Przedstawiamy metodę tworzenia środowiska 3D do hodowli komórek, która może być wykorzystana do zbadania znaczenia interakcji komórka/matryca w progresji raka. Za pomocą prostego, samoorganizującego się oktapeptydu, można kontrolować matrycę otaczającą zamknięte komórki, z niezależną regulacją sygnałów mechanicznych i biochemicznych.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie zdefiniowanego przez użytkownika żelu peptydowego do kontrolowanych modeli hodowlanych 3D nowotworów i chorób
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rośnie świadomość, że komórki hodowane w 3D lepiej modelują zachowanie in vivo niż te hodowane w 2D. W tym protokole opisujemy prosty i przestrajalny hydrożel 3D, odpowiedni do hodowli komórek i tkanek w otoczeniu pasującym do ich rodzimego środowiska. Jest to szczególnie ważne dla naukowców zajmujących się inicjacją, wzrostem i leczeniem raka, w którym interakcja między komórkami a ich lokalną macierzą zewnątrzkomórkową jest fundamentalną częścią modelu. Przejście na hodowlę 3D może być trudne i często wiąże się z brakiem odtwarzalności ze względu na dużą zmienność między partiami w matrycach kultur 3D pochodzenia zwierzęcego. Podobnie, problemy z obsługą mogą ograniczać użyteczność syntetycznych hydrożeli. W odpowiedzi na tę potrzebę zoptymalizowaliśmy prosty, samoorganizujący się żel peptydowy, aby umożliwić hodowlę odpowiednich modeli linii komórkowych raka i choroby, a także tkanek/komórek pochodzących od pacjenta. Sam żel jest wolny od składników matrycy, z wyjątkiem tych dodawanych podczas kapsułkowania lub zdeponowanych w żelu przez kapsułkowane komórki. Właściwości mechaniczne hydrożeli mogą być również zmieniane niezależnie od dodawania matrycy. W związku z tym działa jak "czysta tablica", umożliwiając naukowcom zbudowanie środowiska hodowli 3D, które odzwierciedla tkankę docelową będącą przedmiotem zainteresowania i niezależnie analizuje wpływ sił mechanicznych i/lub biochemicznej kontroli zachowania komórek.
Wprowadzenie
Wiele ról odgrywanych przez środowisko pozakomórkowe w rozwoju i postępie raka staje się coraz bardziej jasne1. Niedawne szczegółowe analizy oparte na proteomii uzupełniły i tak już przekonującą bazę literaturową, wykazując, że składniki macierzy pochodzące z komórek zrębowych związanych z rakiem lub same komórki rakowe są kluczowymi czynnikami w takich zdarzeniach, jak promowanie nabłonkowego przejścia mezenchymalnego i rozprzestrzenianie się przerzutów2,3,4. Biorąc pod uwagę to uznane znaczenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), kluczowe staje się przejście w kierunku platform hodowli komórkowych, które umożliwiają kontrolę nad środowiskiem 3D prezentowanym komórkom. W odpowiedzi na tę potrzebę, protokół ten przedstawia metodę enkapsulacji komórek i hodowli w hydrożelu 3D, ze zdefiniowanym przez użytkownika składem ECM i właściwościami mechanicznymi5.
Obecnie istnieje słaba korelacja między skutecznością terapii raka w hodowli 2D in vitro, wpływem tych terapii w obecnych modelach in vivo (ksenoprzeszczep pochodzący od pacjenta, PDX) a ich ostateczną aktywnością w badaniach klinicznych6,7. Doprowadziło to do poważnych niepowodzeń w procesie opracowywania leków, co wiąże się z pilną potrzebą opracowania ulepszonych modeli in vitro, które pozwolą testowanym terapiom "zawieść wcześnie, tanio". Wielu badaczy używa produktu pochodzącego z mastocytomy myszy, np. Matrigel (lub podobnych produktów) do tworzenia środowisk bogatych w matryce 3D do wzrostu i obserwacji zachowania komórek in vitro, w tym komórek pochodzących z PDX i innych komórek znajdujących się blisko pacjenta8,9,10. Jednak to uniwersalne podejście pomija złożoną rolę, jaką odgrywają białka macierzy/glikany w inicjacji i progresji raka.
Uznanie roli macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w kontroli zachowania komórek zachęciło również do stosowania hodowli 3D w lub na hydrożelach złożonych z określonych składników matrycy11. Chociaż jest to przydatne do badania określonych interakcji, systemy te cierpią z powodu niezdolności do oddzielenia instrukcji mechanicznych i biochemicznych między komórkami a macierzą. Mogą być również trudne w obsłudze i mogą dawać niejasne odczyty zachowania komórek. Żele kolagenowe są kluczowym przykładem tego problemu, ponieważ skurcz żelu za pośrednictwem komórek może radykalnie zmniejszyć zdolność do wizualizacji komórek w obrębie gel5. Istnieje również kilka bardzo eleganckich, wieloskładnikowych systemów żelowych, które eksperci wykorzystali z doskonałym skutkiem12,13,14. Mogą one zawierać wrażliwe na enzymy łączniki i bioaktywne motywy, ale są znacznie bardziej złożone w swoim tworzeniu i zastosowaniu niż opisany tutaj system.
Ten protokół opisuje metodę tworzenia w pełni zdefiniowanych modeli kultur 3D, pozwalając na modelowanie ról ECM w rozwoju i chorobie in vitro. Podstawą modelu 3D jest żel peptydowy, który wcześniej opisaliśmy jako optymalizację prostego, samoorganizującego się hydrożelu oktapeptydowego5,15,16. Odchodząc od złożonych matryc pochodzenia zwierzęcego, system ten oferuje znaczące korzyści w postaci lepszej spójności między partiami i lepszej obsługi. W swoim prostym stanie peptyd nie zawiera motywów pochodzących z matrycy i skutecznie zapewnia "czystą kartę", na której użytkownik może budować funkcjonalność.
Pokazujemy, jak właściwości mechaniczne żelu peptydowego mogą być regulowane niezależnie, wraz z włączeniem białek macierzy/glikanów. System jest wysoce przestrajalny, co pozwala na enkapsulację szeregu typów komórek w różnych formatach. Co ważne dla zbudowania modelu nowotworu, komórki zrębu mogą być również włączane: albo do bezpośredniej wspólnej hodowli, albo rozdzielane, aby umożliwić specyficzną analizę pośrednich interakcji komórka rakowa - zrąb. Co najważniejsze, opisany tutaj protokół nie wymaga skomplikowanej wiedzy chemicznej i może być odtworzony w dowolnym laboratorium hodowli komórkowych bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy chemicznej lub sprzętu.
Zoptymalizowaliśmy metody badania zachowania komórek w żelach peptydowych, w tym obrazowanie, analizę reologiczną, ekstrakcję materiału do PCR5 i osadzanie do oceny histologicznej. Niewątpliwą zaletą prostego systemu hydrożelowego jest możliwość wizualizacji i badania matrycy zdeponowanej przez zamknięte komórki. Znaczenie matryc pochodzących z komórek i korzyści płynące z lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki przeprojektowują swoje lokalne mikrośrodowisko, zostało ostatnio podkreślone 17 i odzwierciedla rosnącą świadomość znaczenia wychwytywania składników macierzy wydzielanych przez komórki, w podobny sposób, jak ma to miejsce in vivo. Wykorzystanie możliwości modelowania takich procesów może być jednym z podstawowych czynników wpływających na zwiększenie znaczenia modeli chorób opartych na hydrożelu dla pacjentów.
Protokół
1. Rozpuszczanie peptydu
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą pipety P1000, dodaj 800 μL sterylnej wody do probówki o pojemności 15 mL.
