Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61731

⸱

23 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

W tym artykule

Podsumowanie

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Streszczenie

Chociaż małe regulatorowe RNA (sRNA) są szeroko rozpowszechnione w bakteryjnej domenie życia, funkcje wielu z nich pozostają słabo scharakteryzowane, szczególnie z powodu trudności w identyfikacji ich celów mRNA. W tym miejscu opisaliśmy zmodyfikowany protokół oczyszczania MS2-Affinity w połączeniu z technologią sekwencjonowania RNA (MAPS), mający na celu ujawnienie wszystkich partnerów RNA określonego sRNA in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, aptamer MS2 jest połączony z końcem 5' interesującego nas sRNA. Konstrukt ten jest następnie wyrażany in vivo, umożliwiając MS2-sRNA interakcję ze swoimi partnerami komórkowymi. Po zebraniu bakterii komórki są poddawane lizie mechanicznej. Surowy ekstrakt jest ładowany do kolumny chromatograficznej na bazie amylozy, uprzednio pokrytej białkiem MS2 połączonym z białkiem wiążącym maltozę. Umożliwia to specyficzne wychwytywanie MS2-sRNA i oddziałujących RNA. Po elucji wspólnie oczyszczone RNA są identyfikowane przez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA, a następnie analizę bioinformatyczną. Poniższy protokół został wdrożony w ludzkim patogenie Gram-dodatnim Staphylococcus aureus i w zasadzie można go przenieść na dowolną bakterię Gram-dodatnią. Podsumowując, technologia MAPS stanowi skuteczną metodę dogłębnego zbadania sieci regulacyjnej danego sRNA, oferując migawkę całego jego celu. Należy jednak pamiętać, że przypuszczalne cele zidentyfikowane przez MAPS nadal muszą zostać zweryfikowane za pomocą uzupełniających podejść eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Setki, a może nawet tysiące małych regulatorowych RNA (sRNA) zostały zidentyfikowane w większości genomów bakteryjnych, ale funkcje zdecydowanej większości z nich pozostają niescharakteryzowane. Ogólnie rzecz biorąc, sRNA są krótkimi, niekodującymi cząsteczkami, odgrywającymi główną rolę w fizjologii bakterii i adaptacji do zmiennych środowisk1,2,3. Rzeczywiście, te makrocząsteczki znajdują się w centrum wielu skomplikowanych sieci regulacyjnych, wpływając na szlaki metaboliczne, reakcje na stres, ale także zjadliwość i oporność na antybiotyki. Logicznie rzecz biorąc, ich synteza jest wyzwalana przez określone bodźce środowiskowe (np. głód składników odżywczych, stresy oksydacyjne lub błonowe). Większość sRNA reguluje wiele docelowych mRNA na poziomie potranskrypcyjnym poprzez krótkie i nieciągłe parowanie zasad. Zazwyczaj zapobiegają one inicjacji translacji, konkurując z rybosomami o regiony inicjacji translacji4. Tworzenie dupleksów sRNA:mRNA często powoduje również aktywną degradację docelowego mRNA poprzez rekrutację specyficznych RNaz.

Charakterystyka celu sRNA (tj. całego zestawu jego docelowych RNA) pozwala na identyfikację szlaków metabolicznych, w które interweniuje, oraz potencjalnego sygnału, na który reaguje. W związku z tym funkcje specyficznego sRNA można ogólnie wywnioskować z jego celu. W tym celu opracowano kilka narzędzi do przewidywania in silico, takich jak IntaRNA i CopraRNA5,6,7. Opierają się one w szczególności na komplementarności sekwencji, energii parowania i dostępności potencjalnego miejsca interakcji w celu określenia przypuszczalnych partnerów sRNA. Jednak algorytmy predykcyjne nie uwzględniają wszystkich czynników wpływających na parowanie zasad in vivo, takich jak udział chaperonów RNA8 faworyzujących nieoptymalne interakcje lub koekspresję obu partnerów. Ze względu na ich nieodłączne ograniczenia, odsetek wyników fałszywie dodatnich narzędzi predykcyjnych pozostaje wysoki. Większość eksperymentalnych podejść na dużą skalę opiera się na wspólnym oczyszczaniu par sRNA:mRNA oddziałujących ze znakowanym białkiem wiążącym RNA (RBP)6,9. Na przykład metoda RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) zidentyfikowała dupleksy RNA oczyszczone z białkami opiekuńczymi RNA, takimi jak Hfq i ProQ, w Escherichia coli10,11. Podobna technologia zwana UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) została zastosowana do sRNazy E i sRNA związanych z Hfq w E. coli12,13. Pomimo dobrze opisanej roli Hfq i ProQ w regulacji za pośrednictwem sRNA u wielu bakterii8,14,15, regulacja oparta na sRNA wydaje się być niezależna od opiekuńczego RNA w kilku organizmach, takich jak S. aureus16,17,18. Nawet jeśli oczyszczanie dupleksów RNA w połączeniu z RNazami jest wykonalne, jak zademonstrowali Waters i współpracownicy13, pozostaje to trudne, ponieważ RNazy powodują ich szybką degradację. W związku z tym oczyszczanie MS2-Affinity w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA (MAPS) 19,20 stanowi solidną alternatywę dla takich organizmów.

