Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Streszczenie

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) odegrały kluczową rolę w ocenie funkcji genów, modelowaniu chorób ludzkich i służyły jako model przedkliniczny do oceny ścieżek terapeutycznych. Jednak ich czasochłonność, pracochłonność i koszty ogranicza ich przydatność do systematycznej analizy funkcji genów. Najnowsze postępy w technologiach edycji genomu przezwyciężają te ograniczenia i pozwalają na szybkie generowanie specyficznych zaburzeń genów bezpośrednio w określonych narządach myszy w sposób multipleksowany i szybki. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w celu wygenerowania tysięcy klonów nokautujących geny w nabłonku skóry i jamy ustnej myszy oraz przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący kroki niezbędne do przeprowadzenia bezpośredniego badania przesiewowego CRISPR in vivo pod kątem genów supresorowych nowotworu. Podejście to można zastosować do innych narządów lub innych technologii CRISPR/Cas9, takich jak aktywacja CRISPR lub inaktywacja CRISPR, w celu zbadania biologicznej funkcji genów podczas homeostazy tkanek lub w różnych warunkach chorobowych.

Wprowadzenie

Jednym z wyzwań dla badań nad rakiem w erze postgenomicznej jest eksploracja ogromnej ilości danych genomowych pod kątem przyczynowych mutacji genowych i zidentyfikowanie węzłów w sieci genowej, które mogą być celem terapeutycznym. Chociaż analizy bioinformatyczne ogromnie pomogły w osiągnięciu tych celów, stworzenie skutecznych modeli in vitro i in vivo jest warunkiem wstępnym do rozszyfrowania złożoności systemów biologicznych i stanów chorobowych oraz umożliwienia opracowywania leków. Podczas gdy konwencjonalne transgeniczne modele myszy były szeroko stosowane w badaniach genetycznych in vivo nad rakiem, ich kosztowny, czasochłonny i pracochłonny charakter w dużej mierze uniemożliwił systematyczną analizę setek domniemanych genów nowotworowych odkrytych przez współczesną genomikę. Aby przezwyciężyć to wąskie gardło, połączyliśmy wcześniej ustaloną metodologię iniekcji in utero pod kontrolą ultradźwięków^1,2 z technologią edycji genów CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^3, aby jednocześnie indukować i badać mutacje powodujące utratę funkcji setek genów w skórze i jamie ustnej jednej myszy.

Metodologia opisana tutaj wykorzystuje ultradźwiękowe iniekcje zmodyfikowanych lentiwirusów do jamy owodniowej żywych embrionów myszy w dniu embrionalnym E9.5. Ładunek lentiwirusowy zawierający składniki CRISPR/Cas9 przekształca jednowarstwową ektodermę powierzchniową, która następnie powoduje powstanie nabłonka skóry i jamy ustnej. Skóra składa się z zewnętrznego naskórka, po którym następuje błona podstawna i skóra właściwa. Naskórek to nabłonek warstwowy złożony z wewnętrznej, podstawowej warstwy, która utrzymuje kontakt z błoną podstawną i ma zdolność proliferacyjną i komórkową macierzystą. Warstwa podstawowa daje początek zróżnicowanym warstwom powyżej, takim jak warstwy kolczyste, ziarniste i warstwa rogowa naskórka^2,4. Badania nad śledzeniem linii pokazują, że ta bezpośrednia metoda CRISPR/Cas9 in vivo genetycznie manipuluje komórkami macierzystymi rezydującymi w tkance w warstwie podstawnej, które utrzymują się przez całe dorosłe życie. Ponieważ lentiwirus może być miareczkowany w celu transdukcji ektodermy powierzchniowej E9.5 przy gęstości klonalnej, metoda ta może być stosowana do generowania myszy mozaikowych zawierających tysiące dyskretnych klonów z nokautem genów. Sekwencjonowanie nowej generacji może być następnie wykorzystane do analizy wpływu ablacji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w tych klonach w sposób multipleksowany⁵.

