Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Streszczenie

W dziedzinie nanotechnologii, charakterystyka analityczna odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu zachowania i toksyczności nanomateriałów (NM). Charakterystyka musi być dokładna, a wybrana technika powinna być dobrze dopasowana do właściwości, która ma być określona, analizowanego materiału i ośrodka, w którym jest obecny. Ponadto działanie i metodologia przyrządu muszą być dobrze opracowane i jasno zrozumiałe dla użytkownika, aby uniknąć błędów w gromadzeniu danych. Wszelkie rozbieżności w zastosowanej metodzie lub procedurze mogą prowadzić do różnic i słabej odtwarzalności uzyskanych danych. Niniejszy artykuł ma na celu wyjaśnienie metody pomiaru średnicy hydrodynamicznej nanocząstek złota za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Badanie to zostało przeprowadzone jako porównanie międzylaboratoryjne (ILC) między siedmioma różnymi laboratoriami w celu walidacji wydajności i odtwarzalności standardowej procedury operacyjnej. Wyniki uzyskane w tym badaniu ILC ujawniają znaczenie i korzyści płynące ze szczegółowych standardowych procedur operacyjnych (SOP), aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i automatyzacji pomiarów.

Wprowadzenie

Nanomateriały (NMs) mogą różnić się zarówno pod względem fizycznym, jak i chemicznym, co z kolei wpływa na ich zachowanie, stabilność i toksyczność^1,2,3,4,5. Jedną z głównych trudności w dokładnym zrozumieniu właściwości, zagrożeń i zachowań nanomateriałów jest możliwość uzyskania powtarzalnych informacji o fizycznych i chemicznych właściwościach nanomateriałów. Przykładami takich właściwości fizycznych są wielkość cząstek i rozkład wielkości^6,7,8. Są to ważne parametry, ponieważ stanowią one kluczowy aspekt definicji terminu "nano" przyjętej przez Komisję Europejską (KE) ⁹.

Osiągnięcie precyzyjnych pomiarów wielkości cząstek jest również kluczowe dla wielu różnych zastosowań i procesów przemysłowych i badawczych, oprócz zrozumienia wpływu NMs na los i toksyczność^6,10. Ważne jest, aby dysponować dobrze ugruntowanymi metodami umożliwiającymi dokładny, niezawodny i powtarzalny pomiar wielkości nanometrów. Ponadto zgłaszane informacje powinny zapewnić dogłębne zrozumienie zastosowanej techniki, np. wskazywać rodzaj parametru wielkości (np. rozmiar rzeczywisty lub rozmiar hydrodynamiczny), a także warunki próbki, np. konkretne medium, w którym obecny jest NM, oraz aby metoda działała niezawodnie w różnych mediach. W celu pomiaru wielkości można zastosować szereg technik, w tym mikroskopię elektronową (EM), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (spICP-MS), różnicową sedymentację odśrodkową (DCS), mikroskopię z sondą skaningową (SPM), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) i analizę śledzenia nanocząstek (NTA).

NTA to stosunkowo nowa technologia, która w ostatnich latach została znacznie zaawansowana i wykazano, że niezawodnie mierzy hydrodynamiczną średnicę sferycznych NM w złożonych ośrodkach wodnych, takich jak te mające znaczenie dla środowiska, np. systemy słodkowodne. Średnica hydrodynamiczna to 'rozmiar hipotetycznej twardej kuli, która dyfunduje w taki sam sposób, jak cząstka mierzona'¹¹; W praktyce i w ośrodkach wodnych opisuje to średnicę większą niż średnica samej cząstki, która obejmuje również warstwę cząsteczek (głównie wody) utrzymywanych na powierzchni cząstki przez słabe siły elektrostatyczne. Średnica hydrodynamiczna cząstki będzie się różnić w różnych ośrodkach, zmniejszając się wraz ze wzrostem siły jonowej ośrodka, w którym jest mierzona.

Dodatkową ważną cechą techniki NTA jest to, że pozwala ona analitykowi na uzyskanie pomiarów wielkości ważonych liczbami, które są wymagane w kontekście definicji nanomateriału EC. Analiza cząstka po cząsteczce o wysokiej rozdzielczości sprawia, że technika ta jest mniej podatna na zakłócenia powodowane przez aglomeraty lub większe cząstki, gdy są obecne w niejednorodnej próbce testowej o dużej przepustowości cząstek^10,12.

