Artykuł metodologiczny

Izolacja, proliferacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej makaka rezusa

DOI:

10.3791/61732

⸱

26 maja 2021

 ,  , 
1Department of Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center - New Orleans, 2Comprehensive Alcohol-HIV/AIDS Research Center, Louisiana State University Health Sciences Center - New Orleans

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzących z makaków rezusów (ADSC) za pomocą protokołu enzymatycznego trawienia tkanek. Następnie opisujemy proliferację ADSC, która obejmuje odłączanie komórek, liczenie i powlekanie. Na koniec opisano różnicowanie ADSC przy użyciu specyficznych środków indukujących adipogen. Dodatkowo opisujemy techniki barwienia w celu potwierdzenia różnicowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa stanowi bogate i dostępne źródło multipotencjalnych komórek macierzystych, które są zdolne do samoodnawiania się. Te komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) zapewniają spójny system komórkowy ex vivo, który jest funkcjonalnie podobny do adipocytów in vivo. Zastosowanie ADSC w badaniach biomedycznych pozwala na komórkowe badanie regulacji metabolicznej i funkcji tkanki tłuszczowej. Różnicowanie ADSC jest niezbędne do odpowiedniej ekspansji adipocytów, a nieoptymalne różnicowanie jest głównym mechanizmem dysfunkcji tkanki tłuszczowej. Zrozumienie zmian w różnicowaniu ADSC ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozwoju dysfunkcji metabolicznej i choroby. Protokoły opisane w tym manuskrypcie, gdy będą przestrzegane, dadzą dojrzałe adipocyty, które można wykorzystać do kilku testów funkcjonalnych in vitro w celu oceny funkcji metabolicznej ADSC, w tym między innymi do testów mierzących wychwyt glukozy, lipolizę, lipogenezę i wydzielanie. Makaki rezusy (Macaca mulatta) są fizjologicznie, anatomicznie i ewolucyjnie podobne do ludzi i jako takie ich tkanki i komórki były szeroko wykorzystywane w badaniach biomedycznych i do opracowywania metod leczenia. W tym artykule opisano izolację ADSC za pomocą świeżej podskórnej i omentalnej tkanki tłuszczowej pozyskanej od 4–9 letnich makaków rezusów. Próbki tkanki tłuszczowej są trawione enzymatycznie w kolagenazie, a następnie filtrowane i odwirowywane w celu wyizolowania ADSC z frakcji naczyniowej zrębu. Wyizolowane ADSC są namnażane w środowiskach zrębowych, a następnie przez około 14–21 dni różnicowania przy użyciu koktajlu 0,5 μg/ml deksametazonu, 0,5 mM izobutylometyloksantyny i 50 μM indometacyny w środowisku zrębowym. Dojrzałe adipocyty obserwuje się po około 14 dniach różnicowania. W tym manuskrypcie opisujemy protokoły izolacji, proliferacji i różnicowania ADSC in vitro. Chociaż skupiliśmy się na ADSC z tkanki tłuszczowej makaka rezusa, protokoły te można wykorzystać do tkanki tłuszczowej uzyskanej od innych zwierząt przy minimalnych korektach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa składa się z niejednorodnej mieszaniny komórek, głównie dojrzałych adipocytów i zrębowej frakcji naczyniowej, w tym fibroblastów, komórek odpornościowych i komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)1,2,3. Pierwotne ADSC mogą być izolowane bezpośrednio z białej tkanki tłuszczowej i stymulowane do różnicowania się w adipocyty, chrząstki lub komórki kostne4. ADSC wykazują klasyczne cechy komórek macierzystych, takie jak utrzymanie multipotencji in vitro i samoodnawianie; i są zwolennikami plastiku w kulturze5,6. ADSC są ważne dla zastosowania w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich wielomoc i zdolność do łatwego zbierania w dużych ilościach przy użyciu technik nieinwazyjnych7. Dyferencjacja adipogenna ADSC wytwarza komórki, które funkcjonalnie naśladują dojrzałe adipocyty, w tym akumulację lipidów, wychwyt glukozy stymulowany insuliną, lipolizę i wydzielanie adipokin8. Ich podobieństwo do dojrzałych adipocytów doprowadziło do powszechnego stosowania ADSC do fizjologicznego badania cech komórkowych i funkcji metabolicznych adipocytów. Istnieje coraz więcej dowodów potwierdzających tezę, że rozwój dysfunkcji i zaburzeń metabolicznych ma swoje źródło na poziomie komórkowym lub tkankowym9,10,11,12. Optymalne różnicowanie ADSC jest wymagane dla wystarczającej rozbudowy tkanki tłuszczowej, prawidłowego funkcjonowania adipocytów i skutecznej regulacji metabolicznej13.