Ostatnio użyliśmy tej metody do oceny funkcji 484 genów, które wykazują powtarzające się mutacje w ludzkim raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSCC)⁵. HNSCC jest wyniszczającym nowotworem o wysokiej śmiertelności wynoszącej 40–50% i jest^szóstym najczęściej występującym nowotworem na świecie⁶. HNSCC powstają w błonie śluzowej górnych dróg oddechowych lub jamy ustnej i są związane ze spożywaniem tytoniu i alkoholu lub zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV). Rak płaskonabłonkowy skóry (SCC) jest nowotworem skóry i stanowi drugi najczęstszy nowotwór u ludzi⁷. Skórne SCC i HNSCC są histologicznie i molekularnie bardzo podobne, z wysokim odsetkiem przypadków wykazujących zmiany w TP53, PIK3CA, NOTCH1 i HRAS⁸. Podczas gdy istnieje tylko garstka genów zmutowanych z dużą częstotliwością, istnieją setki genów, które są zmutowane z niską częstotliwością (< 5%), co jest zjawiskiem powszechnie określanym jako dystrybucja długiego ogona. Ponieważ większość genów z długiego ogona nie ma walidacji biologicznej lub klinicznej, wykorzystaliśmy tę technologię badań przesiewowych CRISPR in vivo do modelowania utraty funkcji tych genów u myszy podatnych na nowotwory z mutacjami uczulającymi w p53, Pik3ca lub Hras i zidentyfikowaliśmy kilka nowych genów supresorowych guza, które współpracują z p53, Pik3ca lub Hras, aby wywołać rozwój nowotworu⁵.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania multipleksowanych bibliotek lentiwirusowych CRISPR sgRNA i przeprowadzania badań przesiewowych nokautujących genów CRISPR/Cas9 w ektodermie na powierzchni myszy. Warto zauważyć, że metodologia ta może zostać zaadaptowana w celu włączenia innych technologii manipulacji genami, takich jak aktywacja CRISPR (CRISPRa) i inaktywacja CRISPR (CRISPRi), lub zmodyfikowana w celu ukierunkowania na inne układy narządów u myszy w celu zbadania funkcji genów.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony i wykonany zgodnie z IACUC Uniwersytetu w Toronto.

