Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Streszczenie

W dziedzinie nanotechnologii, charakterystyka analityczna odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu zachowania i toksyczności nanomateriałów (NM). Charakterystyka musi być dokładna, a wybrana technika powinna być dobrze dopasowana do właściwości, która ma być określona, analizowanego materiału i ośrodka, w którym jest obecny. Ponadto działanie i metodologia przyrządu muszą być dobrze opracowane i jasno zrozumiałe dla użytkownika, aby uniknąć błędów w gromadzeniu danych. Wszelkie rozbieżności w zastosowanej metodzie lub procedurze mogą prowadzić do różnic i słabej odtwarzalności uzyskanych danych. Niniejszy artykuł ma na celu wyjaśnienie metody pomiaru średnicy hydrodynamicznej nanocząstek złota za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Badanie to zostało przeprowadzone jako porównanie międzylaboratoryjne (ILC) między siedmioma różnymi laboratoriami w celu walidacji wydajności i odtwarzalności standardowej procedury operacyjnej. Wyniki uzyskane w tym badaniu ILC ujawniają znaczenie i korzyści płynące ze szczegółowych standardowych procedur operacyjnych (SOP), aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i automatyzacji pomiarów.

Wprowadzenie

Nanomateriały (NMs) mogą różnić się zarówno pod względem fizycznym, jak i chemicznym, co z kolei wpływa na ich zachowanie, stabilność i toksyczność^1,2,3,4,5. Jedną z głównych trudności w dokładnym zrozumieniu właściwości, zagrożeń i zachowań nanomateriałów jest możliwość uzyskania powtarzalnych informacji o fizycznych i chemicznych właściwościach nanomateriałów. Przykładami takich właściwości fizycznych są wielkość cząstek i rozkład wielkości^6,7,8. Są to ważne parametry, ponieważ stanowią one kluczowy aspekt definicji terminu "nano" przyjętej przez Komisję Europejską (KE) ⁹.

Osiągnięcie precyzyjnych pomiarów wielkości cząstek jest również kluczowe dla wielu różnych zastosowań i procesów przemysłowych i badawczych, oprócz zrozumienia wpływu NMs na los i toksyczność^6,10. Ważne jest, aby dysponować dobrze ugruntowanymi metodami umożliwiającymi dokładny, niezawodny i powtarzalny pomiar wielkości nanometrów. Ponadto zgłaszane informacje powinny zapewnić dogłębne zrozumienie zastosowanej techniki, np. wskazywać rodzaj parametru wielkości (np. rozmiar rzeczywisty lub rozmiar hydrodynamiczny), a także warunki próbki, np. konkretne medium, w którym obecny jest NM, oraz aby metoda działała niezawodnie w różnych mediach. W celu pomiaru wielkości można zastosować szereg technik, w tym mikroskopię elektronową (EM), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (spICP-MS), różnicową sedymentację odśrodkową (DCS), mikroskopię z sondą skaningową (SPM), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) i analizę śledzenia nanocząstek (NTA).

NTA to stosunkowo nowa technologia, która w ostatnich latach została znacznie zaawansowana i wykazano, że niezawodnie mierzy hydrodynamiczną średnicę sferycznych NM w złożonych ośrodkach wodnych, takich jak te mające znaczenie dla środowiska, np. systemy słodkowodne. Średnica hydrodynamiczna to 'rozmiar hipotetycznej twardej kuli, która dyfunduje w taki sam sposób, jak cząstka mierzona'¹¹; W praktyce i w ośrodkach wodnych opisuje to średnicę większą niż średnica samej cząstki, która obejmuje również warstwę cząsteczek (głównie wody) utrzymywanych na powierzchni cząstki przez słabe siły elektrostatyczne. Średnica hydrodynamiczna cząstki będzie się różnić w różnych ośrodkach, zmniejszając się wraz ze wzrostem siły jonowej ośrodka, w którym jest mierzona.

