Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu z grzbietowego bieguna hipokampa od dorosłych gryzoni

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61699

⸱

10 września 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opisanie metody wytwarzania wycinków grzbietowego hipokampa do badania elektrofizjologicznego. Procedura ta wykorzystuje perfuzję schłodzonym ACSF przed przygotowaniem plastra z kątem krojenia zbliżonym do korony, co pozwala na zachowanie zdrowych głównych neuronów.

Streszczenie

Zapisy całokomórkowych krostek z ostrych wycinków mózgu gryzoni są podstawą nowoczesnych badań neurofizjologicznych, umożliwiając precyzyjny pomiar właściwości komórkowych i synaptycznych. Niemniej jednak istnieje coraz większa potrzeba wykonywania analiz skorelowanych między różnymi trybami eksperymentalnymi oprócz elektrofizjologii warstwowej, na przykład: immunohistochemii, biologii molekularnej, obrazowania in vivo lub zapisu elektrofizjologicznego; aby odpowiedzieć na coraz bardziej złożone pytania dotyczące funkcjonowania mózgu. Jednak wyciągnięcie znaczących wniosków z tych różnych podejść eksperymentalnych nie jest proste, ponieważ nawet w stosunkowo dobrze opisanych strukturach mózgu istnieje wysoki stopień subregionalnej zmienności funkcji komórkowych. Nigdzie nie jest to lepiej zilustrowane niż w CA1 hipokampa, który ma dobrze zdefiniowane właściwości grzbietowo-brzuszne, oparte na właściwościach komórkowych i molekularnych. Niemniej jednak wiele opublikowanych badań analizuje wzorce ekspresji białek lub behawioralnie skorelowaną aktywność in vivo w grzbietowym zasięgu hipokampa; i wyjaśnić wyniki mechanicznie za pomocą elektrofizjologii komórkowej z obszaru brzuszno-przyśrodkowego. Jest to dodatkowo zagmatwane przez fakt, że wiele eksperymentów elektrofizjologicznych z ostrymi plastrami przeprowadza się u młodych zwierząt, podczas gdy inne tryby doświadczalne są przeprowadzane u bardziej dojrzałych zwierząt. Aby rozwiązać te problemy, metoda ta obejmuje perfuzję przezsercową dojrzałych (>60-dniowych gryzoni) sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, a następnie przygotowanie zmodyfikowanych wycinków koronalnych, w tym bieguna przegrody grzbietowego hipokampa, w celu zarejestrowania z komórek piramidowych CA1. Proces ten prowadzi do wytworzenia zdrowych, ostrych wycinków grzbietowego hipokampa, co pozwala na badanie elektrofizjologiczne komórkowe oparte na warstwach w połączeniu z innymi pomiarami.

Wprowadzenie

Hipokamp jest prawdopodobnie najlepiej zbadaną strukturą w mózgu ssaków, ze względu na jej stosunkowo duży rozmiar i wyraźną strukturę laminarną. Hipokamp jest zaangażowany w wiele procesów behawioralnych: nawigację przestrzenną, pamięć kontekstową i tworzenie epizodów. Wynika to częściowo ze względnej łatwości dostępu do grzbietowych części hipokampa u gryzoni do analizy in vivo. Rzeczywiście, główne ogniwa wyjściowe znajdują się zwykle mniej niż 2 mm od powierzchni pial.

U gryzoni hipokamp jest stosunkowo dużą strukturą, utworzoną z wgłębienia kresomózgowia rozciągającego się od przegrody grzbietowej do brzusznej kory nowej. Składa się z 2 głównych regionów: zakrętu zębatego i rogu amonisowego (CA); ten ostatni jest podzielony na 3 dobrze opisane podregiony (CA1-3), które rozciągają się do zakrętu zębatego hilus (wcześniej znanego jako CA4), w oparciu o łączność, anatomię komórkową i właściwości genetyczne1. Struktura ta jest utrzymywana wzdłuż grzbietowo-brzusznego zasięgu hipokampa, aczkolwiek z dużymi różnicami we właściwościach synaptycznych2,3,4, anatomy5, genetic diversity6,7,8, oraz funkcja behawioralna9,10. Spośród regionów CA subpole CA1 składa się głównie z glutaminergicznego CA1 pyramidal cells (CA1 PCs), dla których zdefiniowano 3 podtypy11, oraz interneuronów hamujących, które stanowią ~10% neuronów, ale są bardzo zróżnicowane z ponad 30 zdefiniowanymi podtypami12,13,14. Oprócz różnic specyficznych dla regionu, wykazano, że normalne starzenie się ma dramatyczny wpływ na przekaźnictwo synaptyczne15,16,17, anatomy18 i profil genetyczny19. Obecnym złotym standardem do oceny zawiłości właściwości komórkowych i synaptycznych w kontrolowany sposób jest wykorzystanie zapisów z całych komórek z ostrych wycinków mózgu20.

