Opracowaliśmy model zwyrodnienia krążka międzykręgowego w odcinku lędźwiowym myszy poprzez resekcję wyrostków kolczystych L3–L5 wraz z więzadłami nad- i międzykolcowymi oraz odłączeniem mięśni przykolcowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model niestabilności odcinka lędźwiowego kręgosłupa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwyrodnienie krążka międzykręgowego (IDD) jest powszechną zmianą patologiczną prowadzącą do bólu krzyża. Potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce do zrozumienia procesów patologicznych i oceny nowych leków. Tutaj wprowadziliśmy chirurgicznie indukowany mysi model niestabilności kręgosłupa lędźwiowego (LSI), u którego rozwija się IDD począwszy od 1 tygodnia po operacji. Szczegółowo rzecz biorąc, mysz w znieczuleniu była operowana przez nacięcie skóry dolnej części pleców, odsłonięcie wyrostków kolczystych L3–L5, oddzielenie mięśni przykolcowych, resekcję wyrostków i więzadeł oraz zamknięcie skóry. Do obserwacji wybranoL4–L5 IVD. W modelu LSI rozwija się IDD odcinka lędźwiowego poprzez porowatość i przerost płytek końcowych we wczesnym etapie, zmniejszenie objętości krążka międzykręgowego, skurcz jądra miażdżystego w stadium pośrednim i utratę kości w kręgach lędźwiowych (L5) w późniejszym etapie. Model myszy LSI ma zalety silnej operacyjności, braku konieczności stosowania specjalnego sprzętu, odtwarzalności, niedrogiego i stosunkowo krótkiego okresu rozwoju IDD. Jednak operacja LSI jest nadal urazem, który powoduje stan zapalny w ciągu pierwszego tygodnia po operacji. Tak więc ten model zwierzęcy nadaje się do badania IDD odcinka lędźwiowego.
Wprowadzenie
Zwyrodnienie krążka międzykręgowego (IDD) jest często obserwowane u starzejących się, a nawet młodych ludzi, spowodowane wieloma czynnikami1. Operacja u pacjentów cierpiących na IDD, powodujące ból krzyża i upośledzenie ruchomości, jest zwykle wykonywana na późniejszym etapie lub w ciężkich przypadkach i wiąże się z potencjalnym ryzykiem, takim jak brak zrostu lub infekcja2. Idealne leczenie nieoperacyjne wymaga kompleksowego zrozumienia mechanizmu IDD. Model zwierzęcy IDD służy jako kluczowe narzędzie do badań nad mechanizmem IDD i oceny leczenia IDD.
Większe zwierzęta zostały wybrane do modeli IDD, takich jak naczelne, owce, kozy, psy i króliki, ze względu na ich podobieństwo do ludzkiej budowy anatomicznej w dużym stopniu i dużą operatywność pod względem wielkości krążków międzykręgowych (IVD)3,4,5,6,7,8. Jednak te modele zwierzęce są czasochłonne i kosztowne9. IVD u myszy jest słabą reprezentacją ludzkiego IVD opartą na pomiarach geometrycznych proporcji, stosunku jądra miażdżystego do powierzchni dysku i znormalizowanej wysokości10. Pomimo różnicy w rozmiarach, segment IVD lędźwiowy myszy wykazuje właściwości mechaniczne podobne do ludzkiego IVD, takie jak sztywność na ściskanie i skręcanie11. Ponadto mysi model IDD ma tę zaletę, że jest niski koszt, stosunkowo krótki rozwój IDD i więcej opcji dla genetycznie modyfikowanych zwierząt i przeciwciał wykorzystywanych w dalszych badaniach mechanistycznych12,13,14,15.
Eksperymentalne modele IDD różnią się od induktorów i zastosowań. Na przykład zwyrodnienie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wywołane kolagenazą jest odpowiednie dla badań nad regeneracją ECM16. Genetycznie modyfikowany fenotyp nadaje się do badania funkcji genów w procesie IDD oraz w terapiach genetycznych17. Modele nacięcia i dymu włóknistego pierścienia naśladują uraz i niewywołany stanem zapalnym IDD12,18.