1. Projektowanie i klonowanie zbiorczych bibliotek CRISPR

1. Wybierz 4-5 sgRNA ukierunkowanych na interesujące nas geny myszy z zasobów takich jak projektant sgRNA Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) lub serwer CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Wybierz równą liczbę niedocelowych sgRNA z np. Sanjana et al.⁹, aby wygenerować bibliotekę gRNA o jednakowej wielkości, która nie jest ukierunkowana.
2. Podczas konstruowania bibliotek sgRNA upewnij się, że każde sgRNA jest wystarczająco pokryte w docelowym układzie narządów. W przypadku skóry myszy naskórek w E9.5 jest pojedynczą warstwą, która zawiera ~150 000 komórek, z których większość ma pojemność komórek macierzystych⁴. Jeśli transdukcja wirusa lenti-wirusa spowoduje 15-20% zakaźności, tylko 18 000-24 000 komórek zostanie transdukowanych w E9,5. Odpowiednio przeskaluj eksperyment.
3. W celu klonowania i amplifikacji tych bibliotek sgRNA, dodaj miejsca restrykcyjne enzymu BsmBI, a także sekwencje DNA wiążące startery do końca 5' i 3' sgRNA i uporządkuj powstałe oligonukleotydy o pełnej długości jako pulę chipów oligonukleotydowych (Figura 1A).
   1. Aby multipleksować różne biblioteki na jednym chipie, dodaj sekwencje starterów specyficzne dla biblioteki.
   2. Używając odpowiednich par starterów, wzmocnij każdą bibliotekę oddzielnie od puli układu oligo. W probówce do PCR wymieszaj 25 μl 2x głównej mieszaniny polimerazy, 20 μl wody wolnej od DNazy/RNazy, 5 ng DNA oligo chipa, 2,5 μl odpowiedniego startera do przodu i 2,5 μl odpowiedniego startera odwrotnego. Użyj 12-15 cykli i amplifikuj denaturacją 98 °C, wyżarzaniem 63-67 °C, parametrami przedłużenia 72 °C dla każdego cyklu w maszynie do PCR.
   3. Uruchom produkt PCR na 2,5% żelu agarozowym i oczyść produkt PCR o stężeniu ~100 pz za pomocą żelowego zestawu do czyszczenia DNA.
4. Przygotuj plazmid szkieletowy.
   1. Wytrawić 5 μg plazmidu Cre-rekombinazy zawierającej plazmid nadziewarki pLKO-Cre v3 z 2 μl BsmBI w 50 μl mieszaniny reakcyjnej przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C, a następnie 1 μl inkubacji fosfatazy alkalicznej przez 45 minut w temperaturze 37 °C zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Cre-rekombinaza zawierająca plazmid nadziewarki pLKO-Cre v3 jest plazmidem na bazie lenti-wirusa, który zawiera enzym rekombinazy Cre do usuwania kasety Lox-Stop-Lox w komórkach myszy, a także ma promotor U6 do napędzania ekspresji sgRNA i tracrRNA. Wersja z Cas9 i bez Cas9 może być używana i dostępna na Addgene #158030 i #158031.
   2. Uruchom strawione DNA na 1% żelu agarozowym i oczyść zlinearyzowane pasmo wektorowe o wielkości 7 kb za pomocą zestawu do czyszczenia DNA w żelu. Warto zauważyć, że powinna być również widoczna wstęga nadziewarki o wielkości 2 kb, wskazująca na pomyślne trawienie.
5. Ustaw reakcję ligacji, aby wygenerować bibliotekę plazmidów sgRNA.
   1. Zmieszać 1 μg oczyszczonego wektora i 30 ng oczyszczonej wstawki PCR z 2 μl BsmBI, 5 μl ligazy DNA T4, 10 μM ATP i 1x buforem specyficznym dla BsmBI. Inkubować mieszaninę do ligacji przez noc w temperaturze 37 °C. Jako kontrolę ujemną użyć dodatkowej probówki zawierającej wszystkie wyżej wymienione materiały, z wyjątkiem wkładki do PCR.
   2. Następnego dnia rano oczyść mieszaninę ligacyjną za pomocą zestawu do oczyszczania oligo i eluuj w 7 μl wody wolnej od RNazy/DNaz.
6. Elektroportuj bibliotekę do kompetentnych komórek.
   1. Dodać 2 μl eluowanej biblioteki sgRNA lub mieszaniny ligacji kontroli ujemnej do 25 μl rozmrożonych elektrokompetentnych komórek we wstępnie schłodzonych kuwetach (1,0 mm) na lodzie. Elektroporacja zgodnie z protokołem producenta (10 μF, 600 Ohm, 1800 Volt). Do kuwety dodać 975 μl pożywki regeneracyjnej (lub pożywki SOC) w ciągu 10 s od impulsu.
   2. Przenieść elektroporowane komórki do probówki hodowlanej i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do wytrząsania bakterii z prędkością 300 obr./min.
7. Oszacuj wydajność transformacji i pokrycie biblioteki na sgRNA.
   1. Przygotować 100-krotne rozcieńczenie, przenosząc 10 μl reakcji przemiany zawierającej komórki elektroporowane biblioteką sgRNA lub ligacją kontroli ujemnej do 990 μl pożywki odzysku i dobrze wymieszać.
   2. Płytkę 10 μl rozcieńczonej mieszanki transformacyjnej na wstępnie ogrzanej płytce agarowej o średnicy 10 cm LB + ampicylina (100 μg/l). Powoduje to 10 000-krotne rozcieńczenie transformantów i wykorzystanie tej płytki do obliczenia wydajności transformacji. Przeprowadzić inkubację płytek w temperaturze 30 °C przez 14–16 godzin.
8. Pozostałą część reakcji przemiany należy poddać na płytkę, rozprowadzając 100 μl odzyskanych komórek na każdej płytce z łącznie 10 wstępnie ogrzanych płytek agarowych LB + ampicylina o średnicy 15 cm. Inkubować płytki przez 14–16 godzin w temperaturze 30 °C. Warto zauważyć, że wzrost w temperaturze 30 °C minimalizuje rekombinację między dwoma długimi powtórzeniami końcowymi w plazmidzie wirusa.
9. Aby ocenić powodzenie klonowania, oblicz wydajność transformacji. Policz liczbę kolonii na płytce rozcieńczającej zawierającej transformanty z biblioteki sgRNA lub ligacji kontroli ujemnej (płytki 10 cm, krok 1.8.2). Mieszanka kontroli ujemnej nie powinna mieć żadnych lub tylko bardzo niewiele rodzin. Aby uzyskać całkowitą liczbę kolonii, pomnóż liczbę kolonii przez 10 000,
   UWAGA: Zliczona całkowita liczba kolonii reprezentuje pokrycie biblioteki, które powinno wynosić co najmniej 200 kolonii na sgRNA.
   1. Upewnij się, że biblioteka z 2000 sgRNA będzie miała co najmniej 400 000 kolonii. W przypadku, gdy nie ma wystarczającej liczby kolonii, powtórz i ustaw więcej elektroporacji.
10. Kontrola jakości: Z płytki rozcieńczającej wybierz 20 kolonii i dodaj każdą kolonię do indywidualnej probówki hodowlanej zawierającej 3 ml pożywki LB + ampicyliny. Inkubować wszystkie 20 probówek przez noc w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą mini-zestawu przygotowawczego zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencjonuj Sangera wszystkie 20 próbek plazmidowego DNA, aby sprawdzić, czy każda próbka ma inną sekwencję sgRNA za pomocą startera U6 (5'-GAG, GGC, CTA, TCT, CCC, ATG, ATT CC-3').
11. Zbierz kolonie z każdego talerza o średnicy 15 cm.
    1. Dodaj 7 ml pożywki LB, a następnie zeskrob kolonie z płytki agarowej LB za pomocą rozsiewacza komórek. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieść komórki do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 2 l. Powtórzyć te czynności dla wszystkich płytek i bakterii w kolbie o pojemności 2 l. Inkubować kolbę przez 2-3 godziny, wytrząsając w temperaturze 30 °C. Odwirować kulturę i zebrać osad.
    2. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu maxi.
12. Dodatkowa kontrola jakości: Użyj 1 ng plazmidowego DNA z biblioteki maxi-prep sgRNA i przeprowadź reakcję PCR przy użyciu starterów sekwencjonowania nowej generacji zgodnie z instrukcjami producenta. Reprezentacja wszystkich sgRNA w bibliotece może być zweryfikowana przez platformę głębokiego sekwencjonowania.