- Używając wagi analitycznej, odważ proszek peptydowy do antystatycznej łódeczki wagowej. Należy odważyć masę (w mg) stanowiącą 1,25-krotność pożądanej końcowej stężenia żelu peptydowego (w mg/mL, Tabela 1).
UWAGA: Opisana tutaj metoda pozwoli na uzyskanie objętości około 1,25 mL żelu peptydowego na probówkę w momencie ostatecznego żelowania. Można przygotować kilka probówek jednocześnie lub alternatywnie zwiększyć objętość w jednej probówce, gdy użytkownik nabierze doświadczenia w prezentowanej metodzie.
| Stężenie peptydów (po końcowej żelacji) | Masa peptydu | Wstępne dodanie NaOH |
| 6 mg/ml | 7,5 mg | 30 µL |
| 10 mg/ml | 12,5 mg | 60 µL |
| 15 mg/ml | 18,75 mg | 100 µL |
Tabela 1: Masa peptydów i sugerowana początkowa ilość dodanego NaOH dla typowych końcowych stężeń żelu. Podane zakresy stężeń peptydów można rozszerzyć w obu kierunkach, jednak bardziej prawdopodobne jest, że niższe stężenia peptydów nie utworzą stabilnych żeli, natomiast przy wysokich stężeniach otrzymany żel może być zbyt gęsty, aby umożliwić wystarczającą wymianę składników odżywczych i przeżywalność komórek. Odpowiednie stężenie będzie wymagało optymalizacji dla różnych typów komórek i partii peptydów.
- Przenieś odważony peptyd do probówki o pojemności 15 mL. Stuknij w łódzkę wagową, aby upewnić się, że nie pozostał w niej żaden proszek.
UWAGA: Proszek peptydowy może wykazywać duże właściwości elektrostatyczne, należy zatem dbać o zminimalizowanie strat materiału. W krokach 1.2 i 1.3 (podobnie jak podczas pomiarów pH) nie jest konieczne zachowanie warunków sterylnych, ponieważ sterylizacja następuje podczas późniejszej inkubacji w temperaturze 80 °C. - Mieszaj na vortexie przez 3 min, a następnie wiruj z prędkością 200 x g przez 3 min.
- Inkubuj roztwór peptydu w piecu ustawionym na 80 °C przez co najmniej 2 h. Jeśli po inkubacji wciąż obecny jest nierozpuszczony peptyd, powtórz krok 1.4.
UWAGA: Ze względu na to, że równomierne ogrzewanie jest kluczowe, blok grzejny nie nadaje się do tego etapu. Stwierdzono jednak, że dobrze sprawdzają się piece do hybrydyzacji, jak i łaźnia wodna, pod warunkiem, że roztwór peptydu jest całkowicie zanurzony.
2. Tworzenie prekursorów żelu
- Przygotować sterylny 0,5 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), używając sterylnej wody.
UWAGA: Dla uzyskania najbardziej powtarzalnych wyników zaleca się stosowanie świeżo rozcieńczonego roztworu NaOH. - W komorze do hodowli tkankowej dodać 0,5 M NaOH do centrum rozpuszczonego peptydu i wymieszać, powoli mieszając końcówką pipety (Tabela 1).
- Wymieszać probówkę na wortexie przez 10 s, a następnie wirować przy 200 x g przez 10 s w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Jeśli prekursor żelu jest mętny, powtórzyć kroki 2.2 i 2.3, dodając NaOH w przyrostach po 5 µL.
UWAGA: Pomiar pH może pomóc określić, czy dodano wystarczającą ilość NaOH: optymalne pH mieści się w zakresie 9–10,5 i najlepiej go nie przekraczać, ponieważ użycie kwasów w celu obniżenia pH może prowadzić do niejednorodności żelu. Precyzyjna objętość wymaganego NaOH może się różnić w zależności od źródła peptydu. - Gdy prekursor żelu stanie się optycznie przejrzysty i samonośny (lub ledwo płynny) po odwróceniu probówki 15 mL, dodać 100 μL sterylnego 10x PBS w komorze do hodowli tkankowej. Wymieszać na wortexie przez 10 s i wirować przy 200 x g przez 10 s.
UWAGA: Jeśli prekursor żelu jest mętny, powtarzać krok 2.4, aż stanie się przejrzysty i półstały. Jeśli prekursor żelu pozostaje w stanie ciekłym (powyżej pH ~10,5), nie utworzy stabilnego żelu i należy go zutylizować. - Inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 80 °C.
- Wizualnie sprawdzić prekursor żelu, aby upewnić się, że jest całkowicie płynny w 80 °C.
- Jeśli prekursor żelu nie jest całkowicie płynny w 80 °C, oznacza to, że nie został wystarczająco zneutralizowany; dodać NaOH zgodnie z krokiem 2.4.
- Jeśli prekursor żelu jest płynny, ale obecne są pęcherzyki powietrza lub małe osady, energicznie pstryknąć w probówkę, aby je rozproszyć. Jeśli pęcherzyki powietrza lub osady nadal występują po pstryknięciu w probówkę, wymieszać prekursor żelu na wortexie, a następnie wirować przy 200 x g przez 10 s.
- Po wykonaniu kroku 2.7.1 lub 2.7.2 inkubować żele prekursorowe przez kolejne 2 h w 80 °C przed przystąpieniem do końcowej żelacji.
- Przechowywać prekursory żelu w 80 °C do momentu użycia (maksymalnie 48 h).
UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać; przechowywać prekursory żelu w 4 °C do 4 tygodni. W przypadku wznowienia prac z tego punktu, inkubować prekursory żelu w 80 °C przez co najmniej 2 h i powtórzyć od kroku 2.7. Zdecydowanie zaleca się przygotowanie prekursorów żelu z dużym wyprzedzeniem przed końcową żelacją, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na powyższe korekty, jeśli będą one wymagane.
3. Przygotowanie komponentów macierzy do wysiewu
UWAGA: Przykładowe obliczenia dla kroków 3–5 przedstawiono na Ryc. 1. Krok 3 oraz krok 4 można pominąć, aby odpowiednio przygotować żel bez macierzy i/lub żel bezkomórkowy.
- Oblicz całkowitą łączną objętość komórek, macierzy i pożywki wymaganych do wysiewu, przyjmując 250 µL na każdy 1 mL żelu prekursorowego. Pomnóż tę objętość przez 1,1, aby uwzględnić błędy pipetowania. Jest to objętość wysiewu, VS.
- Dla każdego składnika macierzy oblicz objętość roztworu stokowego do dodania do objętości wysiewu, korzystając z Równania 1:
(1)
UWAGA: VS odpowiada całkowitej objętości pożywki do wysiewu wymaganej dla wszystkich żeli (krok 3.1). Należy upewnić się, że suma objętości wszystkich składników macierzy nie przekracza VS. - Dokładnie rozmroź wszystkie składniki macierzy (zgodnie z instrukcjami producenta) i przechowuj w lodzie do momentu użycia.
UWAGA: Niektóre składniki macierzy są bardzo podatne na żelowanie. Aby go uniknąć, należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. - Jeśli dodawany jest kwaśny roztwór stokowy kolagenu wymagający neutralizacji (zgodnie z instrukcjami producenta), przygotuj roztwór neutralizujący w następujący sposób:
- Oblicz wymaganą objętość roztworu stokowego kolagenu, VC, korzystając z Równania 1.
- Wyznacz odpowiednią objętość roztworu neutralizującego, VN. Powinna ona zostać dobrana tak, aby łączna objętość wszystkich dodatków do macierzy nie przekroczyła objętości wysiewu, VS.
