Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

DOI:

10.3791/61731

⸱

23 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż małe regulatorowe RNA (sRNA) są szeroko rozpowszechnione w bakteryjnej domenie życia, funkcje wielu z nich pozostają słabo scharakteryzowane, szczególnie z powodu trudności w identyfikacji ich celów mRNA. W tym miejscu opisaliśmy zmodyfikowany protokół oczyszczania MS2-Affinity w połączeniu z technologią sekwencjonowania RNA (MAPS), mający na celu ujawnienie wszystkich partnerów RNA określonego sRNA in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, aptamer MS2 jest połączony z końcem 5' interesującego nas sRNA. Konstrukt ten jest następnie wyrażany in vivo, umożliwiając MS2-sRNA interakcję ze swoimi partnerami komórkowymi. Po zebraniu bakterii komórki są poddawane lizie mechanicznej. Surowy ekstrakt jest ładowany do kolumny chromatograficznej na bazie amylozy, uprzednio pokrytej białkiem MS2 połączonym z białkiem wiążącym maltozę. Umożliwia to specyficzne wychwytywanie MS2-sRNA i oddziałujących RNA. Po elucji wspólnie oczyszczone RNA są identyfikowane przez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA, a następnie analizę bioinformatyczną. Poniższy protokół został wdrożony w ludzkim patogenie Gram-dodatnim Staphylococcus aureus i w zasadzie można go przenieść na dowolną bakterię Gram-dodatnią. Podsumowując, technologia MAPS stanowi skuteczną metodę dogłębnego zbadania sieci regulacyjnej danego sRNA, oferując migawkę całego jego celu. Należy jednak pamiętać, że przypuszczalne cele zidentyfikowane przez MAPS nadal muszą zostać zweryfikowane za pomocą uzupełniających podejść eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Setki, a może nawet tysiące małych regulatorowych RNA (sRNA) zostały zidentyfikowane w większości genomów bakteryjnych, ale funkcje zdecydowanej większości z nich pozostają niescharakteryzowane. Ogólnie rzecz biorąc, sRNA są krótkimi, niekodującymi cząsteczkami, odgrywającymi główną rolę w fizjologii bakterii i adaptacji do zmiennych środowisk1,2,3. Rzeczywiście, te makrocząsteczki znajdują się w centrum wielu skomplikowanych sieci regulacyjnych, wpływając na szlaki metaboliczne, reakcje na stres, ale także zjadliwość i oporność na antybiotyki. Logicznie rzecz biorąc, ich synteza jest wyzwalana przez określone bodźce środowiskowe (np. głód składników odżywczych, stresy oksydacyjne lub błonowe). Większość sRNA reguluje wiele docelowych mRNA na poziomie potranskrypcyjnym poprzez krótkie i nieciągłe parowanie zasad. Zazwyczaj zapobiegają one inicjacji translacji, konkurując z rybosomami o regiony inicjacji translacji4. Tworzenie dupleksów sRNA:mRNA często powoduje również aktywną degradację docelowego mRNA poprzez rekrutację specyficznych RNaz.

Charakterystyka celu sRNA (tj. całego zestawu jego docelowych RNA) pozwala na identyfikację szlaków metabolicznych, w które interweniuje, oraz potencjalnego sygnału, na który reaguje. W związku z tym funkcje specyficznego sRNA można ogólnie wywnioskować z jego celu. W tym celu opracowano kilka narzędzi do przewidywania in silico, takich jak IntaRNA i CopraRNA5,6,7. Opierają się one w szczególności na komplementarności sekwencji, energii parowania i dostępności potencjalnego miejsca interakcji w celu określenia przypuszczalnych partnerów sRNA. Jednak algorytmy predykcyjne nie uwzględniają wszystkich czynników wpływających na parowanie zasad in vivo, takich jak udział chaperonów RNA8 faworyzujących nieoptymalne interakcje lub koekspresję obu partnerów. Ze względu na ich nieodłączne ograniczenia, odsetek wyników fałszywie dodatnich narzędzi predykcyjnych pozostaje wysoki. Większość eksperymentalnych podejść na dużą skalę opiera się na wspólnym oczyszczaniu par sRNA:mRNA oddziałujących ze znakowanym białkiem wiążącym RNA (RBP)6,9. Na przykład metoda RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) zidentyfikowała dupleksy RNA oczyszczone z białkami opiekuńczymi RNA, takimi jak Hfq i ProQ, w Escherichia coli10,11. Podobna technologia zwana UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) została zastosowana do sRNazy E i sRNA związanych z Hfq w E. coli12,13. Pomimo dobrze opisanej roli Hfq i ProQ w regulacji za pośrednictwem sRNA u wielu bakterii8,14,15, regulacja oparta na sRNA wydaje się być niezależna od opiekuńczego RNA w kilku organizmach, takich jak S. aureus16,17,18. Nawet jeśli oczyszczanie dupleksów RNA w połączeniu z RNazami jest wykonalne, jak zademonstrowali Waters i współpracownicy13, pozostaje to trudne, ponieważ RNazy powodują ich szybką degradację. W związku z tym oczyszczanie MS2-Affinity w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA (MAPS) 19,20 stanowi solidną alternatywę dla takich organizmów.

