Artykuł metodologiczny

Uruchomienie promiennika i dozymetria do oceny parametrów α i β LQ, schematu dawkowania promieniowania oraz depozycji dawki in vivo

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61692

⸱

11 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, West Virginia University, 2Radiation Oncology, West Virginia University, 3School of Medicine, West Virginia University, 4Department of Neuroscience, West Virginia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dozymetria promieniowania dostarcza techniki zwiększającej dokładność eksperymentów przedklinicznych i zapewniającej, że dostarczane dawki promieniowania są ściśle związane z parametrami klinicznymi. Protokół ten opisuje kroki, które należy podjąć w każdej fazie podczas przedklinicznych eksperymentów radiacyjnych, aby zapewnić prawidłowy projekt eksperymentu.

Streszczenie

Dozymetria promieniowania ma kluczowe znaczenie dla dokładnego dostarczania i odtwarzalności schematów promieniowania w modelach przedklinicznych dla wysokiej istotności translacyjnej. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek doświadczeń in vitro lub in vivo należy ocenić określoną moc wyjściową naświetlacza i indywidualne projekty doświadczalne. Za pomocą komory jonizacyjnej, elektrometru i konfiguracji ze stałą wodą można określić moc wyjściową dawki szerokich pól w izocentrum. Korzystając z podobnego układu z foliami radiochromowymi w miejscu komory jonizacyjnej, można również określić dawki dla mniejszych pól na różnych głębokościach. Testy przeżycia klonogennego in vitro komórek nowotworowych w odpowiedzi na radioterapię są niedrogimi eksperymentami, które zapewniają miarę wrodzonej wrażliwości linii komórkowych na promieniowanie poprzez dopasowanie tych danych do tradycyjnego modelu liniowo-kwadratowego. Parametry modelowe oszacowane na podstawie tych testów, w połączeniu z zasadami skutecznych dawek biologicznych, pozwalają na opracowanie różnych schematów frakcjonowania dla radioterapii, które zapewniają równoważne dawki skuteczne w eksperymentach na zwierzętach z nowotworem. Jest to ważny czynnik, który należy wziąć pod uwagę i skorygować przy porównywaniu schematów radioterapii in vivo w celu wyeliminowania potencjalnych zakłóceń wyników z powodu rozbieżności w dostarczonych skutecznych dawkach. Podsumowując, w artykule przedstawiono ogólną metodę weryfikacji dawki wyjściowej przedklinicznych naświetlaczy zwierzęcych i gabinetowych, oceny wrażliwości na promieniowanie in vitro oraz weryfikacji dostarczania promieniowania w małych organizmach żywych.

Wprowadzenie

Nowotwory stanowią drugą najczęstszą przyczynę zgonów w Stanach Zjednoczonych i w wielu krajach na całym świecie1. Radioterapia jest podstawą leczenia wielu podtypów nowotworów i jest stosowana u około połowy wszystkich pacjentów z rakiem2,3. Wyniki leczenia prawie wszystkich nowotworów poprawiły się z biegiem czasu, ponieważ sprzęt używany do dostarczania dawek promieniowania stale się rozwijał i opracowano kilka skutecznych metod terapii multimodalnej4,5,6, ale wskaźniki nawrotów i śmiertelności u pacjentów z niektórymi typami nowotworów pozostają wysokie7,8,9. W związku z tym radioterapia nowotworów nadal stanowi aktywny obszar badań podstawowych i klinicznych. Wiele przedklinicznych badań radioterapii wykorzystuje się naświetlacze na małą skalę do dostarczania dawek promieniowania do modeli nowotworów in vitro lub zwierzęcych. Przy mnogości potencjalnych eksperymentów do przeprowadzenia w celu zbadania szczegółów radiobiologii mechanistycznej lub nowatorskich metod leczenia, można napotkać typowe pułapki, które prowadzą do błędnych wniosków, słabej odtwarzalności i marnotrawstwa zasobów. Pułapki te mieszczą się w trzech ważnych obszarach: dozymetrii naświetlaczy, charakterystyce in vitro modelowych linii komórkowych oraz harmonogramie i konfiguracji dawkowania napromieniania in vivo. Dokładne i powtarzalne wyniki bardziej zaawansowanych eksperymentów są trudne do osiągnięcia bez wcześniejszego zwrócenia uwagi na te podstawowe aspekty badań nad radioterapią.

Protokół opisany tutaj opisuje uogólnioną strategię unikania lub łagodzenia tych problemów i opiera się na kilku wcześniej opracowanych metodologiach przeznaczonych do samodzielnego użytku. Te odrębne metody zostały połączone, dzięki czemu badacz zainteresowany rozpoczęciem lub ulepszeniem przedklinicznych eksperymentów radioterapeutycznych może wykorzystać to jako solidny układ eksperymentalny. Proponowane ramy obejmują metodologię uruchamiania małych namienników zwierzęcych, określania podstawowych właściwości radiobiologicznych modelowych linii komórek nowotworowych oraz odpowiedniego projektowania i podawania harmonogramu dawkowania i frakcjonowania dla modeli nowotworów in vivo.

Protokół

Wszystkie etapy niniejszego protokołu obejmujące wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych, w tym ich obchodzenie i procedury, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na West Virginia University w Morgantown, West Virginia (Numer protokołu: 1604001894).