Procedura pomiarowa polega na przygotowaniu odpowiedniej zawiesiny próbki, co często wymaga rozcieńczenia próbki, a następnie nagraniu wideo zachowania ruchów Browna i analizie wideo. Z komory na próbkę przepuszczana jest wiązka laserowa, a cząstki zawiesiny znajdujące się na drodze wiązki laserowej rozpraszają światło, prowadząc do ich wizualizacji za pomocą mikroskopu optycznego z zamontowaną kamerą. Kamera rejestruje plik wideo rozproszonego światła laserowego od cząstek poruszających się pod wpływem ruchu Browna. Wiele cząstek można śledzić indywidualnie w celu określenia ich współczynników dyfuzji, a ich średnice hydrodynamiczne można obliczyć za pomocą równania Stokesa-Einsteina: d = kT/3πηD, gdzie d jest średnicą hydrodynamiczną, k jest stałą Boltzmanna, T to temperatura, η to lepkość, a D to współczynnik dyfuzji¹⁰. NTA może być również używany do śledzenia zachowania agregacji cząstek, które są ogólnie niestabilne koloidalnie (cząstki muszą być jednak stabilne koloidalnie w skali czasu pomiaru)^13,14. NTA jest metodą absolutną i nie jest wymagana kalibracja systemu na przyrządzie używanym w tej pracy. Jeśli użytkownicy chcą sprawdzić wydajność systemu, można to łatwo zrobić, mierząc rozmiar standardowych materiałów tak często, jak jest to pożądane.

Instrument NTA jest łatwy w obsłudze z szybkim czasem analizy (poniżej 10 minut na próbkę). Aby uzyskać wysoką jakość pomiarów z dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością danych, zarówno podczas przygotowywania próbek, jak i obsługi urządzenia, należy wziąć pod uwagę szereg czynników. Jeśli takie czynniki nie zostaną dokładnie uwzględnione, pomiary na tym samym materiale w różnych laboratoriach i u różnych operatorów mogą być obarczone nieznanymi lub słabo określonymi ilościowo niepewnościami. Podczas charakteryzowania NP stosowanie najlepszych praktyk opracowanych przez nas SOP nie zawsze gwarantuje spójność z innymi laboratoriami, jak wykazano przez Roebbena i in. dla techniki DLS¹⁵.

W rzeczywistości, wczesna (pierwsza runda) NTA ILC pomiędzy różnymi laboratoriami, użytkownikami i instrumentami ujawniła niespójne wyniki. Jednym z głównych problemów było korzystanie z różnych starszych, starszych przyrządów, które nie były regularnie serwisowane ani nie były poddawane kontrolom kalibracji, a także różnice w interpretacji metod. Badanie NTA ILC przeprowadzone przez Hole i wsp. wykazało, że przy braku wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu i przygotowywania próbek, zmienność między laboratoriami może być duża nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych¹⁶. To, wraz z wynikami pierwszej rundy ILC, podkreśla potrzebę dobrej konserwacji urządzeń, a także szkolenia w zakresie metod i dobrze opracowanych standardowych procedur operacyjnych (SOP). Te ostatnie działają jako potężne narzędzie do opisywania i dokumentowania zgodności z dobrymi praktykami. Standardowe procedury operacyjne (SOP), jeśli są bardzo szczegółowe, mogą zapewnić jasność, wyjaśnienie, zrozumienie, standaryzację i zapewnienie jakości.

Rekomendacja dotycząca przyjęcia badania ILC jest zatem idealna zarówno do opracowywania, jak i testowania protokołów¹⁶. Ćwiczenie w ramach systemu ILC miało na celu walidację tej konkretnej procedury operacyjnej NTA, a tym samym wprowadziło zaufanie i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami. Składał się on z trzech rund. Runda 1 polegała na analizie nanocząsteczek złota o długości 60 nm na własnych instrumentach każdego uczestnika przed treningiem. Runda 2 polegała na analizie lateksu 100 nm przy użyciu nowego instrumentu o wspólnej konfiguracji jako prostego testu w celu ustalenia, czy instrument został prawidłowo skonfigurowany, a użytkownicy mają dobrą wiedzę na temat korzystania z instrumentu. Runda 3 obejmowała analizę nanocząstek złota o długości fali 60 nm na nowym instrumencie o wspólnej konfiguracji, po przeszkoleniu. Uczestnicy ILC pochodzili z siedmiu różnych laboratoriów, a wszyscy byli członkami konsorcjum projektu ACEnano w ramach programu Horyzont 2020¹⁷.