W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, MAPS wykorzystuje specyficzne sRNA jako przynętę do przechwytywania wszystkich oddziałujących RNA, a zatem nie polega na zaangażowaniu RBP. Cały proces jest przedstawiony w Rysunek 1. Krótko mówiąc, sRNA jest znakowane w 5' aptamerem MS2 RNA, który jest specyficznie rozpoznawany przez białko płaszcza MS2. Białko to jest łączone z białkiem wiążącym maltozę (MBP) w celu unieruchomienia na żywicy amylozy. Dlatego MS2-sRNA i jego partnerzy RNA są zatrzymywani na kolumnie chromatografii powinowactwa. Po elucji maltozą, oczyszczone RNA są identyfikowane za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, a następnie analizy bioinformatycznej (Rysunek 2). Technologia MAPS ostatecznie rysuje mapę interakcji wszystkich potencjalnych interakcji zachodzących in vivo.

Technologia MAPS została pierwotnie zaimplementowana w niepatogennej bakterii Gram-ujemnej E. coli21. Co ciekawe, projekt MAPS pomógł zidentyfikować fragment pochodzący z tRNA, który specyficznie oddziałuje zarówno z sRNA RyhB, jak i RybB i zapobiega jakiemukolwiek szumowi transkrypcyjnemu sRNA w celu regulacji celów mRNA w warunkach nieindukujących. Następnie MAPS został z powodzeniem zastosowany do innych sRNA E. coli, takich jak DsrA22, RprA23, CyaR23 i GcvB24 (Tabela 1). Oprócz potwierdzenia wcześniej znanych celów, MAPS rozszerzyło cel tych dobrze znanych sRNA. Niedawno przeprowadzono MAPS w Salmonella Typhimurium i ujawniono, że sRNA SraL wiąże się z mRNA rho, kodując czynnik terminacji transkrypcji25. Dzięki temu parowaniu SraL chroni mRNA rho przed przedwczesnym zakończeniem transkrypcji wywołanym przez sam Rho. Co ciekawe, technologia ta nie jest ograniczona do sRNA i może być stosowana do dowolnego typu komórkowego RNA, czego przykładem jest użycie fragmentu pochodzącego z tRNA26 i 5'-nieuleganego regionu mRNA22 (Tabela 1).

Metoda MAPS została również dostosowana do patogennej bakterii Gram-dodatniej S. aureus19. W szczególności protokół lizy został szeroko zmodyfikowany w celu skutecznego rozbijania komórek ze względu na grubszą ścianę komórkową niż bakterie Gram-ujemne i utrzymania integralności RNA. Ten zaadaptowany protokół już rozwikłał interaktom RsaA27, RsaI28 i RsaC29. Podejście to dostarczyło informacji na temat kluczowej roli tych sRNA w mechanizmach regulacyjnych właściwości powierzchni komórek, wychwytu glukozy i reakcji na stres oksydacyjny.

Protokół opracowany i wdrożony u E. coli w 2015 roku został niedawno opisany bardzo szczegółowo30. W tym miejscu udostępniamy zmodyfikowany protokół MAPS, który jest szczególnie odpowiedni do badania sieci regulacyjnych sRNA u bakterii Gram-dodatnich (grubsza ściana komórkowa), zarówno niepatogennych, jak i chorobotwórczych (środki ostrożności).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. i nośniki

