Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61693

⸱

2 listopada 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Streszczenie

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) odegrały kluczową rolę w ocenie funkcji genów, modelowaniu chorób ludzkich i służyły jako model przedkliniczny do oceny ścieżek terapeutycznych. Jednak ich czasochłonność, pracochłonność i koszty ogranicza ich przydatność do systematycznej analizy funkcji genów. Najnowsze postępy w technologiach edycji genomu przezwyciężają te ograniczenia i pozwalają na szybkie generowanie specyficznych zaburzeń genów bezpośrednio w określonych narządach myszy w sposób multipleksowany i szybki. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w celu wygenerowania tysięcy klonów nokautujących geny w nabłonku skóry i jamy ustnej myszy oraz przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący kroki niezbędne do przeprowadzenia bezpośredniego badania przesiewowego CRISPR in vivo pod kątem genów supresorowych nowotworu. Podejście to można zastosować do innych narządów lub innych technologii CRISPR/Cas9, takich jak aktywacja CRISPR lub inaktywacja CRISPR, w celu zbadania biologicznej funkcji genów podczas homeostazy tkanek lub w różnych warunkach chorobowych.

Wprowadzenie

Jednym z wyzwań dla badań nad rakiem w erze postgenomicznej jest eksploracja ogromnej ilości danych genomowych pod kątem przyczynowych mutacji genowych i zidentyfikowanie węzłów w sieci genowej, które mogą być celem terapeutycznym. Chociaż analizy bioinformatyczne ogromnie pomogły w osiągnięciu tych celów, stworzenie skutecznych modeli in vitro i in vivo jest warunkiem wstępnym do rozszyfrowania złożoności systemów biologicznych i stanów chorobowych oraz umożliwienia opracowywania leków. Podczas gdy konwencjonalne transgeniczne modele myszy były szeroko stosowane w badaniach genetycznych in vivo nad rakiem, ich kosztowny, czasochłonny i pracochłonny charakter w dużej mierze uniemożliwił systematyczną analizę setek domniemanych genów nowotworowych odkrytych przez współczesną genomikę. Aby przezwyciężyć to wąskie gardło, połączyliśmy wcześniej ustaloną metodologię iniekcji in utero pod kontrolą ultradźwięków1,2 z technologią edycji genów CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3, aby jednocześnie indukować i badać mutacje powodujące utratę funkcji setek genów w skórze i jamie ustnej jednej myszy.

Metodologia opisana tutaj wykorzystuje ultradźwiękowe iniekcje zmodyfikowanych lentiwirusów do jamy owodniowej żywych embrionów myszy w dniu embrionalnym E9.5. Ładunek lentiwirusowy zawierający składniki CRISPR/Cas9 przekształca jednowarstwową ektodermę powierzchniową, która następnie powoduje powstanie nabłonka skóry i jamy ustnej. Skóra składa się z zewnętrznego naskórka, po którym następuje błona podstawna i skóra właściwa. Naskórek to nabłonek warstwowy złożony z wewnętrznej, podstawowej warstwy, która utrzymuje kontakt z błoną podstawną i ma zdolność proliferacyjną i komórkową macierzystą. Warstwa podstawowa daje początek zróżnicowanym warstwom powyżej, takim jak warstwy kolczyste, ziarniste i warstwa rogowa naskórka2,4. Badania nad śledzeniem linii pokazują, że ta bezpośrednia metoda CRISPR/Cas9 in vivo genetycznie manipuluje komórkami macierzystymi rezydującymi w tkance w warstwie podstawnej, które utrzymują się przez całe dorosłe życie. Ponieważ lentiwirus może być miareczkowany w celu transdukcji ektodermy powierzchniowej E9.5 przy gęstości klonalnej, metoda ta może być stosowana do generowania myszy mozaikowych zawierających tysiące dyskretnych klonów z nokautem genów. Sekwencjonowanie nowej generacji może być następnie wykorzystane do analizy wpływu ablacji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w tych klonach w sposób multipleksowany5.

Ostatnio użyliśmy tej metody do oceny funkcji 484 genów, które wykazują powtarzające się mutacje w ludzkim raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSCC)5. HNSCC jest wyniszczającym nowotworem o wysokiej śmiertelności wynoszącej 40–50% i jestszóstym najczęściej występującym nowotworem na świecie6. HNSCC powstają w błonie śluzowej górnych dróg oddechowych lub jamy ustnej i są związane ze spożywaniem tytoniu i alkoholu lub zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV). Rak płaskonabłonkowy skóry (SCC) jest nowotworem skóry i stanowi drugi najczęstszy nowotwór u ludzi7. Skórne SCC i HNSCC są histologicznie i molekularnie bardzo podobne, z wysokim odsetkiem przypadków wykazujących zmiany w TP53, PIK3CA, NOTCH1 i HRAS8. Podczas gdy istnieje tylko garstka genów zmutowanych z dużą częstotliwością, istnieją setki genów, które są zmutowane z niską częstotliwością (< 5%), co jest zjawiskiem powszechnie określanym jako dystrybucja długiego ogona. Ponieważ większość genów z długiego ogona nie ma walidacji biologicznej lub klinicznej, wykorzystaliśmy tę technologię badań przesiewowych CRISPR in vivo do modelowania utraty funkcji tych genów u myszy podatnych na nowotwory z mutacjami uczulającymi w p53, Pik3ca lub Hras i zidentyfikowaliśmy kilka nowych genów supresorowych guza, które współpracują z p53, Pik3ca lub Hras, aby wywołać rozwój nowotworu5.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania multipleksowanych bibliotek lentiwirusowych CRISPR sgRNA i przeprowadzania badań przesiewowych nokautujących genów CRISPR/Cas9 w ektodermie na powierzchni myszy. Warto zauważyć, że metodologia ta może zostać zaadaptowana w celu włączenia innych technologii manipulacji genami, takich jak aktywacja CRISPR (CRISPRa) i inaktywacja CRISPR (CRISPRi), lub zmodyfikowana w celu ukierunkowania na inne układy narządów u myszy w celu zbadania funkcji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi IACUC University of Toronto.

