Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61716

⸱

24 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona, 2Optical Microscopy Core Facilities, IDIBELL, 3Hereditary Cancer Program, Catalan Institute of Oncology, IDIBELL, 4Program in Molecular Mechanisms and Experimental Therapy in Oncology (Oncobell), IDIBELL, 5New Therapeutic Strategies in Cancer Group. Department of Biochemistry and Molecular Biomedicine, School of Biology, Institute of Biomedicine, University of Barcelona (IBUB), 6Department of Biochemistry & Physiology, School of Pharmacy and Food Sciences, University of Barcelona, 7Department of Biosciences, Faculty of Sciences and Technology, University of Vic

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Streszczenie

Nowotworzenie to wieloetapowy proces, w którym komórki nabywają zdolności pozwalające na ich wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się w nieprzyjaznych warunkach. Różne testy mają na celu identyfikację i ilościowe określenie tych cech charakterystycznych komórek rakowych; Jednak często koncentrują się one na jednym aspekcie transformacji komórkowej i w rzeczywistości do ich właściwej charakterystyki wymaganych jest wiele testów. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie naukowcom zestawu narzędzi do oceny przemian komórkowych in vitro z szerokiej perspektywy, a tym samym umożliwienie wyciągnięcia rzetelnych wniosków.

Trwała aktywacja sygnalizacji proliferacyjnej jest główną cechą tkanek nowotworowych i może być łatwo monitorowana w warunkach in vitro, obliczając liczbę podwojeń populacji osiągniętych w czasie. Poza tym wzrost komórek w hodowlach 3D pozwala na ich interakcję z otaczającymi komórkami, przypominając to, co dzieje się in vivo. Umożliwia to ocenę agregacji komórkowej i, wraz z immunofluorescencyjnym znakowaniem charakterystycznych markerów komórkowych, uzyskanie informacji na temat innej istotnej cechy transformacji nowotworowej: utraty prawidłowej organizacji. Inną niezwykłą cechą transformowanych komórek jest ich zdolność do wzrostu bez przyłączania się do innych komórek i do macierzy zewnątrzkomórkowej, którą można ocenić za pomocą testu zakotwiczenia.

Szczegółowe procedury eksperymentalne do oceny tempa wzrostu komórek, przeprowadzania immunofluorescencyjnego znakowania markerów linii komórkowej w hodowlach 3D oraz testowania niezależnego od zakotwiczenia wzrostu komórek w miękkim agarze są zapewnione. Metodologie te są zoptymalizowane pod kątem pierwotnych komórek nabłonka piersi (BPEC) ze względu na ich znaczenie w raku piersi; Jednak po pewnych dostosowaniach procedury można zastosować do innych typów komórek.

Wprowadzenie

Do rozwoju nowotworu wymagane jest wiele następujących po sobie zdarzeń. W 2011 roku Hanahan i Weinberg opisali 10 możliwości, które umożliwiają wzrost, przetrwanie i rozprzestrzenianie się transformowanych komórek: tak zwane "cechy charakterystyczne raka"1. Opisana tutaj metodologia kompiluje trzy różne narzędzia do oceny transformacji komórkowej in vitro, koncentrując się na niektórych charakterystycznych cechach komórek nowotworowych. Techniki te oceniają tempo proliferacji komórek, zachowanie komórek podczas hodowli w 3D oraz ich zdolność do tworzenia kolonii z niezakotwiczeniem.

Modele komórkowe są kluczowe do testowania hipotez in vitro. Opracowano różne podejścia do generowania eksperymentalnych modeli transformacji komórkowej na potrzeby badania raka2,3,4. Ponieważ rak piersi jest najczęstszym nowotworem wśród kobiet na całym świecie i jest odpowiedzialny za około 15% zgonów z powodu raka wśród kobiet5, dostarczenie odpowiednich modeli komórkowych komórek nabłonka sutka ma ogromne znaczenie dla dalszych badań. W tym artykule zilustrowaliśmy potencjał trzech technik oceny transformacji komórkowej za pomocą eksperymentalnego modelu transformacji pierwotnych komórek nabłonkowych piersi (BPECs) pierwotnie opisanego przez Ince i współpracowników w 2007 roku6, a następnie wdrożonego w naszym laboratorium7. Ten eksperymentalny model opiera się na sekwencyjnej zmianie trzech docelowych genów (antygenów SV40 Large T i Small T, zwanych tutaj jako Ttag, hTERT i HRAS) w genomie nieprzekształconych BPEC. Co więcej, metoda zastosowana do wyprowadzenia BPEC sprzyja utrzymaniu komórek nabłonka sutka z markerami luminalnymi lub mioepitelialnymi, co skutkuje niejednorodną hodowlą komórek, która zachowuje niektóre cechy fizjologiczne gruczołu sutkowego.