UWAGA: Zazwyczaj rozsądną wartością jest VN = 2 x Vc, ale może ona zostać dostosowana w zależności od liczby i objętości innych dodawanych składników macierzy. - Oblicz objętość 1 M NaOH wymaganą do neutralizacji, korzystając z Równania 2.
(2) - Oblicz objętość 10x PBS wymaganą w roztworze neutralizującym, korzystając z Równania 3.
(3) - Połącz obliczone objętości 1 M NaOH i 10x PBS, a następnie dopełnij do VN sterylną wodą. Wymieszaj dokładnie i przechowuj w lodzie do momentu użycia.
UWAGA: Na tym etapie nie dodawaj kwaśnego kolagenu. Przedwczesne zmieszanie kolagenu z roztworem neutralizującym doprowadzi do zapoczątkowania fibrillogenezy kolagenu, co może spowodować niespójność właściwości końcowego żelu peptydowego.
4. Przygotowanie komórek do wysiewu
- Jeśli nie zostało to jeszcze wykonane, należy obliczyć objętość wysiewu, VS, zgodnie z krokiem 3.1.
- Oblicz gęstość komórek wymaganą w tej zawiesinie komórkowej, przyjmując pożądaną gęstość komórek w końcowym żelu peptydowym i mnożąc ją przez 5.
UWAGA: Zawiesina komórkowa ma 5-krotnie większe stężenie niż pożądane stężenie końcowe, aby uwzględnić rozcieńczenie podczas mieszania z prekursorem żelu. Gęstość komórek powinna zostać zoptymalizowana dla każdej nowej rozważanej linii komórkowej. W zależności od typu komórek, odpowiednie mogą być gęstości od 1 x 104 do 1 x 106 cells/mL w końcowym żelu peptydowym. - Oblicz całkowitą liczbę komórek wymaganych do wysiewu (pomnóż gęstość komórek przez objętość wysiewu VS obliczoną w kroku 4.1.).
- Stosując standardowe metody hodowli/pasażowania dla używanych komórek, przygotuj pellet komórkowy zawierający wymaganą liczbę komórek obliczoną w kroku 4.3.
5. Końcowa żelowanie/enkapsulacja komórek
- W momencie rozpoczęcia końcowej żelacji, przenieś prekursory żelu z piekarnika o temperaturze 80 °C do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
UWAGA: Prekursory żelu powinny być samonośne w temperaturze 37 °C. Jeśli pozostają w formie ciekłej, mało prawdopodobne jest wystąpienie pełnej żelacji i należy je zutylizować. - Przygotuj płytkę 96-dołkową lub alternatywnie płytkę 24-dołkową (lub podobną) z insertami do hodowli komórkowej.
UWAGA: Przy wysiewaniu żeli peptydowych w insertach 24-dołkowych należy upewnić się, że między dnem insertu a płytką istnieje przerwa. Zapewnia to kontakt żelu z medium. - Jeśli macierz ma zostać dodana, połącz wszystkie komponenty macierzy i roztwory neutralizujące (krok 3). Dopełnij objętość do VS (krok 3.1) przy użyciu medium do hodowli komórkowej i dokładnie wymieszaj. Jeśli mają zostać dodane komórki, resuspenduj pellet komórkowy przygotowany w kroku 4, używając objętości wysiewu VS.
UWAGA: Jeśli w kroku 3 nie przygotowano komponentów macierzy, jako objętość wysiewu należy zastosować medium do hodowli komórkowej. Zazwyczaj jest to standardowe medium hodowlane dla stosowanego typu komórek, choć może to wymagać walidacji w przypadku użycia mieszanki typów komórek. - Za pomocą pipety P1000 delikatnie dodaj 250 μL mieszaniny komórek/macierzy na wierzch prekursora żelu.
UWAGA: Komponenty macierzy, w szczególności ekstrakt błony podstawnej, mogą zacząć polimeryzować po dodaniu do prekursora żelu. Dlatego ważne jest jak najszybsze przejście do następnego kroku. - Delikatnie wymieszaj, łącząc pipetowanie z mieszaniem. Żel wykazuje właściwości pseudoplastyczne (shear thinning), więc będzie łatwiejszy do wymieszania przy delikatnym pipetowaniu/mieszaniu. Po dokładnym wymieszaniu dodaj 100 μL do każdego dołka płytki 96-dołkowej lub 200 μL do każdego insertu do hodowli komórkowej.
UWAGA: Podczas mieszania korzystne może być zastosowanie pipetowania odwrotnego za pomocą pipety P1000 ustawionej na 200 μL, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza. Żel może być początkowo trudny do wymieszania, ale przy kontynuowaniu procesu powinno stać się to łatwiejsze – świadczy to o wydajnym mieszaniu. - Inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 i wysokiej wilgotności.
UWAGA: Ten krok nie jest konieczny, jeśli żel peptydowy nie zawiera dodatków macierzy. - Dodaj 200 μL medium do każdego dołka płytki 96-dołkowej lub 1 mL na zewnątrz insertu do hodowli komórkowej, dodając kilka kropel na wierzch żelu. Inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 i wysokiej wilgotności.
- Wymień medium dwukrotnie w ciągu następnej godziny, a następnie ponownie po kilku godzinach (lub następnego dnia).
UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ żele będą niestabilne przez kilka godzin. - Wymieniaj medium co 2–3 dni (lub zgodnie ze standardowym protokołem hodowli dla stosowanych komórek).
6. Pośrednia kokultura
UWAGA: Metoda ta ma zastosowanie wyłącznie w przypadkach, gdy żele peptydowe są osadzane w insertach do płytek 24-dołkowych lub w podobnych formatach, w których żel może być wsparty nad monowarstwą komórek. Pośrednią ko-kulturę można w tym przypadku wprowadzić poprzez przygotowanie 2D warstwy komórek karmicielskich na dnie płytki wielodołkowej.
- Przygotować płytkę 24-dołkową do wysiewu. Powinna być to płytka oddzielna od tej z żelami peptydowymi, ale tej samej marki, aby zapewnić kompatybilność z używanymi wkładkami (patrz krok 5.2).
- Obliczyć gęstość komórek niezbędną do wysiewu w pośredniej kokulturze, zgodnie z rozważanym typem komórek.
UWAGA: Gęstość wysiewu komórek powinna być zoptymalizowana dla każdej nowej rozważanej linii komórkowej. Komórki należy wysiać tak, aby uzyskać konfluencję na poziomie około 30–50%. Na przykład ludzka linia fibroblastów gruczołu mlekowego HMFU19 jest zazwyczaj wysiewana z gęstością 1-5 x 104 komórek/dołek. - Korzystając ze standardowych metod hodowli/pasażowania stosowanych dla używanych komórek, przygotować zawiesinę komórkową odpowiednią do wysiewu w objętości 1 mL/dołek, używając typowej pożywki wzrostowej dla tych komórek.
- Wysiać zawiesinę komórkową do płytki wielodołkowej w ilości 1 mL na dołek.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i w nawilżonej atmosferze przez kilka godzin lub przez noc, aby komórki przyrosły. Następnie usunąć pożywkę z dołków.
- Za pomocą sterylnej pęsety przenieść wkładki do płytki 24-dołkowej zawierające żele peptydowe do nowych dołków z wcześniej wysianymi komórkami w 2D. Dodać kroplami 1 mL pożywki na zewnątrz wkładki oraz kilka kropel na powierzchnię żelu.
UWAGA: Zazwyczaj pożywka stosowana na tym etapie jest odpowiednia dla komórek enkapsulowanych w żelu, jednak przydatność tej pożywki dla komórek w 2D może wymagać weryfikacji lub optymalizacji dla konkretnego rozważanego eksperymentu. - Regularnie przygotowywać świeże warstwy zasilające, aby uniknąć nadmiernej konfluencji, i przenosić żele peptydowe do tych nowych dołków zgodnie z opisaną powyżej metodą.