1. Projektowanie i klonowanie pulowanych bibliotek CRISPR

  1. Wybierz 4-5 sgRNA celujących w interesujące geny mysie, korzystając z zasobów takich jak projektant sgRNA Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) lub serwer CHOPCHOP (https://chop.cbu.uib.no). Wybierz taką samą liczbę niecelujących sgRNA, np. z pracy Sanjana et al.9, aby wygenerować bibliotekę gRNA kontrolną o tej samej wielkości.
  2. Podczas konstruowania bibliotek sgRNA upewnij się, że zapewniono odpowiednią liczbę kopii dla każdego sgRNA w badanym systemie narządowym. W przypadku skóry myszy, naskórek w dniu E9.5 stanowi pojedynczą warstwę zawierającą ~150 0 komórek, z których większość ma zdolność do różnicowania się z komórek macierzystych4. Jeśli transdukcja lentiwirusowa skutkuje zakażeniem 15-20% komórek, w dniu E9.5 transdukowanych zostanie jedynie 18 0-24 0 komórek. Dostosuj skalę eksperymentu odpowiednio do tych wartości.
  3. W celu klonowania i amplifikacji tych bibliotek sgRNA, dodaj miejsca restrykcyjne dla enzymu BsmBI oraz sekwencje wiążące primery na końcach 5' i 3' sgRNA, a następnie zamów powstałe pełne oligonukleotydy w formie puli na chipie oligonukleotydowym (Rycina 1A).
    1. Aby zmaksymalizować liczbę różnych bibliotek na jednym chipie, dodaj sekwencje primerów specyficzne dla danej biblioteki.
    2. Używając odpowiednich par primerów, amplifikuj każdą bibliotekę oddzielnie z puli oligonukleotydowej. W probówce PCR zmieszaj 25 µL 2x master mixu polimerazy, 20 µL wody wolnej od DNazy/RNazy, 5 ng DNA z chipa oligonukleotydowego, 2,5 µL odpowiedniego primera forward oraz 2,5 µL odpowiedniego primera reverse. Przeprowadź 12-15 cykli amplifikacji w termocyklerze z parametrami: denaturacja 98 °C, przyłączanie 63-67 °C, elongacja 72 °C dla każdego cyklu.
    3. Rozdziel produkt PCR w 2,5% żelu agarozowym i oczyść produkt PCR o wielkości ~10 bp za pomocą zestawu do oczyszczania DNA z żelu.
  4. Przygotuj plazmid szkieletowy.
    1. Traw 5 µg plazmidu pLKO-Cre stuffer v3 zawierającego rekombinazę Cre za pomocą 2 µL BsmBI w 50 µL mieszaniny reakcyjnej przez 1 h w 5 °C, a następnie inkubuj z 1 µL fosfatazy alkalicznej przez 45 min w 37 °C zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Plazmid pLKO-Cre stuffer v3 zawierający rekombinazę Cre jest plazmidem lentiwirusowym, który posiada enzym rekombinazę Cre służący do usunięcia kasety Lox-Stop-Lox w komórkach mysich, a także promotor U6 sterujący ekspresją sgRNA i tracrRNA. Można zastosować wersję z Cas9 lub bez Cas9, dostępne na Addgene pod numerami #158030 i #158031.
    2. Rozdziel strawione DNA w 1% żelu agarozowym i oczyść prążek zlinearyzowanego wektora o wielkości 7 kb za pomocą zestawu do oczyszczania DNA z żelu. Należy zauważyć, że widoczny powinien być również prążek stuffer o wielkości 2 kb, co wskazuje na prawidłowe trawienie.
  5. Przeprowadź reakcję ligacji w celu wygenerowania biblioteki plazmidów sgRNA.
    1. Zmieszaj 1 µg oczyszczonego wektora i 30 ng oczyszczonego insertu PCR z 2 µL BsmBI, 5 µL ligazy T4 DNA, 10 µM ATP oraz 1x buforem specyficznym dla BsmBI. Inkubuj mieszaninę ligacyjną przez noc w 37 °C. Jako kontrolę negatywną wykorzystaj dodatkową probówkę zawierającą wszystkie powyższe składniki z wyjątkiem insertu PCR.
    2. Następnego dnia rano oczyść mieszaninę ligacyjną za pomocą zestawu do oczyszczania oligonukleotydów i eluuj w 7 µL wody wolnej od RNazy/DNazy.
  6. Wprowadź bibliotekę do kompetentnych komórek metodą elektroporacji.