Zrozumienie funkcji hipokampa opiera się głównie na manipulacji grzbietowej, ze względu na łatwość, z jaką jest ona dostępna chirurgicznie lub anatomicznie w celu wykonywania zadań behawioralnych, implantacji elektrod lub okien obrazowania, lub ekspresji plazmidu wirusowego. W wielu badaniach dodatkowo procedury te są wykonywane na późno młodocianych lub dorosłych gryzoniach, aby zapobiec zmienności struktury mózgu podczas rozwoju. Mimo to wiele podejść do badania elektrofizjologii komórkowej i subkomórkowej jest przeprowadzanych u wczesnych i średnich młodych gryzoni, głównie z brzuszno-środkowej części hipokampa w jego płaszczyźnie poprzecznej21,22,23,24,25. Tam, gdzie oceniono cały zasięg grzbietowo-brzuszny, stosuje się rozdrabniacz tkanek do utrzymania rozciągłości poprzecznej4,26, lub eksperyment przeprowadzono na młodych szczurach27 lub myszach28. Ponadto wiadomo, że chłodzenie tkanki przed sekcją mózgu zachowuje strukturę hipokampa u szczurów29 i neuronów kory nowej u myszy30,31. Niemniej jednak istnieje niedostatek szczegółów dotyczących produkcji wycinków mózgu z grzbietowej osi poprzecznej hipokampa, generowanych przez zmodyfikowane wycinki koronalne u dojrzałych szczurów.

Ten protokół opisuje podejście, dzięki któremu można uzyskać nagrania z całych komórek z pojedynczych lub par neuronów w zmodyfikowanych wycinkach koronalnych grzbietowego hipokampa od starszych szczurów, a następnie identyfikację morfologiczną post hoc. Zdrowe wycinki mózgu uzyskuje się po przezsercowej perfuzji schłodzonego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), co ułatwia pomiar właściwości elektrofizjologicznych z CA1 PC i lokalnych interneuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta zostały wygenerowane i utrzymywane zgodnie z wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i Instytucji (HO# P135148E). Wszystkie szczury utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i zapewniono im ad libitum dostęp do pożywienia i wody.