1. Wyznaczenie dawki wyjściowej

  1. Należy zastosować niniejszy protokół, oparty na protokole „metody z fantomem” (In-phantom Method) Grupy Roboczej 61 Amerykańskiego Stowarzyszenia Fizyków Medycznych (AAPM TG) 6110 i zbliżony do protokołu uruchomieniowego ustalonego przez firmę Xstrahl, aby określić moc wiązki irradiatora dla małych zwierząt w odniesieniu do konkretnej geometrii w następujących warunkach konfiguracji.
    1. Ustawić irradiator tak, aby dostarczał promieniowanie przy 220 kVp i 13 mA, z otwartym polem (17 cm na 17 cm) umieszczonym w izocentrum, czyli 35 cm od źródła. Dodatkowo wiązkę należy przefiltrować za pomocą filtra Cu o grubości 0,15 mm z szerokim ogniskiem. Niektóre irradiatory komórkowe zawierają jedynie źródło radioaktywne; niniejszy protokół można stosować wyłącznie w przypadku irradiatorów rentgenowskich.
    2. Ułożyć fantomy z wody stałej w następującej kolejności: płyta 1 cm, płyta 2 cm z otworem na komorę jonizacyjną, płyta 2 cm, płyta 1 cm. Ułożenie fantomów z wody stałej w tej kolejności pozycjonuje komorę jonizacyjną na głębokości 2 cm, pozostawiając jednocześnie 4 cm na rozprószenie wsteczne. Graficzną prezentację konfiguracji doszymetrycznej przedstawiono na Rysunku 1.
      UWAGA: Aby pomieścić duży i dość ciężki stos wody stałej, autorzy zalecają nabycie specjalnie wydrukowanego w technologii 3D stołu z regulowanym wspornikiem, aby zapewnić, że stos fantomów jest wypoziomowany i znajduje się w odpowiedniej odległości od źródła na całej powierzchni materiału, a nie tylko w jego centrum.
  2. Należy użyć sprzętu pomiarowego (tj. komory jonizacyjnej skalibrowanej przez ADCL, elektrometru); wyjaśnienia dotyczące stosowanych czynników korekcyjnych znajdują się odpowiednio w Tabeli materiałów oraz w Tabeli 1.
    UWAGA: ADCL podaje wartości Nk dla kilku punktów przy różnych warstwach połowicznych (HVL, miara jakości wiązki). Wartość Nk użyta w protokole powinna opierać się na interpolacji wartości ADCL dla zmierzonej wartości HVL urządzenia. Producent zmierzył HVL naszego urządzenia i tę wartość wykorzystaliśmy do wyznaczenia mocy dawki.
  3. Należy przygotować stos fantomów i włożyć komorę jonizacyjną do fantomu zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
    1. Dostosować stos fantomów tak, aby odległość od źródła do powierzchni (SSD), czyli odległość od źródła promieniowania do pierwszej powierzchni, wynosiła 33 cm po odpowiednim wypoziomowaniu.
      UWAGA: Autorzy sugerują stworzenie specjalnego stołu wydrukowanego w technologii 3D, wystarczająco dużego, aby pomieścić wymiary płyt z wody stałej. Dodatkowo stół wykorzystany w niniejszym protokole posiada element regulacyjny do poziomowania stosu fantomów.
  4. Obliczyć średnią z trzech oddzielnych naświetlań rentgenowskich, odczytując wartości co minutę przy napięciu polaryzującym elektrometru ustawionym na 300 V. Wynik zostanie oznaczony jako M+.
    UWAGA: Naświetlania są wykonywane przy ustawieniu instrumentu na 220 kVp i 13 mA. Te same ustawienia obowiązują w dwóch następnych krokach (kroki 1.5-1.6). Ze względu na bezpieczeństwo użytkownika należy upewnić się, że drzwi pozostają zamknięte podczas zabiegów.
  5. Wykonać kolejny zestaw trzech oddzielnych naświetlań rentgenowskich, odczytując wartości co 1 min przy napięciu polaryzującym elektrometru ustawionym na -150 V. Wynik zostanie oznaczony jako ML.
  6. Wykonać kolejny zestaw trzech oddzielnych naświetlań rentgenowskich, odczytując wartości co 1 min przy napięciu polaryzującym elektrometru ustawionym na -300 V. Wynik zostanie oznaczony jako MH lub M-.
  7. Obliczyć Ppol oraz Pion, korzystając odpowiednio z Równania 1 i Równania 2, zgodnie z opisem poniżej:
    Obliczenie polaryzacji \( P_{\text{pol}} = (|M^+| + |M^-|)/2|M^-|\), równanie analizy polaryzacji. (Równanie 1)
    Równanie prawdopodobieństwa jonizacji w spektrometrii mas, pokazujące zmienne dla masy i prędkości. (Równanie 2)
  8. Zmierzyć temperaturę w stopniach Celsjusza oraz ciśnienie w kPa wewnątrz irradiatora za pomocą skalibrowanego cyfrowego termometru i barometru. Następnie obliczyć PTP zgodnie z poniższym Równaniem 3.
    UWAGA: Obliczenie to zakłada, że ADCL użyło standardowych wartości temperatury i ciśnienia wynoszących 22 °C i 101,33 kPa przy podawaniu wartości czynnika kalibracyjnego kermy powietrznej.
    Równanie ciśnienia par, P_TP = (273.2+T)/295.2 * 101.33/P, wzór na schemacie fizycznym. (Równanie 3)
  9. Obliczyć skorygowany odczyt komory, M, mnożąc surowy odczyt komory, MH, przez Pelec, Ppol, Pion oraz PTP. Równanie to znajduje się poniżej jako Równanie 4.
    UWAGA: Obliczenie to zakłada, że ADCL przeprowadziło kalibrację przy napięciu polaryzującym ustawionym na -300 V, co jest powszechną praktyką.
    Równanie stanu równowagi statycznej, pokazuje molekularny moment dipolowy. (Równanie 4).
  10. Dalszy wynik skorygowanego odczytu komory należy pomnożyć przez Nk, [(µen/p)wair]water, PQ, cham oraz Psheath. Psheath jest wymagane tylko dla pomiarów wykonanych w wodzie. W związku z tym w niniejszym protokole P­sheath wynosi 1.
    UWAGA: Przy warunkach opisanych w tym protokole trzy ostatnie elementy dają wartość 1,0731. Wartość ta zależy od jakości wiązki, dlatego w celu jej wyznaczenia należy znać wartość HVL. Wartość 1,0731 jest specyficzna dla naszego urządzenia i została podana jako przykład. Aby wyznaczyć wartości PQ,cham oraz [(µen/p)wair]water specyficzne dla Państwa urządzenia, należy użyć zmierzonej wartości HVL i dokonać interpolacji z Tabeli VII oraz Tabeli VIII, a następnie skorygować wartość dla referencyjnego rozmiaru pola zgodnie z Rysunkiem 3 oraz Rysunkiem 4 z protokołu AAPM TG6110. W naszym przypadku pomnożenie Nk przez 1,0731 daje dawkę w wodzie, Dw, w Gy dla nominalnego czasu 1 min, zakładając, że wartość Nk z ADCL podana jest w Gy/Coulumbs.
  11. Określić efekt końcowy stosowanego irradiatora. W momencie pierwszego generowania promieni rentgenowskich moc wzrasta do pełnej wartości w określonym czasie. Podobnie, po wyłączeniu źródła promieniowania rentgenowskiego, moc spada do zera w określonym czasie.
    1. Uwzględnić czas tego przejścia, czyli efekt końcowy. Można to zrobić, obliczając średnią z trzech odczytów przy napięciu polaryzującym elektrometru ustawionym na -300 V dla różnych ustawień czasu. Należy to zrobić dla 6, 12, 18, 24, 30 i 60 sekund.
    2. Narysować wykres odczytów elektrometru w funkcji czasu i wyznaczyć najlepiej dopasowaną linię prostą. Całkowity czas, t, dla jednej minutowego naświetlania można obliczyć za pomocą równania 5:
      Równanie równowagi statycznej t=1+δt/60; wzór na korektę czasu; zasób edukacyjny. (Równanie 5).
  12. Obliczyć moc dawki dla danego irradiatora za pomocą równania 6:
    Wzór na równowagę statyczną: Ḋ = D_w/(1+δt/60), ilustrujący metodę korekty czasu. (Równanie 6)