W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, MAPS wykorzystuje specyficzne sRNA jako przynętę do przechwytywania wszystkich oddziałujących RNA, a zatem nie polega na zaangażowaniu RBP. Cały proces jest przedstawiony w Rysunek 1. Krótko mówiąc, sRNA jest znakowane w 5' aptamerem MS2 RNA, który jest specyficznie rozpoznawany przez białko płaszcza MS2. Białko to jest łączone z białkiem wiążącym maltozę (MBP) w celu unieruchomienia na żywicy amylozy. Dlatego MS2-sRNA i jego partnerzy RNA są zatrzymywani na kolumnie chromatografii powinowactwa. Po elucji maltozą, oczyszczone RNA są identyfikowane za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, a następnie analizy bioinformatycznej (Rysunek 2). Technologia MAPS ostatecznie rysuje mapę interakcji wszystkich potencjalnych interakcji zachodzących in vivo.

Technologia MAPS została pierwotnie zaimplementowana w niepatogennej bakterii Gram-ujemnej E. coli21. Co ciekawe, projekt MAPS pomógł zidentyfikować fragment pochodzący z tRNA, który specyficznie oddziałuje zarówno z sRNA RyhB, jak i RybB i zapobiega jakiemukolwiek szumowi transkrypcyjnemu sRNA w celu regulacji celów mRNA w warunkach nieindukujących. Następnie MAPS został z powodzeniem zastosowany do innych sRNA E. coli, takich jak DsrA22, RprA23, CyaR23 i GcvB24 (Tabela 1). Oprócz potwierdzenia wcześniej znanych celów, MAPS rozszerzyło cel tych dobrze znanych sRNA. Niedawno przeprowadzono MAPS w Salmonella Typhimurium i ujawniono, że sRNA SraL wiąże się z mRNA rho, kodując czynnik terminacji transkrypcji25. Dzięki temu parowaniu SraL chroni mRNA rho przed przedwczesnym zakończeniem transkrypcji wywołanym przez sam Rho. Co ciekawe, technologia ta nie jest ograniczona do sRNA i może być stosowana do dowolnego typu komórkowego RNA, czego przykładem jest użycie fragmentu pochodzącego z tRNA26 i 5'-nieuleganego regionu mRNA22 (Tabela 1).

Metoda MAPS została również dostosowana do patogennej bakterii Gram-dodatniej S. aureus19. W szczególności protokół lizy został szeroko zmodyfikowany w celu skutecznego rozbijania komórek ze względu na grubszą ścianę komórkową niż bakterie Gram-ujemne i utrzymania integralności RNA. Ten zaadaptowany protokół już rozwikłał interaktom RsaA27, RsaI28 i RsaC29. Podejście to dostarczyło informacji na temat kluczowej roli tych sRNA w mechanizmach regulacyjnych właściwości powierzchni komórek, wychwytu glukozy i reakcji na stres oksydacyjny.

Protokół opracowany i wdrożony u E. coli w 2015 roku został niedawno opisany bardzo szczegółowo30. W tym miejscu udostępniamy zmodyfikowany protokół MAPS, który jest szczególnie odpowiedni do badania sieci regulacyjnych sRNA u bakterii Gram-dodatnich (grubsza ściana komórkowa), zarówno niepatogennych, jak i chorobotwórczych (środki ostrożności).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Bufory i pożywki