2. Produkcja lentiwirusa o wysokim mianie nadającego się do transdukcji in vivo

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki opisane w tej sekcji protokołu w obiekcie BSL2+ w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2. 293FT, a zwłaszcza komórki pakujące 293NT, pozwalają na większą produkcję wirusa. Do transfekcji należy użyć komórek HEK293T o niskim przechodzeniu (

1. Przygotuj komórki opakowania wirusowego.
   1. W dniu 1 HEK293T się na płytkach na 6 15-centymetrowych płytkach pokrytych poli-L-lizyną przy 35% zbiegu w pożywce wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 1% roztwór antybiotyku penicylina-streptomycyna (w/v)). Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   2. Gdy posiane komórki zlewają się w 70-80% i równomiernie się rozprowadzają, zastąp pożywkę wzrostową 25 ml surowicy i pożywki DMEM bez antybiotyków.
   3. Podczas karmienia powoli dodawaj pożywkę do boków kolb, ponieważ komórki HEK293T i 293NT mogą łatwo odłączyć się od plastiku do hodowli tkankowych
2. Przygotuj mieszankę do transfekcji.
   1. Dodać 65 μg plazmidów lentiwirusowych psPAX2, 43 μg plazmidu otoczki eksprymującej VSV-G pMD2.G, 65 μg plazmidu biblioteki sgRNA i 240 μl 1 mg/ml polietylenoiminy (PEI) do 6 ml DMEM i vortex.
      UWAGA: Do transfekcji zawsze używaj nieotwartej lub bardzo niedawno otwartej butelki DMEM, ponieważ pH na tym etapie jest krytyczne, a DMEM staje się z czasem bardziej zasadowy po otwarciu.
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ta mieszanka transfekcyjna jest wystarczająca dla komórek platerowanych na płytkach 6 x 15 cm o powierzchni 870 cm². Przeskaluj mieszankę transfekcyjną zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
3. Transfekcja komórek opakowania wirusa.
   1. Po 15 minutach inkubacji należy przeprowadzić transfekcję każdej z 15 cm płytek, dodając 1 ml mieszaniny transfekcji kroplami po całej płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 8 godzin.
   2. Po inkubacji usunąć pożywkę bez surowicy zawierającą mieszaninę do transfekcji i dodać 30 ml zwykłej pożywki hodowlanej do płytek o średnicy 15 cm i hodować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Po 48 godzinach zebrać supernatant wirusa i przefiltrować przez filtr PVDF 0,45 μm. Przechowywać 1 ml supernatantu wirusa i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu kontroli jakości i określenia miana wirusa.
5. Zagęścić supernatant wirusa przez wirowanie w gradiencie sacharozy w wirówce szybkoobrotowej przy użyciu głowicy wirnika SW28.
   1. Probówki ultrawirówek zalać myjąc je 70% etanolem, a następnie 3 płukać PBS. Równomiernie rozprowadzić około 30 ml supernatantu wirusa w każdej z probówek 6-ultrawirówkowych.
   2. Delikatnie odpipetować na dno każdej probówki 4 ml 20% roztworu sacharozy (20 g sacharozy w 100 ml PBS). Umieść sześć probówek ultrawirówek w sześciu obrotowych wiadrach SW28 i precyzyjnie zrównoważ każdą przeciwległą parę wiader, dodając lub usuwając supernatant wirusa.
   3. Odwirować supernatant wirusa w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny i do 4 godzin w temperaturze 80 000 x g w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyrzuć supernatant.
   4. Odcedź pozostały sklarowany sklaratant, umieszczając probówki ultrawirówki do góry nogami na sterylnym miękkim ręczniku papierowym na co najmniej 2 minuty i zetrzyj wszelkie kropelki supernatantu wewnątrz probówki za pomocą miękkiego ręcznika papierowego, aby pozbyć się resztek pożywki. Na dnie probówki może być widoczna mała szaro-biała osadka.
   5. Do każdej probówki dodać 20-25 μl zimnego, świeżego PBS. Uszczelnij probówki folią parafinową i inkubuj probówki pionowo na lodzie, delikatnie potrząsając na wytrząsarce platformy orbitalnej przez ~2 godziny.
   6. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl ostrożnie usunąć i ponownie zawiesić osad z pierwszej probówki, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Przenieś pożywkę do następnej probówki i powtarzaj proces, aż wszystkie granulki wirusa zostaną usunięte i połączone w jedną probówkę o objętości około 120-150 μl. Inkubuj tę zawiesinę wirusową o wysokim mianie przez kolejne ~ 2 godziny na lodzie, delikatnie wstrząsając.
   7. Przenieść zawiesinę wirusa do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i obracać probówkę w temperaturze 4 °C w schłodzonej i wstępnie schłodzonej wirówce stołowej o temperaturze 12 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie podwielokrotnić klarowny supernatant wirusa w postaci 10 μl podwielokrotności w oddzielnych probówkach o pojemności 0,2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wyrzucić osad znajdujący się na dnie probówki, ponieważ spowoduje to zatkanie igły podczas wstrzyknięć embrionalnych.
6. Miareczkowanie zbiorczej biblioteki lentiwirusów CRISPR
   UWAGA: Otrzymana zawiesina wirusa powinna dawać około 2,000-krotne stężenie i otrzymany roztwór wirusa oraz powinna mieć miano wirusa 10^7-109, co jest wystarczające dla ponad 100 operacji E9.5 opisanych poniżej.
   1. Wysiewaj R26-Lox-STOP-Lox-tdPomidorowe mysie fibroblasty embrionalne (MEF) lub R26-Lox-STOP-Lox-tdPierwotne keratynocyty pomidorowe lub dowolną inną linię komórkową Cre-reporter do płytki 2 x 6-dołkowej.
   2. Gdy komórka osiągnie ~40% konfluencji, komórki są gotowe do transdukcji. W tym czasie należy określić liczbę komórek w jednym dołku, aby umożliwić późniejsze obliczenie miana wirusa. Zmień pożywkę komórek Cre-reporter na pożywkę wzrostową uzupełnioną 10 μg / ml polibrenu (= bromek heksadimetryny).
   3. Rozcieńczyć 1 μl skoncentrowanego wirusa w 2 ml pożywki wzrostowej. Dodać 0, 10, 50, 200 μl rozcieńczonej zawiesiny wirusa i 50, 200 μl nieskoncentrowanego wirusa z etapu 2.4, wymieszać płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   4. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową zawierającą wirusa, umyj komórki PBS i zastąp normalną pożywką wzrostową. Supernatant w tym momencie jest nadal uważany za odpad wirusowy i musi być utylizowany zgodnie z instytucjonalnymi przepisami BSL2.
   5. Około 36-48 godzin po transdukcji oceń rekombinację kasety Lox-STOP-Lox za pośrednictwem Cre i ekspresję tdTomato przez FACS. Oblicz miano wirusa. Oblicz jednostki tworzące kolonie (jtk)/ml za pomocą następującego wzoru:
      