2. Tworzenie krzywej kalibracyjnej filmu radiochromicznego

  1. Listę niezbędnych materiałów znajduje się w Tabeli materiałów.
  2. Korzystając z układu niemal identycznego jak w poprzednim protokole, należy umieścić film na głębokości 2 cm w stosie fantoma z wody stałej. Kolejność fantomów z wody stałej nie ma znaczenia, o ile powyżej znajduje się 2 cm wody stałej, a poniżej 4 cm wody stałej, aby uwzględnić efekty narastania dawki i rozproszenia wstecznego.
  3. Wykorzystując dawkę wyznaczoną w protokole 1, należy określić czasy naświetlania dla dawek wymienionych w Tabeli 2, korzystając z równania 7:
    Równanie obliczania czasu, T=(Dx/D̅)*(60s/min), reprezentacja formuły matematycznej. (Równanie 7)
  4. Należy przygotować kilka kawałków filmu, upewniając się, że każdy z nich ma taki sam rozmiar i zachowuje tę samą orientację od momentu naświetlania aż po akwizycję skanów. Można to zrobić, wykonując niewielkie cięcie ukośne w lewym dolnym rogu. Każdy film od tego momentu musi pochodzić z tej samej partii.
    UWAGA: Należy przygotować 3 oddzielne powtórzenia dla każdego punktu dawki poddanego ocenie.
  5. Wycięte kawałki należy zeskanować za pomocą 48-bitowego kolorowego skanera fotograficznego z wyłączonymi wszystkimi korekcjami. Należy upewnić się, że każdy film jest umieszczony dokładnie w centrum łóżka skanera. Uzyskane wartości stanowią skany przednaświetlaniowe używane do wyznaczenia nieeksponowanej gęstości optycznej11,12. Wszystkie obrazy należy zapisać w formacie pliku .Tiff, aby uniknąć kompresji kluczowych danych.
    UWAGA: Autorzy zalecają skanowanie filmów trzykrotnie i wykorzystanie uzyskanej średniej jako pojedynczej wartości dla danego filmu.
  6. Irradiację filmów należy rozpocząć od umieszczenia kawałka filmu na wierzchu 4 cm wody stałej i ustawienia pozostałych 2 cm wody stałej powyżej, zgodnie z opisem w poprzedniej części tej sekcji.
  7. Należy dostosować zestaw fantomu tak, aby film znajdował się w tej samej odległości od źródła, w jakiej znajdowała się komora jonizacyjna podczas wyznaczania mocy dawki. Jest to punkt izocentryczny irradiatora.
  8. Należy zaprogramować czas naświetlania obliczony w kroku 2.3 powyżej dla jednej przepisanej dawki.
  9. Procedurę naświetlania należy powtórzyć dla każdej z dawek wymienionych w Tabeli 2.
  10. Filmy należy pozostawić na 24 godziny w miejscu chronionym przed światłem.
  11. Skanowanie filmów po naświetlaniu należy przeprowadzić w ten sam sposób, co opisano powyżej.
  12. Obrazy należy zaimportować do oprogramowania analitycznego ImageJ i przeprowadzić wszystkie pomiary na kanale czerwonym.
    1. Przeciągnij obraz w formacie pliku .Tiff do programu ImageJ.
    2. Kliknij rozwijane menu Image. Z menu rozwijanego Image wybierz Color. Z opcji Color wybierz split channels.
    3. Korzystając wyłącznie z czerwonego kanału obrazu, wyznacz obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia prostokąta. Naciśnij Ctrl+M. Przepisz średnią wartość z okna wyników.
    4. Powtórz kroki 2.12.1-2.12.4 dla wszystkich zeskanowanych filmów.
  13. Należy uzyskać wartość piksela w centralnie położonym kwadracie o wymiarach 1 cm na 1 cm zarówno dla filmów nieeksponowanych, jak i naświetlonych. Wartości te będą oznaczone odpowiednio jako PVU(D) oraz PV(D) i mogą zostać użyte do obliczenia wypadkowej gęstości optycznej, zgodnie z opisem w Równaniu 8.
    Równanie gęstości optycznej log(PV_U(D)/PV_(D)), symbol, w kontekście analizy fotometrycznej. (Równanie 8)13
  14. Powtórz krok 2.13 dla każdej pary obrazów filmowych, zarówno przed naświetlaniem, jak i po naświetlaniu.
  15. Należy wykreślić wykres zależności dawki od wypadkowej gęstości optycznej i dopasować krzywą do wielomianu trzeciego stopnia w formacie y = ax3 + bx2 + cx + d. Przykład znajduje się na Rysunku 2B.

3. Wyznaczenie wartości α/β dla konkretnych linii komórkowych raka za pomocą testu klonogennego

UWAGA: Poniższy protokół jest zmodyfikowaną wersją metod opisanych przez Franken i wsp.14, a jego przebieg przedstawiono na Rysunku 3.