Niestabilność kręgosłupa (SI) prowadzi do niestabilnego kręgosłupa, który nie jest w optymalnym stanie równowagi. Może to być spowodowane nieprawidłowym ruchem odcinka ruchu lędźwiowego z powodu osłabienia otaczającej tkanki podporowej, takiej jak więzadła i mięśnie. Jest również często spotykany po operacji zespolenia kręgosłupa19. SI jest uważany za główną przyczynę IDD. Dlatego naszym celem jest opracowanie modelu myszy SI (skoncentrowanego na odcinku lędźwiowym kręgosłupa), który naśladuje ludzki proces IDD20,21.
W protokole wprowadziliśmy procedurę ustalania mysiego modelu niestabilności kręgosłupa lędźwiowego (LSI) poprzez resekcję wyrostków kolczystych od trzeciego odcinka lędźwiowego (L3) do odcinka lędźwiowego piątego (L5) wraz z więzadłami nadkolcowymi i międzykolcowymi (Rysunek 1A,B). W modelu zwierzęcym IDD rozwija się już 1 tydzień po operacji, o czym świadczy przerost i porowatość płytek końcowych (EP). Objętość IVD zaczyna zmniejszać się 2 tygodnie po operacji przez 16 tygodni wraz ze wzrostem wyniku IVD, który wskazuje na stopień IDD. Uważamy, że szczegółowa i zwizualizowana procedura jest przydatna dla badaczy w celu ustalenia modelu myszy LSI w ich laboratorium i zastosowania w badaniach IDD w razie potrzeby.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane badania są zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. Wszystkie manipulacje chirurgiczne były wykonywane w głębokiej narkozy, a zwierzęta nie odczuwały bólu na żadnym etapie zabiegu.
1. Przygotowanie do operacji
- Sterylizacja narzędzi: Przed zabiegiem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne parą wodną w autoklawie (121 °C przez 15 min). Zapakuj narzędzia do metalowego pojemnika i przechowuj je do czasu, gdy zostaną użyte w gabinecie.
- Konfiguracja platformy chirurgicznej: Do operacji należy przydzielić powierzchnię stołu o wymiarach co najmniej 60 cm x 60 cm. Oczyść powierzchnię 75% alkoholem i przykryj jednorazowym ręcznikiem medycznym. Umieść sterylny pakiet narzędzi chirurgicznych, odczynniki, artykuły chirurgiczne na jednorazowym ręczniku medycznym w górnej 1/3 obszaru. Pozostaw pozostałe 2/3 obszaru czyste do operacji chirurgicznej. Dodaj hotpad pod podkładkę chirurgiczną, aby uzyskać wsparcie termiczne.
- Przygotowanie zwierząt
- Umieść zwierzę (myszy C57BL/6J, samiec, 8 tygodni) w komorze indukcyjnej. Włącz parownik na poziomie indukcji 4% dla izofluranu i 4 l/min dla tlenu. Po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia należy utrzymać znieczulenie za pomocą stożka nosowego i podawanie środka znieczulającego na poziomie 1,5% dla izofluranu i 0,4 l/min dla tlenu podczas operacji. Monitoruj zwierzę pod kątem oddychania.
- Zastosuj maść do oczu z chlorowodorkiem chlorowodorku chlorowodorku, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
- Ogol obszar chirurgiczny na powierzchni grzbietowej od dolnej części klatki piersiowej do górnej części okolicy krzyżowej za pomocą trymera dla małych zwierząt. Usuń ogolone futro chusteczkami higienicznymi.
- Nałóż krem do depilacji na ogolone miejsce i pozostaw go tam nie dłużej niż 3 minuty. Usuń krem gazą i spłucz 2 ml 0,9% sterylnego soli fizjologicznej.
- Umieść wykonaną na zamówienie cylindryczną podkładkę chirurgiczną (Rysunek 2A) pod brzuchem myszy, aby podnieść kręgosłup lędźwiowy i ułatwić operację chirurgiczną.
2. Ekspozycja wyrostków kolczystych od trzeciego odcinka lędźwiowego do piątego odcinka lędźwiowego (L3–L5)
- Użyj palca wskazującego, aby dotknąć podskórnych wyrostków kolczystych kręgów lędźwiowych, które są bardziej skierowane na zewnątrz, i porównaj z kręgami piersiowymi i krzyżowymi, aby zidentyfikować odcinek lędźwiowy.
- Spłucz skórę 75% alkoholem. Wykonaj 3–4 cm nacięcie skóry w linii środkowej nad obszarem drewna od środkowej części klatki piersiowej do biodra za pomocą ostrza skalpela, aby odsłonić powięź.
