Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nowotworzenie to wieloetapowy proces, w którym komórki nabywają zdolności pozwalające na ich wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się w nieprzyjaznych warunkach. Różne testy mają na celu identyfikację i ilościowe określenie tych cech charakterystycznych komórek rakowych; Jednak często koncentrują się one na jednym aspekcie transformacji komórkowej i w rzeczywistości do ich właściwej charakterystyki wymaganych jest wiele testów. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie naukowcom zestawu narzędzi do oceny przemian komórkowych in vitro z szerokiej perspektywy, a tym samym umożliwienie wyciągnięcia rzetelnych wniosków.
Trwała aktywacja sygnalizacji proliferacyjnej jest główną cechą tkanek nowotworowych i może być łatwo monitorowana w warunkach in vitro, obliczając liczbę podwojeń populacji osiągniętych w czasie. Poza tym wzrost komórek w hodowlach 3D pozwala na ich interakcję z otaczającymi komórkami, przypominając to, co dzieje się in vivo. Umożliwia to ocenę agregacji komórkowej i, wraz z immunofluorescencyjnym znakowaniem charakterystycznych markerów komórkowych, uzyskanie informacji na temat innej istotnej cechy transformacji nowotworowej: utraty prawidłowej organizacji. Inną niezwykłą cechą transformowanych komórek jest ich zdolność do wzrostu bez przyłączania się do innych komórek i do macierzy zewnątrzkomórkowej, którą można ocenić za pomocą testu zakotwiczenia.
Szczegółowe procedury eksperymentalne do oceny tempa wzrostu komórek, przeprowadzania immunofluorescencyjnego znakowania markerów linii komórkowej w hodowlach 3D oraz testowania niezależnego od zakotwiczenia wzrostu komórek w miękkim agarze są zapewnione. Metodologie te są zoptymalizowane pod kątem pierwotnych komórek nabłonka piersi (BPEC) ze względu na ich znaczenie w raku piersi; Jednak po pewnych dostosowaniach procedury można zastosować do innych typów komórek.
Wprowadzenie
Do rozwoju nowotworu wymagane jest wiele następujących po sobie zdarzeń. W 2011 roku Hanahan i Weinberg opisali 10 możliwości, które umożliwiają wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się transformowanych komórek: tak zwane "cechy charakterystyczne raka"1. Opisana tutaj metodologia kompiluje trzy różne narzędzia do oceny transformacji komórkowej in vitro, koncentrując się na niektórych charakterystycznych cechach komórek nowotworowych. Techniki te oceniają tempo proliferacji komórek, zachowanie komórek podczas hodowli w 3D oraz ich zdolność do tworzenia kolonii z niezakotwiczeniem.
Modele komórkowe są kluczowe do t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki ludzkie wykorzystane w poniższych eksperymentach uzyskano podczas zabiegów redukcyjnej plastyki piersi przeprowadzonych w Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) zgodnie ze standardową procedurą zgody. Wszystkie procedury wykonywane są w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II, chyba że wskazano inaczej.
1. Hodowla in vitro ludzkich komórek nabłonka gruczołu piersiowego i tworzenie wykresu krzywej wzrostu
- Hodowla in vitro pierwotnych komórek nabłonkowych piersi (BPECs): pasażowanie komórek
UWAGA: W celu uzyskania i hodowli komórek BPEC należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu uzyskania reprezentatywnych wyników transformacji onkogennej wybrano eksperymentalny model transformacji komórkowej z wprowadzeniem trzech elementów genetycznych do BPEC6,7 (Rysunek 3). Nietransformowane BPEC (N) wyizolowano z wolnej od choroby tkanki piersi zgodnie z opisem Ince i współpracowników6 i hodowano według wskazanego tutaj protokołu. Po przejściu stanu STASIS (starze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokoły eksperymentalne opisane w tym artykule dostarczają użytecznych narzędzi do oceny transformacji onkogennej komórek hodowanych in vitro. Każda technika ocenia określone aspekty procesu transformacji, a co za tym idzie, należy zwrócić szczególną uwagę przy wyciąganiu wniosków z pojedynczej analizy. Tworzenie krzywych wzrostu to podejście, które wymaga informacji już dostępnych podczas hodowli komórek do innych celów. To sprawia, że technika ta jest tańsza i łatwiejsza do zastosowania w porównaniu z innymi testami .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Laboratorium AG jest finansowane przez Hiszpańską Radę Bezpieczeństwa Jądrowego. T.A. i A.G. są członkami grupy badawczej uznanej przez Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT jest beneficjentem kontraktu finansowanego przez Fundację Naukową Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Kontrakt G.F. jest finansowany z grantu Fundacji Cellex.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipety serologiczne 1 ml | Labclinics | PLC91001 | |