  1. Hodować komórki do osiągnięcia ok. 80% konfluencji. Należy unikać stosowania nadmiernie konfluentnych kultur komórkowych w tym eksperymencie, ponieważ niezbędne jest, aby komórki znajdowały się w fazie logarytmicznej wzrostu. Dla reprezentatywnych wyników testu klonogennego przedstawionych na Rysunku 3C, neurotropowe komórki raka piersi MDA-MB-231 hodowano w pożywce DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz penicylinę/streptomycynę, inkubując je w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze z nawilżaczem.
  2. Wysiać komórki z pożądaną gęstością do testu kolonogennego. Precyzyjne rozcieńczenia podczas wysiewu są kluczowe dla określenia wydajności płytowania w teście. Należy pamiętać o przygotowaniu wielu powtórzeń.
  3. Przejść do tego kroku, jeśli naświetlanie poprzedza wysiew komórek (Rysunek 3A). W przeciwnym razie przejść do kroku 3.4, jeśli wysiew komórek poprzedza naświetlanie.
    1. Przeprowadzić pożądane naświetlanie w kolbach hodowlanych. Wszelkie dodatkowe zabiegi (np. traktowanie lekami) można przeprowadzić w dowolnym momencie przed lub po tym etapie. W przypadku reprezentatywnych wyników na Rysunku 3C naświetlanie odbyło się po wysianiu komórek, zgodnie ze szczegółami w kroku 3.4.
    2. Wyizolować komórki przy użyciu preferowanej metody trypsynizacji i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek. Usunąć pożywkę hodowlaną i dodać enzym rekombinowany (np. TrypLE Express), aby odkleić komórki od ścianek kolby. Inkubować komórki z enzymem przez około 3 minuty, aż do momentu odklejenia komórek stwierdzonego pod mikroskopem świetlnym. Zneutralizować enzym, dodając równą objętość pożywki hodowlanej. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min i resuspendować do pożądanego stężenia w pożywce hodowlanej.
    3. Wysiać komórki z pożądaną gęstością w wielu powtórzeniach.
    4. Wymienić pożywkę na świeżą po pierwszych 24 h.
    5. Kontynuować wymianę pożywki co 2-3 dni.
    6. Kontynuować hodowlę komórek, aż kolonie kontrolne przekroczą 50 komórek na kolonię, co zajmuje ok. 9-14 dni. Kolonie kontrolne to grupy traktowane, które nie otrzymały dawek promieniowania. W eksperymentach z zastosowaniem leków wymagana będzie również dodatkowa grupa kontrolna z podaniem leku, ale bez naświetlania.
  4. Przejść do tego kroku w przypadku wysiewu komórek przed naświetlaniem (Rysunek 3B).
    1. Wyizolować komórki przy użyciu preferowanej metody trypsynizacji i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek.
    2. Wysiać komórki z pożądaną gęstością w wielu powtórzeniach.
    3. Pozostawić komórki na noc, aby przylgnęły do płytki.
    4. Zastosować pożądane dawki promieniowania. Dodatkowe zabiegi, takie jak podawanie leków, można przeprowadzić w dowolnym momencie przed lub po tym kroku, o ile komórki przylgnęły do płytek. Dla reprezentatywnych wyników na Rysunku 3C przed zabiegiem wysiano 1250 neurotropowych komórek MDA-MB-231 (krok 3.4). Następnie komórki traktowano 15 nM doksorubicyny 3 godziny przed naświetlaniem dawką 3 Gy promieniowania rentgenowskiego.
    5. Wymienić pożywkę po początkowych 24 h.
    6. Wymieniać pożywkę co 2-3 dni.
    7. Hodować traktowane komórki do momentu, gdy kolonie grupy kontrolnej przekroczą 50 komórek, ok. 9-14 dni. Kolonie kontrolne to grupy traktowane, które nie otrzymały dawek promieniowania. W eksperymentach z zastosowaniem leków wymagana będzie również dodatkowa grupa kontrolna z podaniem leku, ale bez naświetlania.
  5. Usunąć pożywkę hodowlaną z dołków lub naczyń i przemyć PBS.
  6. Utrwalić komórki przez 15 minut w roztworze octu lodowatego i metanolu w stosunku 1:7 (v:v).
  7. Usunąć roztwór utrwalający.
  8. Po utrwaleniu barwić komórki przez 30 minut (lub 2 h, jeśli czas pozwala) w temperaturze pokojowej roztworem fioletu krystalicznego o stężeniu 2,5-5,0 mg/mL w roztworze wody destylowanej i metanolu w stosunku 4:1 (v:v).
  9. Usunąć roztwór barwiący i przemyć komórki w dużej kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Nie przemywać pod bieżącą wodą.
  10. Policzyć powstałą liczbę kolonii w każdej grupie traktowanej i obliczyć frakcję przeżycia dla każdej płytki.
  11. Przedstawić frakcję przeżycia w funkcji odpowiadającej podanej dawki i dopasować krzywą za pomocą regresji wykładniczej.
  12. Aby oszacować wartość α/β, należy wykorzystać dopasowanie wykładnicze powyższego wykresu do oszacowania wartości każdego z parametrów regulowanych w poniższym równaniu liniowo-kwadratowym:
    Równanie równowagi statycznej SF=e^-α*D-β*D²; zanik wykładniczy; wzór matematyczny. (Równanie 9)
    UWAGA: Naświetlanie komórek można zazwyczaj przeprowadzać w izocentrum bez kolimacji, pod warunkiem, że pole jest wystarczająco duże, aby pomieścić płytki wielodołkowe lub szalki Petriego. Potencjalne problemy w tym protokole mogą obejmować takie wyniki jak brak tworzenia kolonii, znacząca migracja komórek z wyraźnym wzrostem, ale bez tworzenia prawdziwych kolonii, lub kontaminacja spowodowana traktowaniem w niesterylnej komorze irradiatora.

4. Wyznaczenie swoistej dawki wyjściowej dla zmiennych schematów eksperymentalnych

  1. Wybrać pożądaną wielkość pola oraz odległość od źródła.
    UWAGA: Kolimacja zmieni moc dawki niezależnie od rozmiaru lub odległości kolimatora od źródła promieni rentgenowskich.
  2. Używając fantomów z wody stałej w celu zapewnienia warstwy narastania i rozproszenia wstecznego, umieścić arkusz filmu w odpowiedniej orientacji, która najlepiej oddaje projekt eksperymentalny.
    UWAGA: W przypadku niektórych układów eksperymentalnych woda stała może nie zapewniać najdokładniejszego odwzorowania danego projektu. Zamiast niej zaleca się stosowanie rzeczywistych naczyń używanych w eksperymencie (np. szalek Petriego, płytek wielodołkowych, fantomów małych zwierząt itp.).
  3. Naświetlać filmy przez 1 (N=3) i 2 (N=3) minuty.
  4. Pozostawić filmy na 24 godziny w warunkach chroniących przed światłem.
  5. Wyznaczyć wypadkową gęstość optyczną każdego z filmów zgodnie z procedurami z Sekcji 2. Użyć krzywej kalibracyjnej filmu, aby wyznaczyć dawkę na podstawie wypadkowej gęstości optycznej.
  6. Wyznaczyć dawkę po 1 minucie, D1, jako moc dawki wyjściowej, Ḋ, dla tego układu eksperymentalnego, zdefiniowaną przez Równanie 10 w następujący sposób:
    Równanie stosunku dynamicznego \(D_{\text{exp1}} = D_1/1\,\text{min}\), symbol dla analizy szybkości czasowej. (Równanie 10)
  7. Analogicznie obliczyć dawkę po 2 minutach zgodnie z Równaniem 11 w następujący sposób:
    Równanie przedstawiające obliczenia szybkości reakcji chemicznej, \(D_{exp2} = D_2/2 \text{ min}\). (Równanie 11)
  8. Ze względu na efekt końcowy, moc dawki dla powyższych obliczeń może się nieznacznie różnić. Z tego powodu, aby obliczyć Dexp dla pożądanego projektu eksperymentalnego, należy użyć średniej z poszczególnych wartości Dexp, jak wskazano w Równaniu 12:
    Równanie średniej dyfuzji, \(D_{\text{avg}}^{\text{exp}}\), formuła pomiaru dyfuzji eksperymentalnej. (Równanie 12)
  9. Wykorzystując tę średnią, określić czas naświetlania do dowolnej pożądanej dawki dla tego konkretnego układu w Równaniu 13:
    Równanie dyfuzji: T = D_avg exp / D, obliczanie czasu dyfuzji (Równanie 13)