Protokoły opisane w tym manuskrypcie to proste techniki wykorzystujące standardowy sprzęt laboratoryjny i podstawowe odczynniki. W manuskrypcie opisano najpierw protokół izolacji pierwotnych ADSC ze świeżej tkanki tłuszczowej za pomocą trawienia mechanicznego i enzymatycznego. Następnie opisano protokół proliferacji i pasażowania ADSC w ośrodku zrębowym. Na koniec opisano protokół adipogennego różnicowania ADSC. Po różnicowaniu komórki te mogą być wykorzystane do badań mających na celu lepsze zrozumienie metabolizmu adipocytów i mechanizmów dysfunkcji. Opisano również protokoły potwierdzania różnicowania adipogennego i detekcji kropelek lipidów za pomocą barwienia czerwienią olejową O i borem-dipyrrometenem (BODIPY). Szczegóły tych protokołów koncentrowały się na pierwotnych ADSC wyizolowanych ze świeżej tkanki tłuszczowej makaków rezusów. My i inni użyliśmy tego protokołu, aby skutecznie wyizolować ADSC z podskórnych i omentalnych tkanek tłuszczowych makaków rezusów14,15. Dla tej samej ilości użytej tkanki zaobserwowaliśmy, że podskórna tkanka tłuszczowa jest gęstsza, twardsza i daje mniej komórek z trawienia w porównaniu z tkanką tłuszczową omentalną. Protokół ten został również wykorzystany do izolacji ADSC od próbek ludzkiego tłuszczu16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie uzyskane tkanki i procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Stanowego Luizjany i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (publikacja NIH nr 85-12, poprawiona w 1996 roku).

1. Przygotowanie i roztworów

  1. Przygotować sterylny roztwór buforu do przemywania soli fizjologicznej buforowany 5-fosforanami (5-PBS), dodając 5% penicyliny/streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) i 0,25 μg/ml inhibitora grzybów do 1x PBS. Przygotować sterylny roztwór buforu płuczącego 2-PBS (2-PBS), dodając 2% pióra/paciorkowca i 0,25 μg/ml inhibitora grzybów w 1x PBS. do płukania można przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości i należy je zużyć w ciągu 4 tygodni.
    UWAGA: Bufor 5-PBS służy do pobierania tkanki tłuszczowej i wstępnego mycia w celu zminimalizowania możliwego zanieczyszczenia, ponieważ próbki tkanek uzyskane podczas sekcji zwłok są pobierane w niesterylnym środowisku.
  2. Przygotuj sterylny bufor kolagenazy (CB), łącząc 0,075% kolagenazy typu I (125 jednostek/mg aktywności), 2% pióra/paciorkowca i 0,25 μg/ml inhibitora grzybów w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) z 1% albuminą surowicy bydlęcej. CB należy zużyć w ciągu 1 godziny.
  3. Przygotować sterylną pożywkę wzrostową ADSC przy użyciu buforu α-MEM. Połącz 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml 200 ml roztworu L-glutaminy, 500 μl 0,25 μg/ml inhibitora grzybów i 10 ml roztworu wstrzykiwacza/paciorkowca w 394 ml buforu α-MEM. Pożywka wzrostowa ADSC może być przechowywana w temperaturze 4 °C i musi zostać zużyta w ciągu 4 tygodni.
    UWAGA: Inaktywacja termiczna FBS nie jest konieczna.
  4. Przygotować sterylną pożywkę różnicującą ADSC, łącząc pożywkę wzrostową ADSC, jak przygotowano powyżej, i środki indukcyjne w celu uzyskania końcowego stężenia 0,5 μg/ml deksametazonu, 0,5 mM izobutylu metyloksysantyny i 50 μM indometacyny.