      UWAGA: Porównanie skoncentrowanej zawiesiny wirusa z jego nieskoncentrowanym supernatantem wirusowym pozwoli oszacować sukces (1) produkcji wirusa, jak również (2) stężenia wirusa. Alternatywnie, miano wirusa można oszacować za pomocą metody qRT-PCR¹⁰. Produkcja na dużą skalę i zagęszczenie lentiwirusa mogą być również przeprowadzone przy użyciu dwuetapowego zagęszczania z koncentracją w kartridżu, a następnie ultrawirowania, jak opisano wcześniej².

3. Chirurgia i iniekcja pod kontrolą ultradźwięków

UWAGA: Ta technologia została zaadaptowana z^4,11. Mikroiniekcja ukierunkowana na transdukcję nabłonka powierzchniowego musi być wykonana w dniu embrionalnym E9,5, kiedy ektoderma powierzchniowa składa się z pojedynczej warstwy i przed utworzeniem perydermy rozpoczynającej się od E10, co zapobiegłoby transdukcji tej warstwy podstawnej. Najlepiej ustawić myszy w piątek, tak aby pierwszym możliwym dniem z zarodkami E9,5 był następny poniedziałek. Użyj myszy Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857), aby uzyskać optymalną wydajność CRISPR/Cas9¹².