W gruczole sutkowym, komórki nabłonka sutka świetlnego, które są odpowiedzialne za produkcję mleka, znajdują się blisko światła, podczas gdy komórki mioepitelialne są rozmieszczone wokół komórek luminalnych i zajmują się ruchami skurczowymi prowadzącymi mleko do brodawki. Utrata prawidłowej organizacji między tymi liniami komórkowymi jest cechą transformacji nowotworowej8, którą można ocenić in vitro po immunofluorescencyjnym wykryciu charakterystycznych markerów linii w hodowlach komórkowych 3D. Inną ważną cechą komórek nowotworowych jest ich zdolność do wzrostu bez przyłączania się do innych komórek i do macierzy zewnątrzkomórkowej1. Kiedy zdrowe komórki są zmuszone do wzrostu w zawiesinie, aktywowane są mechanizmy takie jak anoikis \u2012 rodzaj śmierci komórki indukowany w odpowiedzi na oderwanie od macierzy zewnątrzkomórkowej \u2012 9. Unikanie śmierci komórki jest jedną z charakterystycznych cech raka, a zatem przekształcone komórki są zdolne do dezaktywacji anoikis i przetrwania w sposób niezależny od kotwicy. Zdolność tę można ocenić in vitro za pomocą testu niezależnego od zakotwiczenia przy użyciu miękkiego agaru. Co więcej, nieodłączną cechą tkanek nowotworowych jest ich trwała proliferacyjna zdolność sygnalizacyjna, którą można łatwo monitorować w warunkach in vitro, mierząc wzrost liczby komórek w czasie, nie tylko w testach zawiesinowych, ale także poprzez monitorowanie tempa wzrostu jednowarstwowych kultur przylegających.

Pomimo tego, że najlepszym modelem do testowania potencjału rakotwórczego jest inokulacja komórek nowotworowych w modelach mysich i ocena rozwoju guza in situ, ważne jest, aby zminimalizować liczbę zwierząt wykorzystywanych w procedurach eksperymentalnych tak bardzo, jak to możliwe. W związku z tym posiadanie odpowiednich testów do oceny przemian in vitro jest najwyższym priorytetem. W tym miejscu udostępniamy zestaw narzędzi do oceny potencjału rakotwórczego częściowo i całkowicie przekształconych komórek nabłonka piersi, które można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów pracujących z modelami transformacji komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki ludzkie wykorzystane w poniższych eksperymentach uzyskano podczas zabiegów redukcyjnej plastyki piersi przeprowadzonych w Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) zgodnie ze standardową procedurą zgody. Wszystkie procedury wykonywane są w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II, chyba że wskazano inaczej.