Dodatkową ważną cechą techniki NTA jest to, że pozwala ona analitykowi na uzyskanie pomiarów wielkości ważonych liczbami, które są wymagane w kontekście definicji nanomateriału EC. Analiza cząstka po cząsteczce o wysokiej rozdzielczości sprawia, że technika ta jest mniej podatna na zakłócenia powodowane przez aglomeraty lub większe cząstki, gdy są obecne w niejednorodnej próbce testowej o dużej przepustowości cząstek^10,12.

Procedura pomiarowa polega na przygotowaniu odpowiedniej zawiesiny próbki, co często wymaga rozcieńczenia próbki, a następnie nagraniu wideo zachowania ruchów Browna i analizie wideo. Z komory na próbkę przepuszczana jest wiązka laserowa, a cząstki zawiesiny znajdujące się na drodze wiązki laserowej rozpraszają światło, prowadząc do ich wizualizacji za pomocą mikroskopu optycznego z zamontowaną kamerą. Kamera rejestruje plik wideo rozproszonego światła laserowego od cząstek poruszających się pod wpływem ruchu Browna. Wiele cząstek można śledzić indywidualnie w celu określenia ich współczynników dyfuzji, a ich średnice hydrodynamiczne można obliczyć za pomocą równania Stokesa-Einsteina: d = kT/3πηD, gdzie d jest średnicą hydrodynamiczną, k jest stałą Boltzmanna, T to temperatura, η to lepkość, a D to współczynnik dyfuzji¹⁰. NTA może być również używany do śledzenia zachowania agregacji cząstek, które są ogólnie niestabilne koloidalnie (cząstki muszą być jednak stabilne koloidalnie w skali czasu pomiaru)^13,14. NTA jest metodą absolutną i nie jest wymagana kalibracja systemu na przyrządzie używanym w tej pracy. Jeśli użytkownicy chcą sprawdzić wydajność systemu, można to łatwo zrobić, mierząc rozmiar standardowych materiałów tak często, jak jest to pożądane.

Instrument NTA jest łatwy w obsłudze z szybkim czasem analizy (poniżej 10 minut na próbkę). Aby uzyskać wysoką jakość pomiarów z dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością danych, zarówno podczas przygotowywania próbek, jak i obsługi urządzenia, należy wziąć pod uwagę szereg czynników. Jeśli takie czynniki nie zostaną dokładnie uwzględnione, pomiary na tym samym materiale w różnych laboratoriach i u różnych operatorów mogą być obarczone nieznanymi lub słabo określonymi ilościowo niepewnościami. Podczas charakteryzowania NP stosowanie najlepszych praktyk opracowanych przez nas SOP nie zawsze gwarantuje spójność z innymi laboratoriami, jak wykazano przez Roebbena i in. dla techniki DLS¹⁵.

W rzeczywistości, wczesna (pierwsza runda) NTA ILC pomiędzy różnymi laboratoriami, użytkownikami i instrumentami ujawniła niespójne wyniki. Jednym z głównych problemów było korzystanie z różnych starszych, starszych przyrządów, które nie były regularnie serwisowane ani nie były poddawane kontrolom kalibracji, a także różnice w interpretacji metod. Badanie NTA ILC przeprowadzone przez Hole i wsp. wykazało, że przy braku wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu i przygotowywania próbek, zmienność między laboratoriami może być duża nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych¹⁶. To, wraz z wynikami pierwszej rundy ILC, podkreśla potrzebę dobrej konserwacji urządzeń, a także szkolenia w zakresie metod i dobrze opracowanych standardowych procedur operacyjnych (SOP). Te ostatnie działają jako potężne narzędzie do opisywania i dokumentowania zgodności z dobrymi praktykami. Standardowe procedury operacyjne (SOP), jeśli są bardzo szczegółowe, mogą zapewnić jasność, wyjaśnienie, zrozumienie, standaryzację i zapewnienie jakości.