1. Perfuzja przezsercowa schłodzonego ACSF

  1. Przed wszystkimi eksperymentami umieścić ~ 200 ml sacharozy-ACSF (Tabela 1) w zamrażarce w temperaturze -20 °C (do półzamrożenia, do krojenia) i dalsze ~ 100-200 ml przefiltrowanej sacharozy-ACSF na lodzie (do perfuzji), bulgocząc karbogenem (95% O2/5% CO2).
  2. Zbierz dorosłego szczura z jego domowej klatki i umieść go na ~ 30 minut w klatce w pomieszczeniu zabiegowym, aby przyzwyczaić się do poziomu hałasu i światła.
  3. Przygotuj narzędzia do preparacji (Rysunek 1A), obszar perfuzji i środek znieczulający do wstrzykiwań (ok. 1 ml 200 mg/ml pentobarbitalu sodu dla końcowego stężenia 100 mg / kg).
  4. Przygotuj odpowiednią komorę anestezjologiczną, umieszczając w niej mały wacik z bibuły lub waty. Wprowadzić 1-2 ml lotnego środka znieczulającego izofluranem do materiału chłonnego w komorze.
  5. Umieść szczura w komorze anestezjologicznej w celu uspokojenia. Monitoruj oddech, aż częstość oddechów spadnie do ~1 płytkiego oddechu na sekundę.
  6. W tym momencie zacznij bulgotać półmrożoną sacharozę-ACSF z karbogenem na lodzie do użycia podczas krojenia.
  7. Zważ szczura i zanotuj jego wagę.
  8. Znieczulij szczura terminalnie, wstrzykując przygotowany pentobarbital sodu do jamy dootrzewnowej. Dawka pentobarbitalu sodu powinna wynosić 100 mg/kg, liczona na podstawie wcześniej przyjmowanej masy ciała i stężenia zapasowego leku. Umieść szczura w komorze przetrzymywania i odczekaj 0,5-5 minut na rozpoczęcie znieczulenia końcowego.
  9. Potwierdź ustanie odruchów: przetestuj zarówno mruganie rogówką (dotknij źrenicy), jak i odruchy szczypania tylnej łapy (podnieś nogę i uszczypnij tylną łapę) za pomocą sondy (tj. zaokrąglonych kleszczy). Gdy odruchy ustaną odruchy, przypnij szczura do styropianowej lub korkowej deski chirurgicznej za pomocą igieł podskórnych.
  10. Otwórz klatkę piersiową i umieść kaniulę u podstawy lewej komory serca. Nakłuć prawy przedsionek i natychmiast rozpocząć perfuzję lodowato (0-1 °C) sacharozy-ACSF (za pomocą pompy perystaltycznej o sile 50 ml/minutę).
  11. Po pełnej wymianie płynów i schłodzeniu ciała (<5 minuty) należy usunąć kaniulę i szpilki, a następnie odciąć głowę za pomocą gilotyny.
  12. Ostrożnie i szybko usuń czaszkę za pomocą nożyczek do kości i narzędzi do kości Rongeur (Rysunek 1A,1B).
    1. Zacznij od wykonania 2x obustronnych cięć przez otwór wielki za pomocą nożyczek do kości i usuń czaszkę do szwu lambda za pomocą Rongeurs. Ostrożnie przeciąć wzdłuż szwu linii środkowej nożyczkami do kości tuż za oczami.
    2. Wykonaj 2x obustronne nacięcia przez czaszkę, prostopadle do linii środkowej. Za pomocą Rongeurs otwórz czaszkę wzdłuż linii środkowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby usunąć pia mater za pomocą cienkich nożyczek lub haczykowatej igły.
  13. Wyciągnij mózg z czaszki za pomocą szpatułki, przecinając nerwy czaszkowe i wzrokowe za pomocą ucisku z boku na bok. Umieść mózg w karbogenowanym, częściowo zamrożonym (0-1 °C) sacharozo-ACSF na 1-2 minuty przed krojeniem.

