Przygotowanie ostrych wycinków mózgu z grzbietowego bieguna hipokampa od dorosłych gryzoni

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opisanie metody wytwarzania wycinków grzbietowego hipokampa do badania elektrofizjologicznego. Procedura ta wykorzystuje perfuzję schłodzonym ACSF przed przygotowaniem plastra z kątem krojenia zbliżonym do korony, co pozwala na zachowanie zdrowych głównych neuronów.

Streszczenie

Zapisy całokomórkowych krostek z ostrych wycinków mózgu gryzoni są podstawą nowoczesnych badań neurofizjologicznych, umożliwiając precyzyjny pomiar właściwości komórkowych i synaptycznych. Niemniej jednak istnieje coraz większa potrzeba wykonywania analiz skorelowanych między różnymi trybami eksperymentalnymi oprócz elektrofizjologii warstwowej, na przykład: immunohistochemii, biologii molekularnej, obrazowania in vivo lub zapisu elektrofizjologicznego; aby odpowiedzieć na coraz bardziej złożone pytania dotyczące funkcjonowania mózgu. Jednak wyciągnięcie znaczących wniosków z tych różnych podejść eksperymentalnych nie jest proste, ponieważ nawet w stosunkowo dobrze opisanych strukturach mózgu istnieje wysoki stopień subregionalnej zmienności funkcji komórkowych. Nigdzie nie jest to lepiej zilustrowane niż w CA1 hipokampa, który ma dobrze zdefiniowane właściwości grzbietowo-brzuszne, oparte na właściwościach komórkowych i molekularnych. Niemniej jednak wiele opublikowanych badań analizuje wzorce ekspresji białek lub behawioralnie skorelowaną aktywność in vivo w grzbietowym zasięgu hipokampa; i wyjaśnić wyniki mechanicznie za pomocą elektrofizjologii komórkowej z obszaru brzuszno-przyśrodkowego. Jest to dodatkowo zagmatwane przez fakt, że wiele eksperymentów elektrofizjologicznych z ostrymi plastrami przeprowadza się u młodych zwierząt, podczas gdy inne tryby doświadczalne są przeprowadzane u bardziej dojrzałych zwierząt. Aby rozwiązać te problemy, metoda ta obejmuje perfuzję przezsercową dojrzałych (>60-dniowych gryzoni) sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, a następnie przygotowanie zmodyfikowanych wycinków koronalnych, w tym bieguna przegrody grzbietowego hipokampa, w celu zarejestrowania z komórek piramidowych CA1. Proces ten prowadzi do wytworzenia zdrowych, ostrych wycinków grzbietowego hipokampa, co pozwala na badanie elektrofizjologiczne komórkowe oparte na warstwach w połączeniu z innymi pomiarami.

Wprowadzenie

Hipokamp jest prawdopodobnie najlepiej zbadaną strukturą w mózgu ssaków, ze względu na jej stosunkowo duży rozmiar i wyraźną strukturę laminarną. Hipokamp jest zaangażowany w wiele procesów behawioralnych: nawigację przestrzenną, pamięć kontekstową i tworzenie epizodów. Wynika to częściowo ze względnej łatwości dostępu do grzbietowych części hipokampa u gryzoni do analizy in vivo. Rzeczywiście, główne ogniwa wyjściowe znajdują się zwykle mniej niż 2 mm od powierzchni pial.

U gryzoni hipokamp jest stosunkowo dużą strukturą, utworzoną z wgłębienia kresomózgowia rozciągającego się od przegrody grzbietowej do brzusznej kory nowej. Skła....

Protokół

Wszystkie zwierzęta zostały wygenerowane i utrzymywane zgodnie z wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i Instytucji (HO# P135148E). Wszystkie szczury utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i zapewniono im ad libitum dostęp do pożywienia i wody.

1. Perfuzja przezsercowa schłodzonego ACSF

1. Przed wszystkimi eksperymentami umieścić ~ 200 ml sacharozy-ACSF (Tabela 1) w zamrażarce w temperaturze -20 °C (do półzamrożenia, do krojenia) i dalsze ~ 100-200 ml przefiltrowanej sacharozy-ACSF na lodzie (do perfuzji), bulgocząc karbogenem (95% O₂/5% CO₂).
2. Zbierz dorosłeg....