Rekomendacja dotycząca przyjęcia badania ILC jest zatem idealna zarówno do opracowywania, jak i testowania protokołów¹⁶. Ćwiczenie w ramach systemu ILC miało na celu walidację tej konkretnej procedury operacyjnej NTA, a tym samym wprowadziło zaufanie i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami. Składał się on z trzech rund. Runda 1 polegała na analizie nanocząsteczek złota o długości 60 nm na własnych instrumentach każdego uczestnika przed treningiem. Runda 2 polegała na analizie lateksu 100 nm przy użyciu nowego instrumentu o wspólnej konfiguracji jako prostego testu w celu ustalenia, czy instrument został prawidłowo skonfigurowany, a użytkownicy mają dobrą wiedzę na temat korzystania z instrumentu. Runda 3 obejmowała analizę nanocząstek złota o długości fali 60 nm na nowym instrumencie o wspólnej konfiguracji, po przeszkoleniu. Uczestnicy ILC pochodzili z siedmiu różnych laboratoriów, a wszyscy byli członkami konsorcjum projektu ACEnano w ramach programu Horyzont 2020¹⁷.

Celem tego artykułu jest omówienie metody i wyników trzeciej rundy testów porównawczych dla technologii NTA, gdzie 60 nm złotych nanocząsteczek zostały ponownie przeanalizowane przez siedmiu partnerów po szczegółowym szkoleniu i opracowaniu SOP. Dokonane zostanie również porównanie i odniesienie się do wyników uzyskanych w pierwszej rundzie ILC. Wszystkie analizy od rundy 3 ILC zostały przeprowadzone przy użyciu tego samego przyrządu (patrz tabela materiałów) o identycznej konfiguracji, wyposażonego w laser 405 nm i kamerę sCMOS o wysokiej czułości. Analiza porównawcza polega na ocenie wydajności technologii na próbkach, a tym samym prowadzi do opracowania protokołów "najlepszych praktyk". W związku z tym w niniejszym artykule udostępniono również metodę NTA dla instrumentu stosowanego w tym systemie ILC i udostępnia go społeczności naukowej, ponieważ została ona zharmonizowana poprzez przeprowadzenie i ocenę ILC zgodnie z międzynarodowymi standardami.

Protokół

Opisana tutaj metodologia została użyta do trzeciej rundy porównań międzylaboratoryjnych.

1. Przygotowanie próbki

1. Przefiltruj wodę przez filtr strzykawkowy 0,02 μm. Filtracja wody jest konieczna, aby usunąć wszelkie cząstki zanieczyszczeń przed użyciem jej do rozcieńczenia próbki.
2. Aby przeanalizować świeżo przygotowaną próbkę, należy rozcieńczyć wolumetrycznie próbkę dyspersji koloidalnej złota o długości 60 nm przez współczynnik 50 w przefiltrowanej ultraczystej wodzie. Sugerowane stężenie do analizy NTA to 1 x 10⁷ – 1 x 10⁹ cząstek na ml.