Celem tego artykułu jest omówienie metody i wyników trzeciej rundy testów porównawczych dla technologii NTA, gdzie 60 nm złotych nanocząsteczek zostały ponownie przeanalizowane przez siedmiu partnerów po szczegółowym szkoleniu i opracowaniu SOP. Dokonane zostanie również porównanie i odniesienie się do wyników uzyskanych w pierwszej rundzie ILC. Wszystkie analizy od rundy 3 ILC zostały przeprowadzone przy użyciu tego samego przyrządu (patrz tabela materiałów) o identycznej konfiguracji, wyposażonego w laser 405 nm i kamerę sCMOS o wysokiej czułości. Analiza porównawcza polega na ocenie wydajności technologii na próbkach, a tym samym prowadzi do opracowania protokołów "najlepszych praktyk". W związku z tym w niniejszym artykule udostępniono również metodę NTA dla instrumentu stosowanego w tym systemie ILC i udostępnia go społeczności naukowej, ponieważ została ona zharmonizowana poprzez przeprowadzenie i ocenę ILC zgodnie z międzynarodowymi standardami.

Protokół

Metodologia opisana w niniejszym opracowaniu została zastosowana podczas trzeciej rundy porównań międzylaboratoryjnych.

1. Przygotowanie próbek

1. Przefiltrować wodę przez filtr strzykawkowy 0,02 µm. Filtracja wody jest niezbędna w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń przed jej użyciem do rozcieńczania próbek.
2. Aby przeanalizować świeżo przygotowaną próbkę, rozcieńczyć objętościowo próbkę dyspersji koloidu złota 60 nm 50-krotnie w przefiltrowanej wodzie ultraczystej. Sugerowane stężenie do analizy NTA wynosi 1 x 10⁷ – 1 x 10⁹ cząstek na mL.

2. Wykonywanie pomiaru

1. Włączanie systemu
   1. Podłącz instrument NTA, pompę strzykawkową oraz komputer. Uruchom sprzęt i oprogramowanie. Powiązane oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) zapewnia prawidłowy przebieg komunikacji sprzętowej oraz wyświetlanie odczytu temperatury w czasie rzeczywistym.
   2. Wyjmij moduł laserowy z NTA i używając chusteczki oraz sprężonego powietrza, całkowicie osusz powierzchnie szklane, kanały wewnętrzne celi przepływowej o małej objętości (LVFC), rurki i porty płynowe.
2. Zapełnianie rurek
   1. Przepłucz rurki wlotowe wodą ultrapure, aby usunąć wszelkie cząstki i zmniejszyć prawdopodobieństwo powstania pęcherzyków powietrza, które mogłyby zakłócić pomiary. Podczas płukania koniec rurki wlotowej wewnątrz obudowy instrumentu umieszcza się w pojemniku na odpady.
   2. Włóż strzykawkę 1 mL (bez igły) z filtrowaną wodą do portu Luer i przetłocz ~90 µL cieczy przez rurkę wlotową tak szybko, jak pozwala na to ciśnienie wsteczne. Pozostaw strzykawkę z pozostałą cieczą podłączoną, aby zapobiec efektowi syfonowania.
3. Podłączenie rurek pompy strzykawkowej
   1. Zamontuj LVFC na module laserowym, aby stworzyć komorę próbkową, jak pokazano na Rysunku 1. Podłącz rurkę wylotową do prawego portu LVFC.
      UWAGA: Rurki wlotowe i wylotowe różnią się średnicą; rurka wlotowa ma mniejszą średnicę niż wylotowa. Zamiana podłączeń rurek wlotowej i wylotowej może spowodować nadmierne zwiększenie ciśnienia w celi przepływowej i wycieki.
   2. Odłącz strzykawkę od rurki wlotowej i zamień ją na nową strzykawkę zawierającą 1 mL filtrowanej wody, zapewniając kontakt ciecz-ciecz. Podłącz rurkę wlotową do lewego portu LVFC. Powoli wprowadź ~50 µL płynu do komory próbkowaj. Należy zadbać o to, aby podczas ładowania nie wprowadzono pęcherzyków powietrza. Końcowa konfiguracja rurek przedstawiona jest na Rysunku 2.