  1. Na potrzeby eksperymentów MAPS przygotuj następujące i nośniki:
    - Bufor A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 i 1 mM DTT)
    - Bufor E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltoza, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 i 1 mM DTT)
    - Bufor ładujący RNA (0,025% cyjanolu ksylenu i 0,025% błękitu bromofenolowego w 8 M moczniku)
    - Brain Heart Infusion (BHI) pożywka (12,5 g mózgu cielęcego, 10 g peptonu, 5 g serca wołowego, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 i 2 g glukozy na 1 L)
    - Bulion lizogeniczny (LB) (10 g peptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl na 1 l)
  2. W przypadku testów Northern blot należy przygotować następujące:
    - Roztwór blokujący (1x kwas maleinowy i 1% odczynnik blokujący)
    - Roztwór hybrydyzacyjny (50% formamidu, 5 % SSC, 7% SDS, 1% roztwór blokujący i 0,2% N-laurylosarkozyna, 50 mM fosforan sodu). Podgrzać z mieszaniem do rozpuszczenia.
    UWAGA: Uważnie przestrzegaj środków ostrożności związanych z każdym produktem.
    - 1 M fosforan sodu (58 mM fosforan sodu dwuzasadowy i 42 mM fosforan sodu jednozasadowy)
    - Sól fizjologiczna, bufor cytrynianu sodu (SSC), 20x koncentrat (3 M NaCl i 300 mM cytrynian trisodowy)

2. Kwestie bezpieczeństwa

  1. Wykonaj wszystkie kroki z żywymi bakteriami chorobotwórczymi w laboratorium hermetyzacyjnym poziomu 2.
    UWAGA: Po lizie na zewnątrz można wyjmować tylko ekstrakty komórkowe (krok 5).
  2. Załóż fartuch laboratoryjny i rękawiczki.
  3. Upewnij się, że nadgarstki są zakryte.
  4. Oczyścić komorę bezpieczeństwa biologicznego (klasa II) roztworem dezynfekującym.
  5. Odpady stałe narażone na działanie bakterii należy wyrzucać do odpowiedniego pojemnika biomedycznego.
  6. Kolby zawierające zanieczyszczone płyny należy traktować roztworem dezynfekującym. Następnie wyrzuć go do zlewu.
  7. Ostrożnie umyj ręce i nadgarstki mydłem i zdejmij fartuch laboratoryjny przed opuszczeniem laboratorium przechowawczego poziomu 2.

3. Budowa plazmidu

UWAGA: Dla celów klonowania, kluczowe jest najpierw zidentyfikowanie granic endogennego sRNA. Plazmidy pCN51-P3 i pCN51-P3-MS2 opisano w Tomasini et al. (2017)27. Promotor P3 umożliwia wysoką ekspresję sRNA w sposób zależny od gęstości komórek (tj. gdy bakterie wchodzą w stacjonarną fazę wzrostu). W tej fazie wzrostu gromadzi się wiele gronkowcowych sRNA.