UWAGA: Zazwyczaj komórki do pośredniej kokultury przygotowuje się w tym samym czasie, co wysiew żelu peptydowego. Żele peptydowe można następnie przenieść do kokultury w momencie wymiany pożywki po kilku godzinach lub nocnej inkubacji, patrz krok 5.8.
7. Reologia oscylacyjna w skali makro żeli peptydowych
UWAGA: Zgodnie ze standardem, charakterystyka reologiczna jest przeprowadzana 24 h po wysianiu żelu, co powinno odbywać się w insertach do płytek 24-dołkowych.
- Przygotować i skalibrować reometr zgodnie z instrukcjami producenta. Należy zastosować geometrię płyt równoległych o średnicy jak najbliższej średnicy wkładu do hodowli komórkowych.
UWAGA: Jeśli jest to pożądane, testy można przeprowadzać w temperaturze 37 °C, aby odtworzyć warunki panujące podczas hodowli. - Wyjąć pierwszą do przetestowania próbkę żelu peptydowego z wkładu do hodowli komórkowych, odwracając wkład i wycinając plastikową membranę za pomocą skalpela.
UWAGA: Należy dopilnować, aby płytka zawierająca żele peptydowe znajdowała się poza inkubatorem do hodowli komórkowych jak najkrócej przed rozpoczęciem testów. Pożywki z wodorowęglanowym systemem buforującym wymagają obecności CO2 do utrzymania pH. Żele, które zbyt długo pozostawały poza inkubatorem, wykażą dryft pH, co może wpłynąć na ocenę reologiczną. Aby zapobiec temu efektowi, korzystne może być utrzymanie żeli w pożywce z dodatkiem 10 mM HEPES. - Ostrożnie przenieść żel na płytę reometru. Następnie, używając skalpela, przyciąć wysokość żelu do około 1 mm, aby zminimalizować odkształcenie żelu podczas dociskania go płytą reometru.
UWAGA: Podczas używania skalpela należy uważać, aby nie dotknąć ani nie uszkodzić płyty reometru. - Ustawić odstęp między płytami równoległymi na 1 mm. Odciąć nadmiar żelu, który nie jest przykryty płytami reometru.
- Uruchomić wybrane ustawienia testu na reometrze, zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: W przypadku każdego nowego stanu próbki zaleca się przeprowadzenie skanowania amplitudy w zakresie od 0,1–100% odkształcenia, aby upewnić się, że wszystkie testy są wykonywane przy poziomie odkształcenia mieszczącym się w liniowym obszarze lepkosprężystym próbki.
8. Barwienie żywotności (live/dead) komórek enkapsulowanych
- Usunąć medium z dołków i dwukrotnie przemyć żele peptydowe 1x PBS, stosując tę samą technikę co przy wymianie medium (krok 5.7).
- Usunąć żele peptydowe hodowane w insertach do płytki 24-dołkowej zgodnie z krokiem 7.2. Przechowywać żele w 1x PBS w oryginalnej płytce do momentu barwienia.
UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ żele mogą być na tym etapie kruche, zwłaszcza po długotrwałej hodowli. - Przygotować roztwór do barwienia żywe/martwe, przewidując 500 μL barwnika na jeden insert do płytki 24-dołkowej lub 50 μL na dołek płytki 96-dołkowej. Typowy skład barwnika to 4 μM etydyny homodimeru i 2 μM kalceiny AM w 1x PBS. Powstały roztwór chronić przed światłem.
UWAGA: Stężenia odczynników do barwienia żywe/martwe mogą wymagać dalszej optymalizacji w zależności od zastosowanego typu komórek i dostawcy odczynników. - Ostrożnie usunąć PBS z każdego żelu i zastąpić go kilkoma kroplami roztworu barwiącego, upewniając się, że każdy żel jest całkowicie przykryty.
- Inkubować żele w roztworze barwiącym w ciemności przez 10–15 min, a następnie przeprowadzić wizualizację za pomocą mikroskopu konfokalnego/fluorescencyjnego.
UWAGA: W celu uzyskania obrazów wyższej jakości korzystne może być przeniesienie żeli do naczyń z dnem szklanym o grubości lamelli.
9. Fixowanie żeli peptydowych do obrazowania końcowego
- Przemyj żele peptydowe zgodnie z krokiem 8.1.
- Dodaj 4% paraformaldehyd (PFA) w 1x PBS: 100 μL do każdego dołka płytki 96-dołkowej oraz 1 mL do każdego żelu w wkładce do płytki 24-dołkowej (kilka kropel należy nanieść na wierzch żelu wewnątrz wkładki).
UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest silnie toksyczny i łatwo wchłania się przez skórę. Jest niezwykle niszczący dla skóry, oczu, błon śluzowych i górnych dróg oddechowych. PFA należy stosować w dygestorium, a użytkownicy powinni nosić odzież ochronną i rękawice. W zależności od końcowego zastosowania można w ten sam sposób użyć alternatywnych utrwalaczy chemicznych. - Inkubuj żele peptydowe w utrwalaczu PFA przez 1 h w temperaturze pokojowej.
- Usuń utrwalacz PFA i przemyj żele peptydowe dwukrotnie 1x PBS.
UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół; utrwalone żele peptydowe należy przechowywać w 4 °C w 1x PBS do 4 tygodni, upewniając się, że płytka jest szczelnie zamknięta folią parafilmową.
10. Zatapianie żeli peptydowych do sekcjonowania
UWAGA: Osadzanie żeli peptydowych w 4% agarozie jest kluczowym krokiem przed zatopieniem w parafinie do celów immunohistochemii. Alternatywnie żele można osadzić w 2% agarozie i kroić za pomocą wibratomu (zazwyczaj dobre wyniki dają skrawki o grubości 500 μm). Jest to krok opcjonalny, pozwalający na uzyskanie uwodnionych skrawków żelu, co może być korzystne przy barwieniu lokalizacji macierzy pozakomórkowej w żelu, zgodnie z metodami opisanymi w sekcji 11.
- Przygotować stopiony 2% lub 4% roztwór agaru w 1x PBS (patrz powyższa uwaga), gotując go w kuchence mikrofalowej. Przed użyciem odstawić do wystygnięcia na kilka minut.
UWAGA: Stopiony agar stanowi zagrożenie termiczne – należy z nim obchodzić się ostrożnie, stosując ochronę rąk i twarzy. Po przygotowaniu roztwór agaru można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. - Usunąć żel peptydowy z insertu do hodowli komórkowej zgodnie z krokiem 7.2.
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura pokryć dno formy do zatapiania histologicznego cienką warstwą roztworu agaru. Pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 20 °C przez kilka sekund.
- Za pomocą szpatułki umieścić żel peptydowy w centrum agaru. Następnie całkowicie przykryć żel peptydowy agarem.
UWAGA: Żel nie powinien zatonąć w agarze. Jeśli tak się stanie, należy usunąć żel, odczekać kilka sekund, aż agar bardziej stężeje, i spróbować ponownie. Należy unikać zbyt silnego stężenia, aby uniknąć słabego połączenia między dwiema warstwami. - Pozostawić zatopiony żel do ostygnięcia na 1 h w temperaturze 4 °C przed wyjęciem z formy histologicznej.
UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać; zatopione żele można przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez maksymalnie 4 tygodnie. - Jeśli planowane jest przeprowadzenie immunohistochemii, umieścić zatopione żele w procesorze do tkanek i kontynuować zgodnie ze standardowymi metodami laboratoryjnymi.
UWAGA: Alternatywnie, zatopione żele można pociąć na nawodnione sekcje przy użyciu wibratomu. Nawodnione sekcje należy przechowywać w szczelnych płytkach w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez maksymalnie 4 tygodnie.