5. Leczenie myszy z guzami w interesującej lokalizacji anatomicznej

  1. Znieczuli mysz, stosując bezpieczne i humanitarne techniki znieczulenia zatwierdzone przez instytucjonalny komitet IACUC.
  2. Umieść znieczulone zwierzę w stabilizatorze, zgodnie z przyjętym planem doświadczalnym.
  3. Ten krok jest opcjonalny; jeśli nie jest możliwy do wykonania, przejdź do kroku 5.6. Wykonaj radiogram myszy bez kolimacji, używając wbudowanej kamery portalowej i filtra aluminiowego.
  4. Wykonaj drugi radiogram z zastosowaną kolimacją.
  5. Nałóż radiogramy na siebie w programie ImageJ, aby zweryfikować pozycjonowanie wiązki.
  6. Wykorzystując wcześniej określoną wartość α/β, ustal schemat dawkowania, który stanowi najbardziej uzasadnione podejście do odpowiedzi na pytanie badawcze (np. w przypadku chęci zamodelowania efektów dawki 30 Gy podanej w 10 frakcjach po 3 Gy, przy jednoczesnej chęci podania tylko czterech frakcji). Stosując równanie 14, przy założonej wartości α/β równej 10 (wartość tę można wyznaczyć dla poszczególnych linii komórek nowotworowych w protokole 3) i BED zbliżonym do wartości dla 30 Gy/10 F, zastosuj dawkę 24 Gy w 4 frakcjach po 6 Gy.
  7. Naświetlaj zwierzę przez określony czas przewidziany dla pożądanej dawki.

6. Histologiczne potwierdzenie depozycji dawki in vivo

  1. Zgodnie z protokołem 5, należy pobrać interesującą tkankę w ciągu 1 godziny od zastosowania leczenia15,16. Po pobraniu tkanki należy postępować zgodnie z preferowanym protokołem immunohistochemicznym. Poniżej przedstawiono przykład.
  2. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia lodowatym 4% paraformaldehydem (PFA).
  3. Przeprowadzić postfiksację w PFA w temperaturze 4 °C.
  4. Po utrwaleniu tkankę należy sekwencyjnie utrwalać w 10%, 20% i 30% sacharozie przez 24 godziny w każdym etapie w temperaturze pokojowej.
  5. Zatopić tkankę w żelatynie, a następnie sekwencyjnie utrwalać w 4% PFA i ponownie w 10-30% sacharozie przez 24 godziny w każdym etapie w temperaturze pokojowej.
  6. Przyciąć blok i umieścić w temperaturze -80 °C na 30 minut.
  7. Pokroić tkankę na sekcje o grubości 20-30 µm.
  8. Przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne preparatów jako sekcji swobodnie pływających w płytce sześciodołkowej17,18.
    1. Przepłukać trzy razy i permeabilizować przez 30 minut na wytrząsarce w roztworze 1,83% lizyny w 1% Triton oraz 4% inaktywowanego termicznie surowicy koziej.
    2. Inkubować sekcje z przeciwciałem anty-γH2AX przez 24 godziny, a następnie inkubować przez 2 godziny z wybranym przeciwciałem wtórnym.
    3. Przykryć preparaty szkiełkami podstawowymi, używając preferowanego medium montażowego.
  9. Wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

Postępowanie zgodnie z protokołem 1 pozwoli na wyznaczenie mocy dawki w Gy/min, która jest specyficzna dla używanego irradiatora. Jednak niezależnie od rodzaju irradiatora, przy znanej mocy dawki można wygenerować krzywą kalibracyjną za pomocą protokołu 2, co pozwoli na uzyskanie filmów oraz krzywej kalibracyjnej podobnej do tej w Rycina 2A-BPomyślny test przeprowadzony zgodnie z protokołem 3 pozwoli na uzyskanie wyraźnych, dobrze odgraniczonych kolonii komórek, które barwią się jednorodnie na kolor fioletowy. Oszacowaną wartość α/β można porównać z wartościami literaturowymi lub innymi grupami traktowanymi w celu interpretacji radiowrażliwości danej linii komórkowej. Wykorzystując krzywą kalibracyjną opracowaną zgodnie z protokołem 2 i przedstawioną w Rycina 2B, protokół 4 pozwoli na uzyskanie dwóch próbek filmu przypominających Rysunek 2A które mogą zostać wykorzystane do oszacowania wymaganego czasu naświetlania eksperymentalnego. Jeśli w używanym irradiatorze dostępna jest wbudowana kamera do obrazowania portalowego, można uzyskać radiogramy małych zwierząt z kolimacją i bez niej. Nałożenie tych obrazów na siebie pozwoli określić dokładne położenie skolimowanej wiązki promieniowania względem leczonego małego zwierzęcia, co przedstawiono w Rysunek 4APrawidłowe dostarczenie dawki w protokole 5 można potwierdzić, postępując zgodnie z protokołem 6. Jednym ze wskaźników świadczących o tym, że promieniowanie jest dostarczane do układów in vivo lub in vitro, jest wykrycie pęknięć obu nici DNA. Przedstawiono to w Rysunek 4B, ta sama mysz poddana zabiegowi wyłącznie w prawej półkuli w Rysunek 4Awykazuje pozytywne barwienie γH2AX wyłącznie w półkuli poddanej działaniu czynnika. Na tej rycinie jądra komórkowe zabarwiono DAPI, aby wykazać dwie kwestie: 1) cały obszar mózgu, do którego podczas analizy histologicznej zastosowano przeciwciało anty-γH2AX oraz 2) fakt, że nieleczona półkula mózgu pozostaje niezabarwiona.

