Artykuł metodologiczny

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

DOI:

10.3791/61707

⸱

4 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histony należą do rodziny wysoce konserwatywnych białek u eukariontów. Pakują DNA do nukleosomów jako jednostki funkcjonalne chromatyny. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) histonów, które są bardzo dynamiczne i mogą być dodawane lub usuwane przez enzymy, odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. U roślin czynniki epigenetyczne, w tym histony PTM, są związane z ich reakcjami adaptacyjnymi na środowisko. Zrozumienie molekularnych mechanizmów kontroli epigenetycznej może przynieść bezprecedensowe możliwości dla innowacyjnych rozwiązań bioinżynieryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji jąder i oczyszczania histonów z tkanki liści sorgo. Wyekstrahowane histony można analizować w ich nienaruszonych formach za pomocą spektrometrii mas odgórnie (MS) w połączeniu z chromatografią cieczową (LC) w trybie online z odwróconymi fazami (RP). Kombinacje i stechiometria wielu PTM na tej samej proteoformie histonowej mogą być łatwo zidentyfikowane. Ponadto, obcinanie ogona histonowego można wykryć za pomocą przepływu pracy LC-MS od góry do dołu, uzyskując w ten sposób globalny profil PTM histonów rdzenia (H4, H2A, H2B, H3). Zastosowaliśmy ten protokół wcześniej do profilowania histonów PTM z tkanki liści sorgo pobranej z zakrojonego na szeroką skalę badania terenowego, mającego na celu identyfikację epigenetycznych markerów odporności na suszę. Protokół może potencjalnie zostać zaadaptowany i zoptymalizowany pod kątem sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) lub do badania histonów PTM w podobnych roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekuje się, że rosnąca dotkliwość i częstotliwość suszy wpłynie na produktywność upraw zbóż1,2. Sorgo to roślina zbożowa i energetyczna, znana ze swojej wyjątkowej odporności na warunki ograniczające ilość wody3,4. Staramy się uzyskać mechanistyczne zrozumienie wzajemnych zależności między stresem związanym z suszą, rozwojem roślin i epigenetyką roślin sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench]. Nasze poprzednie prace wykazały silne powiązania między mikrobiomem roślin i ryzosfery w aklimatyzacji i reakcjach na suszę na poziomie molekularnym5,6,7. Badania te utorują drogę do wykorzystania inżynierii epigenetycznej w adaptacji upraw do przyszłych scenariuszy klimatycznych. W ramach wysiłków na rzecz zrozumienia epigenetyki zamierzamy zbadać markery białkowe, które wpływają na ekspresję genów w organizmie rośliny.

Histony należą do wysoce konserwatywnej rodziny białek u eukariontów, które pakują DNA do nukleosomów jako podstawowe jednostki chromatyny. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) histonów są regulowane dynamicznie w celu kontrolowania struktury chromatyny i wpływania na ekspresję genów. Podobnie jak inne czynniki epigenetyczne, w tym metylacja DNA, histony PTM odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych8,9. Testy oparte na przeciwciałach, takie jak western blot, są szeroko stosowane do identyfikacji i ilościowego określania histonów PTM. Ponadto interakcja histonów PTM i DNA może być skutecznie badana przez immunoprecypitację chromatyny – sekwencjonowanie (ChIP-seq)10. W ChIP-seq chromatyna ze specyficznym ukierunkowanym histonem PTM jest wzbogacona o przeciwciała przeciwko temu specyficznemu PTM. Następnie fragmenty DNA mogą zostać uwolnione ze wzbogaconej chromatyny i zsekwencjonowane. Ujawniane są regiony genów, które oddziałują z docelowym histonem PTM. Jednak wszystkie te eksperymenty w dużym stopniu opierają się na wysokiej jakości przeciwciałach. W przypadku niektórych wariantów/homologów histonów lub kombinacji PTM opracowanie silnych przeciwciał może być niezwykle trudne (szczególnie w przypadku wielu PTM). Ponadto przeciwciała można wytworzyć tylko wtedy, gdy znany jest docelowy histon PTM. 11 Dlatego konieczne są alternatywne metody nieukierunkowanego, globalnego profilowania histonów PTM.

Spektrometria mas (MS) jest komplementarną metodą charakteryzowania histonów PTM, w tym nieznanych PTM, dla których przeciwciała nie są dostępne11,12. Dobrze znany "oddolny" przepływ pracy w SM wykorzystuje proteazy do trawienia białek na małe peptydy przed separacją metodą chromatografii cieczowej (LC) i wykryciem SM. Ponieważ histony mają dużą liczbę reszt zasadowych (lizyny i argininy), trawienie trypsyny (proteazy specyficznej dla lizyny i argininy) w standardowym przepływie pracy od dołu do góry tnie białka na bardzo krótkie peptydy. Krótkie peptydy są technicznie trudne do analizy przez standardowy LC-MS i nie zachowują informacji o łączności i stechiometrii wielu PTM. Użycie innych enzymów lub znakowania chemicznego do blokowania lizyn generuje dłuższe peptydy, które są bardziej odpowiednie do charakterystyki histonów PTMs13,14.