2. Przygotowanie wycinków mózgu z grzbietowego hipokampa

  1. Wyjąć perfundowany mózg z częściowo zamrożonej (0–1 °C) sacharozy-ACSF i umieścić na szklanej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną. Umieść mózg na jego brzusznej powierzchni.
  2. Za pomocą skalpela (ostrze nr 22) usuń tylną część mózgu pod kątem ~10° od pionu, aby stworzyć płaską powierzchnię do przyklejenia mózgu do sceny (Rysunek 1C).
  3. Nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na etap wibratomu. Rozprowadź klej, aby utworzyć cienką warstwę o około 50% większą niż pole przekroju poprzecznego powierzchni cięcia mózgu.
  4. Wyjmij mózg ze szklanego naczynia na szpatułkę, przeciętą stroną do dołu, używając pędzla do prowadzenia tkanki. Osusz mózg kawałkiem tkanki, aby usunąć nadmiar ACSF i wsuń mózg, odciętą powierzchnią w dół, na środek kleju. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 1-2 ml lodowatej sacharozy-ACSF na mózg, aby usunąć klej z bloku mózgowego.
  5. Umieść mózg w komorze krojenia i zalej półmrożoną sacharozą ACSF. Użyj łyżki lub szpatułki, aby utrzymać nadmiar lodu z dala od bloku mózgu, a następnie karbogeniczne (Rysunek 1D).
  6. Przesuń ostrze wibratomu na miejsce: ~1 mm od grzbietowej powierzchni mózgu i pionowo ~1 mm do przodu do bregmy. Upewnij się, że ostrze jest całkowicie zanurzone i usuń bąbelki za pomocą pędzla.
  7. Zacznij kroić mózg. Aby przyciąć do grzbietowego hipokampa, użyj prędkości 0,1-0,2 mm/s, z poziomym ruchem ostrza 1-1,5 mm i odwrotną częstotliwością oscylacji ~90 Hz. Podczas krojenia grzbietowego hipokampa zmniejsz prędkość do 0,05-0,1 mm/s.
  8. Zbierz plasterki grzbietowego hipokampa (nominalnie 3-4 pełne plasterki lub 6-8 półsekcji) na mózg. Jeśli wymagane są podłużne plastry hipokampa brzuszno-przyśrodkowego, kontynuuj krojenie. Po przecięciu hipokampa grzbietowego nie ma potrzeby wycinania dodatkowej tkanki poza mniej więcej pozycję 3. komory. Zatrzymaj wibratom, oddziel plasterek wygiętą igłą podskórną i zbierz w podstawie komory krojenia.
    UWAGA: Plastry mogą mieć grubość 250-500 μm, w zależności od wymagań eksperymentalnych. W przypadku nagrań z grzbietowego hipokampa zwykle używa się plastrów o grubości 400 μm, aby zachować jak najwięcej sieci lokalnej, jednocześnie umożliwiając odpowiednie warunki mikroskopowe.
  9. Przytnij plasterki, aby zawierały tylko hipokamp i leżącą nad nim korę pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść plastry do wstępnie ogrzanej komory o temperaturze 35 °C przednią powierzchnią skierowaną do góry.
  10. Określ komorę magazynową na podstawie eksperymentu, który ma zostać przeprowadzony. Aby uzyskać wysokiej jakości nagrania z całych komórek patch-clamp lub zewnątrzkomórkowych nagrań pola blisko powierzchni warstwy w zanurzonych komorach nagrywających, należy przechowywać w zanurzonych komorach. Alternatywnie, przechowywać w komorze interfejsu ciecz/gaz w celu rejestracji aktywności sieci oscylacyjnej lub nagrań pola zewnątrzkomórkowego interfejsu.
  11. W przypadku przechowywania w zanurzeniu plastry powinny odtworzyć się w temperaturze 35 °C przez 30 minut od momentu wprowadzenia ostatniej kromki do komory przechowywania. Pozwala to na reaktywację procesów metabolicznych i ponowne uszczelnienie ciętych neurytów. Po 30 minutach przenieś komorę do przechowywania do temperatury pokojowej.

