyto wektora pAdTrack-GFP, otrzymano prążek 986 bp dla pAdTrack-GFP (A, ścieżka 1). Potencjalnie pozytywne klony rekombinowane przebadano pod kątem ekspresji GFP za pomocą „pozytywnej” reakcji PCR (B); prążek 264 bp pojawił się dla obu potencjalnie rekombinowanych klonów (B, ścieżki 1 i 2), a także dla plazmidu pAdTrack-GFP. DNA z jednego potencjalnego klonu rekombinowanego poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi HindIII, PstI, BamHI i PacI (C-F, ścieżki 2). W kontrolach wektor pAdEasy-1 (C-F, ścieżki 3) oraz plazmid pAdTrack-GFP (C-F, ścieżki 1) trawiono tymi samymi enzymami. Drabina DNA jest przedstawiona w C-F ścieżka 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Pakowanie i amplifikacja adenowirusów zostały przeprowadzone w komórkach AD293. Cząsteczki adenowirusowe (AdV-GFP) oczyszczono z lizatu komórek AD293 oraz z pożywki hodowlanej, do której zostały uwolnione przez zainfekowane komórki. W celu skoncentrowania adenowirusów znajdujących się w pożywce hodowlanej, cząsteczki wytrącono siarczanem amonu, a następnie resuspendowano w 10 mM Tris HCl pH 8 z 2 mM MgCl2, w tym samym buforze, który zastosowano do lizy komórek. Następnie cząsteczki adenowirusowe z lizatu komórkowego i z pożywki hodowlanej oczyszczono metodą ultrawirowania w nieciągłym gradiencie CsCl. Po ultrawirowaniu uzyskano wyraźny prążek oczyszczonego AdV-GFP, co przedstawiono na Rysunku 4.

Gradient wirowania lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, separacja pasm adenowirusowych, gradient gęstości.
Rycina 4: Oczyszczanie adenowirusów metodą ultrawirowania w nieciągłym gradiencie CsCl. Homogenizat komórkowy oraz adenowirusy wytrącone z pożywki poddano ultrawirowaniu w nieciągłym gradiencie utworzonym z roztworów CsCl o niskiej i wysokiej gęstości. W obu przypadkach zaobserwowano wyraźne pasma adenowirusów GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

W celu wyznaczenia miana wirusa wyrażonego w jednostkach transdukcyjnych na jeden mL (TU/mL), komórki AD293 zainfekowano seryjnymi rozcieńczeniami AdV-GFP. Po 48 godzinach zainfekowane komórki wykazywały ekspresję GFP, co było odwrotnie proporcjonalne do stopnia rozcieńczenia zawiesiny wirusowej. Obserwowano to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP-dodatnich określono metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 5). Do obliczenia miana przyjęto rozcieńczenie wirusa, które indukowało 5–20% komórek GFP-dodatnich (Rysunek 5C). Zazwyczaj otrzymujemy miano wirusa na poziomie ~1010 (TU/mL) dla adenowirusa GFP.

Poniżej przedstawiamy przykład obliczenia miana adenowirusa dla konkretnej partii adenowirusa, w której 300000 komórek (C) poddano transdukcji 1 mL roztworu adenowirusa (V), przy współczynniku rozcieńczenia 106 (D), co pozwoliło na uzyskanie 6% komórek GFP-dodatnich (F):