Alternatywnie, etap trawienia można całkowicie pominąć. W tym podejściu "odgórnym" nienaruszone jony białkowe są wprowadzane do MS przez jonizację elektronrozpylania (ESI) po separacji LC online, dając jony nienaruszonych proteoform histonowych. Ponadto jony (tj. proteoformy) będące przedmiotem zainteresowania mogą być izolowane i fragmentowane w spektrometrze mas w celu uzyskania jonów sekwencji do identyfikacji i lokalizacji PTM. W związku z tym MS z góry na dół ma tę przewagę, że zachowuje informacje na poziomie proteoform i przechwytuje łączność wielu PTM i obcięć końcowych na tym samym proteoform15,16. Eksperymenty odgórne mogą również dostarczyć informacji ilościowych i zaoferować wgląd w biomarkery na nienaruszonym poziomie białka17. W tym miejscu opisujemy protokół ekstrakcji histonu z liścia sorgo i analizy nienaruszonych histonów za pomocą odgórnego LC-MS.

Przykładowe dane pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2 pochodzą z liści sorgo zebranych w 2 tygodniu po posadzeniu. Chociaż spodziewane są różnice w wydajności, protokół ten jest na ogół niezależny od określonych warunków próbki. Ten sam protokół został z powodzeniem zastosowany w przypadku tkanki liści rośliny sorgo pobranej z 2, 3, 5, 8, 9 i 10 tygodni po posadzeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału z liści sorgo

UWAGA: Rośliny sorgo były uprawiane w glebie na polu w Parlier, CA.

  1. Zbierz liście sorgo z roślin do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i natychmiast zamroź probówkę w ciekłym azocie. Tkankę liściową należy zebrać, odrywając trzeci i czwarty w pełni rozwinięty liść z glebogryzarki pierwotnej.
    UWAGA: Więcej szczegółów na temat stanu pola, wzrostu próbki i pobierania można znaleźć w opublikowanym raporcie18.
  2. Zmiel liście ciekłym azotem i natychmiast przenieś do probówki wirówkowej.
  3. Zmielony liść przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Weź około 4 g kriomielonego proszku z liści do analizy histonów w każdej próbce.

2. Przygotowanie i materiałów (3–4 h)

UWAGA: Roztwory podstawowe o wysokim stężeniu mogą być przygotowane z wyprzedzeniem i przechowywane do momentu użycia. Jednak wszystkie robocze muszą być świeże w dniu ekstrakcji (przez rozcieńczenie z wywaru i zmieszanie z inną zawartością) i muszą być umieszczone na lodzie podczas procesu. Całe doświadczenie należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C, chyba że zalecono inaczej.