11. Barwienie komórek w żelach z wykorzystaniem immunocytochemii
- Usunąć 1x PBS pokrywający żele peptydowe/sekcje żelu. Usunąć wszystkie żele wciąż znajdujące się w insertach płytek 24-dołkowych po wykonaniu kroku 7.2.
- Przykryć żele/sekcje żelu buforem blokującym i inkubować przez 30 min w temperaturze 20 °C.
UWAGA: Typowy bufor blokujący składa się z 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS z dodatkiem 0,1% Triton X-100. Triton X-100 jest toksyczny, powoduje poważne uszkodzenia oczu, podrażnienia skóry i jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych. Użytkownicy powinni nosić odzież ochronną, ochronę oczu i rękawice. - Przygotować przeciwciała pierwotne w buforze blokującym w zoptymalizowanych stężeniach roboczych. Przeznaczyć 200 μL na żel w płytce 24-dołkowej, 100 μL na sekcję żelu oraz 50 μL na dołek płytki 96-dołkowej.
UWAGA: Zazwyczaj stężenia przeciwciał stosowane do barwienia 3D w żelach powinny być dwukrotnie wyższe niż stężenia stosowane w 2D. - Usunąć bufor blokujący i dodać kroplami roztwór przeciwciał do żeli.
- Uszczelnić płytkę folią parafinową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć dwukrotnie buforem blokującym.
- Dodać przeciwciało wtórne, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 11.3 i 11.4.
- Inkubować w ciemności przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3 godziny w temperaturze 20 °C.
- Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć dwukrotnie 1x PBS.
- Przykryć próbki roztworem DAPI w rozcieńczeniu 1:1 000 i inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 1 h.
- Przenieść żel na szklaną lamellkę i obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej/konfokalnej.
12. Izolacja RNA
UWAGA: Objętości zastosowane w tej metodzie odnoszą się do sytuacji, gdy żele peptydowe są wysiewane do wkładów do płytek 24-dołkowych. Można stosować inne formaty żeli, dostosowując odpowiednio objętości.
- Usunąć medium z dołków i przemyć żele peptydowe dwukrotnie roztworem 1x PBS, stosując tę samą technikę, co przy wymianie medium (krok 5.7).
- Usunąć żele peptydowe hodowane w insertach płytki 24-dołkowej zgodnie z krokiem 7.2. Umieścić każdy żel w oddzielnej probówce wirówkowej o pojemności 15 mL.
UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ na tym etapie żele mogą być kruche, szczególnie po długotrwałej hodowli. - Za pomocą pipety P1000 dodać 500 μL Trypsin-EDTA (0.25%) do każdej probówki, a następnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania i rozbicia żelu.
- Inkubować żele w Trypsin-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.
UWAGA: Czas inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od zastosowanego typu komórek. - Dodać 5 mL 1x PBS, aby rozcieńczyć Trypsin-EDTA.
- Wirować przy 200 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek.
- Usunąć nadsącz.
UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ między osadem komórkowym a nadsączem mogła wytworzyć się warstwa żelu. - Resuspendować osad komórkowy w buforze lizującym zgodnie z instrukcjami producenta i postępować zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji RNA.
Wyniki
Opisana tutaj metoda wytwarzania żelu peptydowego pozwala użytkownikowi na zdefiniowanie i stworzenie spersonalizowanego środowiska hodowli 3D. Podczas gdy środowisko mechaniczne jest determinowane przede wszystkim przez stężenie peptydów, można również dodać interesujące składniki macierzy w kontrolowanych gęstościach, co pokazano w obliczeniach przykładowych na Rysunku 1. W swojej najprostszej formie protokół żelu peptydowego dostarcza metody inkapsulacji komórek w środowisku 3D pozbawionym macierzy. Rysunek 2 pokazuje, jak podejście to można połączyć z szeroką gamą modeli nowotworowych, w tym z liniami komórek nowotworowych znakowanych fluorescencyjnie (Rysunek 2A) oraz materiałem z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) (Rysunek 2B,C). Co istotne, zarówno linie komórkowe, jak i materiał PDX mogą być hodowane w żelach w warunkach bezsurowiczych (Rysunek 2C,D), co zapewnia system hodowli 3D o w pełni zdefiniowanym składzie.
Ponieważ sam peptyd nie zawiera żadnych motywów wiążących komórki, enkapsulowane komórki w niemodyfikowanych żelach peptydowych zazwyczaj wykazują zaokrągloną morfologię. Rycina 3A obrazuje to na przykładzie ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego w żelu peptydowym o stężeniu 6 mg/mL, w porównaniu z ich klasyczną wydłużoną morfologią obserwowaną w czystym Matrigelu oraz czystym żelu kolagenowym. Co istotne, protokół przygotowania żelu peptydowego umożliwia włączenie interesujących badacza komponentów macierzy. Rycina 3A pokazuje, jak dodanie 200 μg/mL kolagenu I może przywrócić wydłużoną morfologię fibroblastów w żelach peptydowych.
Dodatki macierzy mogą również wspierać wzrost i organizację innych typów komórek, na przykład MCF10A, co pokazano na rycinie 3B. W tym przypadku dodanie 100 μg/mL kolagenu I do żelu peptydowego o stężeniu 6 mg/mL umożliwia uformowanie struktur acynarnych do 7. dnia. Dalszą złożoność można wprowadzić poprzez włączenie wspierającej warstwy komórek w pośredniej kokulturze. Rycina 3C demonstruje, w jaki sposób połączone podejście polegające na włączeniu macierzy i pośredniej kokulturze z ludzkimi fibroblastami gruczołu piersiowego może usprawnić wzrost i organizację komórek MCF10A.
Kolejnym ważnym parametrem jest stężenie peptydów wykorzystywanych do wytwarzania żelu peptydowego. Rycina 4A przedstawia przykład tego, jak kontrolowanie stężenia peptydów, w tym przypadku w zakresie od 4 do 10 mg/mL, skutkuje uzyskaniem sztywności w przedziale od setek do tysięcy Pa. Żele te mogą być wytwarzane bez dodatków macierzy lub z dodatkami macierzy, co pozwala na jednoczesną kontrolę zarówno sztywności, jak i składu. Żele peptydowe z dodatkami macierzy można poddać sekcjonowaniu i barwieniu, aby zwizualizować rozkład tych dodatków. Rycina 4B, C przedstawia dwa podejścia do realizacji tego procesu: zatopienie w 4% agarze, a następnie standardowe opracowanie tkanki i zatopienie w parafinie do immunohistochemii (Rycina 4B) lub zatopienie w 2% agarze, a następnie sekcjonowanie w wibrotomie i barwienie fluorescencyjne (Rycina 4C).
Podczas modyfikowania składu żeli peptydowych kluczowe jest upewnienie się, że zmiany te nie wpływają na środowisko mechaniczne początkowo prezentowane komórkom. Rycina 4D demonstruje, w jaki sposób modyfikacje stężenia peptydów mogą być wykorzystane do zniwelowania wszelkich zmian sztywności żelu peptydowego wynikających z inkorporacji macierzy. Pomiary reologii oscylacyjnej żelu w celu określenia jego sztywności (moduł zachowawczy, G’) pozwalają następnie rozróżnić wpływ składu żelu i jego sztywności na morfologię komórek. Jak pokazano na obrazach w świetle przechodzącym, komórki MDA MB 231 wykazują wydłużoną morfologię po dodaniu kolagenu do żeli peptydowych o stężeniu 10 mg/mL lub 15 mg/mL. Rycina 4E pokazuje, że te wydłużone komórki wykazują pozytywne barwienie na pFAK, co wskazuje na interakcję z otaczającą je macierzą. Początkowo wolne od macierzy środowisko żeli peptydowych sprawia, że stanowią one również idealną platformę do badania syntezy komórkowej i odkładania interesujących komponentów macierzy. Rycina 4F przedstawia lokalne odkładanie kolagenu I przez komórki MCF7 enkapsulowane w żelach peptydowych o stężeniu 10 mg/mL.