2. Wykonywanie pomiaru

1. Włączanie systemu
   1. Podłącz przyrząd NTA, pompę strzykawkową i komputer. Włącz sprzęt i oprogramowanie. Powiązane oprogramowanie (patrz Spis materiałów) zapewnia, że cała komunikacja sprzętowa jest uruchomiona i że wyświetlany jest odczyt temperatury na żywo.
   2. Wyjmij moduł laserowy z NTA i za pomocą chusteczki i sprężonego powietrza całkowicie osusz szklane powierzchnie i wewnętrzne kanały komory o małym przepływie (LVFC), rurki i porty płynów.
2. Gruntowanie przewodów
   1. Przepłucz rurkę dopływu wody płynnej ultraczystą wodą, aby usunąć wszelkie cząstki i zmniejszyć prawdopodobieństwo powstania pęcherzyków powietrza, które mogłyby zakłócać pomiary. W celu płukania koniec rurki wlotowej wewnątrz obudowy przyrządu umieszcza się w pojemniku na odpady.
   2. Włóż strzykawkę o pojemności 1 ml (bez igły) z przefiltrowaną wodą do portu Luer i przepchnij ~900 μl płynu przez rurkę dolotową tak szybko, jak pozwala na to przeciwciśnienie. Pozostawić strzykawkę z pozostałym płynem podłączoną, aby zapobiec zasysaniu strzykawki.
3. Przyłącze rurki pompy strzykawkowej
   1. Zamontuj LVFC na module laserowym, aby utworzyć komorę próbki, jak pokazano na Rysunek 1. Podłącz rurkę wylotową do portu po prawej stronie LVFC.
      UWAGA: Rurki wlotowe i wylotowe mają różne średnice, przy czym wlot ma mniejszą średnicę niż wylot. Zamiana przyłącza rurki wlotowo-wylotowej może spowodować nadmierne ciśnienie w komorze przepływowej i nieszczelność.
   2. Odłączyć strzykawkę od rurki doprowadzającej i wymienić ją na nową strzykawkę zawierającą 1 ml przefiltrowanej wody, zapewniając kontakt ciecz z cieczą. Podłącz rurkę dopływową do lewego portu LVFC. Powoli wprowadzić ~500 μL płynu do komory próbki. Uważaj, aby podczas załadunku nie dostały się pęcherzyki powietrza. Ostateczna konfiguracja przewodów jest pokazana w Rysunek 2.

Ilustracja 1: Zespół celi o małym przepływie objętościowym zamontowany na module laserowym. 