Miano (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1.8 x 1010 TU/mL

Obrazy mikroskopowe serii rozcieńczeń i wykresy cytometrii przepływowej dla analizy ekspresji GFP w komórkach przetransdukowanych.
Rycina 5: Ocena miana adenowirusa. Komórki AD293 zainfekowano różnymi rozcieńczeniami adenowirusa. Po czterdziestu ośmiu godzinach komórki obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizowano metodą cytometrii przepływowej, aby określić odsetek komórek dodatnich pod kątem GFP wywołany przez różne rozcieńczenia adenowirusa (A-D). W celu ustalenia bramkowania dla cytometrii przepływowej przeanalizowano również komórki nieprzetransdukowane (E). Miano obliczone dla czynnika rozcieńczenia 106, gdy 6% komórek było dodatnich pod kątem GFP, wyniosło 1.8 x 1010 TU/mL. Dla paneli A-E, paski skali: 100µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby przetestować potencjał transdukcyjny przygotowanego adenowirusa, wykorzystano cztery linie komórkowe: ludzkie komórki śródbłonka (EA.hy926), bydlęce komórki śródbłonka aorty (BAEC), mysie hepatocyty (Hepa 1-6) oraz mysie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Komórki śródbłonka (EA.hy926 i BAEC) poddano transdukcji w dawce 25 TU/cell, hepatocyty w dawce 5 TU/cell, a MSC w dawce 250 TU/cell.

Oto przykład obliczenia objętości zawiesiny adenowirusa potrzebnej do zainfekowania 3 x 106 komórek przy dawce 25 TU/cell, przy użyciu zawiesiny adenowirusa o stężeniu 1.8 x 1010 TU/mL.

Dla 1 komórki .............. 25 TU
3 x 106 komórek .............. x TU Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0; układ dźwigni i punktu podparcia; rozkład sił i momentów obrotowych. x=75 x 106 TU
Jeśli zapas wirusa zawiera
1.8 x 1010 TU .............. 1 mL
75 x 106 TU .............. y mL Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0; układ dźwigni i punktu podparcia; rozkład sił i momentów obrotowych. y= 4.2 x 10-3 mL = 4.2µL zapasu wirusa

Czterdzieści osiem godzin po transdukcji komórki przeanalizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na Rysunku 6, ludzkie lub bydlęce komórki śródbłonka zostały poddane transdukcji z dobrą wydajnością (~50%) przy 25 TU/cell (Rysunek 6 EA.hy926 i BAEC). Hepatocyty mysie (Hepa 1-6) zostały wydajnie poddane transdukcji adenowirusem przy niskiej ilości cząsteczek adenowirusa (5 TU/cell), lecz są one również wrażliwe na adenowirusa, ponieważ odnotowano wyższy odsetek martwych komórek (komórki PI-dodatnie) (~16%) w porównaniu z innymi typami komórek. Komórki macierzyste mezenchymalne były najtrudniejsze do transdukcji (Rysunek 6), co wynikało z braku specyficznych receptorów adenowirusowych (dane niepublikowane).

Wykresy cytometrii przepływowej i obrazy fluorescencyjne pokazują wydajność transdukcji AdV-GFP w różnych typach komórek.
Rycina 6: Zakaźność adenowirusa i indukcja ekspresji GFP w komórkach poddanych transdukcji.Ludzkie komórki śródbłonka (EA.hy926), bydlęce komórki śródbłonka aorty (BAEC), mysie hepatocyty (Hepa 1-6) oraz mysie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) poddano transdukcji wskazaną ilością adenowirusa. GFP wykryto za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a odsetek komórek GFP-dodatnich przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki PI-dodatnie, określone za pomocą cytometrii przepływowej, wskazują śmiertelność komórek spowodowaną transdukcją wirusową. Komórki EA.hy926, bydlęce komórki śródbłonka aorty oraz komórki Hepa 1-6 zostały w wysokim stopniu poddane transdukcji adenowirusem, a wydajność transdukcji wyniosła od 41% do 52%. W przypadku MSC większa ilość wirusa (250 TU/cells) spowodowała uzyskanie jedynie 27% komórek GFP-dodatnich wśród komórek poddanych transdukcji. Paski skali: 100µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Rekombinowane adenowirusy są wszechstronnym narzędziem do dostarczania i ekspresji genów 12,13,14. Aby wywołać silną ekspresję białka przez transdukcję adenowirusa, sekwencja kodująca genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wprowadzana do genomu adenowirusa. System adenowirusowy AdEasy, opracowany w laboratorium Vogelsteina, składa się z plazmidu szkieletowego (pAdEasy-1) zawierającego większość genomu serotypu 5 adenowirusa typu dzikiego oraz wektora wahadłowego (pAdTrack), przeznaczonego do klonowania genów 2,10. Delecja genów adenowirusowych E1 (odpowiedzialnych za składanie zakaźnych cząstek wirusa) i E3 (kodujących białka zaangażowane w unikanie odporności gospodarza) stworzyła przestrzeń w genomie adenowirusa, w którą można wprowadzić gen o wielkości 6,5-7,5 kb 2,3. Ten rozmiar jest wystarczający dla wielu genów, zwłaszcza dla tych z krótszymi intronami 15,16,17. Są również badacze donoszący o produkcji adenowirusów przenoszących cDNA transgenu 18,19,20. Uzyskaliśmy jednak niższą wydajność ekspresji transgenu dla adenowirusów przenoszących cDNA niż dla ich odpowiedników przenoszących gen lub mini-gen (dane nie pokazane).