  1. Amplifikuj sekwencję sRNA metodą PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności i maszyny do PCR. Uważnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i przeczytaj Garibyan and Avashia (2013)31, aby uzyskać więcej informacji.
  2. Skorzystaj z poniższych szablonów, aby zaprojektować konkretne podkłady:
    figure-protocol-1
    i 5'-CGCGGATCC(N)-3' odpowiednio dla starterów do przodu i do tyłu.
    UWAGA: Te oligonukleotydy umożliwiają fuzję sekwencji MS2 (pogrubioną) z końcem 5' interesującego nas sRNA. PstMiejsca restrykcyjne I i BamHI (podkreślone) są dodawane na końcach 5' i 3' konstruktu MS2-sRNA w celu sklonowania amplikonu do plazmidu pCN51-P3 27. (N) odpowiada sekwencji specyficznej dla genu (15-20 nukleotydów).
  3. Roztrawić 1 μg plazmidu pCN51-P3 i 1 μg produktu MS2-sRNA PCR z 2 U PstI i 1 U BamHI w odpowiednim buforze zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i oczyścić DNA za pomocą zestawu do oczyszczania metodą PCR (zob. tabela materiałów).
  5. Wymieszaj strawiony plazmid pCN51-P3 (300 ng) i amplikon MS2-sRNA (stosunek molowy dla wektora: wkładka = 1:3) w probówce o pojemności 1,5 ml. Zobacz Revie et al. (1988)32, aby zmaksymalizować skuteczność ligacji. Dodać 1 μl buforu ligazy i 10 j. ligazy T4 do każdej probówki. Dostosuj objętość do 10 μl za pomocą ultraczystej wody.
  6. Inkubować w temperaturze 22 °C przez co najmniej 2 godziny.
  7. Dodać 5 μl mieszaniny ligacyjnej do 50 μl zamrożonych chemicznie kompetentnych komórek E. coli DH5α. Przeczytaj Seidman et al. (2001)33, aby dowiedzieć się więcej o transformacji plazmidu i chemicznie kompetentnych komórkach.
  8. Inkubować 30 minut na lodzie.
  9. Szok cieplny (45 s w temperaturze 42 °C) rurkę transformacyjną za pomocą bloku grzewczego lub łaźni wodnej.
  10. Dodać 900 μl pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  11. Umieścić 100 μl zawiesiny bakteryjnej na płytce agarowej LB uzupełnionej ampicyliną (100 μg/μL).
    UWAGA: wektor pCN51-P3 koduje gen oporności na ampicylinę, który umożliwia selekcję tylko klonów E. coli zawierających plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA.
  12. Ekstrahować plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA z nocnej kultury bakteryjnej (5 ml) wyhodowanej w obecności ampicyliny (100 μg/μl) przy użyciu zestawu do miniprzygotowania plazmidowego DNA (patrz tabela materiałów).
  13. Sprawdź konstrukcję za pomocą sekwencjonowania Sangera 34 przy użyciu następującego startera, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
  14. Przekształć plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA w chemicznie kompetentne komórki E. coli DC10B. Powtórz kroki od 3.7 do 3.11.
  15. Ekstrahować plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA (patrz krok 3.12) i przekształcić 1-5 μg plazmidowego DNA w elektrokompetentne komórki S. aureus HG001 ΔsRNA za pomocą aparatu do elektroporacji. Dokładnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Przeczytaj Grosser and Richardson (2016)35, aby dowiedzieć się więcej o metodach wytwarzania elektrokompetentnego S. aureus.
    UWAGA: Ten krok obejmuje postępowanie z bakteriami chorobotwórczymi (patrz krok 2).
  16. Dodać 900 μl pożywki BHI i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  17. Wirować 1 min przy 16 000 x g. Odrzucić supernatant.
  18. Zawiesić osad w 100 μl BHI i umieścić zawiesinę bakteryjną na płytkach agarowych BHI z dodatkiem erytromycyny (10 μg/μL).
    UWAGA: Wektor pCN51-P3 koduje również gen oporności na erytromycynę, co umożliwia selekcję tylko klonów S. aureus przenoszących plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Zbieranie bakterii

UWAGA: Ten krok obejmuje postępowanie z bakteriami chorobotwórczymi (zobacz krok 2).

  1. Wyhoduj jedną kolonię szczepów zawierających pCN51-P3-MS2-sRNA lub pCN51-P3-MS227 plazmidów w 3 ml pożywki BHI uzupełnionej erytromycyną (10 μg/μL) w duplikatach.
  2. Rozcieńczyć każdą nocną hodowlę w 50 ml (≈1/100) świeżej pożywki BHI uzupełnionej erytromycyną (10 μg / μL), aby osiągnąć OD600 nm 0,05. Użyj wysterylizowanych kolb o pojemności 250 ml (stosunek kolby do pożywki 5:1).
    UWAGA: Pożywkę i warunki wzrostu należy ustawić zgodnie ze wzorcem ekspresji badanego sRNA.
  3. Hodować kultury w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 6 godzin.
  4. Przenieś każdą kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Odwirować przy 2 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  6. Trzymaj granulki na lodzie i bezpośrednio przeprowadzaj mechaniczną lizę komórek (krok 5) lub zamrażaj i przechowuj granulki w temperaturze -80 °C.

5. Mechaniczna liza komórek

UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonywane na lodzie, a muszą mieć temperaturę 4 °C. Używaj rękawiczek i podejmij wszelkie środki ostrożności, aby chronić próbki przed RNazami.

  1. Zawiesić osady (krok 4.6) w 5 ml buforu A.
  2. Zawieszone komórki przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml z 3,5 g kulek krzemionkowych (0,1 mm).
  3. Włóż probówki do mechanicznego przyrządu do lizy komórek (patrz Tabela materiałów). Uruchom cykl 40 s przy prędkości 4,0 m/s.
    UWAGA: Jeśli jeden cykl nie wystarczy do rozbicia komórek, pozwól urządzeniu ostygnąć przez 5 minut, trzymając próbki na lodzie. Następnie powtórz kolejny cykl 40 s z prędkością 4,0 m/s. Skuteczność lizy komórek można przetestować, posiewając supernatant na płytce BHI-agar.
  4. Wirować przy 15 700 x g przez 15 min. Odzyskać supernatant i utrzymać go na lodzie.