  1. Przygotować 2,5 M sacharozy, rozpuszczając 42,8 g sacharozy (342,30 g/mol) w 15 ml sterylnej wody na płycie grzewczej w szklanym pojemniku, ciągle mieszając. Zwiększyć objętość do 50 ml po całkowitym rozpuszczeniu sacharozy. Przechowywać sacharozę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Przygotować 1 M Tris pH 8, rozpuszczając 1,576 g Tris HCl w 10 ml H2O w 15 ml probówce wirówkowej. Dostosuj pH za pomocą NaOH do 8 i sprawdź za pomocą papieru pH. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Przygotować 1 M ditiotreitol (DTT), ważąc 231 mg DTT (154,25 g/mol) i rozpuszczając go w 1,5 ml sterylnej wody. Naziemna dostawa prądu cyfrowego musi być świeża lub musi być wykonana z przechowywanych zamrożonych porcji.
  4. (Opcjonalnie) Przygotuj dodatkowe inhibitory, mieszając trzy różne sole. Przygotować 18,38 mg ortowanadatu sodu (183,91 g/mol) w 1 ml sterylnej wody, a następnie przygotować oddzielnie maślan sodu, dodając 11,008 mg maślanu sodu (110,09 g/mol) w 1 ml sterylnej wody. Przygotuj końcową sól, dodając 4,199 mg fluorku sodu (41,99 g/mol) do 1 ml wody. Zmieszać trzy roztwory soli w równej objętości jako roztwór podstawowy dla "dodatkowych inhibitorów" (33 mM każdej z trzech substancji chemicznych).
    UWAGA: Wanadan sodu polimeryzuje w stężeniach wyższych niż 0,1 mM w neutralnym pH. Zaleca się aktywację wanadanu sodu w celu jego depolimeryzacji w celu uzyskania maksymalnej skuteczności zgodnie z opublikowanymi protokołami19. Alternatywnie aktywowany wanadan sodu jest dostępny w handlu. W tym przypadku wanadan sodu nie został aktywowany celowo, więc skuteczność nie ulega zmniejszeniu. Aktywowany wanadan sodu nie został jeszcze przetestowany pod kątem tego protokołu.
  5. Przygotować 1 M MgCl2 rozpuszczając 0,952 g bezwodnego chlorku magnezu (95,2 g/mol) w 10 mlH2Ow probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Przechowywać 1 M MgCl2 w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  6. Przygotuj 10% (v/v) Triton X-100, mieszając 53,5 g Triton X-100 z 35 ml sterylnej wody, uzupełnij wodą do 50 ml i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 5% bufor guanidynowy o pH 7 (określany jako "bufor Gdn"), który będzie używany do kondycjonowania żywicy co najmniej przez noc – przygotować 0,1 M dwuzasadowego wodorofosforanu potasu (K2HPO4) przez zważenie 870 mg K2HPO4 i rozpuszczenie w 50 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Odważyć 0,7 g chlorowodorku guanidyny i rozpuścić w 0,1 M K2HPO4 do końcowej objętości 14 ml. Dostosuj pH do 7, sprawdzając za pomocą papieru pH.
  9. Namocz suchą żywicę słabej kationowymienności (WCX) w 5% buforze guanidyny o pH 7 przez noc. Usuń supernatant i ponownie napełnij świeżym buforem 5% Gdn i namocz go ponownie przez noc, aby żywica w pełni się zrównoważyła (do momentu, gdy supernatant będzie miał takie samo pH jak oryginalny bufor).
  10. Przed rozpoczęciem eksperymentu w następnej sekcji wymieszaj odczynniki, aby uzyskać bufor EB1, EB2A i EB2B w oparciu o tabelę 1. Dodaj wszystkie inhibitory i naziemną telewizję cyfrową na świeżo tuż przed użyciem.
powiedział: pkt. pkt. cyfrowa pkt. pkt. pkt. TGL TGL pkt. pkt. pkt. pkt.
OdczynnikiKoncentracja zapasówEB1EB2AEB2B (Biblioteka Przemysłowa)
Objętość (ml)Objętość (ml)Objętość (ml)
sacharoza2,5 mln4.4Wydanie orzeczenia 1,250,5
Tris HCl pH81 mln0,250,1250,05
Naziemna telewizja1 mln0,1250,06250,025
H2OGodzina 20,2259,68754,375
tabletka z inhibitorem proteazy (PI)0,5 tabletki0,5 tabletki0,5 tabletki
Dodatkowe inhibitory (opcjonalnie)33 mln0,250,1250,05
MgCl21 mln0,1250,05
Tryton X10010%Wydanie orzeczenia 1,25
Całkowita objętość25 ml12,5 ml5 ml

Tabela 1: Skład ekstrakcyjnych (EB).

  1. Sporządzić bufor do lizy jąder (NLB) w oparciu o tabelę 2. Przygotować NLB z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Dodaj świeże tabletki PI tuż przed użyciem w ilości 1x (0,5 tabletki na 5 ml). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z konkretnymi objętościami.
pkt.
Równoważenie obciążenia sieciowego (NLKoncentracja zapasówObjętość (ml)
Zawartość NaCl5 mln0,4
Tris HCl pH81 mln0,05
Tryton X10010%0,5
Edta0,5 mln0,2
H2ORejon 3,85
Tabletki PI0,5 tabletki
Dodatkowe inhibitory (opcjonalnie)33 mln0,05
Ogólna objętość5 ml

Tabela 2: Skład buforu do lizy jąder (NLB).

3. Procedura izolacji jąder

UWAGA: Zaleca się wykonanie kroków 3.1–3.3 pierwszego dnia (2–3 h), zapisanie jąder w buforze NLB w temperaturze -80 °C i wznowienie następnego dnia (lub później) w celu oczyszczenia białka (4 godziny). Etapy izolacji jąder w tym protokole zostały zaadaptowane z protokołu ChIP-seq sorgo stosowanego w Joint Genome Institute. Dodatkowe płukanie i separacja w gradiencie sacharozy mogą być wymagane w celu zapewnienia czystości jąder dla zastosowań sekwencyjnych ChIP.