Ulepszając i dostosowując poprzednie metody 2,10,14,18,21, technologia produkcji adenowirusów wymaga krótszego czasu, niższych kosztów i mniejszego wysiłku. Pełnowymiarowe DNA adenowirusowe uzyskuje się w wyniku rekombinacji między wektorem czółenkowym a plazmidem pAdEasy-1 w homologicznym szczepie E. coli podatnym na rekombinację, BJ5183. Protokół zakłada transformację chemiczną komórek AdEasier-1 (bakterie BJ5183 zawierające pAdEasy-1). Technika ta nie wymaga elektroporatora, który może nie być dostępny w niektórych laboratoriach, jest bardzo prosta, zwiększa wydajność rekombinacji i skraca czas niezbędny do uzyskania kompetentnych komórek i przeprowadzenia transformacji. Wstępna selekcja rekombinowanych klonów przeprowadzana metodą PCR dodatkowo skraca czas i ułatwia całą procedurę. Podobną procedurę zastosował Zhao i współpracownicy22, jednak w protokole zoptymalizowaliśmy sekwencje starterów.

Do pakowania i amplifikacji GFP-adenowirusa użyto pochodnej linii komórkowej HEK293, a mianowicie komórek AD293, które są bardziej przylegające do płytki hodowlanej. Inne linie komórkowe powszechnie stosowane do produkcji adenowirusa to: 911, 293FT, pTG6559 (pochodna A549), PER. C6 (pochodna HER), GH329 (pochodna HeLa), N52. E6 oraz HeLa-E1 23,24,25,26. W naszych rękach nie uzyskano poprawy produkcji adenowirusa po użyciu 911 komórek (dane nie pokazane). Transfekcja komórek AD293 rekombinowanym plazmidem przy użyciu odczynnika K2 znacznie zwiększyła skuteczność etapu pakowania wirusa. Po wyprodukowaniu adenowirusa do ~70% adenowirusa nadal znajduje się w komórkach i jest uwalniane w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania. Zwiększanie liczby cykli nie jest odpowiednie, ponieważ niszczy adenowirusa.

W trakcie rutynowego procesu produkcji adenowirusa w pożywce do hodowli komórkowej uwalniane są liczne cząsteczki wirusa. Odrzucenie tej pożywki do hodowli komórkowych podczas pobierania zakażonych komórek AD293 spowodowałoby istotną utratę wirusa. Zoptymalizowaliśmy protokół opisany przez Schagena i współpracowników, aby oczyścić cząstki adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej poprzez wytrącanie siarczanem amonu27. Metoda ta charakteryzuje się wyższą skutecznością w odzyskiwaniu adenowirusa z pożywki do hodowli komórkowej w porównaniu z metodą z użyciem glikolu polietylenowego28. Wytrącony adenowirus należy natychmiast oczyścić przez ultrawirowanie lub przechowywać w lodówce przez kilka dni, ale tylko po dializie, w celu usunięcia nadmiaru soli. Utrzymywanie osadu dłużej niż kilka godzin bez dializy jest szkodliwe dla wirusa.