6. Przygotowanie kolumny

UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia żywicy amylozy. W razie potrzeby uszczelnij kolumnę zaślepką. Przygotuj wszystkie roztwory przed rozpoczęciem oczyszczania powinowactwa.

  1. Umieścić kolumnę chromatograficzną w stojaku kolumnowym (patrz tabela materiałów).
  2. Zdejmij końcówkę kolumny i umyj kolumnę ultraczystą wodą.
  3. Dodać 300 μl żywicy amylozy.
  4. Przemyć kolumnę 10 ml buforu A.
  5. Rozcieńczyć 1,200 pmol białka MBP-MS2 w 6 ml buforu A i załadować go do kolumny.
  6. Przemyć kolumnę 10 ml buforu A.

7. Oczyszczanie powinowactwa MS2 (Rysunek 1)

  1. Załaduj lizat komórkowy do kolumny.
    UWAGA: Zachowaj 1 ml lizatu komórkowego (ekstrakt surowy, CE) w celu ekstrakcji całkowitego RNA (krok 8) i przeprowadzenia analizy Northern blot (krok 9) i transkryptomicznej (krok 10).
  2. Zebrać frakcję przepływową (FT) w czystej probówce zbiorczej.
  3. Przemyć kolumnę 3 razy 10 ml buforu A. Zebrać frakcję płuczącą (W).
  4. Eluować kolumnę za pomocą 1 ml buforu E i zebrać frakcję elucyjną (E) w mikroprobówce o pojemności 2 ml.
  5. Wszystkie zebrane frakcje należy przechowywać na lodzie do czasu ekstrakcji RNA (etap 8) lub zamrozić je w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

8. Ekstrakcja RNA pobranych frakcji (CE, FT, W i E)

  1. Użyj 1 ml każdej frakcji (w tym FT i W) do ekstrakcji RNA.
  2. Dodać 1 objętość fenolu. Mieszać energicznie.
    UWAGA: Fenol jest lotny i, należy zachować ostrożność i bezpiecznie pracować pod wyciągiem.
  3. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Przenieś górną fazę do czystej mikroprobówki o pojemności 2 ml.
  5. Dodać 1 objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1) i powtórzyć kroki od 8.3 do 8.4.
    UWAGA: Pracuj bezpiecznie pod wyciągiem.
  6. Dodać 2,5 objętości zimnego etanolu 100% i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (NaOAc) o pH 5,2.
  7. Wytrącać się przez noc w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Wytrącanie można również przeprowadzić w kąpieli etanolowej/suchego lodu przez 20 min lub w temperaturze -80 °C przez 2 godziny.
  8. Wirować przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powoli usuwać etanol za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    UWAGA: Osad RNA nie zawsze jest widoczny i czasami jest luźny w obecności etanolu.
  9. Dodaj 500 μl 80% zimnego etanolu.
  10. Wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Wyrzuć etanol, pipetując go powoli. Wysuszyć pelety za pomocą koncentratora próżniowego, 5 minut w trybie pracy.
  12. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości (15-50 μl) ultraczystej wody. Zamrozić granulat w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  13. Ocenić ilość i jakość RNA (260 nm) i jakość (proporcje długości fal 260/280 i 260/230) za pomocą spektrofotometru/fluorometru (patrz tabela materiałów). Dokładnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: 3-4 μg uzyskuje się na ogół we frakcji elucyjnej (E). Zależy to głównie od testowanych warunków.