1. Hodowla in vitro ludzkich komórek nabłonka gruczołu piersiowego i tworzenie wykresu krzywej wzrostu

  1. Hodowla in vitro pierwotnych komórek nabłonkowych piersi (BPECs): pasażowanie komórek
    UWAGA: W celu uzyskania i hodowli komórek BPEC należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi przez Ince et al., 20076.
    1. Przygotowanie pożywki.
      1. Uzupełnić podstawowe zdefiniowane medium WIT suplementami P lub T, dostarczonymi przez producenta, w zależności od tego, czy hodowane są pierwotne, czy przekształcone BPECs.
      2. Do uzupełnionej pożywki WIT należy dodać toksynę cholery do stężenia końcowego 10 ng/mL dla komórek pierwotnych lub 25 ng/mL dla transformowanych BPEC.
        OSTRZEŻENIE: Toksyna cholery jest śmiertelna w przypadku połknięcia. Należy stosować środki ochrony osobistej. Należy unikać przedostania się substancji do środowiska.
    2. Utrzymanie i pasażowanie hodowli komórkowych.
      UWAGA: W poniższych krokach należy pamiętać, że komórki rosną w kolbie T25. Niemniej jednak objętości można dostosować do innych formatów hodowli komórkowych, zachowując proporcjonalność względem powierzchni hodowli.
      1. Codziennie sprawdzaj konfluencję komórek. Gdy kultura osiągnie 90% konfluencji, przeprowadź pasażowanie komórek.
      2. Przygotuj 1x PBS, 3x trypsynę, pożywkę oraz probówkę stożkową o pojemności 15 ml zawierającą 2 ml surowicy wołowej płodu (FBS) dla każdej kolby.
      3. Usunąć pożywkę z kolby i przenieść ją do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej FBS.
      4. Przemyj komórki 1x PBS.
      5. Oddzielić komórki od powierzchni, dodając 1 ml 3-krotnego trypsyny. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 ˚C.
      6. Sprawdzić, czy komórki zostały odspojone. W przypadku niepełnego odspojenia komórek zastosować energiczne wytrząsanie.
      7. Zneutralizuj trypsynę, dodając zarezerwowane medium uzupełnione o FBS.
      8. Zebrać zawiesinę komórkową i umieścić ją w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml.
      9. Wirować przy 50 x g przez 5 min, odciąć supernatant i resuspender osad komórkowy, delikatnie uderzając palcem w dno probówki.
      10. Do osadu należy dodać 1–2 ml świeżej pożywki, a następnie zmierzyć stężenie komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Dane te zostaną później wykorzystane do obliczenia liczby podwojeń populacji i wykreślenia krzywej wzrostu. Wysiać 12 00 komórek/cm²2 (np. 30 0 komórek dla kolby T25) w kolbach z modyfikowaną powierzchnią do hodowli komórkowych (patrz Tabela materiałów).
        UWAGA: Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, należy rozcieńczyć roztwór zawiesiny komórkowej, aby zapewnić prawidłową kwantyfikację.
      11. Dodać pożywkę do końcowej objętości 5 ml i inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C i przy 5% CO22 atmosfera
      12. Wymieniaj pożywkę hodowlano-komórkową co 48 h.
  2. Obliczanie podwojenia populacji i wizualizacja danych
    1. Korzystając z danych o liczbie komórek uzyskanych w kroku 1.1.2.10, zastosuj poniższy wzór w celu obliczenia skumulowanych wartości podwojenia populacji (PD):
      Równanie równowagi statycznej; PD=PDᵢ+log(Nₕ/Nₛ)/log2; wzór matematyczny do analizy.
      Gdzie, choroba Parkinsonai oznacza liczbę podwojeń populacji osiągniętą przez komórki do poprzedniego pasażu (odnosi się do PD skumulowanego w poprzednim pasażu), Nh jest liczbą zebranych komórek, a Ns jest liczbą wysianych komórek.
    2. Przedstaw dane dla określonego przedziału czasowego za pomocą wykresu XY, w którym liczba dni hodowli (Błąd: Brak treści źródłowej do tłumaczenia.-oś) i skumulowana dawka (PD (y-osi) są przedstawione.
    3. Wyznacz linię trendu oraz równanie dopasowania:
      Równanie liniowe y=bx+a, wzór matematyczny w algebrze, schemat edukacyjny do analizy danych.
      UWAGA: Większy nachylenie (b) oznacza zwiększone tempo proliferacji.