2. Izolacja ADSC

  1. Przygotowanie tkanek i trawienie
    1. Odpipetować ~10 ml buforu 5-PBS do czterech 100-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych.
    2. Przenieść ~50 g próbki tkanki tłuszczowej do jednej z 100 mm szalek zawierających 5-PBS. Pobraną próbkę tkanki tłuszczowej należy przemyć czterokrotnie, przenosząc ją kolejno przez cztery szalki hodowlane zawierające 5-PBS.
    3. Przenieść próbkę tkanki tłuszczowej do czystego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm i dokładnie zmielić tkankę tłuszczową za pomocą nożyczek lub dwóch sterylnych skalpeli. Mielenie pozwala na zwiększenie powierzchni w celu wydajnego i kompletnego trawienia enzymatycznego.
    4. Przenieś zmieloną tkankę tłuszczową do 50 ml plastikowej stożkowej probówki zawierającej 13 ml CB (1-3 cm skrawek tkanki na 15 ml CB).
    5. Przepłukać naczynie hodowlane 2 ml CB i przenieść pożywkę do plastikowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: W tym momencie powinno znajdować się łącznie 15 ml CB z tkanką w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    6. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml, aby ułatwić mechaniczne trawienie tkanek.
    7. Inkubować stożkową probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml zawierającą tkankę w CB na kołysku ze średnią prędkością w temperaturze 37 °C przez 30–60 minut.
  2. Posiewanie ADSC do hodowli
    1. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej ADSC do probówki zawierającej tkankę o pojemności 50 ml, aby zneutralizować aktywność enzymu. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml w celu oddzielenia wszelkich agregatów tkanki tłuszczowej.
    2. Przenieś płynną porcję do nowej sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 ml, pozostawiając ciała stałe. Umyj oryginalną probówkę o pojemności 50 ml 3 razy ~ 7 ml buforu 2-PBS i przenieś płynną część do probówki o pojemności 50 ml.
    3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu komórkowego. Nie dekantować.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać 5 ml pożywki wzrostowej ADSC do probówki i wirować przy 500 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
    5. Dodać 5 ml pożywki wzrostowej ADSC i odwirować przy 500 x g przez 5 minut, aby przepłukać osad komórkowy. Odrzucić supernatant.
    6. Zawiesić osad w 2 ml pożywki wzrostowej ADSC i przefiltrować przez sitko o pojemności 70 μm do nowej sterylnej stożkowej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml.
    7. Przepłucz sitko do komórek dodatkowymi 2 ml pożywki wzrostowej ADSC. Przenieść 4 ml zawiesiny zawierającej ADSC z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.
    8. Przemyć stożkową probówkę o pojemności 50 ml 2 razy 3 ml pożywki wzrostowej ADSC i przenieść płyn do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego ADSC, co daje w sumie 10 ml pożywki w naczyniu hodowlanym.
    9. Obejrzyj komórki pod odwróconym mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy w podłożu nie ma komórek pływających, jak pokazano na Rysunek 1A. Komórki należy przechowywać w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności względnej 100%.
    10. Po 24 godzinach obejrzyj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić przyleganie komórek. Odessać pożywkę wzrostową ADSC z płytki i zastąpić ją 10 ml świeżej, ciepłej (37 °C) pożywki. Usuwaj i wymieniaj pożywkę co 48 godzin, aż komórki będą zlewne w 80%–90% (Rysunek 1B).
      UWAGA: Co najmniej 10–20% komórek będzie przylegać do ciała w ciągu 24 godzin. Sprawdź hodowlę komórkową pod kątem oznak zanieczyszczenia, takich jak ziarnistość komórek, zmętnienie pożywki lub wzrost zarodników. Gdy komórki zlewają się w 80%, można je zebrać w celu proliferacji i kriokonserwacji lub skłonić do różnicowania. ADSC mogą zostać rozszerzone do 4–6 przejść, zanim stracą zdolność do skutecznego rozprzestrzeniania się lub różnicowania.

3. Rozprzestrzenianie się ADSC

  1. Odłączenie komórki
    1. Usuń pożywkę wzrostową ADSC za pomocą aspiratora/pipety. Przepłukać zlewające się ADSC 2 razy za pomocą 2 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.
    2. Odessać PBS i dodać 2 ml 0,25 % trypsyny-EDTA na 100 mm płytkę hodowlaną. Upewnij się, że cała powierzchnia jest pokryta trypsyną.
    3. Inkubować płytkę przez ~7 min w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do odłączenia ADSC. Wyjąć płytkę z inkubatora i mechanicznie usunąć komórki, mocno pipetując roztwór trypsyny znajdujący się w płytce.
    4. Dodać 2 ml pożywki wzrostowej ADSC do usuniętych komórek i delikatnie odpipetować do wymieszania. Przenieś komórki do sterylnej plastikowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Aby zapewnić maksymalny odzysk komórek, przepłucz naczynie hodowlane kolejnymi 2 ml pożywki wzrostowej ADSC i przenieś pożywkę do stożkowej probówki zawierającej oderwane komórki.
    5. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie zdekantować supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 5–6 ml pożywki wzrostowej ADSC na 1 x 106 komórek.
  2. Liczba komórek i posiewanie
    1. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 10 μl roztworu komórek od góry i 10 μl 0,04% roztworu błękitu trypanowego (0,4% błękitu trypanowego rozcieńczonego w stosunku 1:10 w PBS) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    2. Ponownie zawiesić żądaną liczbę ADSC w pożywce wzrostowej. W przypadku naczynia hodowlanego 100 mm, płytka ~3,0 x 105 komórek w 10 ml pożywki wzrostowej ADSC, aby umożliwić 80% konfluencję w ciągu 72 godzin lub 100% konfluencję w 96 godzin.
    3. Obejrzyj szalkę pod odwróconym mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu przed inkubacją, aby upewnić się, że są tam zawieszone komórki. Utrzymuj ogniwa w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności względnej 100%.
    4. Co 48 godzin odsysaj pożywkę wzrostową i zastępuj ją ciepłą (37 °C) pożywką, aż komórki będą zlewać się w 80% do 90%, jak pokazano na Rysunek 1B.
    5. Powtórzyć kroki z sekcji 3.1 i 3.2 dla odpowiedniej liczby przejść, aby uzyskać żądany numer komórki.
      UWAGA: Po przejściach od 5 do 6 komórki pierwotne wydają się ulegać starzeniu; Dlatego staraj się uzyskać pożądane numery komórek przez przejście 4.