Rysunek 1: Zespół komórki przepływowej o małej objętości zamontowany na module laserowym. 

Rysunek 2: Konfiguracja przewodów celi przepływowej o małej objętości. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Ładowanie modułu laserowego i kontrola systemu
   1. Włożyć moduł laserowy z wypełnioną wodą komorą LVFC do urządzenia i zablokować go w odpowiedniej pozycji.
   2. Umieścić strzykawkę w uchwycie pompy strzykawkowej i zabezpieczyć. Zainicjować kamerę, klikając Start Camera w interfejsie oprogramowania. W zakładce Hardware interfejsu kliknąć Scatter, aby przesunąć do pozycji referencyjnej.
   3. Ustawić poziom kamery na 16 i ręcznie wyregulować ostrość, aby sprawdzić rozcieńczalnik pod kątem obecności cząsteczek. Dostosować pozycję pola widzenia, klikając lewym przyciskiem myszy w głównym oknie podglądu i przeciągając myszą w górę i w dół, aby sprawdzić obecność cząsteczek. Jeśli w polu widzenia znajduje się więcej niż trzy cząsteczki, oznacza to problem z czystością wody lub procesem czyszczenia, w związku z czym proces czyszczenia należy powtórzyć, a wodę wymienić lub przefiltrować.
   4. Wyjąć moduł laserowy z urządzenia.
   5. Odłączyć strzykawkę od rurki wlotowej i zastąpić ją strzykawką wypełnioną wyłącznie powietrzem. Powoli wprowadzać powietrze do komory próbki, aby usunąć znajdujący się wewnątrz płyn. Wyjąć LVFC z modułu laserowego i odłączyć rurki. Oczyścić szklane powierzchnie LVFC oraz szkło optyczne modułu laserowego wodą i osuszyć chusteczką oraz sprężonym powietrzem. Osuszyć rurki sprężonym powietrzem. Ponownie zamontować LVFC na module laserowym i podłączyć rurki, przygotowując układ do ładowania próbki.
      UWAGA: Ten krok nie zawsze jest wymagany, jednak w tym przypadku został dodany jako dodatkowa ostrożność, aby dalej zredukować wszelkie możliwe różnice.
5. Ładowanie próbki
   1. Powtórzyć krok 2.2.2. Do portu Luer podłączyć strzykawkę zawierającą 1 mL dyspersji nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm przygotowanej w kroku 1.1. Powoli wstrzyknąć 750 µL próbki do LVFC poprzez rurkę wlotową, obserwując moduł laserowy poza urządzeniem, aby upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza.
   2. Włożyć moduł laserowy z powrotem do urządzenia NTA i zainicjować kamerę, klikając Start Camera w interfejsie oprogramowania. W zakładce Hardware interfejsu kliknąć Scatter, aby przejść do referencyjnej pozycji ostrzenia i sprawdzić, czy jest ona ustawiona prawidłowo, zapewniając wyraźny obraz cząsteczek.
   3. Sprawdzić, czy pole widzenia jest ustawione centralnie względem pozycji wiązki lasera. Dostosować je, klikając lewym przyciskiem myszy w głównym oknie podglądu w oprogramowaniu i przeciągając myszą w górę i w dół.
   4. Uruchomić funkcję AutoSetup, aby automatycznie zoptymalizować ostrość i poziom kamery, zapewniając uzyskanie optymalnej jakości obrazu.
      UWAGA: Automatyczne parametry kamery i ostrości pozwalają na większą spójność między różnymi laboratoriami, ponieważ są one niezależne od użytkownika.
6. Analiza próbki
   1. Utworzyć skrypt pomiarowy w Standard measurement, zakładka SOP, aby uzyskać 5 powtórzeń nagrań wideo po 60 s przy wolnym (cząsteczki powinny przemieszczać się z jednej strony ekranu na drugą w około 10 s) i stałym przepływie (Supplementary File 1).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie przepływu, aby zapewnić lepszą reprezentację całej próbki do pomiaru. Precyzja i powtarzalność pomiarów stężenia ulegają znacznej poprawie, gdy próbce nadaje się powolny przepływ, co zapewnia, że przez strefę pomiarową przepływa i jest analizowana większa liczba nowych cząsteczek podczas eksperymentu. Długość wideo zależy od rozkładu profilu i jego zmienności w czasie analizy. 5 filmów po 60 s uznaje się za typowy czas pomiaru.
   2. Ustawić nazwę pliku eksperymentu i lokalizację danych, a następnie rozpocząć pomiar. Analiza zgodnie z opisaną procedurą została przeprowadzona przez siedem laboratoriów projektu Horizon 2020 ACEnano¹⁷.