9. Analiza oczyszczania powinowactwa MS2 przez Northern blot36

  1. Rozcieńczyć 5 μg RNA frakcji CE, FT, W i 500 ng frakcji E w 10 μl ultraczystej wody i wymieszać z 10 μl buforu ładującego RNA.
  2. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 90 °C.
  3. Załaduj próbki do studzienek 1% żelu agarozowego uzupełnionego 20 mM tiocyjanianu guanidu i uruchom żel pod napięciem 100-150 V w buforze TBE 1x w temperaturze 4 °C. Przeczytaj Koontz (2013)37, aby uzyskać więcej informacji.
  4. Przenieś RNA na membranę nitrocelulozową przez transfer próżniowy przez 1 godzinę lub transfer kapilarny przez noc.
    UWAGA: Metoda kapilarności jest bardziej skuteczna w przypadku dużych RNA.
  5. Usieciowanie UV RNA na membranie (120 mJ przy 254 nm) za pomocą ultrafioletowego środka sieciującego.
  6. Umieść membranę w butelce do hybrydyzacji stroną RNA skierowaną do góry.
  7. Dodaj 10-20 ml podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 68 °C.
  8. Odrzuć roztwór i dodaj 10-20 ml świeżego roztworu hybrydyzacyjnego uzupełnionego 1 μl sondy specyficznej dla sRNA. Inkubować przez noc w temperaturze 68 °C.
    UWAGA: Sonda RNA znakowana DIG jest syntetyzowana przy użyciu zestawu do znakowania DIG RNA i zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie można użyć sondy znakowanej radioizotopem.
  9. Przemyć membranę 10-20 ml roztworu myjącego 1 (2x SSC i 0,1% SDS) przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Powtórzyć raz.
  10. Przemyć membranę 10-20 ml roztworu myjącego 2 (0,2x SSC i 0,1% SDS) przez 15 minut w temperaturze 68 °C. Powtórzyć raz.
  11. Inkubować z 10-20 ml roztworu blokującego przez co najmniej 30 minut w temperaturze 20 °C.
  12. Odrzucić roztwór i dodać 10-20 ml roztworu blokującego uzupełnionego poliklonalnym przeciwciałem anty-digoksygeninowym (1/1000), sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C.
  13. Przemyć membranę 10-20 ml roztworu myjącego 3 (1x kwas maleinowy i 0,3% Tween 20) przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Powtórzyć raz.
  14. Inkubować błonę z 10-20 ml roztworu detekcyjnego (0,1 M Tris HCl i 0,1 M NaCl pH 9,5) przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  15. Połóż membranę na folii z tworzywa sztucznego i nasącz ją podłożem (patrz Tabela materiałów). Inkubować 5 minut w ciemności.
  16. Uszczelnij membranę folią z tworzywa sztucznego. Umieść membranę w kasecie autoradiografii.
  17. Wystaw membranę na film autoradiograficzny w dedykowanym ciemnym pomieszczeniu.
    UWAGA: Czas ekspozycji zależy od siły sygnału, od kilku sekund do minut.
  18. Odsłoń naświetloną folię w automatycznym urządzeniu wywołującym.

10. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania RNA

UWAGA: Ten krok dotyczy tylko RNA ekstrahowanych z frakcji E i CE.

  1. Do każdej próbki dodać 10 μl 10x buforu DNazy i DNazy I (1 U/μg traktowanych RNA). Dodać wodę do końcowej objętości 100 μl.
  2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Ekstrahuj i oczyszczaj RNA zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki od 8.2 do 8.11).
  4. Zawiesić osad RNA w 20 μl ultraczystej wody.
    UWAGA: Obecność pozostałego DNA można sprawdzić za pomocą PCR i specyficznych starterów (np. genu 16S).
  5. Ocenić ilość i jakość RNA za pomocą systemu analizy elektroforezy opartego na mikroprzepływach (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: 1 μg uzyskuje się na ogół we frakcji elucyjnej (E) po traktowaniu DNazą.
  6. Usuń rybosomalne RNA za pomocą bakteryjnego zestawu do zmniejszania rRNA.
    UWAGA: Duże i obfite RNA (tj. rRNA) mają tendencję do niespecyficznego oddziaływania z kolumną powinowactwa. Do wykonania tego kroku wymagane jest 500 ng wyekstrahowanego RNA.
  7. Ponownie oceń ilość i jakość RNA za pomocą systemu analizy elektroforezy opartego na mikrofluidyce.
  8. Przygotuj biblioteki cDNA z 10-20 ng rybodepletowanego RNA, korzystając z zestawu do przygotowania biblioteki cDNA i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Sekwencjonuj uzyskane biblioteki za pomocą przyrządu do sekwencjonowania (np. jednokońca, 150 pz; patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Generalnie wystarczy 5-10 milionów odczytów na próbkę.