1. Ustaw odpowiednie samce i samice myszy do ciąży zaplanowanej na 10 dni przed pożądaną datą operacji.
   1. Sprawdzaj myszy w ciągu następnych dni, aby zidentyfikować potencjalnie ciężarne myszy. Potwierdź ciążę dzień przed planowanym zabiegiem (tj. E8,5) za pomocą ultradźwięków.
2. Przygotuj zmodyfikowaną szalkę Petriego.
   1. Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej przyklej silikonową membranę do dolnej części szalki Petriego, zakrywając okrągły otwór. Za pomocą ostrych nożyczek wytnij owalny otwór o wymiarach 2 x 10 mm w membranie silikonowej.
3. Przygotowanie systemu mikroiniekcji
   1. Przygotować igły iniekcyjne z grubościennej szklanej kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Ciśnienie = 200; Ciepło = 769; Ciągnięcie = 0; Prędkość = 140; Czas = 100.
   2. Za pomocą cienkich nożyczek odciąć końcówkę igły na poziomie, na którym jej średnica wynosi ~30 μm. Ukosować igłę za pomocą ostrzałki do igieł pod kątem 20° na drobnoziarnistej płycie ściernej z regularnym zwilżaniem przez 20 min.
   3. Wysterylizuj igłę do mikroiniekcji, wciskając 70% etanolu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 26 G1/2. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 26 G1/2 wypełnionej olejem mineralnym wypełnij igłę do mikroiniekcji. Upewnij się, że w igle do mikroiniekcji nie ma pęcherzyków powietrza.
   4. Zamontuj igłę mikrowtryskiwacza na mikromanipulatorze zgodnie z instrukcją producenta.
4. Załaduj igłę biblioteką wirusowego sgRNA.
   1. Odpipetować 10 μl zawiesiny wirusa na parafilm przymocowany do płaskiej powierzchni.
   2. Za pomocą mikromanipulatora usuń olej mineralny. Obecność niewielkiej ilości oleju w igle zapobiegnie kontaktowi lentiwirusa z tłokiem. Załadować około 4-5 μl zawiesiny wirusa przez powolne zasysanie bez pęcherzyków powietrza.
5. Znieczulij ciężarną mysz za pomocą komory indukcyjnej izofluranu. Ustaw regulator tlenu na 1 l/min, a parownik izofluranu na 2%. Aby ustalić, czy zwierzę jest znieczulone, sprawdź przez uszczypnięcie palca u nogi po ~3-5 minutach w komorze indukcyjnej izofluranu.
6. Umieścić znieczulone zwierzę brzuszną stroną do góry na podgrzanym etapie operacji (40 °C) i przyłożyć taśmy chirurgiczne, aby utrzymać łapy na miejscu za pomocą rurki anestezjologicznej stożka nosowego, aby zapewnić stały dopływ izofluranu i tlenu aż do zakończenia operacji.
7. Potwierdź ciążę E9.5, jeśli nie została wykonana w E8.5.
   1. Nałóż niewielką ilość (~ 1/2 łyżeczki) kremu do depilacji na brzuch i rozprowadź na powierzchni 3 x 3 cm za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
   2. Po 2-3 minutach delikatnie usuń krem gazą lub chusteczką i wytrzyj obszar do czysta za pomocą PBS i 70% etanolu.
   3. Za pomocą sondy ultradźwiękowej i żelu sprawdź, czy ciężarna mysz ma dzień embrionalny E9.5. Warto zauważyć, że można to również zrobić dzień wcześniej w E8.5, aby zaoszczędzić czas w dniu operacji.
   4. Usuń żel ultradźwiękowy i wytrzyj obszar do czysta za pomocą BPS, a następnie 70% etanolu do dezynfekcji.
8. Wstrzyknąć podskórnie 0,02 ml leku przeciwbólowego buprenorfiny do matki myszy.
9. Chirurgicznie odsłonić macicę
   1. Za pomocą sterylnych kleszczyków i nożyczek wykonaj pionowe nacięcie ~2 cm w skórze myszy.
   2. Za pomocą kleszczy oddziel skórę wokół nacięcia od otrzewnej.
   3. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przeciąć otrzewną.
   4. Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij lewy i prawy róg macicy i policz zarodki.
   5. Ponownie włóż większość rogów macicy, ale pozostaw odsłonięty dystalny koniec jednego rogu macicy zawierającego 3 zarodki.
   6. Za pomocą kleszczyków delikatnie wepchnij i przeciągnij macicę z 3 zarodkami przez otwór w silikonowej błonie zmodyfikowanej szalki Petriego.
   7. Ustabilizuj szalkę Petriego za pomocą kostek plasteliny.
10. Ustabilizuj macicę z trzema zarodkami wewnątrz szalki Petriego za pomocą silikonowej formy. Spłaszcz silikonową zatyczkę z boku zarodków za pomocą ostrego noża.
11. Napełnij szalkę Petriego sterylnym PBS. Przepłukać membranę silikonową na dnie szalki Petriego z brzuchem ciężarnej matki, zapobiegając w ten sposób wyciekom.
12. Przenieś głowicę ultrasonograficzną na szalkę Petriego ~0,5 cm na szczycie górnego zarodka i wyreguluj stopień tak, aby jama owodniowa stała się wyraźnie widoczna w widoku ultrasonograficznym.
13. Ostrożnie wyrównać igłę wtryskiwacza ze zmodyfikowaną szalką Petriego. Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę igły w odległości ~5 mm od górnego zarodka. Następnie przełącz igłę w przód iw tył i przejdź do płaszczyzny, w której jej końcówka wydaje się najjaśniejsza na obrazie ultrasonograficznym.
14. Za pomocą mikromanipulatora wepchnij igłę przez ścianę macicy do jamy owodniowej.
15. Wstrzyknąć lentiwirusa zawierającego bibliotekę sgRNA.
    1. Zaprogramuj wtryskiwacz na 62 nL i niską prędkość wtrysku. Mikroiniektor można zaprogramować tak, aby wstrzykiwał określone objętości z małą lub dużą prędkością.
    2. Naciśnij przycisk Inject 8 razy, co daje łącznie 496 nl na zarodek. Dostosuj głośność do wymaganych potrzeb i miana wirusa. Miano wirusa 1 x 10⁸ pfu/ml i objętość wstrzyknięcia 496 nL spowoduje około 30% zakaźności.
    3. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych dwóch zarodków.
    4. Podnieś głowicę ultradźwiękową i wyjmij silikonową zatyczkę.
    5. Delikatnie wepchnij 3 zarodki do brzucha myszy za pomocą sterylnej bawełnianej zamiany.
    6. Delikatnie wyciągnij kolejne 3 zarodki i powtarzaj procedurę wstrzykiwania, aż do wstrzyknięcia pożądanej liczby zarodków.
       UWAGA: Nie należy przekraczać 30 minut znieczulenia, ponieważ ciężarne matki są znacznie bardziej narażone na aborcję zarodków po tym czasie. Doświadczony chirurg może wstrzyknąć do 12 zarodków w ciągu 30 minut operacji.
16. Podnieś głowicę ultradźwiękową, wyjmij mikromanipulator z igłą, odessać PBS i wyjmij szalkę Petriego. Za pomocą sterylnych chusteczek wchłonąć wszelkie PBS, które mogły nagromadzić się w jamie brzusznej.
17. Zamknij nacięcie otrzewnej za pomocą szwów wchłanialnych. Użyj dwóch zszywek, aby zamknąć nacięcie w skórze brzucha.
    UWAGA: Podczas wykonywania operacji USG w macicy należy zachować najwyższą ostrożność w celu utrzymania czystego środowiska, utrzymania sterylności w jak największym stopniu i unikania wszelkich możliwych zanieczyszczeń. Jeśli tego samego dnia musi być wykonana więcej niż jedna operacja, ważne jest, aby wysterylizować narzędzia preparacyjne za pomocą sterylizatora perełkowego i wyczyścić inne urządzenia, które napotkają tkankę myszy oczyszczoną etanolem. To znacznie zwiększa przeżywalność zarodków po operacji. Wskaźnik przeżycia dla opisanej tutaj metody chirurgicznej wynosi stale 80-100%.
18. Opieka pooperacyjna.
    1. Pozwól ciężarnej samicy dojść do siebie w ogrzewanej klatce i obserwuj przez 15-30 minut.
    2. Sprawdź kanał pochwy pod kątem krwi, która jest wczesnym objawem poronienia i powikłań. W celu złagodzenia bólu pooperacyjnego należy podawać środek przeciwbólowy dwa razy dziennie przez dwa dni po zabiegu.
19. Zidentyfikuj transdukowane zarodki/nowonarodzone myszy Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, fluorescencyjnej latarki białkowej i okularów filtrujących lub poprzez genotypowanie w celu uzyskania zintegrowanych cząstek wirusa w klipsach do uszu lub ogona.
    UWAGA: Myszy najlepiej zidentyfikować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego do 3 dnia po urodzeniu, zanim zaczną rosnąć włosy.
20. Aby zapewnić wystarczające pokrycie biblioteki CRISPR, oblicz pokrycie na podstawie następujących parametrów: Ektoderma powierzchni myszy E9.5 składa się z ~150 000 komórek; transdukcja ~20% powoduje minimalny wskaźnik podwójnej infekcji (~1/10 podwójnie zainfekowanych komórek)^4,5,11; Przy 20% zakaźności każdy zarodek ma 30 000 zainfekowanych komórek. Upewnij się, że co najmniej 100 pojedynczych komórek jest transdukowanych za pomocą danego sgRNA. Na przykład pula 2000 sgRNA wymaga 2 x 10⁵ komórek lub 6-7 zwierząt.