Oczyszczanie cząstek adenowirusa za pomocą ultrawirowania wykonanego w jednym kroku zmniejsza manipulację bulionem adenowirusowym i ułatwia procedurę w porównaniu z protokołami wykorzystującymi kolejne etapy ultrawirowania14,29. Dializa oczyszczonego adenowirusa jest konieczna w celu usunięcia chlorku cezu, który może dalej wpływać na transdukcję. W protokole użyliśmy buforu Tris zawierającego MgCl2, ale nie sacharozę do dializy, ponieważ wymaga on ogromnej, nieuzasadnionej ilości sacharozy, która jest potrzebna w inny sposób jako środek konserwujący do zamrażania. W ten sposób dodaliśmy sacharozę później, bezpośrednio do zapasów adenowirusowych przygotowanych do zamrożenia. Aby uniknąć częstego zamrażania i rozmrażania oczyszczonego adenowirusa, zaleca się porcjowanie zapasów adenowirusa i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C. Miano adenowirusa oceniano za pomocą cytometrii przepływowej, biorąc pod uwagę gen reporterowy GFP i procent transdukowanych komórek dla określonego rozcieńczenia wirusa. Metoda ta jest szybsza w porównaniu z klasycznym testem płytki nazębnej i jest bardziej wiarygodna w porównaniu z oceną białek kapsydu (za pomocą różnych metod, takich jak ELISA lub cytometria przepływowa), która nie ujawnia zdolności do infekcji cząstek adenowirusa. Jednak kwantyfikacja oparta na teście ELISA, Q-PCR lub test płytki nazębnej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów są metodami alternatywnymi, szczególnie przydatnymi do miareczkowania adenowirusów, które nie zawierają znacznika fluorescencyjnego.

Biorąc pod uwagę, że adenowirusy pAdTrack pochodzą z ludzkich adenowirusów serotypu 5, który jest rozpoznawany przez wirusa Coxsackie i receptory adenowirusa (CAR), wykazaliśmy zdolność adenowirusa GFP do transdukcji komórek pochodzenia ludzkiego (komórki śródbłonka), ale także komórek innego pochodzenia: bydlęcego (komórki śródbłonka) i mysiego (mezenchymalne komórki zrębu i hepatocyty). Dane wykazały, że adenowirus GFP może indukować wysoki poziom ekspresji transgenu.

Podsumowując, zoptymalizowaliśmy tę pracochłonną technologię, aby skrócić czas, koszty i wysiłek potrzebny do uzyskania cząsteczek adenowirusa. Przygotowany adenowirus jest w stanie infekować różne typy komórek i indukować ekspresję interesującego genu. Protokół ten może być stosowany w różnych eksperymentach, ponieważ transfer genów za pośrednictwem adenowirusa stanowi jedno z głównych narzędzi do opracowywania nowoczesnych terapii genowych.