Schemat pomiaru promieniowania; konfiguracja komory jonizacyjnej, elektrometr, termometr, manometr.
Rycina 1: Schematyczny układ komory jonizacyjnej i fantoma wodnego do wyznaczania mocy dawki.Piktogram przedstawia podstawową konfigurację z wykorzystaniem różnych komponentów niezbędnych do dozymetrii z użyciem komory jonizacyjnej i stałych fantomów wodnych wewnątrz komory irradiatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza gęstości optycznej; (A) zmiany barwy, (B) wykres zależności odpowiedzi od dawki, efekt radioterapii.
Rycina 2: Tworzenie krzywej kalibracyjnej z wykorzystaniem folii radiochromicznej. (A) Reprezentatywna zmiana barwy folii radiochromicznej wraz ze wzrostem dawki. Góra po lewej (0 cGy); dół po prawej (2000 cGy). (B) Potencjalna krzywa kalibracyjna folii radiochromicznej porównująca wypadkową gęstość optyczną i dawkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat i wynik testu formowania kolonii; hodowla komórkowa do analizy proliferacji.
Rycina 3: Test klonogenny komórek nowotworowych. Naświetlanie komórek można przeprowadzić przed wysianiem na płytki sześciodołkowe/szalki Petriego (A) lub po wysianiu (B). Na panelu (C) przedstawiono reprezentatywny obraz pomyślnego testu klonogennego z wykorzystaniem komórek raka piersi MDA-MB-231 po wykonaniu czynności opisanych w sekcji 3 protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie optyczne mózgu myszy; mikroskopia rentgenowska i fluorescencyjna, analiza struktury mózgu.
Rycina 4: Wykorzystanie podwójnych nałożonych radiogramów do pozycjonowania (jeśli są dostępne) oraz dodatniego barwienia immunohistochemicznego γH2AX w celu potwierdzenia depozycji dawki. (A) Reprezentatywne nałożone radiogramy przedstawiające rozmieszczenie wiązki promieniowania. (B) Reprezentatywne wyniki wskazujące na depozycję dawki w prawej półkuli, co wykazano poprzez zwiększoną intensywność γH2AX. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Współczynnik korekcyjnyWyjaśnienie
NκWspółczynnik kalibracji kermy powietrza
[(µProszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który mam przetłumaczyć na język polski./ρ)Wpowietrze]wodaStosunek masowych współczynników absorpcji energii wody do powietrza; około 1,05
Pq,ChamKorekta uwzględniająca wpływ trzpienia komory na zaburzenia strumienia fotonów wywołane przez komorę; wartość przybliżona 1,022
PosłonkaKorekta uwzględniająca osłonę chroniącą komorę jonizacyjną; wartość 1, ponieważ komora jest wodoodporna
PProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Współczynnik korekcyjny uwzględniający polarność; wyznaczony w Protokole 1
PjonWspółczynnik korekcyjny uwzględniający rekombinację jonów; wyznaczony w Protokole 1
PTpWspółczynnik korekcyjny uwzględniający temperaturę i ciśnienie w dniu eksperymentu; wyznaczony w Protokole 1

Tabela 1: Współczynniki korekcyjne niezbędne do wyznaczenia mocy dawki w Protokole 1.

DawkaN
0.53
13
23
33
43
63
83
103
12*3
15*3
20*3
*Wymagane tylko dla dawek przekraczających 10 w poszczególnych eksperymentach.

Tabela 2: Dawki wykorzystywane do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej folii radiochromicznej.

Dyskusja

Powyższy protokół opisuje przyjazne dla użytkownika podejście do dozymetrii radiacyjnej, wyznaczania wartości α/β w liniach komórkowych raka oraz przedstawia krótki przykład metody napromieniania w przedklinicznym modelu przerzutów raka piersi do mózgu. Metody te mogą być stosowane do badania dowolnego modelu nowotworu i nie ograniczają się wyłącznie do przerzutów raka piersi do mózgu. W tej sekcji omówimy istotne niuanse leżące u podstaw przedklinicznych eksperymentów z zakresu radioterapii.

Dozymetria składa się z dwóch części: 1) kalibracji wyjścia za pomocą komory Farmera w celu ustalenia mocy dawki urządzenia rentgenowskiego oraz 2) przygotowania praktycznego systemu pomiarów dozymetrycznych z wykorzystaniem folii radiochromowej. W odniesieniu do kalibracji wyjścia, protokół TG-61 zapewnia powtarzalną metodę w wodzie. W niniejszym protokole zastosowano wodę stałą Gammex RMI 457, zgodnie z zaleceniami producenta irradiatora, firmy XStrahl. Chociaż analiza dozymetrii względnej (profile lub krzywe dawki w zależności od głębokości znormalizowane do dawki maksymalnej) z użyciem wody stałej wykazuje zgodność z wodą na poziomie lepszym niż 1%, występuje różnica w dawce bezwzględnej wynosząca około 3-4% ze względu na wyższy współczynnik absorpcji energii masy dla wody stałej w porównaniu do wody. Jednakże, ponieważ wszystkie instalacje systemu XStrahl wykorzystują protokół wody stałej do kalibracji wyjścia, nie korygowaliśmy tych różnic. Znajomość wyjścia pozwala na obliczenie czasu ekspozycji wymaganego do dostarczenia pożądanej dawki. Umieszczenie folii w tej samej konfiguracji co komora Farmera pozwala na dostarczenie znanych dawek do folii. Skanowanie folii dostarcza następnie gęstości optycznych. Dawkę otrzymaną przez folię można następnie nanieść na wykres w funkcji odpowiadającej netto gęstości optycznej (różnica gęstości optycznej po i przed ekspozycją). W ten sposób powstaje krzywa kalibracyjna folii. Przy zmianie konfiguracji eksperymentalnej moc dawki w danej sytuacji może ulec zmianie, ponieważ zależy ona od wielkości pola, głębokości i naświetlanego materiału. Naświetlenie folii w konfiguracji eksperymentalnej pozwala uzyskać netto gęstość optyczną, a korzystając z krzywej kalibracyjnej folii, możemy następnie wyznaczyć odpowiadającą jej dawkę. Dzieląc tę dawkę przez czas naświetlania folii, otrzymujemy moc dawki. Tę moc dawki można następnie wykorzystać do obliczenia czasu ekspozycji w celu dostarczenia pożądanej dawki dla danej konfiguracji eksperymentalnej. Opisany powyżej protokół uwzględnia kilka niuansów związanych z dozymetrią filmową. Na przykład po ekspozycji folia wymaga około 24 godzin, aby reakcje chemiczne w warstwie aktywnej folii zostały praktycznie zakończone. Brak odczekania tego czasu doprowadzi do uzyskania niższej gęstości optycznej.

Aby każde badanie cechowało się odtwarzalną dozymetrią, ważne jest poznanie i zrozumienie kilku kluczowych elementów danego irradiatora. W szczególności kluczowe jest określenie i przekazanie innym badaczom informacji o producente i modelu użytego irradiatora, rodzaju źródła (promienie rentgenowskie, radioaktywne itp.), energii, warstwie połowiczej, rozmiarze pola, odległościach od źródła do powierzchni i od źródła do izocentrum, rozmiarze napromieniowanego materiału, tłumieniu przed materiałem i rozproszeniu wstecznemu po materiale, mocy dawki specyficznej dla eksperymentu, schemacie frakcjonowania, wykorzystanym sprzęcie dozymetrycznym oraz zastosowanym protokołem dozymetrycznym. Wszystkie te informacje spójnie opisują jakość wiązki danego irradiatora przed podaniem dawki jakiemukolwiek zwierzęciu lub komórce19. Innym istotnym punktem informacji z niniejszego oraz innych protokołów jest to, że moc dawki osiągnięta w Protokole 1 to po prostu wydajność używanego irradiatora. W przypadku każdego konkretnego eksperymentu ważne jest zdefiniowanie mocy dawki dla danej konfiguracji (Protokół 4) poprzez porównanie z wygenerowaną krzywą kalibracyjną filmu radiochromicznego (Protokół 2).