    1. Dodaj 2 µL eluowanej biblioteki sgRNA lub mieszaniny ligacyjnej kontroli negatywnej do 25 µL rozmrożonych komórek elektrokompetentnych w schłodzonych wcześniej kuwetach (1,0 mm) na lodzie. Wykonaj elektroporację zgodnie z protokołem producenta (10 µF, 60 Ohmów, 180 Woltów). W ciągu 10 s od impulsu dodaj do kuwety 975 μL pożywki regeneracyjnej (lub pożywki SOC).
    2. Przenieś elektroporowane komórki do probówki z kulturą i inkubuj przez godzinę w 37 °C w bakteriologicznym inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 rpm.
  7. Oszacuj wydajność transformacji oraz pokrycie biblioteki na każdy sgRNA.
    1. Przygotuj 10-krotne rozcieńczenie, przenosząc 10 μL reakcji transformacji zawierającej komórki elektroporowane biblioteką sgRNA lub kontrolną ligacją do 90 μL pożywki regeneracyjnej i wymieszaj dokładnie.
    2. Wysiej 10 μL rozcieńczonej mieszaniny transformacyjnej na uprzednio ogrzaną płytkę LB z ampicyliną (100 µg/L) o średnicy 10 cm. Daje to 10 0-krotne rozcieńczenie transformantów; użyj tej płytki do obliczenia wydajności transformacji. Inkubuj płytki w 30 °C przez 14–16 h.
  8. Wysiej resztę reakcji transformacyjnej, rozcierając 10 μL zregenerowanych komórek na każdej z łącznie 10 uprzednio ogrzanych płytek LB z ampicyliną o średnicy 15 cm. Inkubuj płytki przez 14–16 h w 30 °C. Należy pamiętać, że wzrost w 30 °C minimalizuje rekombinację między dwiema długimi powtórzeniami końcowymi (LTR) w plazmidzie wirusowym.
  9. Aby ocenić sukces klonowania, oblicz wydajność transformacji. Policz liczbę kolonii na płytce rozcieńczeniowej zawierającej transformanty z biblioteki sgRNA lub kontroli negatywnej (płytki 10 cm, krok 1.8.2). Mieszanina kontrolna nie powinna zawierać kolonii lub tylko ich bardzo niewielką liczbę. Aby uzyskać całkowitą liczbę kolonii, pomnóż liczbę kolonii przez 10 0.
    UWAGA: Policzona całkowita liczba kolonii reprezentuje pokrycie biblioteki, które powinno wynosić minimum 20x kolonii na jeden sgRNA.
    1. Upewnij się, że biblioteka zawierająca 200 sgRNA posiada co najmniej 40 0 kolonii. W przypadku niewystarczającej liczby kolonii, powtórz proces i wykonaj więcej elektroporacji.
  10. Kontrola jakości: Z płytki z rozcieńczeniem wybierz 20 kolonii i przenieś każdą do oddzielnej probówki zawierającej 3 mL pożywki LB z ampicyliną. Inkubuj wszystkie 20 probówek przez noc w 30 °C przy wytrząsaniu 250 rpm. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do mini-prep zgodnie z instrukcją producenta i przeprowadź sekwencjonowanie metodą Sangera dla wszystkich 20 próbek DNA plazmidowego, aby zweryfikować, czy każda próbka posiada inną sekwencję sgRNA, używając primera U6 (5’-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3’).
  11. Zbierz kolonie z każdej płytki 15 cm.
    1. Dodaj 7 mL pożywki LB, a następnie zeskrob kolonie z płytki LB Agar za pomocą rozcieracza do komórek. Użyj pipety 10 mL, aby przenieść komórki do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 2 L. Powtórz dla wszystkich płytek i połącz bakterie w kolbie 2 L. Inkubuj kolbę przez 2-3 h przy wytrząsaniu w 30 °C. Odwiruj kulturę i zbierz osad.
    2. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów maxi-.
  12. Dodatkowa kontrola jakości: Użyj 1 ng plazmidowego DNA biblioteki sgRNA z maxi-prep i przeprowadź reakcję PCR przy użyciu primerów do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zgodnie z instrukcją producenta. Reprezentację wszystkich sgRNA w bibliotece można zweryfikować za pomocą platformy głębokiego sekwencjonowania.