  1. Do eksperymentów MAPS przygotować następujące bufory i pożywki:
    - Bufor A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 i 1 mM DTT)
    - Bufor E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltozy, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 i 1 mM DTT)
    - Bufor do ładowania RNA (0,025% cyjanolu ksylenowego i 0,025% błękitu bromofenolowego w 8 M moczniku)
    - Pożywka Brain Heart Infusion (BHI) (12,5 g mózgu cielęcego, 10 g peptonu, 5 g serca wołowego, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 i 2 g glukozy na 1 L)
    - Pożywka Lysogeny Broth (LB) (10 g peptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl na 1 L)
  2. Do analiz Northern blot przygotować następujące bufory:
    - Roztwór blokujący (1x kwas maleinowy i 1% reagentu blokującego)
    - Roztwór do hybrydyzacji (50% formamidu, 5x SSC, 7% SDS, 1% roztworu blokującego i 0,2% N-laurosarkozyny, 50 mM fosforanu sodu). Podgrzewać z mieszaniem do czasu rozpuszczenia.
    UWAGA: Należy ściśle przestrzegać zasad bezpieczeństwa dotyczących każdego produktu.
    - 1 M fosforan sodu (58 mM fosforanu sodu dwuzasadowego i 42 mM fosforanu sodu jednozasadowego)
    - Bufor solno-cytryczanowy (SSC), stężenie 20x (3 M NaCl i 300 mM cytrynianu trisodowego)

2. Kwestie bezpieczeństwa

  1. Wszystkie etapy obejmujące pracę z żywymi bakteriami patogennymi należy przeprowadzić w laboratorium o 2. stopniu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
    UWAGA: Po przeprowadzeniu lizy (krok 5) poza laboratorium można wynieść jedynie ekstrakty komórkowe.
  2. Założyć fartuch laboratoryjny i rękawiczki.
  3. Upewnić się, że nadgarstki są zakryte.
  4. Oczyścić komorę z laminarnym przepływem powietrza (klasa II) roztworem dezynfekującym.
  5. Odpady stałe zanieczyszczone bakteriami należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady biomedyczne.
  6. Kolby zawierające zanieczyszczone ciecze należy potraktować roztworem dezynfekującym, a następnie wylać zawartość do zlewu.
  7. Przed opuszczeniem laboratorium o 2. stopniu bezpieczeństwa biologicznego należy dokładnie umyć ręce i nadgarstki mydłem oraz zdjąć fartuch laboratoryjny.

3. Konstrukcja plazmidu

UWAGA: W celu klonowania kluczowe jest uprzednie zidentyfikowanie granic endogennego sRNA. Plasmidy pCN51-P3 i pCN51-P3-MS2 zostały opisane w pracy Tomasini et al. (2017)27. Promotor P3 umożliwia wysoką ekspresję sRNA w sposób zależny od gęstości komórek (tj. w momencie, gdy bakterie wchodzą w stacjonarną fazę wzrostu). Wiele sRNA gronkowców kumuluje się podczas tej fazy wzrostu.

  1. Należy przeprowadzić amplifikację sekwencji sRNA metodą PCR, wykorzystując polimerazę DNA o wysokiej wierności oraz termocykler. Należy ściśle przestrzegać instrukcji producenta oraz zapoznać się z opracowaniem Garibyan i Avashia (2013).31 po więcej szczegółów.
  2. Użyj następujących szablonów do zaprojektowania specyficznych starterów:
    Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, przedstawiający siły i momenty działające na belkę w analizie fizycznej.
    oraz 5’-CGCGGATCC(N)-3’ odpowiednio dla starterów prawego i lewego.
    UWAGA: Te oligonukleotydy umożliwiają przyłączenie sekwencji MS2 (zaznaczonej pogrubieniem) do końca 5’ interesującego sRNA. PstJa i BamMiejsca restrykcyjne HI (podkreślone) dodano na końcach 5’ i 3’ konstrukcji MS2-sRNA, aby sklonować amplikon do plazmidu pCN51-P327(N) odpowiada sekwencji specyficznej dla genu (15–20 nukleotydów).
  3. Streszczenie 1 µg plazmidu pCN51-P3 oraz 1 µg produktu PCR MS2-sRNA z dodatkiem 2 J odnośnika PstI oraz 1 j. BamHI w odpowiednim buforze zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C i oczyścić DNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR (patrz Tabela materiałów).
  5. W probówce o objętości 1,5 ml wymieszać trawiony plazmid pCN51-P3 (30 ng) oraz amplikon MS2-sRNA (stosunek molowy wektora do wkładki = 1:3). Patrz Revie et al. (198)32 aby zmaksymalizować wydajność ligacji. Dodać 1 µL buforu ligazy oraz 10 J T4 ligazy do każdej probówki. Dolewać do objętości 10 µL wodą ultrapure.
  6. Inkubować w temperaturze 22 °C przez co najmniej 2 h.
  7. Dodaj 5 µL mieszaniny ligacyjnej do 50 µL zamrożonych, chemicznie kompetentnych komórek DH5α *E. coli* komórki. Zapoznaj się z publikacją Seidman et al. (201)33 aby dowiedzieć się więcej na temat transformacji plazmidowej oraz komórek chemicznie kompetentnych.
  8. Inkubować przez 30 min na lodzie.
  9. Szok termiczny (45 s w temp. 42 °C) probówkę do transformacji, używając bloku grzewczego lub łaźni wodnej.
  10. Dodaj 900 µL pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  11. Płytka 100 µL zawiesiny bakteryjnej na płytkę z agarem LB z dodatkiem ampicyliny (100 µg/µL).  
    UWAGA: wektor pCN51-P3 koduje gen oporności na ampicylinę, co pozwala na wyselekcjonowanie wyłącznie E. coli klony niosące plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA.
  12. Wyizoluj plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA z nocnej hodowli bakteryjnej (5 ml) prowadzonej w obecności ampicyliny (100 µg/µL) przy użyciu zestawu do minipreparatyki plazmidowego DNA (patrz Tabela materiałów).
  13. Zweryfikuj konstrukt za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera34 przy użyciu następującego startera: 5’-TCTCGAAAATAATAGGG-3’. 
  14. Transformuj plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA do chemicznie kompetentnych komórek DC10B E. coli komórki. Powtórz kroki od 3.7 do 3.1.
  15. Wyizoluj plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA (patrz krok 3.12) i przeprowadź transformację 1-5 µg plazmidowego DNA do elektrokompetentnych komórek HG01 ΔsRNA S. aureus komórki za pomocą urządzenia do elektroporacji. Należy ściśle przestrzegać instrukcji producenta. Zapoznać się z publikacją Grosser i Richardson (2016)35 aby dowiedzieć się więcej o metodach przygotowania komórek elektrokompetentnych S. aureus.
    OSTRZEŻENIE: Ten etap obejmuje pracę z bakteriami patogennymi (patrz krok 2).
  16. Dodaj 900 µL pożywki BHI i inkubować w 37 °C przez 3 h.
  17. Wirować przez 1 min w prędkości 16 00 x g gOdrzuć nadpłyn.
  18. Resuspenduj osad w 100 µL podłoża BHI i wysiać zawiesinę bakteryjną na płytki z agarem BHI uzupełnionym o erytromycynę (10 µg/µL).  
    UWAGA: Wektor pCN51-P3 koduje również gen oporności na erytromycynę, co pozwala na selekcję wyłącznie S. aureus klony niosące plazmid pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Pozyskiwanie bakterii