  1. Filtracja zanieczyszczeń (~0,5 h)
    1. Zważyć zmielone liście w proszku ~ 4 g, upewniając się, że pozostaje zamrożony, umieszczając go na suchym lodzie lub ciekłym azocie, aż będzie gotowy do użycia.
    2. Dodać tabletki inhibitora proteazy do EB1 do końcowego stężenia 0,2x (0,5 tabletki na 25 ml na próbkę). Użyj miniaturowego plastikowego tłuczka lub końcówki do pipety, aby wstępnie zmiażdżyć tabletki w probówce do mikrowirówki przed dodaniem do, aby ułatwić rozpuszczenie tabletki w buforze. Aby zapobiec utracie materiału, dodaj tabletkę PI i poddaj sonicyzacji bufor w celu rozpuszczenia tabletki.
    3. Dodaj 20 ml EB1 do zamrożonego mielonego proszku liściastego, delikatnie zmieszaj i mieszaj, aż proszek zostanie całkowicie zawieszony. Mieszaj delikatnie przez ~10 min.
    4. Przefiltrować przez siatkę 100, przepłukując przefiltrowany materiał dwukrotnie za każdym razem 2 ml EB1.
      UWAGA: Zarówno filtrat, jak i przefiltrowane zanieczyszczenia powinny być zielone. W przypadku śledzenia za pomocą mikroskopu powinno być w tym momencie w stanie zobaczyć nienaruszone jądra i nienaruszone chloroplasty w filtracie. Większość dużych zanieczyszczeń powinna być nieobecna/zubożona. Wymieszaj barwniki, takie jak błękit metylenowy, z próbką. Jądra są łatwo widoczne jako ciemnoniebieskie/akwamarynowe kule o średnicy ~3–5 μm, gdy są wizualizowane za pomocą obiektywu 20x, 40x i/lub 100x. W stosunku do jąder chloroplasty mają podobną wielkość, ale zielonkawy kolor i często bardziej owalny kształt. Wakuole są również podobne do jąder pod względem wielkości i kształtu, ale nie będą łatwo wchłaniać barwnika błękitu metylenowego.
    5. Odwirować połączony filtrat o sile 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym w celu osadzenia resztek i dużych organelli subkomórkowych, w tym jąder i chloroplastów.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie EB2A podczas tego wirowania (patrz krok 3.2.1).
    6. Zdekantować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
      UWAGA: Ponieważ nie dodano jeszcze detergentu, granulka powinna pozostać intensywnie zielona, a supernatant powinien być co najwyżej bladozielony/żółty
      7. .
  2. Liza organelli niebędących przedmiotem zwalczania (~0,5 h)
    1. Przygotować EB2A, dodając inhibitory proteazy do końcowego stężenia 0,4x (0,5 tabletki na 12,5 ml EB2A).
    2. Zawiesić osad z kroku 3.1.6 w 5 ml EB2A i inkubować na lodzie przez 10 minut z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Stężenie detergentu musi być zoptymalizowane, aby preferencyjnie lizować nienaruszone komórki i chloroplasty, ale nie jądra. Wymagana ilość może się różnić w zależności od organizmu. Zaleca się sprawdzenie pod mikroskopem lizy chloroplastów i zatrzymania nienaruszonych jąder.
    3. Wirować przy 2 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym do granulowania zanieczyszczeń i jąder.
      UWAGA: Na tym etapie supernatant powinien być intensywnie zielony, a osad powinien być znacznie mniej zielony niż obserwowano w poprzednich etapach ze względu na lizę chloroplastów i uwalnianie chlorofilu do cytozolu.
    4. Zdekantować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  3. Izolacja jąder z pozostałych zanieczyszczeń cytoplazmatycznych (~0,5 h)
    1. Przygotować EB2B, dodając inhibitory proteazy do końcowego stężenia 1x (0,5 tabletki na 5 ml EB2B).
    2. Zawiesić surowe granulki jądrowe z kroku 3.2.3 w 2 ml EB2B.
      UWAGA: EB2B nie zawiera Triton X-100, więc w tym momencie nie powinna wystąpić dodatkowa liza.
    3. Wirować przy 2 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym do granulowania zanieczyszczeń i jąder.
      UWAGA: Małe organelle i składniki cytoplazmatyczne nie powinny się osadzać, więc powinny pozostać w supernatancie.
    4. Zdekantować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    5. Zawiesić osad za pomocą 250 μl NLB (dodać 0,5 tabletki inhibitora proteazy na 5 ml).