2. Hodowla trójwymiarowa (3D) w macierzy błony podstawnej oraz immunofluorescencyjne wykrywanie białek

  1. Kultura 3D w macierzy błony podstawnej
    UWAGA: Protokół ten został zaadaptowany z pracy Debnath et al., 20310 i jest zoptymalizowany dla płytek 24-dołkowych (patrz Tabela materiałów).
    1. Przygotować materiały dzień przed eksperymentem: schłodzić macierz błony podstawnej przez noc w temperaturze 4 ˚C; końcówki do pipet, probówki do mikrocentryfugi i płytki wielodołkowe schłodzić w zamrażarce.
      UWAGA: Macierz musi być przechowywana w temperaturze -20 ˚C do długoterminowego składowania. Należy przygotować aliquoty, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. W dniu eksperymentu umieścić schłodzone materiały na lodzie.
    3. Opłukać dołki zimnym, sterylnym 1x PBS w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego.
    4. Pokryć dno każdego dołka 10 µL macierzy błony podstawnej.
      UWAGA: Macierz należy dozować powoli i rozprowadzić w całym dołku; kluczowe jest uniknięcie powstawania pęcherzyków powietrza w warstwie dennej, aby zapobiec wzrostowi komórek w formie monowarstwy.
    5. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, aby warstwa macierzy stężała.
      UWAGA: Stężenie trwa zazwyczaj około 20 min.
    6. W tym czasie przeprowadzić trypsynizację komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.1. Odwirować komórki przy 50 x g przez 5 min i resuspendować w medium. Przygotować zawiesinę o stężeniu 40 0 komórek/mL i delikatnie rozbić wszelkie skupiska komórkowe poprzez pipetowanie.
    7. Przygotować medium z 8% macierzą błony podstawnej i zmieszać w stosunku 1:1 (v/v) z zawiesiną komórkową, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 0 komórek/mL w 4% macierzy.
      UWAGA: Obliczyć potrzebną ilość medium, aby uniknąć niepotrzebnego marnowania macierzy.
    8. Nanieść 50 µL zawiesiny komórkowej w roztworze macierzy na wierzch już stężonej warstwy macierzy, aby zasiać łącznie 10 00 komórek w medium z 4% macierzą błony podstawnej.
    9. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C przez kilka minut, a następnie dodać 50 µL medium z 4% macierzą błony podstawnej. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C w inkubatorze z 5% CO2 przez 14 dni. Zasiałe komórki będą się grupować i proliferować, tworząc struktury przypominające acini.
      UWAGA: Mobilność i agregację komórek można monitorować za pomocą techniki time-lapse podczas procesu formowania 3D. Do oceny tych zdarzeń należy użyć oprogramowania do analizy obrazu (np. Fiji/ImageJ lub Imaris). Liczba i wielkość acini zależą od procesu agregacji i tempa proliferacji i mogą się różnić w zależności od typu komórek. Dostosować stężenie macierzy błony podstawnej oraz liczbę zasianych komórek, aby uzyskać pożądane struktury 3D.
    10. Dodać 50 µL medium z 4% macierzą błony podstawnej 2–3 razy w tygodniu.
      UWAGA: Aby uniknąć zaburzenia warstw, płytkę należy przenosić delikatnie podczas manipulacji.
    11. W razie potrzeby liczbę i wielkość acini można mierzyć w trakcie okresu hodowli. W tym celu należy wykonywać losowe zdjęcia w różnych odstępach czasu po zasianiu, używając mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym lub DIC. Użyć oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć średnicę 10–20 struktur 3D.
  2. Immunobarwienie
    UWAGA: Na tym etapie protokołu nie są wymagane warunki sterylne.
    1. Usunąć medium hodowlane.
    2. Rozbić macierz błony podstawnej, używając końcówki pipety p20 z odciętym końcem. Nanieść ~50 µL rozproszonej macierzy na szkiełko przedmiotowe i rozprowadzić na obszarze 1–2 cm2.