Jedną z głównych zalet żeli peptydowych jest łatwość, z jaką do ich analizy można zastosować standardowe metody laboratoryjne. Materiał można wyekstrahować do analizy qRT-PCR w celu określenia profili ekspresji genów (jak pokazano w naszej niedawnej publikacji5). Obrazowanie za pomocą mikroskopii w polu jasnym umożliwia dodatkowo wizualizację wzrostu komórek w czasie rzeczywistym. Rycina 5 przedstawia niektóre z typowych problemów, które mogą wystąpić w przypadku nieudanych żeli peptydowych: niepełne wymieszanie prekursora żelu (Rycina 5A,B); nieprawidłowa optymalizacja stężenia peptydów (Rycina 5C,D) lub gęstości zasiewu (Rycina 5E,F); oraz nieprawidłowa neutralizacja kwasowego kolagenu przed włączeniem go do żeli peptydowych (Rycina 5G,H). W szczególności stężenie peptydów i gęstość zasiewu muszą zostać zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej i źródła peptydów, aby zapewnić, że środowisko hodowlane jest odpowiednio zdefiniowane i reprezentatywne dla badanego zastosowania.
Rycina 1: Przykład obliczeń składu macierzy i gęstości wysiewu.Ten przykładowy schemat opisuje procedurę, którą należy zastosować w celu wysiania dwóch prekursorów żelu peptydowego z dodatkiem 100 µg/mL kolagenu, przy końcowej gęstości komórek 1 x 105 komórek/mL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Bezmacierzowe żele peptydowe stanowią odpowiednią platformę do hodowli 3D dla linii komórkowych i modeli nowotworowych pochodzących od pacjentów.(A) Linie komórkowe raka jelita grubego HCT116 i raka piersi MCF7, konstytutywnie wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych odpowiednio mCherry i tdTomato, tworzą skupiska komórek w żelach 6 mg/mL do 9 dnia (lewo) i mogą być obrazowane na żywo przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (prawo, pasek skali 50 µm); (B) Komórki ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) od pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi (BR8) tworzą skupiska komórek do 7 dnia w żelach peptydowych 10 mg/mL; (C) Komórki PDX z guzów piersi dodatnich pod kątem receptora estrogenowego (BB3RC31) mogą być hodowane w warunkach bezsurowiczych18, przedstawione wraz z kontrolą w postaci macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) przy analogicznym numerze pasażu w celu porównania; (D) Komórki raka piersi MCF7 są żywotne w żelach peptydowych 6 mg/mL w warunkach bezmacierzowych i bezsurowiczych, co oceniono za pomocą testu żywotności/śmierci komórek (LIVE/DEAD) w 7 dniu. KSR = zamiennik surowicy (knockout serum replacement), medium MS = medium do hodowli mammosfer19. Pasek skali 100 µm, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Złożoność żelu peptydowego może zostać zwiększona poprzez wprowadzenie dodatków macierzy oraz kokulturę.(A) Ludzka linia komórkowa fibroblastów gruczołu piersiowego HMFU19 wymaga dodatku kolagenu w celu przywrócenia wydłużonej morfologii w żelu peptydowym o stężeniu 6 mg/mL; dla porównania pokazano czystą macierz błony podstawnej (np. Matrigel) oraz żel z kolagenu I z ogona szczura o stężeniu 1,5 mg/mL, pasek skali 50 µm; (B) normalne komórki piersi MCF10A tworzą struktury acinarne do 7. dnia w żelach peptydowych o stężeniu 6 mg/mL po dodaniu 100 µg/mL ludzkiego kolagenu I, pasek skali 100 µm; (C) połączony dodatek składników macierzy: fibronektyny/HA (kwas hialuronowy, masa cząsteczkowa 804 kDa) oraz komórek HMFU19 w pośredniej kokulturze zwiększa rozmiar i organizację acini MCF10A w żelach peptydowych o stężeniu 10 mg/mL, co oceniono za pomocą barwienia na rozszczepioną kaspazę 3, pasek skali 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Żele peptydowe umożliwiają niezależną kontrolę sztywności i składu oraz ocenę macierzy odłożonej przez komórki.(A) Pomiary reologii objętościowej wykazujące typowy zakres sztywności (moduł zachowawczy, G’) osiągalny poprzez kontrolę stężenia peptydów, * oznacza p < 0,05; (B) Immunohistochemia wykazująca barwienie 150 µg/mL kolagenu I w żelu peptydowym 10 mg/mL z enkapsulowanymi komórkami MCF7 (dzień 7, pasek skali 100 µm); (C) Immunofluorescencja rozkładu kolagenu I w żelu peptydowym 6 mg/mL z 200 µg/mL ludzkiego kolagenu I, wykonana poprzez zatopienie w agarze i cięcie w wibratomie, pasek skali 25 µm; (D) Dodatek 200 µg/mL kolagenu I powoduje niewielki spadek modułu zachowawczego G’ żeli peptydowych 10 mg/mL (reologia oscylacyjna objętościowa), co jest kompensowane przez zwiększenie stężenia peptydów do 15 mg/mL. W każdym wariancie pokazano komórki potrójnie ujemnego raka piersi MDA MB 231 (dzień 7, pasek skali 50 µm); (E) Komórki MDA MB 231 w żelach peptydowych 15 mg/mL z 200 µg/mL ludzkiego kolagenu I wykazują wydłużenie i interakcję z macierzą, co obrazuje barwienie pFAK (dzień 14, pasek skali 50 µm); (F) Barwienie in situ odkładania kolagenu I przez komórki MCF7 w początkowo pozbawionym macierzy żelu peptydowym 10 mg/mL (dzień 10, pasek skali 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Typowe problemy podczas przygotowywania żeli peptydowych można rozwiązać za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Przedstawione komórki to prawidłowe komórki nabłonka piersi MCF10A w dniu 7, chyba że zaznaczono inaczej. (A) Prawidłowo wymieszany prekursor żelu powinien być optycznie przejrzysty i jednorodny, podczas gdy (B) niewystarczające mieszanie/neutralizacja mogą powodować widoczne niejednorodności/smugi w żelu peptydowym (białe strzałki); (C) komórki MCF10A tworzą struktury acynarne w żelach peptydowych o stężeniu 6 mg/mL po dodaniu pośredniej kokultury HMFU19, jednak (D) przy stężeniu 15 mg/mL stężenie peptydów jest zbyt wysokie, aby umożliwić tworzenie acinusów; (E) komórki MCF10A wysiane w gęstości 5 x 105 cells/mL tworzą struktury acynarne w żelach 6 mg/mL po dodaniu 100 μg/mL kolagenu I, natomiast (F) przy 2 x 105 cells/mL gęstość komórek jest zbyt niska, aby umożliwić tworzenie acinusów; (G) dodatek kolagenu może prowadzić do powstania dużych skupisk komórek do 14 dnia, jednak (H) nieprawidłowe dodanie (zbyt wczesna neutralizacja kolagenu w procesie) może zapobiec wzrostowi skupisk. Pasek skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Odkryliśmy, że opisane tutaj żele peptydowe są prostym, opłacalnym i elastycznym rozwiązaniem wspierającym hodowlę 3D wielu typów komórek. Zapewniając pełną kontrolę nad stężeniem zastosowanego peptydu oraz wykonanymi dodatkami białkowymi lub glikanowymi, metoda ta pozwala na staranne dopasowanie żeli peptydowych do ich zastosowania.