2. Produkcja wysokomiarecznego lentiwirusa odpowiedniego do transdukcji in vivo

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji protokołu należy przeprowadzić w placówce BSL2+ w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2. Komórki pakujące 293FT, a w szczególności 293NT, umożliwiają wyższą produkcję wirusa. Do transfekcji należy używać komórek HEK293T, 293FT lub 293NT o niskim numerze pasażu (

  1. Przygotowanie komórek do pakowania wirusów.
    1. W dniu 1. wysiać komórki HEK293T na 6 płytkach o średnicy 15 cm powlekanych poli-L-lizyną, osiągając 35% konfluencji w pożywce wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 1% roztwór antybiotyku penicylina-streptomycyna (m/v)). Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO22.
    2. Gdy wysiane komórki osiągną 70-80% konfluencji i będą równomiernie rozmieszczone, należy zastąpić pożywkę wzrostową 25 ml pożywki DMEM bez surowicy i antybiotyków.
    3. Podczas dokarmiania należy powoli dodawać pożywkę po ściankach kolb, ponieważ komórki HEK293T i 293NT mogą łatwo odklejać się od tworzywa sztucznego naczyń do hodowli tkanek.
  2. Przygotować mieszaninę do transfekcji.
    1. Dodaj 65 µg plazmidów pakujących lentiwirusowych psPAX2, 43 µg plazmidu pMD2.G kodującego białko osłonki VSV-G, 65 µg plazmidu biblioteki sgRNA i 240 µL dodaj 1 mg/mL polietylenoiminy (PEI) do 6 mL DMEM i wymieszaj na wortexie.
      UWAGA: Do transfekcji należy zawsze używać nieotwartej lub bardzo niedawno otwartej butelki medium DMEM, ponieważ na tym etapie kluczowe jest pH, a DMEM z czasem staje się bardziej zasadowe po otwarciu.
    2. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Taka mieszanina do transfekcji jest wystarczająca dla komórek wysianych na 6 płytkach o wymiarach 15 cm o powierzchni 870 cm²2 powierzchnia. Dostosuj skalę mieszaniny do transfekcji zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
  3. Transfekcja komórek do pakowania wirusów.
    1. Po 15 min inkubacji przeprowadź transfekcję każdej z płytek 15 cm, dodając kroplami 1 ml mieszaniny do transfekcji na całą powierzchnię płytki. Inkubuj w 37 °C, 5% CO22 przez 8 h.
    2. Po inkubacji usunąć pożywkę bezsurowiczą zawierającą mieszaninę do transfekcji, dodać 30 ml zwykłej pożywki hodowlanej do płytek 15 cm i inkubować przez 48 h w 37 °C, 5% CO22.
  4. Po 48 h należy zebrać nadsącz wirusowy i przefiltrować przez 0.45 μm filtr PVDF. Zachować 1 ml supernatantu wirusowego i przechowywać w temperaturze -80 °C do kontroli jakości i miareczkowania wirusów.
  5. Skoncentruj nadsącz wirusowy za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy w wirówce wysokoprędkościowej z zastosowaniem rotora SW28.
    1. Przygotuj probówki do ultrawirówki, myjąc je 70% etanolem, a następnie płucząc trzykrotnie w PBS. Równomiernie rozdziel około 30 ml supernatantu wirusowego do każdej z 6 probówek do ultrawirówki.
    2. Ostrożnie nanieś pipetą na dno każdej probówki 4 ml 20% roztworu sacharozy (20 g sacharozy w 10 ml buforu PBS). Umieść sześć probówek do ultrawirowania w sześciu koszykach SW28 i precyzyjnie zrównoważ każdą przeciwległą parę koszyków, dodając lub usuwając nadsącz wirusowy.
    3. Wirułkę z nadnadkładu wirować przy 4 °C przez co najmniej 2 h i do 4 h przy 80 0 x g i 4 °CPo zakończeniu wirowania należy ostrożnie odlać supernatant.
    4. Odlać pozostały supernatant, umieszczając probówki do ultrawirówki dnem do góry na sterylnym, miękkim ręczniku papierowym przez co najmniej 2 min, a następnie wytrzeć miękkim ręcznikiem papierowym wszelkie krople supernatantu wewnątrz probówki, aby usunąć resztki pożywki. Na dnie probówki może być widoczny mały, szaro-biały osad.