UWAGA: Ten etap wiąże się z obchodzeniem się z bakteriami patogennymi (patrz krok 2).

  1. W dwóch powtórzeniach wyhodować jedną kolonię szczepów niosących plazmidy pCN51-P3-MS2-sRNA lub pCN51-P3-MS227 w 3 mL podłoża BHI z dodatkiem erytromycyny (10 µg/µL).
  2. Każdą kulturę nocną rozcieńczyć w 50 mL (≈1/10) świeżego podłoża BHI z dodatkiem erytromycyny (10 µg/µL), aby osiągnąć OD60nm wynoszącą 0,05. Należy użyć sterylnych kolb o pojemności 250 mL (stosunek objętości kolby do pożywki 5:1).
    UWAGA: Podłoże i warunki hodowli należy dostosować do wzorca ekspresji badanego sRNA.
  3. Hodować kultury w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 180 rpm przez 6 h.
  4. Przenieść każdą kulturę do probówki do wirowania o pojemności 50 mL.
  5. Wirować przy 2 90 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz.
  6. Przechowywać osady w lodzie i bezzwłocznie przeprowadzić mechaniczną lizę komórek (krok 5) lub zamrozić i przechowywać osady w temperaturze -80 °C.

5. Mechaniczna liza komórek

UWAGA: Następne kroki muszą być wykonywane na lodzie, a bufory muszą mieć temperaturę 4 °C. Należy używać rękawiczek i zachować wszelkie środki ostrożności, aby chronić próbki przed RNazami.

  1. Resuspendować osady (krok 4.6) w 5 mL Buforu A.
  2. Przenieść resuspendowane komórki do probówek wirówkowych o pojemności 15 mL zawierających 3,5 g kulek krzemionkowych (0,1 mm).
  3. Umieścić probówki w mechanicznym homogenizatorze do lizy komórek (patrz Tabela materiałów). Przeprowadzić cykl trwający 40 s przy prędkości 4,0 m/s.
    UWAGA: Jeśli jeden cykl nie wystarczy do rozbicia komórek, pozwolić urządzeniu ostygnąć przez 5 min, utrzymując próbki w lodzie. Następnie powtórzyć kolejny cykl 40 s przy 4,0 m/s. Efektywność lizy komórek można sprawdzić, wysiewając nadsącz na płytkę z agarem BHI.
  4. Wirować przy 15 70 x g przez 15 min. Zebrać nadsącz i przechowywać go w lodzie.