    3. Pozostawić próbkę do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej lub użyć płyty grzewczej w temperaturze 37 ˚C, aby przyspieszyć ten proces. Utrwalić próbki w mieszaninie metanol:aceton (1:1, v/v) w temperaturze -20 ˚C przez 30 min.
      UWAGA: Sygnał fluorescencyjny poprzednich markerów, takich jak białka fluorescencyjne ekspresowane przez komórki, zostanie usunięty.
      OSTRZEŻENIE: Metanol jest łatwopalny, toksyczny w przypadku wdychania, połknięcia lub kontaktu ze skórą. Należy stosować środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem (dygestorium).
    4. Usunąć roztwór utrwalający i odprowadzić nadmiar, jeśli występuje, przechylając szkiełko na papierze filtracyjnym.
      UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół. Po wyschnięciu szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 ˚C przez kilka miesięcy.
    5. Zablokować epitopy próbek, używając 5% normalnego surowicy koziej i 0,1% triton-X-10 w 1x PBS (roztwór blokujący) przez 2 h w temperaturze pokojowej.
    6. W międzyczasie przygotować robocze roztwory przeciwciał poprzez rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych do pożądanej koncentracji w roztworze blokującym.
      UWAGA: Koncentracja przeciwciał musi być dokładnie dostosowana do typu komórek i specyfikacji przeciwciała. Jako wytyczne, w celu identyfikacji komórek linii luminalnej i mioepitelialnej w BPEC, można zastosować pierwszorzędowe przeciwciała anty-Cytokeratyna 14 i anty-Klaudyna-IV (patrz Tabela materiałów). Zalecana koncentracja roztworu roboczego dla tych przeciwciał pierwszorzędowych wynosi 1:10, a dla przeciwciał drugorzędowych anty-mysich i anty-kroliczych 1:50 (patrz Tabela materiałów).
    7. Dodać 30 µL roboczego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych i przykryć paskiem laboratoryjnej folii stretch, aby zapobiec odparowaniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 ˚C w komorze wilgotnej.
    8. Przemyć trzy razy 1x PBS po 1 h każdego mycia.
    9. Powtórzyć krok 2.2.7 dla przeciwciał drugorzędowych. Inkubację należy przeprowadzać w ciemności.
    10. Przemyć 1x PBS przez 2 h.
      UWAGA: Dostosować koncentrację przeciwciał, czas inkubacji i intensywność mycia, aby poprawić stosunek sygnału do szumu dla konkretnych próbek.
    11. Usunąć pozostały PBS i po wyschnięciu przeprowadzić przeciwbarwienie DAPI w stężeniu 0,25 µg/mL rozpuszczonym w medium montażowym antyfade. Przykryć szkiełka szkiełkiem zakrywającym, pozwalając mu opaść bez wywierania nacisku. Uszczelnić lakierem do paznokci.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 ˚C przez kilka tygodni. Do długoterminowego przechowywania zachować w temperaturze -20 ˚C.
    12. Analizować rozkład sygnału fluorescencyjnego dla każdego acinus za pomocą mikroskopu konfokalnego.
      UWAGA: Konfiguracja mikroskopu konfokalnego musi być dokładnie określona w zależności od użytego sprzętu i przeciwciał zastosowanych w próbce. Jako wytyczne, przy użyciu sprzętu i odczynników szczegółowo opisanych w Tabeli materiałów, należy zastosować obiektyw 40x oraz następujące ustawienia lasera i detektora: dla DAPI użyć wzbudzenia laserem 405 (3%–5%), detekcji detektorem PMT (800V, Offset: -9) i pasma widmowego od 410 nm do 50 nm; dla A48 (Klaudyna-IV) użyć wzbudzenia laserem 48 (7%–10%), detekcji detektorem PMT (80V, Offset: -20) i pasma widmowego od 490 nm do 550 nm; a dla Cy3 (Cytokeratyna 14) użyć wzbudzenia laserem 5 (2%–10%), detekcji detektorem PMT (80V, Offset: -35) i pasma widmowego od 560 nm do 60 nm.