Rysunek 2: Konfiguracja przewodów komory o niskim przepływie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Załadunek modułu laserowego i kontrola systemu
   1. Włóż moduł laserowy z wypełnionym wodą LVFC do przyrządu i zablokuj na miejscu.
   2. Umieścić strzykawkę w kołysce pompy strzykawkowej i zabezpieczyć. Zainicjuj kamerę, klikając Uruchom kamerę w interfejsie oprogramowania. Na karcie Sprzęt w interfejsie kliknij Rozproszenie, aby przesunąć pozycję odniesienia.
   3. Ustaw poziom kamery na 16 i ręcznie wyreguluj ostrość, aby sprawdzić, czy w rozcieńczalniku nie ma żadnych cząstek. Dostosuj położenie pola widzenia, klikając lewym przyciskiem myszy główne okno podglądu i przeciągając myszą w górę iw dół, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych cząstek. Jeśli w polu widzenia znajdują się więcej niż trzy cząstki, oznacza to problem z czystością wody lub procesem czyszczenia, a zatem proces czyszczenia należy powtórzyć lub wymienić lub przefiltrować wodę.
   4. Wyjmij moduł laserowy z przyrządu.
   5. Odłączyć strzykawkę od rurki doprowadzającej i zastąpić ją strzykawką pełną tylko powietrza. Powoli wprowadzaj powietrze do komory na próbkę, aby usunąć znajdującą się w niej ciecz. Wyjmij LVFC z modułu laserowego i odłącz rurki. Oczyść szklane powierzchnie LVFC i szkło optyczne modułu laserowego wodą i osusz chusteczką i sprężonym powietrzem. Osusz rurkę sprężonym powietrzem. Zamontuj LVFC na module laserowym i podłącz rurkę, aby była gotowa do załadowania próbki.
      UWAGA: Ten krok nie zawsze jest wymagany, jednak w tym przypadku został dodany jako dodatkowy środek ostrożności, aby jeszcze bardziej zmniejszyć wszelkie możliwe różnice.
5. Ładowanie próbki
   1. Powtórz krok 2.2.2. Podłączyć strzykawkę zawierającą 1 ml dyspersji nanocząstek złota o długości fali 60 nm wykonanej w kroku 1.1 do portu Luer. Powoli wstrzyknąć 750 μl próbki do LVFC przez rurkę wlotową z modułem laserowym viewed na zewnątrz instrumentu, aby upewnić się, że nie zostały wprowadzone pęcherzyki.
   2. Załaduj moduł laserowy z powrotem do instrumentu NTA i zainicjuj kamerę, klikając przycisk Start Camera w interfejsie oprogramowania. Na karcie Sprzęt interfejsu kliknij Punktowy, aby przejść do referencyjnej pozycji ostrości, sprawdź, czy jest ona ustawiona prawidłowo, aby uzyskać wyraźny obraz cząstek.
   3. Sprawdź, czy pole view jest ustawione centralnie w stosunku do położenia wiązki laserowej. Dostosuj odpowiednio, klikając lewym przyciskiem myszy główne okno podglądu w oprogramowaniu i przeciągając myszą w górę iw dół.
   4. Uruchom funkcję AutoSetup, aby automatycznie zoptymalizować ostrość i poziom kamery, zapewniając osiągnięcie optymalnej jakości obrazu.
      UWAGA: Automatyczne parametry aparatu i ostrości pozwalają na większą spójność między różnymi laboratoriami, ponieważ są niezależne od użytkownika.
6. Analiza próbki
   1. Utwórz skrypt pomiarowy w Pomiar standardowy, zakładka SOP, aby uzyskać 5 powtarzających się filmów z 60 s przy wolnym (cząstki powinny przechodzić z jednej strony ekranu na drugą w ciągu około 10 s) i stałym przepływie (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Przepływ jest zalecany, aby zapewnić lepsze odwzorowanie całej próbki do pomiaru. Precyzja i powtarzalność pomiarów stężeń ulegają znacznej poprawie, gdy na próbkę przekazywany jest powolny przepływ, aby zapewnić, że większa liczba nowych cząstek przepływa przez strefę pomiarową i jest analizowana podczas eksperymentu. Długość filmu zależy od rozkładu profilu i jego zmienności w czasie analizy. 5 filmów trwających 60 s jest uważanych za typowy czas trwania pomiaru.
   2. Ustaw nazwę pliku eksperymentu i lokalizację dla danych i rozpocznij przebieg. Analiza zgodnie z opisaną procedurą została przeprowadzona przez siedem laboratoriów projektu ACEnano w ramach programu Horyzont 2020 ACEnano project¹⁷.

3. Analiza danych

UWAGA: Wszystkie analizy danych zostały wykonane w oprogramowaniu v 3.4 (patrz Spis materiałów), nie stosuje się żadnych dodatkowych ręcznych konwersji ani obliczeń. Dane dotyczące wielkości cząstek są prezentowane w postaci surowej jako rozkład histogramu i są obliczane na podstawie zmierzonej zmiany położenia cząstki za pomocą równania Stokesa-Einsteina. Oprogramowanie określa średnią odległość przebytą przez każdą cząstkę w płaszczyznach x i y. Wartość ta pozwala na wyznaczenie współczynnika dyfuzji cząstek (D), na podstawie którego, jeżeli znana jest temperatura próbki T i lepk η ość rozpuszczalnika, można obliczyć równoważny sferyczny promień hydrodynamiczny, R_H, cząstek. Temperatura próbki jest automatycznie rejestrowana przez NTA. Domyślna lepkość próbki używana przez oprogramowanie dotyczy wody i jest zawarta w skrypcie pomiarowym pokazanym powyżej, chociaż lepkość może zostać zmieniona przez użytkownika, gdy używane są różne rozcieńczalniki do próbek, przed lub po wykonaniu pomiaru.