6. Przygotowanie kolumny

OSTROŻNIE: Należy dopilnować, aby żywica amylozowa nie wyschła. W razie potrzeby należy zamknąć kolumnę za pomocą zakrętki. Przed rozpoczęciem oczyszczania powinowactwa należy przygotować wszystkie roztwory.

  1. Umieść kolumnę chromatograficzną w statywie do kolumn (patrz Tabela materiałów).
  2. Zdejmij końcówkę kolumny i przemyj kolumnę wodą ultraczystą.
  3. Dodaj 30 µL żywicy amylozowej.
  4. Przemyj kolumnę 10 mL Buforu A.
  5. Rozcieńcz 1,20 pmol białka MBP-MS2 w 6 mL Buforu A i nanieś je na kolumnę.
  6. Przemyj kolumnę 10 mL Buforu A.

7. Oczyszczanie powinowactwa MS2 (Rycina 1)

  1. Nałóż lizat komórkowy na kolumnę.
    UWAGA: Odstaw 1 mL lizatu komórkowego (ekstrakt surowy, CE) w celu wyekstrahowania całkowitego RNA (krok 8) oraz przeprowadzenia analizy Northern blot (krok 9) i analizy transkrypcyjnej (krok 10).
  2. Zabierz frakcję przepłuku (FT) do czystej probówki zbiorczej.
  3. Przemyj kolumnę 3 razy, używając 10 mL Buforu A. Zabierz frakcję płukania (W).
  4. Eluuj kolumnę 1 mL Buforu E i zbierz frakcję elucji (E) do mikroprobówki o pojemności 2 mL.
  5. Przechowuj wszystkie zebrane frakcje na lodzie do czasu ekstrakcji RNA (krok 8) lub zamroź je w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

8. Ekstrakcja RNA z zebranych frakcji (CE, FT, W i E)

  1. Do ekstrakcji RNA należy wykorzystać 1 mL każdej frakcji (w tym FT i W).
  2. Dodać 1 objętość fenolu. Wymieszać energicznie.
    OSTRZEŻENIE: Fenol jest lotny i żrący, należy zachować ostrożność i pracować bezpiecznie pod wyciągiemstym.
  3. Wirować przy 16,0 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C.
  4. Przenieść górną fazę do czystej mikroprobówki o pojemności 2 mL.
  5. Dodać 1 objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1) i powtórzyć kroki 8.3–8.4.
    OSTRZEŻENIE: Pracować bezpiecznie pod wyciągiem.
  6. Dodać 2,5 objętości zimnego etanolu 10% oraz 1/10 objętości 3 M octanu sodu (NaOAc) o pH 5,2.
  7. Wytrącać przez noc w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Wytrącanie można również przeprowadzić w kąpieli etanolowej z suchym lodem przez 20 min lub w temperaturze -80 °C przez 2 h.
  8. Wirować przy 16,0 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Powoli usunąć etanol pipetą, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    OSTRZEŻENIE: Osad RNA nie zawsze jest widoczny i czasami jest luźny w obecności etanolu.
  9. Dodać 50 µL 80% zimnego etanolu.
  10. Wirować przy 16,0 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  11. Usunąć etanol, pipetując go powoli. Osuszyć osad za pomocą koncentratora próżniowego przez 5 min w trybie pracy.
  12. Resuspender osad w odpowiedniej objętości (15-50 µL) wody ultrapure. Zamrozić osad w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
  13. Ocenić ilość RNA (260 nm) oraz jego jakość (stosunki długości fal 260/280 i 260/230) za pomocą spektrofotometru/fluorometru (patrz Tabela materiałów). Starannie postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: W frakcji elucyjnej (E) zazwyczaj uzyskuje się 3-4 µg. Zależy to głównie od testowanych warunków.