3. Test niezależności od podłoża, barwienie MTT i automatyczna kwantyfikacja kolonii

  1. Test niezależności od przytwierdzenia: wysiew na agar i zawiesinę komórkową
    UWAGA: Protokół został opracowany na podstawie pracy Borowicz et al., 201411 do przeprowadzenia eksperymentów na BPEC.
    1. Przygotuj 1,2% roztwór agaru rozcieńczony w wodzie ultrapurej w sterylnym słoiku. Poddaj roztwór autoklawowaniu i utrzymuj go w temperaturze 42 ˚C podczas eksperymentu. Roztwór agaru można przechowywać w temperaturze 4 ˚C; w razie potrzeby podgrzej roztwór agaru, aż ponownie stanie się płynny.
      OSTROŻNIE: Należy używać rękawic odpornych na wysoką temperaturę, aby uniknąć oparzeń po autoklawowaniu.
      UWAGA: Od tego momentu należy zachować warunki sterylne.
    2. Przygotuj 0,6% roztwór agaru, mieszając w stosunku 1:1 (v/v) podgrzaną wcześniej pełną pożywkę z 1,2% roztworem agaru. Przechowuj w temperaturze 42 ˚C, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu.
      UWAGA: Pożywkę można wcześniej poddać podwójnej suplementacji, aby po zmieszaniu uzyskać w pełni suplementowany roztwór pożywki z 0,6% agarem.
    3. Pokryj dno studzienki o średnicy 35 mm 1,5 ml 0,6% agaru w roztworze pożywki i pozostaw do zastygnięcia w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że dno płytki jest całkowicie pokryte przed zastygnięciem agaru, w przeciwnym razie komórki mogą przywrzeć do płytki i rosnąć w monowarstwie.
      UWAGA: Można stosować płytki z powierzchnią adhezyjną i nieadhezyjną.
    4. W tym czasie należy poddać komórki trypsynizacji, a po odwirowaniu i resuspensji w pożywce przygotować roztwór o stężeniu 50 0 komórek/ml i delikatnie rozbić wszelkie skupiska komórkowe poprzez wielokrotne pipetowanie.
    5. Przygotować zawiesinę komórek w pożywce z dodatkiem 0,3% agaru, o końcowym stężeniu 25 0 komórek/ml.
      UWAGA: Optymalne stężenie komórek może różnić się w zależności od typu komórek. Należy testować różne stężenia, aż do uzyskania pojedynczych kolonii.
      1. Umieść 40 µm umieścić filtr cedzakowy na górze sterylnej probówki o pojemności 50 ml i przefiltrować roztwór zawierający 50 00 komórek/ml, pozwalając mu spłynąć na dno probówki.
      2. Usuń filtr z jałowej probówki o pojemności 50 ml, przechyl probówkę z komórkami pod kątem 45˚ i wlej taką samą objętość roztworu 0,6% agaru z pożywką, rozprowadzając go po wewnętrznej ściance probówki. Pozwoli to roztworowi agaru schłodzić się w stopniu wystarczającym, aby nie uszkodzić komórek i zapobiec jego przedwczesnemu stężeniu.
    6. Uhomogenizować mieszaninę i nanieść 1 ml zawiesiny komórek w 0,3% agarze (zawierającej 25 00 komórek) na powierzchnię wcześniej zastygłej dolnej warstwy agaru.
    7. Wizualizuj wysiane komórki za pomocą mikroskopu odwróconego, aby upewnić się, że komórki są odizolowane. W przeciwnym razie należy powtórzyć eksperyment.
    8. Należy odczekać do całkowitego zestalenia się warstwy agaru, a następnie ostrożnie nanieść na jej powierzchnię 1 ml świeżej pożywki, tak aby nie naruszyć delikatnych warstw agaru znajdujących się poniżej.
    9. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C i przy 5% CO22 w inkubatorze przez 3 tygodnie.
      UWAGA: Czas potrzebny na formowanie kolonii może różnić się w zależności od rodzaju komórek, jednak zazwyczaj wystarczające są 3 tygodnie.
    10. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu. W tym celu należy delikatnie przechylić płytkę w swoją stronę, odessać pożywkę z dolnego narożnika i dodać 1 ml świeżej pożywki.
      UWAGA: Należy unikać dotykania warstw agaru, ponieważ łatwo odrywają się one od płytki.
  2. Barwienie MTT
    1. Przygotować roztwór zapasowy bromku tetrazoliowego z grupy tiazolowych barwników niebieskich (MTT) o stężeniu 6 mg/mL w wodzie ultraczystej w sterylnej butelce, a następnie przefiltrować roztwór za pomocą 0.2 µm filtry. Roztwór MTT można przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze -20 ˚C.
      OSTRZEŻENIE: MTT może powodować podrażnienia i istnieje podejrzenie, że może powodować wady genetyczne. Należy stosować okulary ochronne, rękawice oraz filtr oddechowy.
      UWAGA: Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. Przygotować roztwór roboczy MTT o stężeniu 1 mg/mL poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego sterylną wodą ultrapurą.
    3. Po zakończeniu okresu formowania kolonii usunąć medium z płytki i dodać 1 ml MTT w stężeniu 1 mg/ml do każdej studni.
    4. Inkubować przez 24 h w inkubatorze. Usunąć roztwór MTT, delikatnie go odsysając. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 ˚C przez kilka tygodni.