1. Ustaw próg wykrywania (DT), przeciągając suwak lub klikając przyciski + i - w oprogramowaniu w obszarze Próg wykrywania, który jest parametrem analizy dla optymalnego śledzenia wizualizowanych cząstek, w zakresie od 2 do 20. Upewnij się, że wybrana wartość ID identyfikuje i śledzi jak najwięcej widocznych cząstek (oznaczonych automatycznie jako czerwone krzyżyki na ekranie obrazu oprogramowania).
   1. Jako wytyczne przy ustalaniu progu wykrywalności, liczba zidentyfikowanych cząstek na obrazie powinna mieścić się w zakresie około 30-80, gdzie nie więcej niż 10 czerwonych krzyżyków powinno odpowiadać miejscom, które nie są uważane przez obserwatora za cząstki. Nie powinno być zaobserwowanych więcej niż 5 niebieskich krzyżyków (wskazujących na hałas).

Rysunek 3: Obserwacje dotyczące ustawiania progów. Obserwacja złego (po lewej) i dobrego (po prawej) ustawienia progu wykrywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Automatycznie przetwarzaj filmy z analizą śledzenia cząstek, naciskając przycisk Process (Proces) w oprogramowaniu. Pozostaw wszystkie parametry przetwarzania ustawione na automatyczne i wyeksportuj dane jako plik wyników w formacie .csv z pełnym rozkładem wielkości cząstek i dodatkowymi metadanymi opisującymi konfigurację pomiaru. Aby zweryfikować jakość pomiaru, spójrz na zakładkę Analizuj w oprogramowaniu lub sprawdź plik wyjściowy .csv pod kątem ostrzeżeń, komunikatów lub alertów. Przykładowy raport z wynikami w formacie PDF znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
3. Odczytaj wyniki wielkości drgań własnych i związane z nimi odchylenie standardowe z raportu PDF.
   UWAGA: Wyniki dotyczące wielkości trybu zostały wykorzystane do porównania rozmiarów uzyskanych w siedmiu laboratoriach i są pokazane i omówione w sekcji 5.

4. Czyszczenie i suszenie

1. Po użyciu dokładnie przepłucz system czystą wodą, aby usunąć wszelkie ślady próbki z rurki i powierzchni optycznych. Skuteczność czyszczenia można monitorować poprzez obserwację ilości cząstek w polu widzenia.
2. Wyjmij moduł laserowy z przyrządu NTA.
3. Załaduj strzykawkę z powietrzem przez system, aby opróżnić rurkę i LVFC.

Wyniki

Wyniki rundy 1 ILC przy użyciu różnych konfiguracji urządzeń NTA są pokazane w Rysunek 4. Z wyjątkiem Lab 6, powtarzalność między 5 powtórzeniami przechwytywania była dobra, ale kilka laboratoriów zarejestrowało rozmiar trybu wyższy niż oczekiwano. Wyniki Lab 6 wykazały słabą powtarzalność i znacznie większy zmierzony rozmiar modu. Po przeprowadzeniu dochodzenia stwierdzono, że systemy zgłaszające największe różnice w wielkości albo nie były utrzymywane zgodnie z zaleceniami, albo na analizę miała wpływ niespójność w przygotowaniu próbki, w wyniku której etap rozcieńczania może powodować różnice spowodowane różnymi urządzeniami do pipetowania, obsługą i techniką użytkownika i/lub konfiguracją pomiarową, w tym nieczystością celi przepływowej, używany jest niewłaściwy poziom kamery, obraz nie jest prawidłowo ostry i nieprawidłowo ustawia próg wykrywania analizy.

Rysunek 4: Wyniki dotyczące rozmiaru w trybie ILC w rundzie 1. Rozmiar modu wynika ze wszystkich partnerów NTA przeprowadzających testy porównawcze dla dyspersji nanocząstek złota w rundzie 1 o długości fali 60 nm przeprowadzonej na różnych instrumentach NTA (w skrócie na osi x).