Eksperymenty in vitro dostarczają istotnych informacji na temat zachowania radiobiologicznego linii komórek nowotworowych. Testy przeżywalności klonogennej in vitro pozwalają na precyzyjną ocenę i ilościowe określenie immanentnej radios wrażliwości linii komórkowej20, co pomaga w projektowaniu schematów frakcjonowania w kolejnych eksperymentach komórkowych lub na małych zwierzętach21. W szczególności testy te pozwalają na przybliżenie wartości parametrów α i β wykorzystywanych w modelu liniowo-kwadratowym do przewidywania śmierci komórek w odpowiedzi na radioterapię zgodnie z równaniem:

Równanie równowagi statycznej SF=e^-α*D-β*D²; zanik wykładniczy; wzór matematyczny. (Równanie 9)

gdzie SF to frakcja przeżywalności komórek zdolnych do tworzenia kolonii, D to dawka promieniowania w Gy, a α i β to parametry dopasowane22. Stosunek α/β stanowi wrodzoną miarę radiosensytywności komórkowej, przy czym wyższe wartości korelują ze zwiększoną wrażliwością danej linii komórkowej22. Ponieważ ta zależność funkcjonalna jest nieliniowa w odniesieniu do dawki, efekty biologiczne schematu frakcjonowania radioterapii zależą nie tylko od całkowitej dawki wprowadzonej, ale także od liczby i wielkości frakcji23. Biologiczna dawka efektywna (BED) jest miarą rzeczywistej dawki biologicznej dostarczonej do tkanki i umożliwia bezpośrednie porównanie różnych schematów frakcjonowania24,25. Równanie BED wymaga jedynie oszacowania α/β i jest przedstawione poniżej:

Wzór na biologicznie efektywną dawkę, BED=n*D*[1+D/(α/β)], obliczenia radioterapeutyczne. (Równanie 14)

gdzie n to liczba frakcji dawki D. Testy przeżywalności klonogenicznej komórek pozwalają oszacować α/β i ułatwiają bezpośrednie porównanie schematów frakcjonowania radioterapii za pomocą równania BED. Błędne wnioski dotyczące odpowiedzi tkanki lub narządu na radioterapię (lub połączenia radioterapii z innymi metodami) mogą zostać wyciągnięte, jeśli BED w grupach terapeutycznych nie jest równoważny w obrębie jednego eksperymentu lub pomiędzy eksperymentami. Na przykład, 2 frakcje po 10 Gy w porównaniu z 4 frakcjami po 5 Gy nie dają takiego samego BED, a zatem te schematy dawkowania nie mogą być bezpośrednio porównywane pod kątem odpowiedzi biologicznej. Równanie BED, mimo niedoskonałości wynikających z wrodzonych ograniczeń modelu liniowo-kwadratowego, wiarygodnie szacuje równoważne efekty dla szerokiego zakresu warunków eksperymentalnego leczenia24,25.

Testy przeżywalności kolonogennej komórek odgrywają istotną rolę w badaniu efektów radioterapii w modelach nowotworowych, jednak eksperymenty in vitro oferują szereg dodatkowych możliwości dalszego zgłębiania szczegółów mechanistycznych radiobiologii komórek nowotworowych. Proste modyfikacje testu przeżywalności kolonogennej wykorzystywano do określenia sposobów działania niektórych chemioterapii radiouczulających, takich jak paklitaksel lub etoposyd26,27. Dalsze opcje eksperymentalne in vitro obejmują badania immunocytochemiczne w celu analizy specyficznych szlaków naprawy komórkowej, takich jak barwienie ognisk γ-H2AX i/lub 53BP1 w celu badania naprawy pęknięć dwuniciowych DNA28. Eksperymenty te mogą być szczególnie interesujące przy porównywaniu radioterapii jako pojedynczej metody z terapiami skojarzonymi, zwłaszcza podczas badania szczegółów mechanistycznych dla danej linii komórkowej. Inne opcje eksperymentalne obejmują pomiary cytokin w celu zbadania wrodzonej roli odpowiedzi zapalnej komórki na napromieniowanie lub analizy sposobu śmierci komórek (np. apoptozy, nekrozy, katastrofy mitotycznej itp.) w różnych warunkach terapeutycznych29,30,31. Ten rodzaj eksperymentów może uzupełnić lub zastąpić badania na zwierzętach i zapewnić pełniejsze zrozumienie radiobiologii linii komórek nowotworowych. Niezależnie od wyboru dodatkowych eksperymentów do przeprowadzenia, standardowy test przeżywalności kolonogennej komórek, opisany w protokole 3, stanowi ważną wstępną ocenę radiobiologiczną linii komórkowej.

Testy klonogenne i dozymetria radiacyjna umożliwiają badaczowi precyzyjne planowanie eksperymentów w sposób bardziej bezpośrednio odwzorowujący scenariusze kliniczne. Dzięki zastosowaniu przedklinicznych modeli nowotworowych u małych gryzoni możliwe jest badanie odpowiedzi na samo promieniowanie lub w kontekście planu leczenia in vivo. Przed rozpoczęciem badań na zwierzętach ważne jest określenie względnej dawki wyjściowej dla konkretnej konfiguracji, jeśli różni się ona od układu użytego do wyznaczenia dawki wyjściowej32,33. W przypadku wyznaczania mocy dawki dla pól o rozmiarach <10 mm, stosowanie komory jonizacyjnej staje się mniej dokładne ze względu na trudności z centrowaniem w małym polu oraz efekty uśredniania objętościowego33. W przeszłości do wyznaczania mocy dawki oraz depozycji dawki, w połączeniu z eksperymentami immunohistochemicznymi in vivo, stosowano folię radiochromową16,34,35,36,37,38.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Zakładom Obrazowania Mikroskopów i Modeli Zwierzęcych w WVU za korzystanie z ich sprzętu wspartego grantem numer P20GM103434. Ponadto prace te były wspierane przez grant numer P20GM121322 z National Institue of General Medical Sciences, przez grant National Cancer Institute numer F99CA25376801 oraz Mylan Chair Endowment Fund.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy, lodowatySigma-AldrichA6283Ten lub porównywalne produkty z lodowatego kwasu octowego są dopuszczalne.
Crystal VioletSigma-AldrichC6158Ten lub porównywalny produkt z fioletu krystalicznego jest dopuszczalny
Baraometr cyfrowyFisher Scientific14-650-118Do pomiarów ciśnienia i temperatury.
Obrazowanie wzorcowe elektrometruCDX 2000Bkalibrowane przez ADCL; Potrzebujesz współczynnika korekcyjnego, Pelec
FilmFolia GafchromicEBT3Dostarczany w arkuszach po 25 sztuk; Folie kalibracyjne i filmy eksperymentalne muszą pochodzić z tego samego zestawu
Komora jonizacyjnaFarmerPTW TN30013Kalibrowane przez ADCL @ dwa punkty kalibracji
MetanolSigma-Aldrich34860Ten lub porównywalne produkty metanolowe są dopuszczalne.
Skaner fotograficznyEpsonPerfection V700Odpowiedniki skanerów to V800, V10000, V11000, V12000
XenXXstrahlNANagrzejnik używany.
.