4. Różnicowanie adipogenne ADSC

  1. Aspiruj pożywkę wzrostową ADSC z przylegających ADSC, które osiągnęły konfluencję od 80% do 90%.
  2. Szybko spłucz warstwę komórek ADSC sterylnym PBS o temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj pożywkę różnicującą ADSC. Do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm dodać 10 ml pożywki różnicującej ADSC.
  4. Wymieniaj podłoże co 3 dni przez około 14–21 dni. Dojrzałe adipocyty obserwuje się na ogół po 14 dniach różnicowania.
  5. Zbadaj komórki pod mikroskopem światła odwróconego przy 40-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić obecność kropelki lipidu, jak pokazano na Rysunek 2A.

5. Wykrywanie adipocytów

UWAGA: Ta sekcja opisuje protokoły barwienia używane do wykrywania kropelek lipidów w zróżnicowanych adipocytach, jednak barwienie immunofluorescencyjne dla CD105, mezenchymalnego markera komórek macierzystych, może być również użyte do potwierdzenia ADSC.

  1. Barwienie czerwienią olejową O
    1. Przygotować 0,5% roztwór podstawowy czerwieni olejowej O w izopropanolu. Na 20 ml roztworu podstawowego czerwieni olejowej O rozpuścić 100 mg czerwonej oliwy O w 20 ml izopropanolu. Przefiltrować roztwór przez sterylny filtr strzykawkowy z membraną 0,2 μm.
    2. Ostrożnie zassać pożywkę różnicującą i umyć komórki 2 razy, dodając PBS wzdłuż boków studzienki, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
    3. Ostrożnie odessać PBS z komórek i dodać wystarczającą ilość neutralnej buforowanej formaliny (NBF, 10%), aby pokryć warstwę komórkową. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30–60 minut.
    4. Na etapie utrwalania formaliny należy przygotować roztwór roboczy Oil Red O, rozcieńczając 3 części roztworu podstawowego Oil Red O z 2 częściami wody destylowanej. Wymieszać roztwór i przefiltrować przez sterylny filtr strzykawkowy z membraną 0,2 μm. Roztwór roboczy jest stabilny do 2 godzin.
    5. Ostrożnie odessać NBF i szybko przepłukać (~ 15 s) warstwę komórkową wodą destylowaną. Dodaj tyle 60% izopropanolu, aby pokryć warstwę komórkową po zassaniu wody i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Ostrożnie odessać izopropanol po 5 minutach inkubacji i dodać tyle roztworu roboczego Oil Red O, aby pokryć warstwę komórkową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10–15 minut.
    7. Ostrożnie odessać roztwór roboczy Oil Red O i kilkakrotnie przemyć warstwę komórkową wodą destylowaną, aż woda stanie się czysta.
    8. Dodaj PBS do naczynia do hodowli komórkowej i zbadaj komórki pod odwróconym mikroskopem pod kątem wskazania różnicowania i obecności kropelek lipidów (Rysunek 2B).
  2. Barwienie BODIPY
    1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy BODIPY, rozpuszczając 1,3 g BODIPY w 1 ml DMSO. Przygotować 2 μg/ml roztworu roboczego BODIPY, rozcieńczając roztwór podstawowy 1:25 000 razy w PBS.
    2. Ostrożnie zassać pożywkę różnicującą i umyć komórki 2 razy, dodając PBS wzdłuż boków studzienki, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
    3. Ostrożnie odessać PBS i dodać tyle roztworu roboczego BODIPY, aby pokryć warstwę komórkową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Od tego momentu należy chronić ogniwa przed światłem, przykrywając płytkę folią.
    4. Ostrożnie odessać roztwór roboczy BODIPY i przemyć warstwę komórkową 3 razy PBS.
    5. Utrwal komórki, dodając 4% paraformaldehydu i inkubując w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    6. Ostrożnie zassać bufor utrwalający i umyć komórki 2 razy, dodając PBS wzdłuż boków studzienki, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