Dokładność wyników NTA z rundy 3 została poprawiona przez wszystkie laboratoria wdrażające te same SOP i ustawienia instrumentu. Wyniki dotyczące rozmiaru trybu uzyskane dla tej rundy 3 ILC można zobaczyć w Rysunek 5. Średni tryb we wszystkich laboratoriach wynosił 62,02 ± 1,97 nm. Wszystkie zmierzone wyniki z rundy 3 były bardziej spójne niż wyniki pierwszego etapu, przy czym wyniki mieściły się w granicach 10% średniej wielkości partii 60,5 nm, jak podaje producent. Współczynnik zmienności dla próbek złota podany przez producenta wynosił ≤8%.

Rysunek 5: Wyniki rozmiaru trybu ILC Round 3. Rozmiar modu wynika ze wszystkich partnerów testowych NTA dla złota ILC 60 nm Runda 3 analizowana na tym samym instrumencie NTA. Średni tryb we wszystkich laboratoriach wynosił 62,02 ± 1,97 nm.

Aby zweryfikować rozmiar cząstek, zgodnie z informacjami producenta, niewielka liczba (N=82) cząstek została przeanalizowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Około 10 μl nierozcieńczonej dyspersji odlewano kroplowo na pokrytą węglem siatkę Cu TEM i suszono w powietrzu przed obrazowaniem w analitycznym TEM przy napięciu 200 kV. Obrazy takie jak na rysunku uzupełniającym 1 zostały wykonane z obszarów o minimalnym nakładaniu się cząstek i przeanalizowane przy użyciu półautomatycznego procesu analizy obrazu. Do oddzielnych cząstek zastosowano metodę automatycznego zlewni, a artefakty tego procesu zostały wykluczone, podobnie jak cząstki krawędziowe¹⁸. Średnią średnicę obliczono albo jako średnią z osi głównej i mniejszej (61 ± 7 nm), albo jako przeliczenie z mierzonego obszaru (62 ± 6 nm) przy założeniu cząstek sferycznych. Cząstki wydają się być w większości kuliste ze średnim współczynnikiem kształtu wynoszącym 1,1. Wyniki TEM wskazują na nieco większą średnicę niż wartość producenta (60,5 nm), ale mieszczą się w granicach tolerancji. Dodatkowo istnieje bardzo dobra zgodność z wyprowadzoną przez NTA wartością średnicy hydrodynamicznej.

Rysunek uzupełniający 1: Obraz TEM nanocząstek złota o długości 60 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Plik uzupełniający 1: Skrypt pomiarowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przykład raportu z wynikami PDF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niespójne wyniki uzyskane w ramach rundy 1 ILC uwypukliły potrzebę kontroli stanu urządzeń w przypadku starszych systemów, a także opracowania bardziej szczegółowych standardowych procedur operacyjnych, potrzebę praktycznego szkolenia oraz lepszego zrozumienia ustawień pomiarów i analizy, aby zapewnić bardziej spójne wyniki w różnych laboratoriach. W rzeczywistości Hole i in. stwierdzili, że brak wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu NTA i przygotowywania próbek skutkował zmiennością między laboratoriami, nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych¹⁶. W związku z tym wszyscy uczestnicy ILC wzięli udział w warsztatach szkoleniowych obejmujących najlepsze praktyki dotyczące warunków działania systemu i pomiarów, a także wskazówki dotyczące czyszczenia i konserwacji konkretnego instrumentu NTA. Wszyscy uczestnicy wykonywali również pomiary na tym samym instrumencie we własnych laboratoriach na potrzeby kolejnych rund ILC. Procedura obejmowała najpierw rundę, w której przetestowano system lokalnie w każdym laboratorium, przeprowadzając ILC na standardowych próbkach lateksu (ILC Runda 2), a następnie wykorzystano go przez partnerów do powtórzenia pomiarów złota (ILC Runda 3). Celem pomiaru tych próbek złota za pomocą NTA było wprowadzenie pewności i jasności do metod i praktyk oceny ryzyka związanego z nanomateriałami, które są niezbędne do wywarcia wpływu na protokoły wytycznych dotyczących nanobezpieczeństwa.