3. Rejestrowanie grzbietowych neuronów hipokampa

  1. Wytwarzanie pipet rejestrujących z plastrem ze szkła kapilarnego. W protokole tym wykorzystuje się szkło borokrzemianowe o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i średnicy wewnętrznej 0,86 mm z żarnikiem, co daje rezystancję końcówki 3-5 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym (tabela 1). Roztwory wewnątrzkomórkowe należy przechowywać schłodzone na lodzie, aby zapobiec degradacji składników energetycznych i przefiltrowane przed użyciem (filtr strzykawkowy, wielkość porów: 0,2 μm).
  2. Karbogenian zapisujący ACSF i wstępnie podgrzany w łaźni wodnej (35-40 ºC). Dostarczyć karbonogenowany i wstępnie ogrzany ACSF do komory rejestracyjnej za pomocą rurki perfuzyjnej wspomaganej pompą perystaltyczną. Rozpocznij perfuzję na kilka minut przed przeniesieniem plastra do komory.
  3. Zatrzymaj perfuzję i przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej z przednią powierzchnią skierowaną do góry. Przytrzymaj plasterek na miejscu za pomocą platynowego pierścienia z pojedynczymi włóknami jedwabiu przymocowanymi, tworząc kształt "harfy". Ułóż warstwy w taki sposób, aby warstwa piramidalna CA1 przebiegała prostopadle do osi pierwszej pipety rejestrującej.
  4. Wznowić przepływ karbogenicznego i wstępnie ogrzanego (35-40 ºC) ACSF rejestrującego (Tabela 1) z optymalną szybkością 6-8 ml∙min-1,
    UWAGA: Wysokie natężenia przepływu (6-8 mL∙min-1) są optymalne do utrzymania aktywności sieci w slices32. Niższe prędkości przepływu (tj. 2-3 ml∙min-1) mogą być stosowane w celu utrzymania stabilności warstwy w eksperymentach obrazowych lub tam, gdzie nie jest wymagana biologicznie istotna aktywność sieci.
  5. Oceń jakość wycinka za pomocą optyki kontrastu wnioskowania różnicowego w podczerwieni (IR-DIC) z 40-krotnym powiększeniem obiektywu (wizualizowanym za pomocą kamery CCD). Załóżmy dobrą jakość plasterka, jeśli duża liczba jajowatych, umiarkowanie kontrastowych CA1 PC można zobaczyć w str. pyramidale na głębokości 20-30 μm poniżej gładkiej i lekko wgłębionej powierzchni (Rysunek 2A). Plastry niskiej jakości zawierają dużą liczbę silnie skontrastowanych, skurczonych lub spuchniętych komórek, z nierówną powierzchnią plasterka.
  6. Pipety z plastrami należy napełnić roztworem wewnątrzkomórkowym (np. na podstawie wewnątrzkomórkowego [Cl-] 24 mM), aby umożliwić porównanie z innymi opublikowanymi danymi.
  7. Wykonaj nagrania z użyciem zacisku krosowego całej komórki, jak opisano wcześniej22. Wyklucz ogniwa z analizy, jeśli potencjał błonowy (VM) przy przebiciu jest bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV, rezystancja szeregowa wynosi >30 MΩ; lub rezystancja szeregowa zmienia się o >20% w trakcie nagrywania. W tych warunkach nagrywania rezystancja szeregowa mieści się zwykle w zakresie 8 – 25 MΩ i jest stabilna przez maksymalnie 1 godzinę.
  8. Aby zbadać wewnętrzną pobudliwość CA1 z grzbietowego hipokampa, przetestuj wewnętrzne właściwości fizjologiczne za pomocą zapisów całych komórek za pomocą następujących protokołów w konfiguracji prądowo-cęgowej:
    1. Z spoczynkowego potencjału błony bez przyłożonego prądu polaryzacji zastosuj małe (-10 pA, 500 ms) kroki prądowe powtórzone 30 razy.
    2. Od -70 mV z zastosowanym prądem polaryzacyjnym, zastosuj hiper do depolaryzujących kroków prądu o czasie trwania 500 ms (-100 do +400 pA, co 25 pA) z 3 powtórzeniami rodziny ścieżek.
    3. Zastosuj falę sinusoidalną o amplitudzie międzyszczytowej 100 pA ze zmienną częstotliwością od 0,1 do 20 Hz. Powtórz 3 razy.
    4. Zastosuj bodźce 5x 2 nA, 2 ms, aby wysterować potencjały czynnościowe przy 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 przemiatania na częstotliwość.
    5. Z cęgów napięciowych -70 mV zastosuj 5 minut spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) do nagrywania.
  9. Aby ponownie uszczelnić komórki do analizy histologicznej po pomyślnym zarejestrowaniu, należy wytworzyć plastry na zewnątrz, powoli cofając pipetę z plastrem. W przypadku zaobserwowania wzrostu rezystancji szeregowej z poziomów doświadczalnych do >1 GΩ mierzonej impulsem testowym -5 mV, należy zwiększyć potencjał utrzymywania do -40 mV i całkowicie wycofać pipetę.
  10. Wykonać dodatkowe nagrania w tym samym wycinku, aby spełnić wymaganą moc statystyczną projektu eksperymentalnego.
  11. Usunąć wycinki mózgu zawierające nagrane neurony z komory zapisu, umieścić na płytce 24-dołkowej, zastąpić ACSF 4% paraformaldehydem (w 0,1 M buforze fosforanowym) i pozostawić na noc.
  12. Następnego dnia zastąpić PFA 0,1 M buforem fosforanowym i przechowywać do czasu obróbki histologicznej. Wizualizuj komórki za pomocą streptawidyny sprzężonej z fluorescencją zgodnie z wcześniejszym opisem22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół umożliwia przygotowanie żywotnych skrawków z bieguna przegrodowego grzbietowego hipokampa u dorosłych szczurów. Kluczowym elementem tego protokołu jest perfuzja schłodzonym roztworem sacharozy-ACSF przed przygotowaniem skrawka, co skutkuje obecnością zdrowych PC CA1 w pobliżu powierzchni skrawka. Jakość otrzymanego skrawka ocenia się wizualnie za pomocą optyki IR-DIC; zdrowe komórki, rozpoznawane po dużych, owalnych ciałach komórkowych, znajdują się w całej rozciągłości stratum pyramidale

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół mający na celu wytworzenie wysokiej jakości wycinków mózgu z grzbietowego zasięgu CA1 hipokampa, co pozwala na zapisy z wielu żywotnych neuronów w tym regionie. Podejście kombinatoryczne polegające na rejestrowaniu całej komórki z wycinków w pobliżu korony, a następnie wizualizacji neuronów ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia żywotności i tożsamości komórki.