    7. Dodaj PBS do naczynia do hodowli komórkowej i zbadaj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem dowodów na różnicowanie i obecność kropelki lipidu (Figura 2C). Obrazuj komórki za pomocą zestawu filtrów FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. Długość fali wzbudzenia wynosi 480 nm przy szerokości pasma 40 nm, a długość fali emisji wynosi 535 nm przy szerokości pasma 50 nm. Można użyć podobnego lub odpowiedniego zestawu filtrów i mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADSC wyizolowane z próbek tkanki tłuszczowej makaków rezusów zostały wysiane na płytkach hodowlanych i są pokazane w Rysunek 1. W dniu posiewu komórki nie przylegają i unoszą się w naczyniu hodowlanym, jak pokazano na Rysunek 1A. W ciągu 72 godzin ADSC staną się w 80% zlewające i będą gotowe do różnicowania adipocytów (Rysunek 1B). ADSC wykazują silne właściwości adipogenne po indukcji chemicznej. Po 14 dniach różnicowania dojrzałe adipocyty można obserwować za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły izolacji, proliferacji i różnicowania ADSC są proste i powtarzalne, ale wymagają starannej techniki, aby zapewnić odpowiednią izolację, zdrową ekspansję i skuteczne różnicowanie. Sterylne środowisko pracy ma kluczowe znaczenie dla wszystkich eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Bakterie lub grzyby mogą zostać wprowadzone do kultur komórkowych za pośrednictwem skażonych narzędzi, pożywek lub środowiska pracy. Na zanieczyszczenie grzybami wskazuje wzrost zarodników w kulturze, podczas gdy na zanieczyszczenie ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Curtisowi Vande Stouwe za jego pomoc techniczną. Badania leżące u podstaw opracowania protokołów były wspierane przez granty z National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 i 1F31AA028459-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4 % błękit trypanowyThermo-Fisher15250061
1,5 ml probówka do mikrowirówekDot Scientific707-FTG
100 % izopropanolSigma-AldrichPX1838-P
naczynie do hodowli komórkowychCorning430167
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-AldrichI7018
50-mL plastikowa rurka stożkowaFisher Scientific50-465-232
70-&mikro; m Sitko komórkoweCorningCLS431751
a-MEMThermo-Fisher12561056
Folia aluminiowaReynolds Wrap
BODIPYThermo-FisherD3922
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich05470
WirówkaEppendorf5810 R
Kolagenaza, Typ IThermo-Fisher17100017
Deksametazon-Rozpuszczalnyw wodzie Sigma-AldrichD2915
Dimetylosulfotlenek, DMSOSigma-AldrichD2650
Woda destylowanaThermo-Fisher15230162
Płodowa surowica bydlęca, zatwierdzona przez USDASigma-AldrichF0926
Fungizone/Amfoterycyna B (250 ug/ml)Thermo-Fisher15290018
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo-Fisher14175095
z szkiełkiem korkowymSigma-AldrichZ359629
IndometacynaSigma-AldrichI7378
Mikroskop światła odwróconegoNikonDIAPHOT-TMD
L-glutamina (200 mM)Thermo-Fisher25030081
Laboratory Rocker, 0,5 do 1,0 HzNiezawodny model naukowy55 Rocking
Neutralna buforowana formalina (10 %)Pharmco8BUFF-FORM
Oil Red OSigma-AldrichO0625
ParaformeldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo-Fisher15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Thermo-Fisher10010023
Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC)Qiagen158904
Pipety serologiczne, od 2 do 25 mlCostar Stripettes
Standardowy inkubator do hodowli komórek nawilżanych, 37 °; C, 5 % CO2SanyoMCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo-Fisher25200056
100-mm Hemacytometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
  6. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  7. Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959(2013).
  8. Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
  9. Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
  10. Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
  11. Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
  12. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  13. Sarjeant, K., Stephens, J. M. Adipogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (9), 008417(2012).
  14. Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
  15. Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  17. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  18. Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka t uszczowa makaka rezusaizolacja frakcji naczyniowo stromalnejprotok trawienia kolagenazmetoda proliferacji ADSCkoktajl r nicowania adipocyt wtest poboru glukozypomiar lipogenezytest lipolizybarwienie Oil Red O

Powiązane artykuły