    5. Dodaj 20-25 μL do każdej probówki dodać zimny, świeży PBS. Probówki należy zamknąć folią parafinową i inkubować w pozycji pionowej na lodzie, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce orbitalnej przez ok. 2 h.
    6. Korzystając z 20 μL pipetą ostrożnie rozbić i resuspendować pellet z pierwszej probówki, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Przenieść medium do kolejnej probówki i powtarzać tę czynność, aż wszystkie pellety wirusowe zostaną rozbite i połączone w jednej probówce o objętości około 120-150 μL objętość. Inkubować tę zawiesinę wirusową o wysokim mianie przez kolejne ok. 2 h na lodzie, delikatnie wstrząsając.
    7. Przenieść zawiesinę wirusową do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wirować probówkę przy 4 °C w chłodzonej i schłodzonej wcześniej wirówce nakładkowej przy 12 0 x g przez 2 min. Ostrożnie odnieś odpowiednią ilość klarownego naddestapenu wirusowego jako 10 μL alikwoty w osobnych probówkach o pojemności 0,2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °COdrzuć osad znajdujący się na dnie probówki, ponieważ mógłby on zapchać igłę podczas wstrzykiwań do zarodków.
  6. Miareczkowanie puli biblioteki CRISPR w wektorach lentiwirusowych
    UWAGA: Otrzymana zawiesina wirusowa powinna wykazać około 200-krotne zagęszczenie, a otrzymany roztwór wirusa powinien posiadać miano wirusa wynoszące 107-109, co wystarczy na przeprowadzenie ponad 100 operacji zarodków w stadium E9.5 opisanych poniżej.
    1. Wysiać embrionalne fibroblasty mysie (MEF) R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato lub pierwotne keratynocyty R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato lub dowolną inną linię komórkową z reporterem Cre do płytki 2 x 6 dołkowej.
    2. Gdy komórki osiągną około 40% konfluencji, są gotowe do transdukcji. W tym momencie należy określić liczbę komórek w jednej studience, aby umożliwić późniejsze obliczenie miana wirusa. Należy wymienić medium komórek Cre-reporter na medium wzrostowe uzupełnione o 10 µg/mL polybrene (=bromek heksadymetryny).
    3. Rozcieńczyć 1 μL skoncentrowanego wirusa z 2 ml pożywki wzrostowej. Dodać 0, 10, 50, 200 µL rozcieńczonej zawiesiny wirusowej i 50, 200 µL niekoncentrowanego wirusa z kroku 2.4, wymieszać płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO22.
    4. Następnego dnia należy usunąć pożywkę wzrostową zawierającą wirusa, przemyć komórki PBS i zastąpić ją zwykłą pożywką wzrostową. Nadpływ w tym momencie nadal jest traktowany jako odpad wirusowy i musi zostać zutylizowany zgodnie z instytucjonalnymi przepisami BSL2.
    5. Około 36–48 h po transdukcji ocenia się rekombinację kasety Lox-STOP-Lox zapośredniczoną przez Cre oraz ekspresję tdTomato za pomocą FACS. Oblicza się miano wirusa. Oblicza się liczbę jednostek tworzących kolonie (cfu)/ml, korzystając z następującego wzoru:
      Wzór na wydajność transdukcji, równanie do analizy oddziaływań między komórką a wirusem w badaniach wirusologicznych.
      UWAGA: Porównanie skoncentrowanej zawiesiny wirusowej z niekoncentrowanym nadsączem wirusowym pozwoli ocenić skuteczność (1) produkcji wirusa oraz (2) koncentracji wirusa. Alternatywnie miano wirusa można oszacować za pomocą metody qRT-PCR.10Wielkoskalowa produkcja i koncentracja lentiwirusów może być również przeprowadzona w procesie dwuetapowej koncentracji, obejmującej koncentrację za pomocą wkładu, a następnie ultrawirowanie, zgodnie z wcześniejszym opisem.2.