      UWAGA: Celem jest ponowne zawieszenie jąder w minimalnej ilości NLB bez znacznych strat materiałowych. Ponieważ NLB jest bardzo lepki, a granulki zawierają dużą ilość nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, pipetowanie jest bardzo trudne i ma tendencję do przylegania do wnętrza końcówek pipet. Z tego powodu zaleca się ponowne używanie tej samej końcówki pipety, gdy tylko jest to możliwe. Jeśli obawiasz się resztek materiału w końcówce do pipety, po prostu zawieś pipetę na półce lub stojaku na ~1 minutę, aby umożliwić grawitacji zebranie materiału przy otworze końcówki. Nie należy agresywnie pipetować w celu ponownego wymieszania granulek. Zamiast tego należy użyć końcówki pipety jako pręta mieszającego, aż granulowany materiał będzie mógł zostać zassany do końcówki pipety. Oznacza to, że duże grudki peletów mogą pozostać na tym etapie, o ile można je wciągnąć do końcówki pipety.
    6. Wirować maksymalnie 15 s w celu homogenizacji i częściowego ponownego zawieszenia materiału. Sonikować przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W kolejnych krokach należy pamiętać, że całkowita ilość dodanego NLB wynosi 250 μl, ale całkowita pozorna objętość próbki może być nawet dwukrotnie większa z powodu nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Próbka jest zamrażana i rozmrażana, aby wspomóc lizę jąder.
  4. Liza jąder i ekstrakcja histonów (~4 h)
    1. Do rozmrożonej próbki dodać 750 μl 5% buforu Gdn. Sonikować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieść próbkę do pojedynczej probówki o pojemności 2 ml i wirować 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Supernatant prawdopodobnie będzie wyglądał na zielony. Następujące etapy chromatografii powinny usunąć większość pigmentów z białka.
    3. Czekając na kroki 3.4.1 i 3.4.2, przygotuj kolumnę do czyszczenia metodą chromatografii jonowymiennej. Przepłukać kolumnę chromatograficzną 2 ml acetonitrylu i 4 ml wody, aby zminimalizować zanieczyszczenie powierzchni.
    4. Załaduj 200 ~ 300 μl żywicy WCX (wstępnie kondycjonowanej buforem 5% Gdn) na kolumnę chromatograficzną. Niech żywica opadnie. Przemyć cztery razy 1 ml 5% buforu Gdn. Utrzymuj rurkę i kolumnę na lodzie przez resztę etapów oczyszczania.
    5. Umieścić kolumnę chromatograficzną na probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Załaduj supernatant z kroku 3.4.2 powoli na złoże żywicy, nie naruszając żywicy (spróbuj powoli opadać z boku rurek). Pozwól, aby roztwór przepływał grawitacyjnie. Gdy roztwór przepływa, załaduj eluent z powrotem na górę kolumny 6-8 razy, aby umożliwić maksymalne związanie z żywicą. Następnie wyrzuć eluent.
    6. Załaduj 2 ml 5% buforu Gdn, aby zmyć białka niehistonowe z kolumny. Wyrzucić eluent.
    7. Elute histony za pomocą 1 ml buforu 20% Gdn. Zbierz eluent, który zawiera białka histonowe.
    8. Użyć filtra wirowego o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWCO) (0,5 ml) do odsolenia eluentu z kroku 3.4.6. Przed użyciem załaduj 500 μl rozpuszczalnika do mycia (0,2% kwasu mrówkowego w 3% ACN) i odkręć go dwukrotnie, aby wyczyścić filtr.
      UWAGA: Zaleca się rozpoczęcie mycia filtra MWCO podczas wykonywania czynności chromatografii żywicznej, aby zaoszczędzić czas. Kolejne kroki filtra wirowego zajmują ~3–4 godziny.
    9. Najpierw załaduj 500 μL próbki histonu, wiruj w temperaturze 14 000 x g przez ~25 min, aby zmniejszyć objętość do ~100 μL. Następnie załaduj kolejne 400 μl próbki i ponownie wiruj w temperaturze 14 000 x g przez ~25 minut. Załadować ostatnie 100 μl próbki, przepłukać probówkę z próbką 300 μl rozpuszczalnika do płukania i załadować rozpuszczalnik do filtra. Ponownie wirować przy 14 000 x g przez ~25 min.
    10. Załaduj 400 μl rozpuszczalnika do mycia, wiruj w temperaturze 14 000 x g przez ~25 min, aby zmniejszyć objętość do ~100 μl lub mniej. Każdy cykl zmniejsza stężenie soli o jedną piątą. Powtarzaj przez kolejne trzy cykle, aby doprowadzić stężenie guanidyny do ~0,01%. Odwróć filtr do czystej probówki zbiorczej i wiruj z prędkością 1 000 x g przez 2 minuty. Oczyszczoną próbkę histonu należy zachować w temperaturze -20 °C lub -80 °C do analizy.
      UWAGA: Zaleca się wirowanie dłużej (30–40 min) na ostatnim etapie, aby zminimalizować objętość próbki w celu uzyskania wyższego stężenia. Objętość powinna być w stanie spaść do 50–70 μl.