11. Analiza danych RNAseq (Rysunek 2)

  1. Pobierz pliki sekwencjonowania FastQ z platformy sekwencjonowania.
  2. Uzyskaj dostęp do instancji Galaxy stacji biologicznej Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) i zaloguj się.
    UWAGA: Każdy wspomniany algorytm można łatwo znaleźć za pomocą paska wyszukiwania. Do każdego narzędzia dołączona jest instrukcja obsługi.
    UWAGA: Wersja wymaganych narzędzi może różnić się od publicznej wersji serwera Galaxy38.
  3. Kliknij ikonę Pobierz dane, a następnie Prześlij plik z komputera. Prześlij plik sekwencjonowania FastQ każdej kontroli MS2 i próbek MS2-sRNA. Prześlij również plik referencyjny genomu FASTA i plik adnotacji GFF.
  4. Uruchom raporty jakości odczytu FastQC (Galaxy Version 0.69).
    UWAGA: To narzędzie zapewnia ocenę jakości surowych sekwencji (np. wynik jakości, obecność sekwencji adaptera).
  5. Uruchom elastyczne narzędzie do przycinania odczytu Trimmomatic (Galaxy w wersji 0.36.6), aby wyraźnie usunąć sekwencje adapterów i odczyty o niskiej jakości. Wskaż sekwencje adapterów używane do przygotowania biblioteki (np. TruSeq 3, single-ended). Dodaj następujące operacje Trimmomatic: SLIDINGWINDOW (Liczba podstaw=4; Średnia jakość = 20) i MINLEN (Min. długość odczytów = 20).
  6. Uruchom ponownie raporty jakości odczytu FastQC (Galaxy w wersji 0.69).
  7. Uruchom Bowtie2 - mapa odczytuje genom referencyjny (Galaxy Version 2.3.2.2). Użyj pliku FASTA Genome Reference z historii, aby zmapować odczyty z ustawieniami domyślnymi (bardzo wrażliwe lokalne).
    UWAGA: Plik BAM wygenerowany przez narzędzie Bowtie2 może być wizualizowany za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV). Wymagany będzie również powiązany plik BAI.
  8. Opcjonalnie uruchom Flagstat, który kompiluje statystyki dla zestawu danych BAM (Galaxy w wersji 2.0).
  9. Uruchom htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1), który wyrównuje nakładające się obiekty w pliku adnotacji GFF. Użyj trybu Przecięcie (niepuste).
  10. Zarchiwizuj wszystkie nieprzetworzone pliki zliczeń z analizy htseq w jednym pliku Zip.
  11. Uruchom SARTools DESeq2, aby porównać dane (Galaxy w wersji 1.6.3.0). Podaj plik zip zawierający nieprzetworzone pliki zliczania i plik projektu, plik rozdzielany tabulatorami opisujący eksperyment. Dokładnie postępuj zgodnie z podanymi instrukcjami, aby wygenerować plik projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki pochodzą z badania celu RsaC u S. aureus29. RsaC jest niekonwencjonalnym sRNA o długości 1 116 nt. Jego koniec 5' zawiera kilka powtarzających się regionów, podczas gdy jego koniec 3' (544 nt) jest strukturalnie niezależny i zawiera wszystkie przewidywane miejsca interakcji z celami mRNA. Ekspresja tego sRNA jest indukowana, gdy mangan (Mn) jest rzadki, co często występuje w kontekście odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Korzystając z technologii MAPS, zidentyfik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowany protokół dla bakterii Gram-dodatnich
Wstępny protokół MAPS został opracowany w celu zbadania interaktomu sRNA w organizmie modelowym E. coli20,30. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół, który jest odpowiedni do scharakteryzowania zależnych od sRNA sieci regulacyjnych w oportunistycznym ludzkim patogenie S. aureus i z pewnością można go przenieść na inne bakterie Gram-dodatnie, chorobotwórcze lub nie.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, oraz ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, do PR). Został on również opublikowany w ramach labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 oraz ANR-17-EURE-0023 (do PR), jako finansowanie przez państwo zarządzane przez ANR w ramach programu Inwestycje na przyszłość. DL otrzymał wsparcie w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr 753137-SaRNAReg. Prace w E. Massé Lab zostały wsparte grantami operacyjnymi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlSarstedt72.690.001
15 ml probówki wirówkoweFalcon352070
Probówka do mikrowirówek 2 mlStarstedt72.691
2100 Instrument do bioanalizowaniaAgilentG2939BAilość i jakość RNA
250 ml kolba hodowlanaDominique Dutscher2515074Bakteryjne kultury
50 ml probówki wirówkoweFalcon352051Wirowanie kultur
Etanol absolutnyVWR Chemicals20821.321Ekstrakcja i oczyszczanie RNA Wirówka
Allegra X-12RBeckman CoulterPeletowanie bakteryjne
Ampicilin (amp)Sigma-AldrichA9518-5GPożywka
wzrostowa Żywica amylozowa Nowość Anglia BioLabsE8021SOczyszczanie powinowactwa MS2
Antydioksygenina AP Fragment FabSigma Aldrich11093274910Testy Northern blot
Kaseta autoradiografiiThermoFisher Scientific50-212-726Testy Northern blot
BamHIThermoFisher ScientificER0051Budowa plazmidu
Bulion BHI (Brain Heart Infusion)Sigma-Aldrich53286Pożywka wzrostowa