3. Operacja i iniekcja pod kontrolą ultradźwięków

UWAGA: Technologia ta została zaadaptowana z4,1. Mikrowstrzyknięcie nakierowane na transdukcję nabłonka powierzchniowego musi zostać wykonane w 9,5 dniu embrionalnym (E9.5), kiedy ektodermy powierzchniowe składają się z pojedynczej warstwy i przed powstaniem perydermy rozpoczynającym się w E10, co zapobiegłoby transdukcji tej warstwy podstawnej. Zaleca się przygotowanie myszy w piątek, aby pierwszym możliwym dniem z embrionami w stadium E9.5 był następny poniedziałek. W celu uzyskania optymalnej wydajności CRISPR/Cas9 należy użyć myszy Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857)12.

  1. Przygotuj odpowiednie samce i samice myszy do zapłodnień kontrolowanych na 10 dni przed planowaną datą operacji.
    1. W kolejnych dniach sprawdzaj obecność czopów u myszy, aby zidentyfikować potencjalnie ciężarne zwierzęta. Potwierdź ciążę dzień przed planowaną operacją (tj. w dniu E8.5) za pomocą badania USG.
  2. Przygotuj zmodyfikowaną szalkę Petriego.
    1. Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej przyklej membranę silikonową do dna szalki Petriego, zakrywając okrągły otwór. Ostrymi nożyczkami wytnij w membranie silikonowej otwór owalny o wymiarach 2 x 10 mm.
  3. Przygotowanie systemu mikroiniekcji
    1. Przygotuj igły do iniekcji z grubościennej kapilary szklanej, używając wyciągacza mikrokapilar (micropipette puller) z następującymi ustawieniami: Pressure = 20; Heat = 769; Pull = 0; Velocity = 140; Time = 10.
    2. Używając precyzyjnych nożyczek, odetnij końcówkę igły na poziomie, gdzie jej średnica wynosi ok. 30 μm. Zaostrz igłę za pomocą ostrzałki do igieł pod kątem 20° na płytce ściernej o drobnej ziarnistości, regularnie zwilżając ją przez 20 min.
    3. Sterylizuj igłę do mikroiniekcji, przepychając 70% etanol za pomocą strzykawki 10 mL z igłą 26 G1/2. Używając strzykawki 10 mL i igły 26 G1/2 wypełnionej olejem mineralnym, wypełnij igłę do mikroiniekcji od tyłu. Upewnij się, że w igle nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Zamocuj igłę do mikroiniekcji w mikromanipulatorze zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Napełnij igłę wirusową biblioteką sgRNA.
    1. Nanieś pipetą 10 μL zawiesiny wirusowej na parafilm przymocowany do płaskiej powierzchni.
    2. Za pomocą mikromanipulatora usuń olej mineralny. Obecność niewielkiej ilości oleju w igle zapobiegnie kontaktowi lentiwirusa z tłokiem. Napełnij igłę ok. 4-5 μL zawiesiny wirusowej poprzez powolne zasysanie, unikając pęcherzyków powietrza.
  5. Znieczul ciężarną mysz w komorze indukcyjnej z izofluranem. Ustaw regulator tlenu na 1 L/min, a parowar izofluranu na 2%. Aby sprawdzić, czy zwierzę jest znieczulone, wykonaj test ucisku palca u nogi po ok. 3-5 min przebywania w komorze indukcyjnej.
  6. Umieść znieczulone zwierzę brzuchem do góry na podgrzewanym stole operacyjnym (40 °C) i użyj taśm chirurgicznych, aby unieruchomić łapy, stosując rurkę anestezjologiczną przy nosie w celu zapewnienia stałego dopływu izofluranu i tlenu aż do zakończenia operacji.
  7. Potwierdź ciążę w dniu E9.5, jeśli nie zostało to zrobione w dniu E8.5.
    1. Nanieś niewielką ilość (ok. ½ łyżeczki) kremu do depilacji na brzuch i rozprowadź go na obszarze 3 x 3 cm za pomocą aplikatora z bawełką.
    2. Po 2-3 min delikatnie usuń krem gazą lub chusteczką i przemyj obszar za pomocą PBS i 70% etanolu.
    3. Używając głowicy USG i żelu, sprawdź u ciężarnej myszy dzień embrionalny E9.5. Należy zauważyć, że można to zrobić również dzień wcześniej, w dniu E8.5, aby zaoszczędzić czas w dniu właściwej operacji.
    4. Usuń żel USG i przemyj obszar za pomocą PBS, a następnie 70% etanolu w celu dezynfekcji.
  8. Wstrzyknij podskórnie samicy myszy 0,02 cc analgetyku buprenorfinowego.
  9. Chirurgicznie odsłoń macicę
    1. Używając sterylnych pęset i nożyczek, wykonaj pionowe nacięcie skóry myszy o długości ok. 2 cm.
    2. Za pomocą pęsety tępej oddziel skórę wokół nacięcia od otrzewnej.
    3. Używając sterylnych pęset i nożyczek, przetnij otrzewną.
    4. Za pomocą pęsety tępej delikatnie wysuń lewy i prawy róg macicy i policz embriony.
    5. Wprowadź z powrotem większość rogów macicy, pozostawiając odsłonięty dystalny koniec jednego rogu zawierający 3 embriony.