9. Analiza oczyszczania z powinowactwem do MS2 za pomocą Northern blot36

  1. Rozcieńczenie 5 µg RNA frakcji CE, FT, W oraz 500 ng frakcji E w 10 µL wody ultrapurej i wymieszanie z 10 µL buforu do nakładania RNA.
  2. Inkubacja przez 3 min w temperaturze 90 °C.
  3. Nałożenie próbek do studzienek 1% żelu agarozy uzupełnionego o 20 mM tiocyjanianu guanydyny i prowadzenie elektroforezy przy napięciu 10-150 V w buforze TBE 1x w temperaturze 4 °C. Szczegóły znajdują się w pracy Koontz (2013)37.
  4. Przeniesienie RNA na membranę nitrocelulozową poprzez transfer próżniowy przez 1 h lub transfer kapilarny przez noc.
    UWAGA: Metoda kapilarna jest bardziej efektywna w przypadku dużych cząsteczek RNA.
  5. Utrwalenie RNA na membranie za pomocą wiązań sieciujących pod wpływem UV (120 mJ przy 254 nm) przy użyciu urządzenia do sieciowania UV.
  6. Umieszczenie membrany w butelce do hybrydyzacji stroną z RNA do góry.
  7. Dodanie 10-20 mL podgrzanego roztworu do hybrydyzacji. Inkubacja przez 30 min w temperaturze 68 °C.
  8. Odlanie roztworu i dodanie 10-20 mL świeżego roztworu do hybrydyzacji uzupełnionego o 1 µL sondy specyficznej dla sRNA. Inkubacja przez noc w temperaturze 68 °C.
    UWAGA: Sonda RNA znakowana DIG jest syntetyzowana przy użyciu zestawu do znakowania RNA DIG zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie można zastosować sondę znakowaną radioaktywnie.
  9. Przemycie membrany 10-20 mL roztworu do płukania 1 (2x SSC i 0,1% SDS) przez 5 min w temperaturze 20 °C. Powtórzyć czynność raz.
  10. Przemycie membrany 10-20 mL roztworu do płukania 2 (0,2x SSC i 0,1% SDS) przez 15 min w temperaturze 68 °C. Powtórzyć czynność raz.
  11. Inkubacja z 10-20 mL roztworu blokującego przez co najmniej 30 min w temperaturze 20 °C.
  12. Odlanie roztworu i dodanie 10-20 mL roztworu blokującego uzupełnionego o poliklonalne przeciwciało anty-digoksygeninowe (1/100), sprzężone z fosfatazą alkaliczną. Inkubacja przez 30 min w temperaturze 20 °C.
  13. Przemycie membrany 10-20 mL roztworu do płukania 3 (1x kwas maleinowy i 0,3% Tween 20) przez 15 min w temperaturze 20 °C. Powtórzyć czynność raz.
  14. Inkubacja membrany z 10-20 mL roztworu detekcyjnego (0,1 M Tris HCl i 0,1 M NaCl pH 9,5) przez 5 min w temperaturze 20 °C.
  15. Położenie membrany na folii plastikowej i nasączenie substratem (patrz Tabela materiałów). Inkubacja przez 5 min w ciemności.
  16. Zapieczętowanie membrany w folii plastikowej. Umieszczenie membrany w kasecie do autoradiografii.
  17. Naświetlanie membrany na film autoradiograficzny w dedykowanej ciemni.
    UWAGA: Czas naświetlania zależy od siły sygnału i wynosi od kilku sekund do kilku minut.
  18. Wywołanie naświetlonego filmu w automatycznej wywoływarce.

10. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania RNA

UWAGA: Ten krok dotyczy wyłącznie RNA wyekstrahowanego z frakcji E i CE.

  1. Do każdej próbki dodać 10 µL buforu do DNazy 10x oraz DNazę I (1 U/µg traktowanego RNA). Dopełnić wodą do objętości końcowej 100 µL.
  2. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  3. Wyekstrahować i oczyścić RNA zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 8.2 do 8.1).
  4. Resuspendować osad RNA w 20 µL wody ultrapurej.
    UWAGA: Obecność pozostałego DNA można sprawdzić za pomocą PCR i specyficznych starterów (np. genu 16S).
  5. Ocenić ilość i jakość RNA, korzystając z systemu analizy elektroforetycznej opartego na mikrofluidyce (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: W frakcji elucyjnej (E) po traktowaniu DNazą zazwyczaj uzyskuje się 1 µg.
  6. Usunąć rybosomalne RNA za pomocą zestawu do usuwania bakteryjnego rRNA.
    UWAGA: Duże i liczne cząsteczki RNA (tj. rRNA) mają tendencję do niespecyficznych oddziaływań z kolumną powinowactwa. Do wykonania tego kroku wymagane jest 50 ng wyekstrahowanego RNA.
  7. Ponownie ocenić ilość i jakość RNA, korzystając z systemu analizy elektroforetycznej opartego na mikrofluidyce.
  8. Przygotować biblioteki cDNA z 10-20 ng RNA pozbawionego rybosomów, używając zestawu do przygotowania bibliotek cDNA i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Zsekwencjonować otrzymane biblioteki za pomocą instrumentu do sekwencjonowania (np. single-end, 150 bp; patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zazwyczaj wystarczające jest 5-10 milionów odczytów na próbkę.