Ten protokół niezawodnie wytwarza opłacalne plasterki z 2 głównych powodów. Po pierwsze, modyfikacja k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor oświadcza, że nie mają one konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autor pragnie podziękować Prof. Davidowi JA Wyllie, dr Emmie Perkins, Laurze Simoes de Oliveira i Prof. Peterowi C. Kindowi za pomocne komentarze na temat optymalizacji manuskryptu i protokołu, a także The Simons Initiative for the Developing Brain za pokrycie kosztów publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie do akwizycjiUrządzenia molekularnepClamp 10
Dorosłe szczuryRóżnenie dotyczyDowolna odmiana dorosłego szczura (60 dni i starszego)
WzmacniaczUrządzenia molekularneAxopatch 700B
Oprogramowanie analityczneFreewareStimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
Nożyczki do kościFST16152-12Styl Littauer
Szkło kapilarneHarvard Apparatus30-0060Pipety ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 0,86 mm.
CarbogenBOCVarious95% O2/5% CO2
CCDkamera ScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
Chemikalia/OdczynnikiSigmaAldrich RóżneWszystkie odczynniki laboratoryjne zakupione w Sigma Aldrich.
Cyjanoakrylan (tj. RS Pro 3)RS Components918-6872Unikaj preparatów cyjanoakrylowych na bazie żelu
DigitizerUrządzenia molekularneDigidata 1550B
Szpilki / igły do preparacjiRóżneRóżneZastosowanie Igły o rozmiarze 16 (powyżej)
System elektrofizjologicznyScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Nożyczki do cienkiej tęczówkiFST14568-12Z końcówkami z węglika wolframu
Szklana szalka PetriegoFisher Scientific12911408
Igły podskórneBD HealthcareRóżne16, 18 i 22 gauge
Izofluoran 100% W/W (i.IsoFlo)Zoetis50019100
Nożyczki typu MayoFST14110-17
końcówki MikromanipulatoryScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
PędzelSklep artystycznyn/aPędzel z cienkim włosiem, zakupiony w lokalnym sklepie plastycznym.
Pipeta PasteuraFisher Scientific11546963Szklana pipeta Pasteura, ale przycięta tak, aby koniec służył do przenoszenia pipety.
Pompa perystaltycznaWatson Marlow12466260Jednokanałowa pompa perystaltyczna
Ściągacz do pipetSutter InstrumentsP-97Inne modele i metody produkcji pipet sprawdziłyby się równie dobrze.
Plastikowe strzykawki (1, 2, 5 ml)BD HealthcareRóżne
narzędzia do kości RongeurFST16021-14
Komora do przechowywania plastrówDomowa
waga Slice / harfaAparat HarvardSHD-22L/15Alternatywy byłyby odpowiednie.
Pentobarbital sodu (tj. Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 mg/mL; odpowiednie byłyby inne preparaty pentobarbitalu
SzpatułkaBochem3213Dostępne w Fisher Scientific
Filtry strzykawkoweFisher Scientific10482012Corning, 0,22 i mikro; m średnicy porów.
VibtratomeLeica1491200S001model VT1200S z
kąpielą wodnąFisher Scientific151670155 Litrowa kąpiel wodna, na przykład: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro
marki Vibrocheck