- Zidentyfikuj kręgosłup lędźwiowy na podstawie morfologii powięzi tylnej umieszczonej na końcach wyrostków kolczystych. Szczegółowo, trzecia powięź lędźwiowa (L3) do pierwszej powięzi krzyżowej (S1) różni się od innych powięzi kształtem "V". Ostatnia końcówka "V" łączy się z pierwszą powięzią krzyżową (S1), a pierwsza końcówka "V" odpowiada wyrostkowi kolczystemu L3 (Rysunek 2B).
- Wykonaj tylne nacięcia mięśni przykolcowych wzdłuż wyrostków kolczystych od L3 do L5 po obu stronach bocznie za pomocą ostrza skalpela (Rysunek 2C). Kontroluj głębokość nacięcia w kierunku faset, aby zmniejszyć krwotok.
- Oddziel warstwy mięśni za pomocą dwóch kleszczy okulistycznych, aby odsłonić wyrostki kolczyste L3 do L5 i więzadła nadokolcowe.
3. Resekcja wyrostków kolczystych L3–L5 wraz z więzadłami
- Oddziel poszczególne wyrostki kolczyste, odcinając więzadła międzykolcowe za pomocą nożyc Venus (Rysunek 2D).
- Wytnij wyrostki kolczyste L3–L5 wraz z więzadłami międzykolcowymi za pomocą nożyc Wenus (Ryc. 2E).
- Zszyj nacięcie skóry sterylnym jedwabnym plecikiem (rozmiar szwu 5,0) bez ponownego przyczepiania mięśni przykręgosłupowych.
- Nałóż maść do oczu z chlorowodorkiem chlorotetracykliny na miejsce operacji.
- Buprenorfinę-SR (25 μl na gram masy myszy) należy podać natychmiast po operacji LSI w celu znieczulenia.
- Umieść zwierzęta w ciepłej komorze i monitoruj podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Monitoruj spożycie pokarmu i wody przed powrotem zwierząt do klatki domowej.
- Monitoruj zwierzę raz dziennie przez pierwsze 3 dni po operacji. Zwierzę powinno mieć normalny apetyt i powinno goić się bez oznak ropy, krwotoku lub obrzęku. Mogą mieć niewielkie upośledzenie lokomocji.
- Operacje pozorowane należy wykonywać tylko poprzez odłączenie tylnych mięśni przykręgosłupowych od kręgów L3–L5.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model myszy LSI jest stosowany w badaniach nad mechanizmami IDD, leczeniem IDD, degeneracją płytek granicznych (EP), taką jak stwardnienie, oraz unerwieniem sensorycznym w EP20,21,22,23. U myszy LSI rozwija się IDD oraz zmiany degeneracyjne EP, co przejawia się zmniejszeniem objętości i wysokości IVD, zwiększeniem objętości EP oraz wzrostem wyników oceny IVD i EP.
Pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy mysi model niestabilności kręgosłupa lędźwiowego w oparciu o mysi model spondylozy szyjnej, w którym odłączono tylne mięśnie przykręgosłupowe od kręgów i wycięto wyrostki kolczyste wraz z więzadłami nadkolcowymi i międzykolcowymi25. Podobną operację przeprowadziliśmy na odcinku lędźwiowym kręgosłupa, który ma bardziej wydatne wyrostki kolczyste. Mysi model LSI rozwinął podobne IDD w odcinku lędźwiowym kręgosłupa.
Zaletami modelu LSI są wysoka operatywność,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81973607) oraz Essential Drug Research and Development (2019ZX09201004-003-032) z Ministerstwa Nauki i Technologii Chin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Maść do oczu chlorowodorku chlorowodorku chlorowodorku | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Zapobiegaj wysuszeniu oczu, zapobiegaj infekcji ran |
| C57BL / 6J samce myszy | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Model zwierzęcy |
| Jednorazowy ręcznik medyczny | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platforma do operacji chirurgicznych |
| Sprzęt do znieczulenia wziewnego | MIDMARK | Matrx 3000 | Znieczulenie |
| Izofluran | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Znieczulenie |
| Chlorowodorek lidokainy | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Igła |
| do szycia medycznego przeciwbólowego | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Zszyj skórę |
| Kleszcze okulistyczne | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabryka instrumentów chirurgicznych | JD1050 | Przytnij skórę |
| Nożyczki okulistyczne (10 cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabryka instrumentów chirurgicznych | Y00030 | do nacięcia skóry |
| Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Szycie skóry | |
| Trymer dla małych zwierząt | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Depilacja |
| Sterylne ostrza chirurgiczne (12 #) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Nacięcie mięśni |
| Krem do depilacji Veet | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Depilacja |
| Nożyce do Wenus Sprzęt | medyczny Mingren | Długość: 12,5 cm | Przytnij wyrostek mięśniowy i kolczysty |
Bibliografia
- Makino, H., et al. Lumbar disc degeneration progression in young women in their 20's: a prospective ten-year follow up. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 22 (4), 635-640 (2017).