4. Spektrometria mas oczyszczonych histonów

  1. Akwizycja danych ze spektrometrii mas chromatografii cieczowej (LC-MS)
    1. Oszacować stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA) zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: BCA może jedynie podać szacunkowe całkowite stężenie białka, ale nie jakość oczyszczania histonów. Jeśli oprzyrządowanie do stwardnienia rozsianego nie jest łatwo dostępne do sprawdzenia jakości oczyszczania histonów, można użyć western blot. Można również zastosować LC z odwróconą fazą w połączeniu z detekcją absorbancji ultrafioletu 210 nm, jak opisano w naszym poprzednim raporcie20. Chromatogram można porównać ze znanym wzorcem do sprawdzania jakości próbki. Jednak różne organizmy mogą mieć różne profile elucji. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie wzorców histonowych z podobnych organizmów.
    2. Podłączyć kolumnę analityczną C18 z odwróconymi fazami (RP) (np. 3 μm 300 A, średnica wewnętrzna kolumny 75 μm, średnica zewnętrzna 360 μm, długość 70 cm) i kolumnę pułapki C18 (np. 3,6 μm, średnica wewnętrzna kolumny 150 μm, średnica zewnętrzna 360 μm, długość 5 cm) do systemu nanoprzepływowej chromatografii cieczowej z dwiema pompami (np. Wody NanoAcquity). Rozpuszczalniki binarne to A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie i B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu.
      UWAGA: Podwójna pompa LC zawiera pompę myjącą i pompę gradientową. Obie pompy przechodzą przez dwa etapy w każdej analizie — etap wychwytywania, po którym następuje etap analityczny. Na etapie wychwytywania pompa myjąca wpływa do kolumny pułapki, a pompa gradientowa wpływa do kolumny analitycznej. Na etapie analitycznym kolumna pułapki jest sprzężona z kolumną analityczną, a pompa gradientowa przepływa do obu kolumn. Następnie pompa myjąca trafia do odpadów.
    3. Etap pułapkowania: Ustaw metodę LC, aby najpierw załadować 1–2 μg próbki histonu na kolumnę pułapki. Odsalać próbkę za pomocą pompy płuczącej o stężeniu 3 μl/min 5% rozpuszczalnika B przez 10 minut. Ustawić pompę analityczną na 0,3 μl/min 5% rozpuszczalnika B w celu zrównoważenia.
    4. Etap analityczny: Ustaw pompę gradientową (0,3 μl/min) tak, aby zaczynała od 5% B i zwiększała do 30% po 15 minutach. Następnie zwiększ do 41% B po 100 minutach przed wysokim poziomem organicznego prania do 95% B na końcu.
      UWAGA: Nachylenie można zoptymalizować w zależności od różnych profili przechowywania w poszczególnych kolumnach. Zazwyczaj histony o pełnej długości eluują około 30%-40% B w określonych warunkach LC. Dłuższe gradienty można wykorzystać do zwiększenia liczby widm MS2 w celu uchwycenia większej liczby proteoform histonowych.
    5. Skonfiguruj metodę akwizycji zależnej od danych na MS o wysokiej rozdzielczości (np. Thermo Orbitrap Fusion Lumos lub podobny) z możliwością dysocjacji transferu elektronów (ETD). Użyj trybu nienaruszonego białka i wykonaj wszystkie niezbędne kalibracje zgodnie z sugestią producenta. Parametry krytyczne zostały opisane poniżej. Będą one specyficzne dla używanego instrumentu.
      1. MS1: zakres skanowania 600–2 000 m/z, rozdzielczość 120k (przy m/z 200), 4 mikroskopy, cel AGC 1E6, maksymalna iniekcja 50 ms.
      2. MS2: rozdzielczość 120k; 1 mikroskop; Tarcza AGC 1E6; zależne od danych MS/MS: naprzemienne ETD (czas reakcji 25 ms, maksymalny czas wtrysku 500 ms) i dysocjacja kolizyjna o wyższej energii (HCD, 28% znormalizowanej energii zderzenia z ±5% energii krokowej, maksymalny czas wtrysku 100 ms); okno izolacji 0,6 Da; Priorytet w stanach najwyższego ładunku.
      3. Wykluczenie dynamiczne: okno czasowe 120 s, okno masowe ±0,7 Da. Wyklucz stany naładowania niższe niż 5 i nieokreślone stany naładowania.
    6. Uruchom kilka wstrzyknięć wzorców peptydowych lub histonów na nowe kolumny, aby zrównoważyć i sprawdzić system przed uruchomieniem właściwych próbek. W przypadku dużej liczby próbek należy dodać krótkie półfabrykaty lub płukania między próbkami, aby zminimalizować przenoszenie. Pozwól kolumnom zrównoważyć się przez 15–20 minut w warunkach początkowych (5% rozpuszczalnika B) przed następną próbką.
      UWAGA: Dłuższe gradienty LC i wyższy maksymalny czas wstrzykiwania dla MS2 mogą poprawić jakość widma w celu identyfikacji większej liczby proteoform histonowych.
  2. Przetwarzanie danych LC-MS i identyfikacja proteoform
    1. Otrzymać sekwencję białka (sorgo) w formacie FASTA z JGI (https://genome.jgi.doe.gov) lub UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Użyj MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml), aby przekonwertować pliki surowych danych instrumentu (*.raw) na format mzML.
    3. Pobierz TopPIC suite22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) do przetwarzania danych. Program można uruchomić w wierszu poleceń lub za pośrednictwem interfejsu graficznego.