Wyniki

Opisany powyżej protokół umożliwia przygotowanie żywotnych skrawków z bieguna przegrodowego grzbietowego hipokampa u dorosłych szczurów. Kluczowym elementem tego protokołu jest perfuzja schłodzonym roztworem sacharozy-ACSF przed przygotowaniem skrawka, co skutkuje obecnością zdrowych PC CA1 w pobliżu powierzchni skrawka. Jakość otrzymanego skrawka ocenia się wizualnie za pomocą optyki IR-DIC; zdrowe komórki, rozpoznawane po dużych, owalnych ciałach komórkowych, znajdują się w całej rozciągłości stratum pyramidale

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół mający na celu wytworzenie wysokiej jakości wycinków mózgu z grzbietowego zasięgu CA1 hipokampa, co pozwala na zapisy z wielu żywotnych neuronów w tym regionie. Podejście kombinatoryczne polegające na rejestrowaniu całej komórki z wycinków w pobliżu korony, a następnie wizualizacji neuronów ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia żywotności i tożsamości komórki.

Ten protokół niezawodnie wytwarza opłacalne plasterki z 2 głównych powodów. Po pierwsze, modyfikacja k.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie do akwizycji	Urządzenia molekularne	pClamp 10
Dorosłe szczury	Różne	nie dotyczy	Dowolna odmiana dorosłego szczura (60 dni i starszego)
Wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Axopatch 700B
Oprogramowanie analityczne	Freeware	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
Nożyczki do kości	FST	16152-12	Styl Littauer
Szkło kapilarne	Harvard Apparatus	30-0060	Pipety ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 0,86 mm.
Carbogen	BOC	Various	95% O2/5% CO2
CCD	kamera Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
Chemikalia/Odczynniki	Sigma	Aldrich Różne	Wszystkie odczynniki laboratoryjne zakupione w Sigma Aldrich.
Cyjanoakrylan (tj. RS Pro 3)	RS Components	918-6872	Unikaj preparatów cyjanoakrylowych na bazie żelu
Digitizer	Urządzenia molekularne	Digidata 1550B
Szpilki / igły do preparacji	Różne	Różne	Zastosowanie Igły o rozmiarze 16 (powyżej)
System elektrofizjologiczny	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Nożyczki do cienkiej tęczówki	FST	14568-12	Z końcówkami z węglika wolframu
Szklana szalka Petriego	Fisher Scientific	12911408
Igły podskórne	BD Healthcare	Różne	16, 18 i 22 gauge
Izofluoran 100% W/W (i.IsoFlo)	Zoetis	50019100
Nożyczki typu Mayo	FST	14110-17
końcówki Mikromanipulatory	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Pędzel	Sklep artystyczny	n/a	Pędzel z cienkim włosiem, zakupiony w lokalnym sklepie plastycznym.
Pipeta Pasteura	Fisher Scientific	11546963	Szklana pipeta Pasteura, ale przycięta tak, aby koniec służył do przenoszenia pipety.
Pompa perystaltyczna	Watson Marlow	12466260	Jednokanałowa pompa perystaltyczna
Ściągacz do pipet	Sutter Instruments	P-97	Inne modele i metody produkcji pipet sprawdziłyby się równie dobrze.
Plastikowe strzykawki (1, 2, 5 ml)	BD Healthcare	Różne
narzędzia do kości Rongeur	FST	16021-14
Komora do przechowywania plastrów	Domowa
waga Slice / harfa	Aparat Harvard	SHD-22L/15	Alternatywy byłyby odpowiednie.
Pentobarbital sodu (tj. Pentoject)	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL; odpowiednie byłyby inne preparaty pentobarbitalu
Szpatułka	Bochem	3213	Dostępne w Fisher Scientific
Filtry strzykawkowe	Fisher Scientific	10482012	Corning, 0,22 i mikro; m średnicy porów.
Vibtratome	Leica	1491200S001	model VT1200S z
kąpielą wodną	Fisher Scientific	15167015	5 Litrowa kąpiel wodna, na przykład: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro

marki Vibrocheck