Bibliografia

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  3. Babiec, W. E., Jami, S. A., Guglietta, R., Chen, P. B., O'Dell, T. J. Differential regulation of NMDA receptor-mediated transmission by SK channels underlies dorsal-ventral differences in dynamics of schaffer collateral synaptic function. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1950-1964 (2017).
  4. Papatheodoropoulos, C. Striking differences in synaptic facilitation along the dorsoventral axis of the hippocampus. Neuroscience. 301, 454-470 (2015).
  5. O'Reilly, K. C., et al. Identification of dorsal-ventral hippocampal differentiation in neonatal rats. Brain Structure and Function. 220 (5), 2873-2893 (2015).
  6. Cembrowski, M. S., et al. Spatial gene-expression gradients underlie prominent heterogeneity of CA1 pyramidal neurons. Neuron. 89 (2), 351-368 (2016).
  7. Cembrowski, M. S., Wang, L., Sugino, K., Shields, B. C., Spruston, N. Hipposeq: a comprehensive RNA-seq database of gene expression in hippocampal principal neurons. elife. 5, 14997(2016).
  8. Leonardo, E., Richardson-Jones, J., Sibille, E., Kottman, A., Hen, R. Molecular heterogeneity along the dorsal–ventral axis of the murine hippocampal CA1 field: a microarray analysis of gene expression. Neuroscience. 137 (1), 177-186 (2006).
  9. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 77 (5), 955-968 (2013).
  10. Kjelstrup, K. B., et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science. 321 (5885), 140-143 (2008).
  11. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  12. Booker, S. A., Vida, I. Morphological diversity and connectivity of hippocampal interneurons. Cell and Tissue Research. 373 (3), 619-641 (2018).
  13. Freund, T. F., Buzsaki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347(1996).
  14. Pelkey, K. A., et al. Hippocampal GABAergic inhibitory interneurons. Physiological Reviews. 97 (4), 1619(2017).
  15. Barnes, C. A., Rao, G., Foster, T. C., McNaughton, B. L. Region-specific age effects on AMPA sensitivity: Electrophysiological evidence for loss of synaptic contacts in hippocampal field CA1. Hippocampus. 2 (4), 457-468 (1992).
  16. Potier, B., Jouvenceau, A., Epelbaum, J., Dutar, P. Age-related alterations of GABAergic input to CA1 pyramidal neurons and its control by nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampus. Neuroscience. 142 (1), 187-201 (2006).
  17. Ekonomou, A., Pagonopoulou, O., Angelatou, F. Age-dependent changes in adenosine A1 receptor and uptake site binding in the mouse brain: An autoradiographic study. Journal of Neuroscience Research. 60 (2), 257-265 (2000).
  18. Pyapali, G. K., Turner, D. A. Increased dendritic extent in hippocampal CA1 neurons from aged F344 rats. Neurobiology of Aging. 17 (4), 601-611 (1996).
  19. Blalock, E. M., et al. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3807-3819 (2003).
  20. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  21. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075(2006).
  22. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically-and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  23. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflügers Archive. 443 (3), 491-501 (2002).
  24. Aitken, P., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  25. Siwani, S., et al. OLMα2 cells bidirectionally modulate learning. Neuron. 99 (2), 404-412 (2018).
  26. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The rat hippocampal slice preparation as an in vitro model of ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  27. Dougherty, K. A. Differential developmental refinement of the intrinsic electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons from the rat dorsal and ventral hippocampus. Hippocampus. 30 (3), 233-249 (2020).
  28. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Reports. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  29. Newman, G. C., Qi, H., Hospod, F. E., Grundmann, K. Preservation of hippocampal brain slices with in vivo or in vitro hypothermia. Brain Research. 575 (1), 159-163 (1992).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Springer. 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  33. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  34. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. (10), Cold Spring Harbor Protocols. 4848(2007).
  35. Gee, C. E., Ohmert, I., Wiegert, J. S., Oertner, T. G. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), (2017).
  36. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  37. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-Clamp Analysis. , Springer. 135-193 (2002).
  38. Dougherty, K. A., et al. Differential expression of HCN subunits alters voltage-dependent gating of h-channels in CA1 pyramidal neurons from dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1940-1953 (2013).
  39. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 48(2013).
  40. Booker, S. A., et al. Presynaptic GABAB receptors functionally uncouple somatostatin interneurons from the active hippocampal network. Elife. 9, 51156(2020).
  41. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  42. Ordemann, G. J., Apgar, C. J., Brager, D. H. D-type potassium channels normalize action potential firing between dorsal and ventral CA1 neurons of the mouse hippocampus. Journal of Neurophysiology. 121 (3), 983-995 (2019).
  43. Arnold, E. C., McMurray, C., Gray, R., Johnston, D. Epilepsy-induced reduction in HCN channel expression contributes to an increased excitability in dorsal, but not ventral, hippocampal CA1 neurons. eNeuro. 6 (2), (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pole CA1 hipokampagrzbietowy hipokamppatch-clamp całej komórkiperfuzja transkardialnamodyfikowane skrawki koronalneelektrofizjologia gryzoniprzygotowanie skrawkówelektrofizjologia komórkowaprzygotowanie skrawków mózgu

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.