Odczynnik blokującySigma Aldrich11096176001Testy Northern blot
CDP-StarSigma Aldrich11759051001Testy Northern blot (substrat)
Wirówka 5415 REkstrakcja i oczyszczanie RNAEppendorf
ChloroformDominique Dutscher508320-CEREkstrakcja RNA i oczyszczanie
Mieszanka do znakowania DIG-RNASigma-Aldrich11277073910Testy Northern blot
DNase IRoche4716728001leczenie DNazy
Erytromycyna (ery)Sigma-AldrichFluka 45673Pożywka wzrostowa
Urządzenie FastPrepMP Biomedicals116004500Mechaniczna liza
TiocyjanianguaniduTesty Northern blot Sigma-AldrichG9277-250G
Hybrydyzacja Hoven HybrigeneTechneFHB4DDTesty Northern blot
Probówki hybrydyzacyjneTechneFHB16Testy Northern blot
Alkohol izoamylowyFisher ScientificA/6960/08Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
LB (bulion lizogenny)Sigma-AldrichL3022Pożywka wzrostowa
Lysing Matrix B BulkMP Biomedicals6540-428Mechaniczna liza
MicroPulser ElectroporatorBioRad1652100Budowa plazmidu
Urządzenie wodne Milli-Q MilliporeZ00QSV0WWNanoDrop do wody ultraczystej
Membrana nitrocelulozowaDominique Dutsher10600002Testy Northern blot
Phembact NeutrePHEM TechnologiesBAC03-5-11205Czyszczenie i odkażanie
FenolCarl Roth38.2Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530Budowa plazmidu
pMBP-MS2Addgene65104Produkcja MS2-MBP
Kolumna chromatograficzna Poly-PrepBioRad7311550Oczyszczanie powinowactwa MS2
PstIThermoFisher ScientificER0615Konstrukcja plazmidu
Fluorometr Qubit 3Invitrogen15387293ilość RNA
Roztwór RNAProMP Biomedicals6055050Mechaniczna liza
Kompletny zestaw ScriptSeqIlluminaBB1224Przygotowanie bibliotek cDNA
Spektrofotometr Genesys 20ThermoFisher Scientific11972278Kultury bakteryjne
Urządzenie próżniowe SpeedVac SavantEkstrakcja i oczyszczanie RNAThermoFisher ScientificDNA120
Stratalinker UV Crosslinker 1800Stratagene400672Testy Northern blot
Ligaza DNA T4ThermoFisher ScientificEL0014Budowa plazmidu
TBE (Tris-Borate-EDTA)EuromedexET020-CTesty Northern blot
ThermalCycler T100BioRad1861096Budowa plazmidu
Tween 20Sigma AldrichP9416-100MLTesty Northern blot
Procesor filmu rentgenowskiegohu.qHQ-350XTTesty Northern blot
Filmy rentgenowskie Super RX-NFujiFilm4741019318Testy Northern blot
Spektrofotometr Ilość i jakość ThermoFisher Scientific RNA/DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
  2. Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
  3. Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
  4. Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524(2020).
  5. Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
  6. Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506(2020).
  7. Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
  8. Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
  9. Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
  10. Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
  11. Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
  12. Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
  13. Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
  14. Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
  15. Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
  16. Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10(2007).
  17. Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
  18. Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
  19. Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
  20. Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
  21. Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
  22. Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
  23. Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
  24. Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
  25. Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
  26. Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
  27. Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
  28. Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
  29. Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
  30. Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
  31. Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
  32. Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
  33. Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
  34. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  35. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
  36. Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
  37. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
  38. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
  39. Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
  40. Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
  41. Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja cel w sRNAchromatografia amylozowamechaniczna liza kom rekanaliza Northern blotanaliza bioinformatycznaStaphylococcus aureussRNA RsaC

Powiązane artykuły