SKRÓTY: AdV-GFP, cząstki adenowirusowe; BAEC, komórki śródbłonka aorty bydlęcej; CsCl, chlorek cezu; GFP, białko zielonej fluorescencji; MSC, mezenchymalne komórki zrębowe; TU, jednostki przetwornikowe.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Projekt współfinansowany z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego poprzez Program Operacyjny na rzecz Konkurencyjności 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronim DIABETER), grant rumuńskiego Ministerstwa Badań i Innowacji PCCDI- UEFISCDI, Numer projektu PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 w ramach PNCD III oraz przez Akademię Rumuńską. Autorzy dziękują Kyriakosowi Kypreosowi (Uniwersytet w Patras, Grecja) za hojne i trafne rady, Ovidiu Croitoru (Uniwersytet Sztuk Pięknych, Bukareszt, Rumunia) za filmowanie, montaż i projekt graficzny oraz Mihaeli Bratu za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa AD293Agilent Technologies240085
Ogniwa AdEasier-1Addgene16399
Agaroza I (do elektroforezy)Thermo Scientific17850
Siarczan amonuSigmaA4418
Sól sodowa ampicylinySigmaA0166
BamH IThermo ScientificFD0054
Płytki do hodowli komórkowych 100 mmEppendorf30702115
Chlorek cezuSigmaL4036
Bakterie DH5alphaThermo Scientific18265017
DMEM (GlutaMAX, 4,5g/L D-Glukoza)Gibco3240-027
EA.hy926 komórkiATCCCRL-2922
EDTASigmaE5134
Etanol (99,8%)Roth5054.2
Płodowa surowica bydlęca SigmaF7524
Kolby T25, T75, T175Eppendorf
GlukozaSigmaG7021
Hepa 1-6 mysie hepatocytyATCCCRL-1830
Hind IIIThermo ScientificFD0504
Siarczan KanamycynyThermo Scientific 15160054
System transfekcji K2BiontexT060-5.0
LB średniFormediumLBx0102
LB-agarFormediumLBx0202
Mix & Go E. coli Zestaw transformacyjnyZymo ResearchT3001
Midori Green Zaawansowane barwienie DNANippon Genetics EuropeMG-04
NaOHSigmaS8045
Opti-MEMThermo Scientific31985070
Pac IThermo ScientificFD2204
pAdEasy-1Addgene16400
pAdTrack-CMVAddgene16405
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (24:24:1)Invitrogen15593-031
Polimeraza GoTaqPromegaM3005
Pme I (Mss I)Thermo ScientificFD1344
Octan potasuVWR Chemicals43065P
Pst IThermo ScientificFD0614
Qiagen Midi Zestaw przygotowawczyQiagen12125
Skrobak do komórekTPP99003
SDSThermo Scientific28365
Slide-A-LyzerThermo Scientific66330
Pirogronian soduSIGMAP5280-100G
Strzykawka z 23G neeedleB Braun464BR
Tris HClSigma1185-53-1
Trypan niebieskiRothCN76.1
Probówki 50mlTPP91050
Ultra-Clear Probówki (14x89 mm)do redlic Beckman Coulter344059
(chłodzona)Sigma Sartorius3-19KS
HeraeusFresco 17 MikrowirówkaThermo Scientific75002420
Ultrawirówka z rotorem SW41TiBeckman CoulterOptima L-80 XP
Breed Hood PipetyThermo ScientificClass II
(0-2&mikro; l, 1-10 i mikro; l, 2-20&mikro; l, 10-100 i mikro; l, 20-200 i mikro; l, 100-1000 i mikro; l)Termostat grzewczy Thermo Scientific
suchym blokiemBiosanTDB-120
ThermocycleSensoQuest012-103
Łaźnia wodnaMemmertWNB 14
30712129 Kasety dializacyjne Wirówka z

Bibliografia

  1. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  2. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  3. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).
  4. Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells. European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).
  5. Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion. Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).
  6. Kreppel, F., Kochanek, S. Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).
  7. Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield. Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).
  8. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  9. Jager, L., Ehrhardt, A. Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders. Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).
  10. Luo, J., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).
  11. Dumitrescu, M., et al. Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  12. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).
  13. Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).
  14. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).
  15. Zvintzou, E., et al. Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity. Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).
  16. Karavia, E. A., et al. Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice. Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).
  17. Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties. Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).
  18. Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma. World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).
  19. Ambar, B. B., et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand. Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).
  20. Okuyama, T., et al. Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system. Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).
  21. van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. Adenovirus-mediated gene transfer. Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).
  22. Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR. Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).
  23. Kovesdi, I., Hedley, S. J. Adenoviral producer cells. Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).
  24. Lin, X. Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors. Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).
  25. Fallaux, F. J., et al. Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).
  26. Altaras, N. E., et al. Production and formulation of adenovirus vectors. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).
  27. Schagen, F. H., et al. Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield. Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).
  28. Colombet, J., et al. Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).
  29. Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Miareczkowanie wirusawytr canie siarczanem amonugradient chlorku cezuultracentryfugacjacytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnaekspresja GFPkom rki AD293bakterie BJ5183
Skuteczna metoda produkcji adenowirusa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.