    6. Za pomocą pęsety tępej delikatnie przesuń macicę z 3 embrionami przez otwór w membranie silikonowej zmodyfikowanej szalki Petriego.
    7. Ustabilizuj szalkę Petriego za pomocą kostek plasteliny.
  10. Ustabilizuj macicę z trzema embrionami wewnątrz szalki Petriego za pomocą formy silikonowej. Spłaszcz silikonową zatyczkę po stronie embrionów za pomocą ostrego noża.
  11. Wypełnij szalkę Petriego sterylnym PBS. Dociśnij membranę silikonową na dnie szalki do brzucha ciężarnej samicy, aby zapobiec wyciekom.
  12. Przesuń głowicę USG do szalki Petriego na wysokość ok. 0,5 cm nad górnym embrionem i ustaw stół tak, aby jamka płucno-owodniowa była wyraźnie widoczna w obrazie USG.
  13. Ostrożnie skieruj igłę iniekcyjną do zmodyfikowanej szalki Petriego. Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę igły w odległości ok. 5 mm od górnego embrionu. Następnie przesuwaj igłę w przód i w tył, aż znajdzie się w płaszczyźnie, w której jej końcówka jest najjaśniejszym punktem w obrazie USG.
  14. Za pomocą mikromanipulatora wprowadź igłę przez ścianę macicy do jamki płucno-owodniowej.
  15. Wstrzyknij lentiwirusa zawierającego bibliotekę sgRNA.
    1. Zaprogramuj iniekcję na 62 nL i powolną prędkość wtryskiwania. Mikroinjektor można zaprogramować na wstrzykiwanie określonych objętości z prędkością powolną lub szybką.
    2. Naciśnij przycisk Inject 8 razy, aby wstrzyknąć łącznie 496 nL na embrion. Dostosuj objętość do aktualnych potrzeb i miana wirusa. Miano wirusa 1 x 108 pfu/mL i objętość iniekcji 496 nL zapewnią około 30% infekcyjności.
    3. Powtórz tę samą procedurę dla dwóch pozostałych embrionów.
    4. Podnieś głowicę USG i usuń silikonową zatyczkę.
    5. Delikatnie wprowadź 3 embriony do jamy brzusznej myszy za pomocą sterylnego tamponu bawełnianego.
    6. Delikatnie wysuń kolejne 3 embriony i powtarzaj procedurę iniekcji, aż do wstrzyknięcia pożądanej liczby embrionów.
      UWAGA: Nie przekraczaj 30 min znieczulenia, ponieważ ciężarne samice znacznie częściej dokonują aborcji embrionów po tym czasie. Doświadczony chirurg może wstrzyknąć do 12 embrionów w ciągu 30-minutowej operacji.
  16. Podnieś głowicę USG, usuń mikromanipulator z igłą, odessaj PBS i usuń szalkę Petriego. Używając sterylnych chusteczek, wchłoń cały PBS, który mógł zebrać się w jamie brzusznej.
  17. Zamknij nacięcie otrzewnej za pomocą szwów wchłanialnych. Użyj dwóch zszywek do zamknięcia nacięcia w skórze brzucha.
    UWAGA: Podczas przeprowadzania operacji in utero pod kontrolą USG należy zachować najwyższą ostrożność w celu utrzymania czystego środowiska, zachowania maksymalnej sterylności i uniknięcia wszelkich możliwych zanieczyszczeń. Jeśli tego samego dnia należy przeprowadzić więcej niż jedną operację, ważne jest wysterylizowanie narzędzi sekcyjnych za pomocą sterylizatora kuleczkowego oraz oczyszczenie innych aparatów mających kontakt z tkanką myszy za pomocą etanolu. Znacznie zwiększa to przeżywalność embrionów po operacji. Wskaźnik przeżywalności dla opisanej tutaj metody chirurgicznej stale mieści się w przedziale 80-10%.
  18. Opieka pooperacyjna.
    1. Pozwól ciężarnej samicy dojść do siebie w podgrzewanej klatce i obserwuj ją przez 15-30 min.
    2. Sprawdź kanał pochwy pod kątem obecności krwi, co jest wczesnym objawem aborcji i powikłań. W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego podawaj analgetyk dwa razy dziennie przez dwa dni po operacji.
  19. Zidentyfikuj transdukowane embriony/noworodki myszy Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopią sekcyjnego, latarki do białek fluorescencyjnych i szkieł filtrujących lub poprzez genotypowanie zintegrowanych cząstek wirusowych w wycinkach ucha lub ogona.
    UWAGA: Myszy najlepiej identyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym do 3. dnia po urodzeniu, zanim zacznie rosnąć sierść.
  20. Aby zapewnić odpowiednie pokrycie biblioteki CRISPR, oblicz pokrycie na podstawie następujących parametrów: ektodermy powierzchniowej myszy w dniu E9.5 składa się z ok. 150 0 komórek; transdukcja na poziomie ok. 20% skutkuje minimalnym wskaźnikiem podwójnej infekcji (ok. 1/10 komórek z podwójną infekcją)4,5,1; przy 20% infekcyjności każdy embrion ma 30 0 zainfekowanych komórek. Upewnij się, że co najmniej 10 pojedynczych komórek jest transdukowanych danym sgRNA. Na przykład pula 20 sgRNA wymaga 2 x 105 komórek lub 6-7 zwierząt.