    4. Użyj TopFD w pakiecie TopPIC, aby zdekonwoluować widma z pliku mzML z kroku 4.2.2. Można użyć parametrów domyślnych. Ale "okno prekursorowe" (-w) musi być zredukowane do 1 m/z, ponieważ używane jest wąskie okno izolacyjne.
    5. Użyj TopPIC w pakiecie TopPIC, aby zidentyfikować proteoformy. Można użyć większości parametrów domyślnych. Ustaw typ odcięcia widma i proteoformy na FDR (współczynnik fałszywego wykrywania) i ustaw wartość odcięcia na 0,01 (1% FDR) lub zgodnie z potrzebami. Ustaw "tolerancję błędu proteoformu" na 5 (Dalton). Załaduj plik FASTA z kroku 4.2.1 i plik "*_ms2.msalign" z kroku 4.2.4. Następnie rozpocznij wyszukiwanie.
      UWAGA: Ustawienie "tolerancja błędu proteoformu" połączy proteoformy o podobnych masach (± 5 Da) jako jeden. Pomaga to zmniejszyć nadmiarowość liczby proteoformów. Należy go jednak stosować ostrożnie, ponieważ duża tolerancja spowoduje połączenie proteoform o małych lub zerowych różnicach masy. Ten parametr jest dostępny tylko w TopPIC w wersji 1.3 lub nowszej.
    6. Zidentyfikowane proteoformy można sprawdzić w pliku "*_proteoform.csv" lub zobrazować za pomocą modułu Topview w folderze "*_html" danych wyjściowych.
    7. Lista proteoform wygenerowana na podstawie powyższych kroków przy użyciu TopPIC adnotuje PTM histonów jako przesunięcia masy. W celu zlokalizowania poszczególnych PTM należy dołączyć listę modyfikacji. Szczegółowy opis znajduje się w instrukcji TopPIC. Alternatywnie przejdź do następnego kroku, aby przeprowadzić komplementarną analizę danych przy użyciu pakietu Informed-Proteomics23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
    8. Postępuj zgodnie z instrukcjami i użyj modułu PbfGen, aby przekonwertować surowe dane instrumentu na plik PBF. Następnie zdekonwolucjonizuj dane MS1 za pomocą modułu ProMex, aby wyprowadzić plik ms1ft (lista funkcji, każda cecha reprezentuje unikalną kombinację masy i czasu przechowywania).
    9. Utwórz ukierunkowaną FASTA dla Informed-Proteomiki, korzystając ze zidentyfikowanej listy białek z TopPIC w kroku 4.2.6.
      UWAGA: Przeszukiwanie całego genomu za pomocą Informed-Proteomics z dużą liczbą zmiennych PTM może być bardzo powolne i może powodować awarie. Dlatego zaleca się zmniejszenie rozmiaru FASTA poprzez włączenie tylko białek docelowych.
    10. Utwórz ukierunkowaną listę modyfikacji, aby wyszukać histonowe PTM zgodnie z formatem w przykładowym pliku. Typowe PTM, które należy uwzględnić, to: acetylacja lizyny, monometylacja lizyny, dimetylacja lizyny, trimetylacja lizyny, fosforylacja seryny/treoniny/tyrozyny, N-końcowa acetylacja białek, utlenianie metioniny/cysteiny. W przypadku sorgo należy dodać N-końcową monometylację białka, dimetylację i trimetylację.
      UWAGA: Informed-Proteomics szuka tylko PTM określonych na liście. Jeśli obecne są nieokreślone PTM, proteoforma może nie zostać zidentyfikowana lub może zostać błędnie zidentyfikowana przez inne proteoformy. Jednak lista PTM powinna być jak najkrótsza, aby zminimalizować czas wyszukiwania.
    11. Uruchom moduł MSPathFinder, aby zidentyfikować proteoformy, korzystając z plików z kroku 4.2.8, skoncentrowanego FASTA z kroku 4.2.9 i listy modyfikacji z kroku 4.2.10. Można użyć parametrów domyślnych.
    12. Wyniki można wizualizować w LcMsSpectator, ładując wszystkie pliki wyników.
      UWAGA: Dostępne są inne narzędzia bioinformatyczne do przetwarzania i wizualizacji danych z góry na dół, z których każde ma swoje mocne strony24,25,26,27,28. Sorgo i wiele innych organizmów ma ograniczone znane informacje na temat histonów PTM w bazie danych. Użyj najpierw TopPIC, aby zidentyfikować przesunięcia masy z PTM. Ta analiza może z łatwością odkryć zarówno znane, jak i nieznane PTM. Następnie wykryte PTM można przeszukiwać w ukierunkowany sposób, określając listę PTM w TopPIC lub za pomocą innych narzędzi uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, histony mogą być wyodrębnione i zidentyfikowane za pomocą analizy LC-MS. Surowe dane i przetworzone wyniki są dostępne w MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) poprzez akcesję: MSV000085770. Na podstawie wyników TopPIC z reprezentatywnej próby (dostępnej również z MassIVE) zidentyfikowaliśmy 303 proteoformy histonów (106 proteoform H2A, 72 H2B, 103 H3 i 22 H4). Wykryto również wspólnie oczyszczone proteoformy rybosomalne, zwykle eluujące na wczesnym etapie LC. Zwykle składają się one z ~20% zidentyfiko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje sposób ekstrakcji histonów z próbek liści sorgo (lub ogólniej liści roślin). Oczekuje się, że średni plon histonów wyniesie 2–20 μg na 4–5 g materiału z liści sorgo. Materiały są wystarczająco czyste do dalszej analizy histonów za