11. Analiza danych RNAseq (Rycina 2)

  1. Pobierz pliki z sekwencjonowania w formacie FastQ z platformy sekwencyjnej.
  2. Przejdź do instancji Galaxy stacji biologicznej w Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) i zaloguj się.
    UWAGA: Każdy wymieniony algorytm można łatwo odnaleźć za pomocą paska wyszukiwania. Dla każdego narzędzia dostępny jest przewodnik użytkownika.
    OSTRZEŻENIE: Wersje wymaganych narzędzi mogą różnić się od wersji dostępnych na publicznym serwerze Galaxy38.
  3. Kliknij ikonę Get Data, a następnie Upload File from your computer. Prześlij pliki sekwencjonowania FastQ dla każdej kontroli MS2 oraz próbek MS2-sRNA. Prześlij również plik referencyjnego genomu w formacie FASTA oraz plik adnotacji GFF.
  4. Uruchom raporty jakości odczytów FastQC (wersja Galaxy 0.69).
    UWAGA: Narzędzie to umożliwia ocenę jakości surowych sekwencji (np. wynik jakości, obecność sekwencji adapterów).
  5. Uruchom narzędzie do elastycznego przycinania odczytów Trimmomatic (wersja Galaxy 0.36.6), aby usunąć sekwencje adapterów oraz odczyty słabej jakości. Wskaż sekwencje adapterów użyte do przygotowania biblioteki (np. TruSeq 3, single-ended). Dodaj następujące operacje Trimmomatic: SLIDINGWINDOW (Number of bases=4; Average quality=20) oraz MINLEN (Min length of reads=20).
  6. Ponownie uruchom raporty jakości odczytów FastQC (wersja Galaxy 0.69).
  7. Uruchom Bowtie2 - map reads against reference genome (wersja Galaxy 2.3.2.2). Użyj pliku Genome Reference FASTA z historii, aby zmapować odczyty przy użyciu ustawień domyślnych (very sensitive local).
    UWAGA: Plik BAM wygenerowany przez narzędzie Bowtie2 może być wizualizowany za pomocą programu Integrative Genomics Viewer (IGV). Wymagany będzie również powiązany plik BAI.
  8. Opcjonalnie uruchom Flagstat, który kompiluje statystyki dla zbioru danych BAM (wersja Galaxy 2.0).
  9. Uruchom htseq-count - Count (wersja Galaxy 0.6.1), który zlicza odczyty nakładające się na cechy w pliku adnotacji GFF. Użyj trybu Intersection (non-empty).
  10. Zarchiwizuj wszystkie pliki z surowymi zliczeniami z analizy htseq-count w jednym pliku Zip.
  11. Uruchom SARTools DESeq2 w celu porównania danych (wersja Galaxy 1.6.3.0). Dostarcz plik Zip zawierający pliki z surowymi zliczeniami oraz plik projektu (design file), czyli plik z rozdzielaczem tabulacyjnym opisujący eksperyment. Dokładnie postępuj zgodnie z dostarczonymi instrukcjami w celu wygenerowania pliku projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pochodzą z badania targetomu RsaC u S. aureus29. RsaC jest niekonwencjonalnym sRNA o długości 116 nt. Jego koniec 5’ zawiera kilka regionów powtarzalnych, natomiast koniec 3’ (54 nt) jest strukturalnie niezależny i zawiera wszystkie przewidywane miejsca oddziaływania z docelowymi mRNA. Ekspresja tego sRNA jest indukowana w warunkach niedoboru manganu (Mn), co często występuje w kontekście odpowiedzi odpornościowej gospodarza. Wykorzystując technologię MAPS, zidentyf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmodyfikowany protokół dla bakterii Gram-dodatnich
Wstępny protokół MAPS został opracowany w celu zbadania interaktomu sRNA w organizmie modelowym E. coli20,30. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół, który jest odpowiedni do scharakteryzowania zależnych od sRNA sieci regulacyjnych w oportunistycznym ludzkim patogenie S. aureus i z pewnością można go przenieść na inne bakterie Gram-dodatnie, chorobotwórcze lub nie.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, oraz ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, do PR). Został on również opublikowany w ramach labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 oraz ANR-17-EURE-0023 (do PR), jako finansowanie przez państwo zarządzane przez ANR w ramach programu Inwestycje na przyszłość. DL otrzymał wsparcie w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr 753137-SaRNAReg. Prace w E. Massé Lab zostały wsparte grantami operacyjnymi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlSarstedt72.690.001
15 ml probówki wirówkoweFalcon352070
Probówka do mikrowirówek 2 mlStarstedt72.691
2100 Instrument do bioanalizowaniaAgilentG2939BAilość i jakość RNA
250 ml kolba hodowlanaDominique Dutscher2515074Bakteryjne kultury
50 ml probówki wirówkoweFalcon352051Wirowanie kultur
Etanol absolutnyVWR Chemicals20821.321Ekstrakcja i oczyszczanie RNA Wirówka
Allegra X-12RBeckman CoulterPeletowanie bakteryjne
Ampicilin (amp)Sigma-AldrichA9518-5GPożywka
wzrostowa Żywica amylozowa Nowość Anglia BioLabsE8021SOczyszczanie powinowactwa MS2
Antydioksygenina AP Fragment FabSigma Aldrich11093274910Testy Northern blot
Kaseta autoradiografiiThermoFisher Scientific50-212-726Testy Northern blot
BamHIThermoFisher ScientificER0051Budowa plazmidu
Bulion BHI (Brain Heart Infusion)Sigma-Aldrich53286Pożywka wzrostowa