4. Procedura głębokiego sekwencjonowania

1. Po uzyskaniu eksperymentalnego punktu końcowego, takiego jak powstawanie guza lub jakikolwiek inny fenotyp, poświęć mysz i zbierz tkankę, która Cię interesuje. Użyj zestawu do ekstrakcji DNA krwi i tkanek, aby oczyścić genomowe DNA zgodnie z protokołem producenta. Przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA z guzów wyczyść stół roboczy za pomocą DNA Erase i pracuj z dala od obszaru laboratoryjnego, w którym obsługiwane są plazmidy.
   UWAGA: Ważne jest, aby wygenerować próbkę referencyjną, aby umożliwić obliczenie zmian fałdowania sgRNA w czasie. Transdukowane zarodki 3 dni po zakażeniu lub transdukowane komórki (patrz krok 2.6) mogą służyć jako próbka referencyjna do określenia reprezentacji sgRNA w oryginalnej bibliotece.
2. Użyj 100 ng – 1,5 μg genomowego DNA jako matrycy w 50 μl reakcji PCR 1 przed amplifikacją przy użyciu zewnętrznych starterów wymienionych w tabeli 1 i programu PCR opisanego w tabeli 2. Ustaw wystarczającą reakcję, aby uzyskać pożądane pokrycie.
   UWAGA: Reakcję PCR z kodowaniem kreskowym należy przeprowadzić w oddzielnym przeznaczonym do tego obszarze laboratorium lub w kapturze do hodowli tkankowej, który jest dokładnie czyszczony przez usuwanie DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przeprowadzić kontrolę ujemną dla każdej płytki PCR z wodą jako szablonem, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.
3. Połącz wszystkie reakcje PCR 1 i uruchom 20 μl na 1,5% kontrolnym żelu agarozowym, aby sprawdzić powodzenie amplifikacji pasma 600 pz.
4. Użyć 5 μl zbiorczej reakcji PCR1 jako matrycy w 50 μl reakcji PCR 2 przy użyciu unikalnej kombinacji starterów z kodami kreskowymi wymienionej w tabeli 3 i programu PCR opisanego w tabeli 4. Przeprowadź 50 μl reakcji PCR 2 na 2% żelu agarozowym i oczyść pasmo 200 pz za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Etap wstępnej amplifikacji jest wymagany tylko w przypadku amplifikacji złożonej transdukowanej tkanki. W przypadku amplifikacji pojedynczego guza, który przypuszczalnie rozwinął się z komórki klonalnej, a zatem zawiera tylko pojedynczy sgRNA, można pominąć PCR1 przed amplifikacją i od razu przejść do PCR2.
5. Określ ilościowo stężenie DNA za pomocą kwantyfikacji fluorometrycznej i wyślij do głębokiego sekwencjonowania do zakładu sekwencjonowania (np. 1 milion odczytów na guz).
6. Użyj Bowtie v1.2.3, który pozwala tylko na niezainfekowane wyrównania, wyrównaj sekwencjonowane odczyty do biblioteki sgRNA¹³. Utwórz indeks muszki za pomocą polecenia bowtie-build, wprowadzając sekwencje sgRNA w formacie fasta. Mapuj odczyty za pomocą polecenia muszka z opcjami -m 2 -v 1, co pozwala na maksymalnie dwie niezgodności podczas wyrównywania odczytu i odrzuca odczyty, które wyrównują więcej niż jedną sekwencję sgRNA biblioteki. Zazwyczaj ponad 80% odczytów jest wyrównanych do tych parametrów.
7. Użyj polecenia MAGeCK count, aby uzyskać tabelę zliczania odczytów przy użyciu wyrównanego pliku jako input¹⁴. Tabela zliczania sgRNA może być używana do dalszych analiz, takich jak określanie różnicowych sgRNA (MAGeCK) i znajdowanie niezbędnych genów (BAGEL).