pomocą LC-MS (głównie histonów z ~20% zanieczyszczeniem białkami rybosomalnymi). Niższą wydajność można uzyskać ze względu na różnice w próbce lub potencjalne niewłaściwe obchodzenie się/awarie w całym protokole. Utrzymanie integralności jąder przed etapem lizy jąd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ronaldowi Moore'owi i Thomasowi Fillmore'owi za pomoc w eksperymentach ze spektrometrią mas, a Matthew Monroe za deponowanie danych. Badania te zostały sfinansowane z grantów Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) ds. Badań Biologicznych i Środowiskowych w ramach projektu Epigenetic Control of Drought Response in Sorgo (EPICON) w ramach nagrody o numerze DE-SC0014081, przyznawanej przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) oraz za pośrednictwem Joint BioEnergy Institute (JBEI), obiektu sponsorowanego przez DOE (kontrakt DE-AC02-05CH11231) między Lawrence Berkeley National Laboratory a DOE. Badania przeprowadzono przy użyciu Laboratorium Środowiskowych Nauk Molekularnych (EMSL) (grid.436923.9), Biura Użytkowników Nauki DOE sponsorowanego przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylFisher ChemicalA955-4L
Ditiothreitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, roztwór 500mM, pH 8,0EMD Millipore Corp324504-500mL
Kwas mrówkowyThermo Scientific28905
Chlorowodorek guanidynySigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Fosforan potasu, dwuzasadowySigmaP3786-100G
Koktajl inhibitorów proteazy, tabletki cOmcomplete5892791001
Maślan soduSigma303410-5GStosowany do inhibitora deacetylazy histonowej
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS1888
Sód FluorekSigmaS7020-100GUżywany do inhibitora fosfatazy
Ortowanadan soduSigma450243-10GUżywany do inhibitora fosfatazy
SacharozaSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Słaba żywica kationowymienna, siatka 100-200 analityczna (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Jednorazówka
Kolumna chromatograficzna (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Tkanina filtracyjna Mesh 100Millipore SigmaNY1H09000Jest to część zestawu Sigma (katalog # CELLYTPN1) do ekstrakcji jąder roślinnych. Można stosować podobne filtry o tym samym rozmiarze oczek.
Końcówki do mikropipet (P20, P200, P1000)Sigma
, 50mL/15mL, Wirówka, StożkowaGenesee Scientific28-103
Probówka, Mikrowirówka, 1.5/2 mLSigma
Sprzęt
Analytical BalanceFisher Scientific01-912-401
Zlewki ( 50 ml – 2L)
Mikrowirówka z chłodzeniemFisher Scientific13-690-006
Mikropipety
Wirówka wahadłowa z chłodzeniemFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Sonikator do kąpieli wodnejFisher Scientific15-336-120
Roche Probówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
  3. Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
  4. Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
  5. Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
  6. Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
  7. Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
  10. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  11. Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
  12. Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  13. Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
  14. Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
  15. Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
  16. Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361(2019).
  17. Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
  18. Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124(2019).
  19. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  20. Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
  21. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  22. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
  23. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  24. LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
  25. Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
  26. Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
  27. Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
  28. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
  29. Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
  30. Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
  31. Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
  32. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  33. Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
  34. Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
  35. Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
  36. Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja histon woczyszczanie j der kom rkowychchromatografia wymiany jonowejmodyfikacje potranslacyjnechromatografia cieczowaanaliza proteoformodsalanie bia ek

Powiązane artykuły