      UWAGA: Należy unikać ekspozycji na światło, aby zapobiec nieswoistemu tworzeniu się kryształów.
  3. Kwantyfikacja kolonii
    1. Należy wykonać zdjęcia każdej płytki za pomocą mikroskopu odwróconego. Należy dostosować powiększzenie tak, aby uzyskać maksymalne pole widzenia przy mniejszej liczbie zdjęć, zachowując jednocześnie możliwość wykrycia małych kolonii (zazwyczaj przy użyciu obiektywów 4x lub 10x).
      UWAGA: Należy upewnić się, że obrazy mają jednorodne tło. Nie jest wymagane użycie kontrastu fazowego ani kontrastu interferencyjnego, ponieważ niebarwione kolonie nie będą kwantyfikowane.
    2. Przesyłanie obrazów do oprogramowania ImageJ/Fiji12 aby policzyć liczbę kolonii oraz powierzchnię każdej kolonii pozytywnej w teście MTT.
      UWAGA: Do automatycznej kwantyfikacji dostarczono skrypt w formie Plik uzupełniającyAby wykonać kod, wklej go do edytora makr (Wtyczki | Nowy | Makro) i postępuj zgodnie z instrukcjami.
      1. Uzyskać maskę binarną poprzez progowanie obrazu oryginalnego (Obraz | Dopasuj | Próg) w celu uzyskania wyraźnie odseparowanych kolonii (Rycina 1).
        UWAGA: do wykonania tego kroku zazwyczaj wymagane są obrazy 8- lub 16-bitowe. Zaleca się zastosowanie metody „Minimum threshold” (minimalny próg).
      2. Uruchom funkcję Extended Particle Analyzer z wtyczki Biovoxxel13 (Wtyczki | BioVoxxel | Rozszerzony analizator cząstek) w celu zidentyfikowania kolonii MTT-dodatnich (Rycina 2). Początkowe warunki sterujące: Rozmiar (µm2) = 250–nieskończoność; Solidity = 0,75–1,0.
    3. Oblicz średnią średnicę (D) dla każdej wartości powierzchni kolonii (A) zgodnie z wzorem:
      Wzór dyfrakcyjny D=2(A/π)^1/2 w fizyce, schemat wyprowadzenia dla badań optycznych.
    4. Filtruj wyniki, wykluczając kolonie o niskiej proliferacji (np. o małej średnicy).
      1. Wybierz minimalną liczbę podziałów na tydzień (m) należy wziąć pod uwagę (np. 1).
      2. Oszacuj promień kolonii (R) z n komórki zgodnie z następującym wzorem:
        Równanie w fizyce przedstawiające R = r(n/ρ)^(1/3), wskazujące na zależność w analizie gęstości.
        Gdzie, r jest średnim promieniem poszczególnych komórek w zawiesinie, n liczba komórek tworzących kolonię, która uległa m podziały w każdym tygodniu podczas w tygodni hodowli. W fazie wzrostu wykładniczego: n = 2(m*w). ρ wydajność upakowania. Należy zauważyć, że przy ruchu chaotycznym wydajność upakowania wynosi ~0,64, a najgęstszy możliwy ułamek upakowania dla jednakowych sfer wynosi 0,7414.
      3. Należy odrzucić wszystkie kolonie o średnicy mniejszej niż 2R, ponieważ ich komórki nie osiągnęły minimalnej liczby podziałów określonej w kroku 3.3.4.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu uzyskania reprezentatywnych wyników transformacji onkogennej wybrano eksperymentalny model transformacji komórkowej z wprowadzeniem trzech elementów genetycznych do BPEC6,7 (Rysunek 3). Nietransformowane BPEC (N) wyizolowano z wolnej od choroby tkanki piersi zgodnie z opisem Ince i współpracowników6 i hodowano według wskazanego tutaj protokołu. Po przejściu stanu STASIS (starze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokoły eksperymentalne opisane w tym artykule dostarczają użytecznych narzędzi do oceny transformacji onkogennej komórek hodowanych in vitro. Każda technika ocenia określone aspekty procesu transformacji, a co za tym idzie, należy zwrócić szczególną uwagę przy wyciąganiu wniosków z pojedynczej analizy. Tworzenie krzywych wzrostu to podejście, które wymaga informacji już dostępnych podczas hodowli komórek do innych celów. To sprawia, że technika ta jest tańsza i łatwiejsza do zastosowania w porównaniu z innymi testami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Laboratorium AG jest finansowane przez Hiszpańską Radę Bezpieczeństwa Jądrowego. T.A. i A.G. są członkami grupy badawczej uznanej przez Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT jest beneficjentem kontraktu finansowanego przez Fundację Naukową Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Kontrakt G.F. jest finansowany z grantu Fundacji Cellex.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipety serologiczne 1 mlLabclinicsPLC91001
1,5 ml EppendorfsThermo Fisher Scientific3451Ciemne eppendorfy są preferowane do długotrwałego przechowywania MTT
10 μ l Końcówki do pipet bez filtraBiologix20-0010
szklana butelkaZ nakrętką, autoklawowalne
1000 μ l Końcówki do pipet z filtremLabclinicsLAB1000ULFNL
1000 μ l Końcówki do pipet bez filtraBiologix20-1000
15 ml Probówki stożkoweVWR525-0400
Pipety serologiczne 2 mlLabclinicsPLC91002
200 μ l Końcówki do pipet z filtremLabclinicsFTR200-96
5 ml Pipety serologiczneLabclinicsPLC91005
Probówki stożkowe 50 mlVWR525-0304