Wyniki

Rysunek 1A pokazuje projekt oligonukleotydów do multipleksowania kilku niestandardowych bibliotek CRISPR w opłacalny sposób w jednym 12k lub 92k oligo chipie. Po wybraniu sgRNA (oznaczonych kolorem niebieskim) oligonukleotydy są projektowane z miejscami restrykcyjnymi (BsmBI w kolorze pomarańczowym) i parami starterów PCR specyficznymi dla biblioteki (oznaczone kolorem zielonym). Można zaprojektować kilka bibliotek przy użyciu unikalnej kombinacji par starterów do multipleksowania w pojedync...

Dyskusja

Edycja genomu CRISPR/Cas9 jest szeroko stosowana w badaniach in vitro i in vivo w celu zbadania funkcji genów i procesów komórkowych. Większość badań in vivo wykorzystuje komórki z edytowanym genem CRISPR/Cas9 przeszczepione do modelu zwierzęcego (alloprzeszczep lub ksenoprzeszczep). Chociaż jest to potężne narzędzie do badania genetyki raka i funkcji komórkowych, nadal brakuje mu natywnego mikrośrodowiska tkanek i może wywoływać zranienia i/lub reakcje immunologiczne.

Aby przezwyciężyć te wyz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0,45 mikrona	Sigma	S2HVU02RE
12k lub 92k oligo chip	Customarray Inc. (Genscript)
Płytki do hodowli komórkowych 15 cm	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Fosfataza alkaliczna	NEB	M0290L
Amplicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Chromowy szew jelitowy	Covidien
Głębokie sekwencjonowanie (Next-Seq lub Hi-Seq)	Zestaw
	Zymo Research	D4008
DNAesy Zestaw do ekstrakcji DNA krwi i tkanek	Qiagen	69506
Elektrokompetentne komórki Endura	Lucigen	60242-1
Szklane naczynia włosowate	Drummond	3-000-203-G/X
HEK293T komórki	ATCC	CRL-3216
Wirówka szybkoobrotowa	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Bisent Technologies	800-011-LG
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument	P97
Olej mineralny	Sigma	M5904
Zestaw plazmidów do mini-przygotowania	Frogga Bio	PDH300
System znieczulenia tlenowego dla myszy Visual	Sonics
Nanoject II mikromanipulator	Drummond
NEBuffer 3.1 ( Bufor do BsmBI)	NEB	R0580L
Ostrzałka do igieł	Sutter Instrument	BV-10
Zestaw do czyszczenia oligo	Zymo research	D4060
PAGE oczyszczony podkład do sekwencjonowania illumina	IDT DNA
PEI (polietylenoimina)	Sigma	408727-100ML
Modelina			permoplastowa
Petridish z centralnym otworem	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polimeraza 2x Master mix NEB		M0494L
Qubit Fluorometryczna kwantyfikacja	Invitrogen	Q33327
Półokrągła wtyczka silikonowa	Corning
Membrana silikonowa	Visual Sonics
T4 Ligaza DNA	NEB	M0202L
Ultra-probówki wirówkowe	Beckman Coulter	344058
System ultradźwiękowy Vevo2000	Visual Sonics