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for Cancer: Present and Future. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 1-2 (2017).
  3. Delaney, G., Jacob, S., Featherstone, C., Barton, M. The role of radiotherapy in cancer treatment: estimating optimal utilization from a review of evidence-based clinical guidelines. Cancer. 104 (6), 1129-1137 (2005).
  4. Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
  5. Le, Q. T., Shirato, H., Giaccia, A. J., Koong, A. C. Emerging Treatment Paradigms in Radiation Oncology. Clinical Cancer Research. 21 (15), 3393-3401 (2015).
  6. Baumann, M., et al. Radiation oncology in the era of precision medicine. Nature Reviews Cancer. 16 (4), 234-249 (2016).
  7. Leeman, J. E., et al. Patterns of Treatment Failure and Postrecurrence Outcomes Among Patients With Locally Advanced Head and Neck Squamous Cell Carcinoma After Chemoradiotherapy Using Modern Radiation Techniques. JAMA Oncology. 3 (11), 1487-1494 (2017).
  8. Coy, P., et al. Patterns of failure following loco-regional radiotherapy in the treatment of limited stage small cell lung cancer. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 28 (2), 355-362 (1994).
  9. Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5(2019).
  10. Ma, C. M., et al. AAPM protocol for 40-300 kV x-ray beam dosimetry in radiotherapy and radiobiology. Medical Physics. 28 (6), 868-893 (2001).
  11. Wang, Y. F., Lin, S. C., Na, Y. H., Black, P. J., Wuu, C. S. Dosimetric verification and commissioning for a small animal image-guided irradiator. Physics in Medicine and Biology. 63 (14), 145001(2018).
  12. Wack, L., et al. High throughput film dosimetry in homogeneous and heterogeneous media for a small animal irradiator. Physical Medicine. 30 (1), 36-46 (2014).
  13. Devic, S. Radiochromic film dosimetry: past, present, and future. Physical Medicine. 27 (3), 122-134 (2011).
  14. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  15. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiation Research. 175 (6), 774-783 (2011).
  16. Zarghami, N., et al. Half brain irradiation in a murine model of breast cancer brain metastasis: magnetic resonance imaging and histological assessments of dose-response. Radiation Oncology. 13 (1), 104(2018).
  17. Nwafor, D. C., et al. Loss of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) enzyme activity in cerebral microvessels is coupled to persistent neuroinflammation and behavioral deficits in late sepsis. Brain, Behavior, and Immunity. , (2019).
  18. Amtul, Z., Hepburn, J. D. Protein markers of cerebrovascular disruption of neurovascular unit: immunohistochemical and imaging approaches. Reviews in Neuroscience. 25 (4), 481-507 (2014).
  19. Draeger, E., et al. A Dose of Reality: How 20 Years of Incomplete Physics and Dosimetry Reporting in Radiobiology Studies May Have Contributed to the Reproducibility Crisis. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 106 (2), 243-252 (2020).
  20. Dunne, A. L., et al. Relationship between clonogenic radiosensitivity, radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells. British Journal of Cancer. 89 (12), 2277-2283 (2003).
  21. Yang, Y., Xing, L. Optimization of radiotherapy dose-time fractionation with consideration of tumor specific biology. Medical Physics. 32 (12), 3666-3677 (2005).
  22. Hall, E. J., Giaccia, A. J. Radiobiology for the radiologist. Eighth edition. , Wolters Kluwer. (2019).
  23. van Leeuwen, C. M., et al. The alfa and beta of tumours: a review of parameters of the linear-quadratic model, derived from clinical radiotherapy studies. Radiation Oncology. 13 (1), 96(2018).
  24. Fowler, J. F. 21 years of biologically effective dose. British Institute of Radiology. 83 (991), 554-568 (2010).
  25. Jones, B., Dale, R. G., Deehan, C., Hopkins, K. I., Morgan, D. A. The role of biologically effective dose (BED) in clinical oncology. Clinical Oncology journal | The Royal College of Radiologists. 13 (2), 71-81 (2001).
  26. Choy, H., Rodriguez, F. F., Koester, S., Hilsenbeck, S., Von Hoff, D. D. Investigation of taxol as a potential radiation sensitizer. Cancer. 71 (11), 3774-3778 (1993).
  27. Ng, C. E., Bussey, A. M., Raaphorst, G. P. Inhibition of potentially lethal and sublethal damage repair by camptothecin and etoposide in human melanoma cell lines. International Journal of Radiation Biology. 66 (1), 49-57 (1994).
  28. Kurashige, T., Shimamura, M., Nagayama, Y. Differences in quantification of DNA double-strand breaks assessed by 53BP1/gammaH2AX focus formation assays and the comet assay in mammalian cells treated with irradiation and N-acetyl-L-cysteine. Journal of Radiation Research. 57 (3), 312-317 (2016).
  29. Schaue, D., Kachikwu, E. L., McBride, W. H. Cytokines in radiobiological responses: a review. Radiation Research. 178 (6), 505-523 (2012).
  30. Mery, B., et al. In Vitro Cell Death Determination for Drug Discovery: A Landscape Review of Real Issues. Journal of Cell Death. 10, 1179670717691251(2017).
  31. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  32. Felix, M. C., et al. Collimator optimization for small animal radiation therapy at a micro-CT. Z Medical Physics. 27 (1), 56-64 (2017).
  33. Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical Physics. 38 (12), 6754-6762 (2011).
  34. Wong, J., et al. High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 71 (5), 1591-1599 (2008).
  35. Ghita, M., et al. Small field dosimetry for the small animal radiotherapy research platform (SARRP). Radiation Oncology. 12 (1), 204(2017).
  36. Biglin, E. R., et al. Preclinical dosimetry: exploring the use of small animal phantoms. Radiation Oncology. 14 (1), 134(2019).
  37. Munoz Arango, E. T., Peixoto, J. G., de Almeida, C. E. Small field dosimetry with a high-resolution 3D scanning water phantom system for the small animal radiation research platform SARRP: a geometrical and quantitative study. Physics in Medicine and Biology. , (2019).
  38. Murrell, D. H., et al. Evaluating Changes to Blood-Brain Barrier Integrity in Brain Metastasis over Time and after Radiation Treatment. Translational Oncology. 9 (3), 219-227 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dosymetria promieniowaniamodel liniowo kwadratowytest prze ywalno ci klonogenicznejkalibracja folii radiochromicznejkonfiguracja komory jonizacyjnejfantom z litej wodyweryfikacja dawki wyj ciowejbarwienie gamma H2AXpozycjonowanie wi zki
Uruchomienie promiennika i dozymetria do oceny parametrów α i β LQ, schematu dawkowania promieniowania oraz depozycji dawki in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.