4. Procedura sekwencjonowania głębokiego

  1. Po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu, takiego jak powstanie guza lub jakikolwiek inny fenotyp, uśmierć mysz i pobierz interesującą tkankę. Użyj zestawu do ekstrakcji DNA z krwi i tkanek, aby oczyścić DNA genomiczne zgodnie z protokołem producenta. Przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA z guzów oczyść stanowisko pracy preparatem DNA Erase i pracuj w miejscu oddalonym od części laboratorium, w której operuje się plazmidami.
    UWAGA: Ważne jest przygotowanie próbki referencyjnej, aby umożliwić obliczenie krotności zmian sgRNA w czasie. Przetransdukcyjne embriony 3 dni po infekcji lub przetransdukcyjne komórki (patrz krok 2. 6) mogą służyć jako próbka referencyjna do określenia reprezentacji sgRNA w oryginalnej bibliotece.
  2. Użyj 100 ng – 1,5 μg DNA genomicznego jako matrycy w 50 μL reakcji PCR 1 (wstępna amplifikacja), stosując zewnętrzne primery wymienione w Tabeli 1 oraz program PCR opisany w Tabeli 2. Przygotuj odpowiednią liczbę reakcji, aby uzyskać pożądaną głębokość pokrycia.
    UWAGA: Reakcję PCR z kodowaniem kreskowym (barcoding) przeprowadź w oddzielnym, dedykowanym obszarze laboratorium lub w komorze do hodowli tkankowej, która została dokładnie oczyszczona preparatem DNA erase, aby uniknąć zanieczyszczeń. Dla każdej płytki PCR przeprowadź kontrolę negatywną z wodą jako matrycą, aby upewnić się, że nie występuje kontaminacja.
  3. Połącz wszystkie reakcje PCR 1 i nałóż 20 μL na 1,5% kontrolny żel agarozowy, aby zweryfikować pomyślną amplifikację pasma o wielkości 60 bp.
  4. Użyj 5 μL połączonej reakcji PCR 1 jako matrycy w 50 μL reakcji PCR 2, stosując unikalną kombinację primerów z kodowaniem kreskowym wymienioną w Tabeli 3 oraz program PCR opisany w Tabeli 4. Nałóż 50 μL reakcji PCR 2 na 2% żel agarozowy i oczyść pasmo 20 bp za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Etap wstępnej amplifikacji jest wymagany tylko w przypadku amplifikacji złożonej tkanki przetransdukowanej. Jeśli amplifikowany jest pojedynczy guz, który prawdopodobnie rozwinął się z komórki klonalnej i w związku z tym zawiera tylko jedno sgRNA, można pominąć wstępny PCR 1 i przejść bezpośrednio do PCR 2.
  5. Oznacz stężenie DNA za pomocą kwantyfikacji fluorometrycznej i przekaż do głębokiego sekwencjonowania do ośrodka sekwencjonowania (np. 1 milion odczytów na guz).
  6. Użyj programu Bowtie v1.2.3, który pozwala jedynie na dopasowania bez luk (ungapped alignments), aby dopasować zsekwencjonowane odczyty do biblioteki sgRNA13. Utwórz indeks bowtie za pomocą polecenia bowtie-build, wprowadzając sekwencje sgRNA w formacie fasta. Mapuj odczyty za pomocą polecenia bowtie z opcjami -m 2 -v 1, co pozwala na maksymalnie dwa niedopasowania podczas dopasowania odczytu i odrzuca odczyty, które dopasowują się do więcej niż jednej sekwencji sgRNA z biblioteki. Zazwyczaj powyżej 80% odczytów dopasowuje się przy tych parametrach.
  7. Użyj polecenia count w programie MAGeCK, aby uzyskać tabelę liczby odczytów, wykorzystując plik z dopasowaniami jako dane wejściowe14. Tabela liczby sgRNA może być wykorzystana do dalszych analiz, takich jak określanie różnicowego sgRNA (MAGeCK) oraz wyszukiwanie genów niezbędnych (BAGEL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia projekt oligonukleotydów służących do kosztowo efektywnego multipleksowania kilku niestandardowych bibliotek CRISPR na pojedynczym chipie oligo 12k lub 92k. Po wybraniu sgRNA (oznaczonych kolorem niebieskim), oligonukleotydy projektuje się z miejsc restrykcyjnymi (BsmBI zaznaczone na pomarańczowo) oraz specyficznymi dla biblioteki parami starterów PCR (oznaczonymi kolorem zielonym). Można zaprojektować kilka bibliotek, stosując unikalne kombinacje par starterów do mult...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Edycja genomu CRISPR/Cas9 jest szeroko stosowana w badaniach in vitro i in vivo w celu zbadania funkcji genów i procesów komórkowych. Większość badań in vivo wykorzystuje komórki z edytowanym genem CRISPR/Cas9 przeszczepione do modelu zwierzęcego (alloprzeszczep lub ksenoprzeszczep). Chociaż jest to potężne narzędzie do badania genetyki raka i funkcji komórkowych, nadal brakuje mu natywnego mikrośrodowiska tkanek i może wywoływać zranienia i/lub reakcje immunologiczne.

Aby przezwyciężyć te wyz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR 365252), Fundacji Krembil oraz Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan jest stypendystą Kanadyjskiego Towarzystwa Onkologicznego (BC-F-16#31919).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr 0,45 mikronaSigmaS2HVU02RE
12k lub 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
Płytki do hodowli komórkowych 15 cmCorning
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Fosfataza alkalicznaNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
BsmBINEBR0580L
Chromowy szew jelitowyCovidien
Głębokie sekwencjonowanie (Next-Seq lub Hi-Seq)Zestaw
Zymo ResearchD4008
DNAesy Zestaw do ekstrakcji DNA krwi i tkanekQiagen69506
Elektrokompetentne komórki EnduraLucigen60242-1
Szklane naczynia włosowateDrummond3-000-203-G/X
HEK293T komórkiATCCCRL-3216
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterMLS-50
LB AgarBisent Technologies800-011-LG
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP97
Olej mineralnySigmaM5904
Zestaw plazmidów do mini-przygotowaniaFrogga BioPDH300
System znieczulenia tlenowego dla myszy VisualSonics
Nanoject II mikromanipulatorDrummond
NEBuffer 3.1 ( Bufor do BsmBI)NEBR0580L
Ostrzałka do igiełSutter InstrumentBV-10
Zestaw do czyszczenia oligoZymo researchD4060
PAGE oczyszczony podkład do sekwencjonowania illuminaIDT DNA
PEI (polietylenoimina)Sigma408727-100ML
Modelinapermoplastowa
Petridish z centralnym otworemVisual Sonics
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
Q5 Polimeraza 2x Master mix NEBM0494L
Qubit Fluorometryczna kwantyfikacjaInvitrogenQ33327
Półokrągła wtyczka silikonowaCorning
Membrana silikonowaVisual Sonics
T4 Ligaza DNANEBM0202L
Ultra-probówki wirówkoweBeckman Coulter344058
System ultradźwiękowy Vevo2000Visual Sonics
do oczyszczania DNA Illumina

Bibliografia

  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34(2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554(2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508(2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiew CRISPR in vivonokaut CRISPR Cas9nab onek sk ry myszytkanka jamy ustnejgeny supresorowe nowotwor wwstrzykiwanie pod kontrol ultrad wi k wlentiwirusowa biblioteka sgRNA95 dzie embrionalnysekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekrak g owy i szyi
Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.