Zasadniczą przewagą żeli peptydowych nad istniejącymi metodami jest to, że skład matrycy i właściwości mechaniczne mogą być kontrolowane niezależnie, przy użyciu prostej metody, która nie wymaga żadnych skomplikowanych procedur chemicznych. Właściwości mechaniczne żelu peptydowego zależą przede wszystkim od stężenia peptydu w początkowym prekursorze żelu. Późniejsze dodawanie komórek i/lub komponentów macierzy pozwala na stworzenie w pełni zdefiniowanego przez użytkownika środowiska in vitro. Chociaż dodatki do matrycy mogą zmieniać początkowe właściwości mechaniczne żelu, można to łatwo zniwelować przez niezależną zmianę stężenia peptydów5. Daje to wymierną przewagę nad istniejącymi systemami, np. żelami kolagenowymi, w których parametry kontrolujące sztywność często skutkują również zmianą motywów wiążących integryny20,21.
Wykazaliśmy zastosowanie żelu peptydowego do hodowli in vitro linii komórek nowotworowych i materiału pochodzącego od pacjenta5. Zakres sztywności dostępny za pomocą żelu peptydowego (w zakresie od 100 s do 1000 s Pa) jest idealnie dostosowany do replikacji normalnych środowisk i środowisk macierzy nowotworowej w tkankach miękkich, takich jak piersi. Zdajemy sobie jednak sprawę, że inne zastosowania wymagają znacznie sztywniejszych środowisk, np. w zakresie 10–20 kPa do regeneracji kości. Dalsza modyfikacja przedstawionego tutaj protokołu byłaby wymagana w celu rozszerzenia osiągalnej sztywności do tego zakresu, który jest bardziej typowy dla alternatywnych podejść, takich jak żele alginianowe22. Podobnie tutaj opisaliśmy prostą metodę funkcjonalizacji poprzez fizyczne uwięzienie białek macierzy / glikanów w żelu peptydowym. W przypadku opisanych tutaj zastosowań podejście to sprawdza się dobrze i jest łatwo adaptowane do użytku przez grupy niespecjalistyczne, które chcą korzystać z modeli 3D chorób in vitro. Podobnie jak wiele innych hydrożeli11, zastosowany tutaj peptyd może zostać rozszerzony o wiązanie komórek lub inne motywy biologiczne i w przypadku niektórych zastosowań takie podejście może być preferowane.
Zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych punktów, które wymagają szczególnej uwagi, aby zapewnić sukces. Tworzenie prekursora żelu jest krytycznym etapem pośrednim, który umożliwia użytkownikowi sprawdzenie, czy zastosowane warunki są prawidłowe przed włączeniem komórek. Prekursor ten może być przechowywany przez kilka tygodni (w temperaturze 4 °C), ale przed użyciem musi być inkubowany w temperaturze 80 °C, a następnie w temperaturze 37 °C. Odpowiedni prekursor będzie całkowicie płynny w temperaturze 80 °C i samonośny w temperaturze 37 °C. Kontrole te są niezbędne, aby upewnić się, że żelowanie będzie przebiegać prawidłowo. Komórki i/lub macierz mogą być następnie włączone w warunkach fizjologicznych.
Laboratoria już korzystające z matryc 3D będą zaznajomione z ostrożnym obchodzeniem się z komórkami w żelach peptydowych. Należy zachować ostrożność w celu ograniczenia mieszania komórek przed i w trakcie etapów kapsułkowania. Odkryliśmy, że określone typy komórek są w różny sposób podatne na uszkodzenia podczas tego procesu i musi to zostać dokładnie ocenione przez użytkownika. Opisane tutaj stężenia żelu peptydowego pozwalają na przebieg żelowania w czasie, który w przypadku wspomnianych komórek pozwala na zamknięcie komórek przed opadnięciem na dno odlewu, ale na tyle wolno, aby nie zostały uszkodzone przez ten proces. Należy jednak zauważyć, że niektóre wrażliwe typy komórek mogą wymagać szybszej neutralizacji, aby uniknąć długotrwałego narażenia na podwyższone pH. W takim przypadku korzystne może być dodanie 10 mM HEPES do podłoża otaczającego żel peptydowy.
Przyjmując metodę opisaną w tym protokole, bardzo ważne jest, aby dokładnie rozważyć jakość źródła peptydów. Peptyd nie jest używany jako funkcjonalny motyw lub powłoka, ale jest tutaj całością nierozpuszczalnej części hydrożelu. W związku z tym wszelkie zanieczyszczenia lub zmiany w strukturze peptydów mogą mieć znaczący wpływ na integralność lub zdolność do wspierania żywotności komórek w końcowym hydrożelu. Przy przechodzeniu do nowej partii peptydu należy zadbać o dobrą konsystencję między partiami od dostawcy, a także sprawdzić zachowanie peptydu podczas tworzenia prekursora żelu.
Podsumowując, protokół ten opisuje system hodowli 3D z kluczowym naciskiem na niezależną kontrolę właściwości mechanicznych i biologicznych. Prostota i zdolność adaptacji metody sprawia, że nadaje się ona do przyjęcia przez każde laboratorium hodowli komórkowych oraz do szerokiego zakresu zastosowań5. W przyszłości protokół ten może zostać rozszerzony, aby umożliwić kowalencyjną modyfikację sekwencji peptydowej. Można to połączyć z zaawansowanymi metodami mikroskopowymi w celu zbadania sił rozciągających wywieranych przez komórki na otaczającą je matrycę. Kluczowe znaczenie ma jednak umiejętność rozróżnienia między matrycą sztucznie wbudowaną a macierzą zsyntetyzowaną przez same zamknięte komórki. Ta zdolność do kontrolowania i monitorowania zmian w matrycy w czasie pozwoli na bezprecedensowy wgląd w rolę interakcji komórka-matryca w rozwoju nowotworów i innych chorób.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za dofinansowanie z Krajowego Centrum Wymiany, Udoskonalenia i Redukcji Zwierząt w Badaniach NC/N0015831/1 dla JCA, GF i CLRM, NC/T001267/1 dla RBC, CLRM, JCA, KL-S i KS, NC/T001259/1 dla JCA, KL-S i CLRM oraz NC/P002285/1 dla AMG, SJ i CLRM. Również finansowanie z Rady ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych EP/R035563/1 dla KL-S i CLRM oraz EP/N006615/1 dla JLT i CLRM. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu grafiki zaadaptowanej z Servier Medical Art. Servier Medical Art firmy Servier jest dostępny na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa 3.0 Unported.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gel fabrication - Odczynniki | |||
| FEFEFKFK | Pepceuticals | n/a | Polipeptyd; dostępny u różnych dostawców. Pepceuticals jest naszym rekomendowanym dostawcą ze względu na jakość produktu. |
| PBS 10X | Gibco | 70011-036 | |
| Wodorotlenek sodu (1 M) | Sigma-Aldrich | S2770 | NaOH; rozcieńczyć do 0,5 M przed użyciem |
| Woda | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Gel produkcja - Sprzęt i materiały eksploatacyjne | |||
| 15 mL probówki sokoła | Greiner | 188261 | Jeśli używasz innej marki, upewnij się, że materiał wytrzymuje temperatury do 90 stopni C |
| 24-dołkowa płytka | Corning Costar | 3524 | Alternatywne marki/dostawcy mogą być używane, o ile istnieje przerwa między podstawą wkładki a powierzchnią płytki |
| Wirówka | Dowolna | 200 x g przez 3 minuty | |
| Komora bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy II | Dowolna | ||
| Precyzyjna równowaga | Dowolna Dokładność | odczytu 0,1 mg | |