| 1,5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Ciemne eppendorfy są preferowane do długotrwałego przechowywania MTT |
| 10 μ l Końcówki do pipet bez filtra | Biologix | 20-0010 | |
| szklana butelka | Z nakrętką, autoklawowalne | ||
| 1000 μ l Końcówki do pipet z filtrem | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ l Końcówki do pipet bez filtra | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Probówki stożkowe | VWR | 525-0400 | |
| Pipety serologiczne 2 ml | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ l Końcówki do pipet z filtrem | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Pipety serologiczne | Labclinics | PLC91005 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | VWR | 525-0304 | |
| Aceton | PanReac AppliChem | 211007 | Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Służy do oznaczania zakotwiczenia |
| Przeciwciało anty-Claudin 4 | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: królik |
| Przeciwciało anty-cytokeratyny 14 [RCK107] | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: mysz |
| Przeciwciało anty-mysie Cyjanina Cy3 | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza |
| Przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza |
| Autoklaw | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Hodowla komórkowa 24-dołkowa płytka | Labclinics | PLC30024 | Używany do kultur 3D w Matrigel. Płaskie dno |
| Hodowla komórkowa 6-dołkowa płytka | Labclinics | PLC30006 | Służy do oznaczania zakotwiczenia |
| Inkubator komórkowy (37 º C i 5 % CO2) | |||
| Sitka do komórek | Fisherbrand | 11587522 | Rozmiar oczek: 40 μ m |
| Oprogramowanie CellSense | Olympus | Służy do akwizycji obrazu | |
| Wirówka | |||
| Toksyna z Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych |
| Klasa II Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Konfokalny mikroskop odwrócony | Leica | TCS SP5 | |
| Okulary nakrywkowe | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, grubość 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinofenyl)-1H -indolo-6-karboksyamidyna | ||
| Płodowa surowica bydlęca | Biowest | S1810 | Służy do inaktywacji działania trypsyny |
| Oprogramowanie Fidżi (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana |
| Szklane pipety | |||
| Szkiełka podstawowe | Fisherbrand | 11844782 | |
| Kozia surowica | Biowest | S2000 | Służy do immunofluorescencji struktur 3D |
| Rękawice | Służy do manipulacji agarem po autoklawie | ||
| Kąpiel grzewcza (37 º C) | Służy do hartowania roztworów przed subkulturą komórkową | ||
| Kąpiel grzewcza (42 º C) | Służy do utrzymywania ciepła agaru | ||
| grzewcza | Służy do odwadniania Matrigel | ||
| Komora | Służy do inkubacji przeciwciał podczas immunofluorescencji | ||
| Lód | Używany podczas manipulacji Matrigelem | ||
| Ice-box | |||
| Olympus | IX71 | ||
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Sklep pod adresem -20 º C i przechowywać w chłodnym miejscu podczas użytkowania. Określany jako matryca membrany podstawnej |
| Metanol | PanReac AppliChem | 131091 | Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym |
| Mikropipety | p1000, p200 i p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Służy do obliczania podwojenia populacji i uzyskiwania równania szybkości wzrostu |
| MiliQ wody | Określany jako ultraczysty lakier | ||
| do paznokci | Służy do uszczelniania próbek po zamontowaniu | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Służy do pokrywania roztworu przeciwciał podczas inkubacji |
| PBS pH 7,4 (bez wapnia i magnezu) | Gibco | 10010-056 | Sterylny. Stosowany do subhodowli komórkowych |
| PBS tabletki | Sigma-Aldrich | P4417 | Rozcieńczyć w wodzie miliQ. Nie jest wymagana sterylność. Używany do immunofluorescencji |
| Pipeta Aid | |||
| Primaria T25 Kolby | Corning | 353808 | Używany do hodowli BPEC |
| Berło Automatyczny licznik komórek | Millipore | PHCC20060 | Alternatywnie użyj hemocytometru |
| Nożyczki | Służy do cięcia końcówek pipet i parafilmu | ||
| Sterylne filtry 0,22 μ m | Milipore | SLGP033RS | Służy do filtrowania roztworu MTT |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromek (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Przechowywać w temperaturze -20 º C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Służy do immunofluorescencji struktur 3D |
| Trypsyna-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Rozcieńczony w PBS w celu uzyskania roztworu 3X |
| Vectashield Antifade Podłoże montażowe | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Używany do pierwotnej hodowli BPEC |
| WIT-T Pożywka hodowlana | Stemgent | 00-0047 | Używana do transformacji kultur BPEC |
Bibliografia
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