NTA to technika, która może mierzyć hydrodynamiczną sferyczną równoważną średnicę cząstek i może być stosowana do analizy wizualnej cząstka po cząstce w czasie rzeczywistym układów polirozproszonych w zakresie od 10 nm do 50 nm do około 1000 nm (w zależności od właściwości próbki i konfiguracji urządzenia). Wymagane jest minimalne przygotowanie próbki. Pomimo minimalnego przygotowania próbki, ten krok ma kluczowe znaczenie dla protokołu i należy zachować dużą ostrożność podczas rozcieńczania próbki i wyboru rozcieńczalnika. Kształt może być czynnikiem ograniczającym w odniesieniu do NTA, ponieważ uzyskuje się pomiary równoważnej wielkości sferycznej, a cząstki niesferyczne będą miały mniej dokładną wartość rozmiaru.

W przypadku technologii NTA zawsze należy spodziewać się pewnych zmian w wynikach, ponieważ z całej próbki obserwuje się tylko reprezentatywną próbkę. Niezależnie od tego, wszystkie wyniki są zgodne z normą ISO 19430 dotyczącą wymiarowania cząstek. Optymalne stężenie, które należy zapewnić, wynosi zwykle około 10-8 cząstek/ml w czasie analizy 30-60 sekund. W przypadku próbek o niższych stężeniach cząstek wymagany będzie dłuższy czas analizy, aby zapewnić powtarzalne wyniki. W przypadku próbek zawierających cząstki o stężeniu większym niż 10⁹ cząstek/ml istnieje większe prawdopodobieństwo wystąpienia problemów ze śledzeniem, a próbki będą musiały zostać rozcieńczone do odpowiedniego zakresu do pomiaru NTA.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki 3. rundy ILC wskazują na dobrą odtwarzalność pomiarów nanocząstek złota za pomocą NTA ze zwiększoną dokładnością i powtarzalnością. Wszystkie pomiary NTA zostały przeprowadzone przy użyciu automatycznych ustawień poziomu kamery i ostrości w celu dostosowania obrazu, zgodnie z wyborem funkcji Auto-Setup w oprogramowaniu. Poziom kamery ustawiony przez oprogramowanie był bardzo spójny, przy czym poziom kamery 10 lub 11 był ustawiany we wszystkich przypadkach, co pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami, im więcej automatyzacji obejmuje proces, tym większa spójność jest osiągana. Wyniki wymiarowania były porównywalne z wynikami uzyskanymi przez producenta za pomocą TEM, co wskazuje, że wyniki były odtwarzalne, jednak należy oczekiwać minimalnych różnic w przypadku różnych technik, ponieważ TEM nie określa średnicy hydrodynamicznej. Znaczna poprawa spójności wyników pokazuje znaczenie i korzyści płynące z konserwacji urządzeń, szczegółowych procedur SOP, aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i stosowanej automatyzacji pomiarów dla NTA. Podsumowując, Komisja Zarządzania Iloką zatwierdziła tę konkretną standardową procedurę operacyjną NTA, a tym samym wprowadziła pewność i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dyspersja koloidowa złota 60 nm	BBI Solutions OEM Ltd.	Produkt EM. GC60, Numer serii 024650
0,02 µ m filtr strzykawkowy - Sterylne filtry strzykawkowe Whatman Anotop 25	Sigma Aldrich	WHA68092102
NanoSight	Malvern Panalytical Ltd.	Oprogramowanie NS300
NanoSight NTA v3.4	Malvern Panalytical Ltd.	v3.4
Strzykawka PP/PE bez końcówki ślizgowej luer igły, wyśrodkowana, pojemność 1  ml, z podziałką, 0,01  ml, sterylne	Sigma Aldrich	Z230723