| Wkładka wisząca do płytki 24-dołkowej | Millipore | MCRP24H48 | Można stosować alternatywne marki/dostawców, o ile istnieje szczelina między podstawą wkładki a powierzchnią płytki |
| Inkubator | Dowolna | 37° C, 5% CO2, wilgotne środowisko | |
| Piekarnik | Dowolny | ustawiony na 80° Pipeta C | |
| P1000/200/20/10 | Dowolna | Istotne jest, aby pipety używane do zabiegu były skalibrowane | |
| Końcówki P1000/200/20/10 | Dowolna | ||
| pH-metr z mikrosondą | Dowolna | ||
| szpatułka | Dowolna | ||
| Dodatek do matrycy | |||
| Kolagenu I (ludzkiego) | 07005 | ||
| Kolagen I (ogon szczura) | Gibco | A10483 | |
| fibronektyny | 07159 | ||
| Kwas hialuronowy | Iduron | HA804 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Enkapsulacja komórek/hodowla | |||
| B27 Suplement (bez kwasu retinowego) | Gibco | 12587010 | Dodatki pożywek do kultur bezsurowicowych (Ryc. 2D) |
| Toksyna | Sigma-Aldrich | C-8052 | Dodatki do mediów dla ogniw MCF10A (Rysunek 3, 5) |
| DMEM | Gibco | 21969-035 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | Dodatki do mediów dla komórek MCF10A (Rysunek 3, 5) |
| DMEM/F12 Phenol Red Free | Gibco | 21041-025 | Dodatki pożywki do kultur bezsurowicowych (Rysunek 2D) |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| EGF | ŹródłoNauki biologiczne | ABC016 | Dodatki do pożywek dla komórek MCF10A (Ryc. 3, 5) |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10500-064 | |
| Surowica dla koni | Gibco | 26050-070 | Dodatki do pożywek dla komórek MCF10A (Ryc. 3, 5) |
| człowieka/linie komórkowe nabłonka | np. MCF7/tdPomidor MCF7/MCF10a/HCT116-mWiśnia | ||
| Ludzkie fibroblasty | np. HMFU19 | ||
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H-0888 | Dodatki do pożywek dla komórek MCF10A (Ryc. 3, 5) |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | Dodatki do pożywki dla komórek MCF10A (Rycina 3, 5) |
| Wymiana surowicy nokautującej | Gibco | 10828-028 | Dodatki pożywki do kultur bezsurowicowych (Rysunek 2D) |
| L-glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| RPMI | Gibco | 21875-034 | |
| RPMI Phenol Red Free | Sigma-Aldrich | R7509 | |
| Obrazowanie i inne testy | |||
| 4% paraformaldehydu | Polysciences | 18814 | |
| Agar | SLS | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | 5482 | |
| Mikroskop konfokalny i/lub fluorescencyjny | Dowolny | , np. konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica TCS SPE (Ryciny 2-4) | |
| Roztwór DAPI | Invitrogen | D3571 | 300 uM roztwór |
| roboczy DPX medium montażowe | ThermoFisher Scientific | ||
| Szkiełka nakrywkowe do szkła | Dowolne | szkiełka nakrywkowe No1 o grubości 0,13 - 0,17 mm | |
| Naczynia ze szklanym dnem | MatTek | ||
| Goat Anti-Rabbit IgG H& L (polimer HRP) | Abcam | ab214880 | |
| Hematoksylina i Eozyna | Dowolne | ||
| formy histologiczne (jednorazowe, plastikowe) | Dowolne | ||
| oprogramowanie do analizy obrazu | ImageJ | ||
| Zestaw do oznaczania żywych/martwych | zwierząt Invitrogen | L3224 | |
| Mikrotom | Dowolne | ||
| falloidyny | F432/R415 | ||
| Zestaw do wykrywania peroksydazy przebijającej IHC | ThermoFisher Scientific | 36000 | |
| Pierwotna kaspaza ab 3 | abcam | ab34710 | Pokazane w Rysunek 3C |
| Primary Ab Collagen I | Cell Signalling Technology | 9661 | Pokazane w Rysunek 4B, C, F |
| Primary Ab pFAK Tyr 397 | ThermoFisher Scientific | 44-624G | Pokazane na Rysunek 4E |
| Prolong złoto-diamentowy anty-blaknięcie z | sondami molekularnymi DAPI | S36939 | |
| Reometr Physica MCR 301 | Skalpel Anton Paar | ||
| Dowolne | |||
| przeciwciało wtórne Koza anty Królik AF488 | nvitrogen | a11034 | |
| Przeciwciało drugorzędowe Koza przeciwko królikowi AF546 | Invitrogen | a11010 | |
| Prowadnice SuperFrost | Powłoka ThermoFisher Scientific | np. APES, może pomóc w utrzymaniu skrawków mikrotomów na szkiełkach. | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsyna-EDTA (0,25%) | Gibco | ||
| Vibratome | Leica |
Bibliografia
- Hynes, R. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Tian, C., et al. Cancer-cell-derived matrisome proteins promote metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Research. 80 (7), 1461-1474 (2020).
- Hebert, J. D., et al. Proteomic profiling of the ECM of xenograft breast cancer metastases in different organs reveals distinct metastatic niches. Cancer Research. 80 (7), 1475-1485 (2020).
- Vennin, C., et al. CAF hierarchy driven by pancreatic cancer cell p53-status creates a pro-metastatic and chemoresistant environment via perlecan. Nature Communication. 10 (1), 3637(2019).
- Ashworth, J. C., et al. Peptide gels of fully-defined composition and mechanics for probing cell-cell and cell-matrix interactions in vitro. Matrix Biology. 85, 15-33 (2020).
- Toniatti, C., Jones, P., Graham, H., Pagliara, B., Draetta, G. Oncology drug discovery: Planning a turnaround. Cancer Discovery. 4 (4), 397-404 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5, 539-551 (2020).
- Onion, D., et al. 3-Dimensional patient-derived lung cancer assays reveal resistance to standards-of-care promoted by stromal cells but sensitivity to histone deacetylase inhibitors. Molecular Cancer Therapy. 15 (4), 753-763 (2016).
- Saunders, J. H., et al. Individual patient oesophageal cancer 3D models for tailored treatment. Oncotarget. 8 (15), 24224-24236 (2017).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Kühn, S., et al. Cell-instructive multiphasic gel-in-gel materials. Advanced Functional Materials. 30, 1908857(2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Synthesis and characterization of well- defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture. Nature Protocols. 12 (11), 2263-2274 (2017).
- Saiani, A., et al. Self assembly and gelation properties of α-helix versus β-sheet forming peptides. Soft Matter. 5 (1), 193-202 (2008).
- Wan, S., et al. Self-assembling peptide hydrogel for intervertebral disc tissue engineering. Acta Biomaterialia. 46, 29-40 (2016).
- Blache, U., Stevens, M. M., Gentleman, E. Harnessing the secreted extracellular matrix to engineer tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 357-363 (2020).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Barcus, C. E., Keely, P. J., Eliceiri, K. W., Schule, L. A. Stiff collagen matrices increase tumorigenic prolactin signaling in breast cancer cells. Journal of Biological Chemistry. 288, 12722-12732 (2013).
- Bax, D. V., et al. Impact of UV- and carbodiimide-based crosslinking on the Integrin-binding properties of collagen-based materials. Acta Biomaterialia. 100, 280(2019).
- Huang, B. P., et al. Multi-peptide presentation and hydrogel mechanics jointly enhance therapeutic duo-potential of entrapped stromal cells. Biomaterials. 245, 119973(2020).
Przedruki i uprawnienia