- Lee, Y. C., Zotti, M. G. T., Osti, O. L. Operative management of lumbar degenerative disc disease. Asian Spine Journal. 10 (4), 801-819 (2016).
- Wei, F., et al. In vivo experimental intervertebral disc degeneration induced by bleomycin in the rhesus monkey. BMC Musculoskeletal Disorders. 15, 340(2014).
- Lim, K. Z., et al. Ovine lumbar intervertebral disc degeneration model utilizing a lateral retroperitoneal drill bit injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55753(2017).
- Zhang, Y., et al. Histological features of the degenerating intervertebral disc in a goat disc-injury model. Spine. 36 (19), 1519-1527 (2011).
- Bergknut, N., et al. The dog as an animal model for intervertebral disc degeneration. Spine. 37 (5), 351-358 (2012).
- Kong, M. H., et al. Rabbit Model for in vivo Study of Intervertebral Disc Degeneration and Regeneration. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (5), 327-333 (2008).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Jin, L., Balian, G., Li, X. J. Animal models for disc degeneration-an update. Histology and Histopathology. 33 (6), 543-554 (2018).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparative intervertebral disc anatomy across several animal species. 52nd Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society. , (2006).
- Elliott, D. M., Sarver, J. J. Young investigator award winner: validation of the mouse and rat disc as mechanical models of the human lumbar disc. Spine. 29 (7), 713-722 (2004).
- Ohnishi, T., et al. In vivo mouse intervertebral disc degeneration model based on a new histological classification. Plos One. 11 (8), 0160486(2016).
- Vo, N., et al. Accelerated aging of intervertebral discs in a mouse model of progeria. Journal of Orthopaedic Research. 28 (12), 1600-1607 (2010).
- Oichi, T., et al. A mouse intervertebral disc degeneration model by surgically induced instability. Spine. 43 (10), 557-564 (2018).
- Ohnishi, T., Sudo, H., Tsujimoto, T., Iwasaki, N. Age-related spontaneous lumbar intervertebral disc degeneration in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 224-232 (2018).
- Stern, W. E., Coulson, W. F. Effects of collagenase upon the intervertebral disc in monkeys. Journal of Neurosurgery. 44 (1), 32-44 (1976).
- Silva, M. J., Holguin, N. LRP5-deficiency in OsxCreERT2 mice models intervertebral disc degeneration by aging and compression. bioRxiv. , (2019).
- Nemoto, Y., et al. Histological changes in intervertebral discs after smoking and cessation: experimental study using a rat passive smoking model. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (2), 191-197 (2006).
- Mulholland, R. C. The myth of lumbar instability: the importance of abnormal loading as a cause of low back pain. European Spine Journal. 17 (5), 619-625 (2008).
- Bian, Q., et al. Mechanosignaling activation of TGFβ maintains intervertebral disc homeostasis. Bone Research. 5, 17008(2017).
- Bian, Q., et al. Excessive activation of tgfβ by spinal instability causes vertebral endplate sclerosis. Scientific Reports. 6, 27093(2016).
- Ni, S., et al. Sensory innervation in porous endplates by Netrin-1 from osteoclasts mediates PGE2-induced spinal hypersensitivity in mice. Nature Communications. 10 (1), 5643(2019).
- Liu, S., Cheng, Y., Tan, Y., Dong, J., Bian, Q. Ligustrazine prevents intervertebral disc degeneration via suppression of aberrant tgfβ activation in nucleus pulposus cells. BioMed Research International. 2019, 5601734(2019).
- Boos, N., et al. Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science. Spine. 27 (23), 2631-2644 (2002).
- Miyamoto, S., Yonenobu, K., Ono, K. Experimental cervical spondylosis in the mouse. Spine. 16, 10 Suppl 495-500 (1991).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