Odczynnik blokującySigma Aldrich11096176001Testy Northern blot
CDP-StarSigma Aldrich11759051001Testy Northern blot (substrat)
Wirówka 5415 REkstrakcja i oczyszczanie RNAEppendorf
ChloroformDominique Dutscher508320-CEREkstrakcja RNA i oczyszczanie
Mieszanka do znakowania DIG-RNASigma-Aldrich11277073910Testy Northern blot
DNase IRoche4716728001leczenie DNazy
Erytromycyna (ery)Sigma-AldrichFluka 45673Pożywka wzrostowa
Urządzenie FastPrepMP Biomedicals116004500Mechaniczna liza
TiocyjanianguaniduTesty Northern blot Sigma-AldrichG9277-250G
Hybrydyzacja Hoven HybrigeneTechneFHB4DDTesty Northern blot
Probówki hybrydyzacyjneTechneFHB16Testy Northern blot
Alkohol izoamylowyFisher ScientificA/6960/08Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
LB (bulion lizogenny)Sigma-AldrichL3022Pożywka wzrostowa
Lysing Matrix B BulkMP Biomedicals6540-428Mechaniczna liza
MicroPulser ElectroporatorBioRad1652100Budowa plazmidu
Urządzenie wodne Milli-Q MilliporeZ00QSV0WWNanoDrop do wody ultraczystej
Membrana nitrocelulozowaDominique Dutsher10600002Testy Northern blot
Phembact NeutrePHEM TechnologiesBAC03-5-11205Czyszczenie i odkażanie
FenolCarl Roth38.2Ekstrakcja i oczyszczanie RNA
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530Budowa plazmidu
pMBP-MS2Addgene65104Produkcja MS2-MBP
Kolumna chromatograficzna Poly-PrepBioRad7311550Oczyszczanie powinowactwa MS2
PstIThermoFisher ScientificER0615Konstrukcja plazmidu
Fluorometr Qubit 3Invitrogen15387293ilość RNA
Roztwór RNAProMP Biomedicals6055050Mechaniczna liza
Kompletny zestaw ScriptSeqIlluminaBB1224Przygotowanie bibliotek cDNA
Spektrofotometr Genesys 20ThermoFisher Scientific11972278Kultury bakteryjne
Urządzenie próżniowe SpeedVac SavantEkstrakcja i oczyszczanie RNAThermoFisher ScientificDNA120
Stratalinker UV Crosslinker 1800Stratagene400672Testy Northern blot
Ligaza DNA T4ThermoFisher ScientificEL0014Budowa plazmidu
TBE (Tris-Borate-EDTA)EuromedexET020-CTesty Northern blot
ThermalCycler T100BioRad1861096Budowa plazmidu
Tween 20Sigma AldrichP9416-100MLTesty Northern blot
Procesor filmu rentgenowskiegohu.qHQ-350XTTesty Northern blot
Filmy rentgenowskie Super RX-NFujiFilm4741019318Testy Northern blot
Spektrofotometr Ilość i jakość ThermoFisher Scientific RNA/DNA

Bibliografia

  1. Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
  2. Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
  3. Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
  4. Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524(2020).
  5. Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
  6. Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506(2020).
  7. Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
  8. Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
  9. Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
  10. Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
  11. Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
  12. Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
  13. Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
  14. Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
  15. Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
  16. Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10(2007).
  17. Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
  18. Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
  19. Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
  20. Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
  21. Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
  22. Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
  23. Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
  24. Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
  25. Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
  26. Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
  27. Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
  28. Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
  29. Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
  30. Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
  31. Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
  32. Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
  33. Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
  34. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  35. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
  36. Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
  37. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
  38. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
  39. Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
  40. Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
  41. Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Identyfikacja cel w sRNAchromatografia amylozowamechaniczna liza kom rekanaliza Northern blotanaliza bioinformatycznaStaphylococcus aureussRNA RsaC
Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.