AcetonPanReac AppliChem211007Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym
AgarSigma-AldrichA1296Służy do oznaczania zakotwiczenia
Przeciwciało anty-Claudin 4Abcam15104, RRID:AB_301650Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: królik
Przeciwciało anty-cytokeratyny 14 [RCK107]Abcam9220, RRID:AB_307087Rozcieńczenie robocze 1:100, gospodarz: mysz
Przeciwciało anty-mysie Cyjanina Cy3Jackson ImmunoResearch Inc.115-165-146, RRID:AB_2338690Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza
Przeciwciało przeciw królikowi Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034, RRID:AB_2576217Rozcieńczenie robocze 1:500, gospodarz: koza
Autoklaw
BioVoxxel ToolboxRRID:SCR_015825
Hodowla komórkowa 24-dołkowa płytkaLabclinicsPLC30024Używany do kultur 3D w Matrigel. Płaskie dno
Hodowla komórkowa 6-dołkowa płytkaLabclinicsPLC30006Służy do oznaczania zakotwiczenia
Inkubator komórkowy (37 º C i 5 % CO2)
Sitka do komórekFisherbrand11587522Rozmiar oczek: 40 μ m
Oprogramowanie CellSenseOlympusSłuży do akwizycji obrazu
Wirówka
Toksyna z Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych
Klasa II Szafa Bezpieczeństwa BiologicznegoHerasafeHAEREUS HS12
Konfokalny mikroskop odwróconyLeicaTCS SP5
Okulary nakrywkoweWiteg Labortechnik GmbH460012222 X 22 mm, grubość 0,13 - 0,17 mm
DAPI2-(4-amidinofenyl)-1H -indolo-6-karboksyamidyna
Płodowa surowica bydlęcaBiowestS1810Służy do inaktywacji działania trypsyny
Oprogramowanie Fidżi (ImageJ)National Institutes of HealthRRID:SCR_002285Bezpłatne pobieranie, licencja nie jest wymagana
Szklane pipety
Szkiełka podstawoweFisherbrand11844782
Kozia surowicaBiowestS2000Służy do immunofluorescencji struktur 3D
RękawiceSłuży do manipulacji agarem po autoklawie
Kąpiel grzewcza (37 º C)Służy do hartowania roztworów przed subkulturą komórkową
Kąpiel grzewcza (42 º C)Służy do utrzymywania ciepła agaru
grzewczaSłuży do odwadniania Matrigel
KomoraSłuży do inkubacji przeciwciał podczas immunofluorescencji
LódUżywany podczas manipulacji Matrigelem
Ice-box
OlympusIX71
Matrigel MatrixBecton Dickinson354234Sklep pod adresem -20 º C i przechowywać w chłodnym miejscu podczas użytkowania. Określany jako matryca membrany podstawnej
MetanolPanReac AppliChem131091Służy do utrwalania struktury 3D przed znakowaniem immunofluorescencyjnym
Mikropipetyp1000, p200 i p10
Microsoft Office ExcelMicrosoftRRID:SCR_016137Służy do obliczania podwojenia populacji i uzyskiwania równania szybkości wzrostu
MiliQ wodyOkreślany jako ultraczysty lakier
do paznokciSłuży do uszczelniania próbek po zamontowaniu
Parafilm MBemisPM-999Służy do pokrywania roztworu przeciwciał podczas inkubacji
PBS pH 7,4 (bez wapnia i magnezu)Gibco10010-056Sterylny. Stosowany do subhodowli komórkowych
PBS tabletkiSigma-AldrichP4417Rozcieńczyć w wodzie miliQ. Nie jest wymagana sterylność. Używany do immunofluorescencji
Pipeta Aid
Primaria T25 KolbyCorning353808Używany do hodowli BPEC
Berło Automatyczny licznik komórekMilliporePHCC20060Alternatywnie użyj hemocytometru
NożyczkiSłuży do cięcia końcówek pipet i parafilmu
Sterylne filtry 0,22 μ mMiliporeSLGP033RSSłuży do filtrowania roztworu MTT
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromek (MTT)Sigma-AldrichM2128Przechowywać w temperaturze -20 º C
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Służy do immunofluorescencji struktur 3D
Trypsyna-EDTA 10XBiowestX0930Rozcieńczony w PBS w celu uzyskania roztworu 3X
Vectashield Antifade Podłoże montażoweVector LaboratoriesH-1000
WIT-P-NC Culture MediumStemgent00-0051Używany do pierwotnej hodowli BPEC
WIT-T Pożywka hodowlanaStemgent00-0047Używana do transformacji kultur BPEC
100 ml Pasteura żaroodporne Płyta wilgotna Odwrócony mikroskop optyczny

Bibliografia

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
  3. Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).
  4. Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).
  5. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  6. Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
  7. Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
  8. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  9. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  10. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).
  11. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).
  14. Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
  15. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podwojenia populacjitr jwymiarowa hodowla kom rekznakowanie immunofluorescencyjnetest niezale no ci od pod o atworzenie kolonii w mi kkim agarzemikroskopia konfokalnatest MTTtempo proliferacji kom rek
Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.