3. Analiza danych

UWAGA: Wszystkie analizy danych zostały przeprowadzone w oprogramowaniu v 3.4 (patrz Tabela materiałów), nie zastosowano dodatkowych ręcznych konwersji ani obliczeń. Dane dotyczące wielkości cząstek są przedstawione w formie surowej jako histogram rozkładu i są obliczane na podstawie zmierzonej zmiany pozycji cząstki przy użyciu równania Stokesa-Einsteina. Oprogramowanie określa średnią odległość, jaką przemieściła każda cząstka w płaszczyznach x i y. Wartość ta pozwala na wyznaczenie współczynnika dyfuzji cząstek (D), z którego – przy znanej temperaturze próbki T i lepkości rozpuszczalnika η – można obliczyć równoważny sferyczny hydrodynamiczny promień, R_H, cząstek. Temperatura próbki jest automatycznie rejestrowana przez NTA. Domyślna lepkość próbki używana przez oprogramowanie dotyczy wody i jest zawarta w powyższym skrypcie pomiarowym, choć lepkość może zostać zmieniona przez użytkownika w przypadku zastosowania innych rozcieńczalników próbek,either przed lub po wykonaniu pomiaru.

1. Ustaw próg detekcji (DT), przeciągając pasek suwaka lub klikając przyciski + i - w oprogramowaniu w sekcji Detection Threshold. Jest to parametr analizy służący do optymalnego śledzenia wizualizowanych cząstek, którego wartość powinna mieścić się w zakresie od 2 do 20. Upewnij się, że wybrana wartość DT pozwala na identyfikację i śledzenie jak największej liczby widocznych cząstek (automatycznie zaznaczonych czerwonymi krzyżykami na ekranie obrazu w oprogramowaniu).
   1. W ramach wytycznych dotyczących ustawiania progu detekcji, liczba zidentyfikowanych cząstek na obrazie powinna wynosić około 30-80, przy czym nie więcej niż 10 czerwonych krzyżyków powinno odpowiadać miejscaom, które obserwator nie uzna za cząstki. Nie powinno być widocznych więcej niż 5 niebieskich krzyżyków (wskazujących na szum).

Rysunek 3: Obserwacje dotyczące ustawiania progu. Obserwacja błędnego (po lewej) oraz prawidłowego (po prawej) ustawienia progu detekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Automatycznie przetwórz filmy z analizy śledzenia cząstek, klikając przycisk Process w oprogramowaniu. Pozostaw wszystkie parametry przetwarzania w trybie automatycznym i wyeksportuj dane do pliku wyników w formacie .csv, zawierającego pełny rozkład wielkości cząstek oraz dodatkowe metadane opisujące konfigurację pomiaru. Aby zweryfikować jakość pomiaru, przejdź do karty Analyze w oprogramowaniu lub sprawdź w wyeksportowanym pliku .csv, czy nie pojawiły się żadne komunikaty ostrzegawcze lub alerty. Przykład raportu z wynikami w formacie PDF przedstawiono w Supplementary File 2.
3. Odczytaj wyniki rozmiaru dominującego (mode size) oraz powiązaną z nimi odchylenie standardowe z raportu PDF.
   UWAGA: Wyniki rozmiaru dominującego zostały wykorzystane do porównania wielkości uzyskanych w siedmiu laboratoriach; są one przedstawione i omówione w Sekcji 5.

4. Czyszczenie i suszenie

1. Po zakończeniu pracy dokładnie wypłucz system czystą wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości próbki z przewodów i powierzchni optycznych. Efektywność czyszczenia można monitorować, obserwując ilość cząsteczek w polu widzenia.
2. Wyjmij moduł laserowy z urządzenia NTA.
3. Przepuść przez system powietrze za pomocą strzykawki, aby opróżnić przewody oraz LVFC.

Wyniki

Wyniki pierwszej rundy (Round 1) ILC z wykorzystaniem różnych konfiguracji aparatury NTA przedstawiono na Rysunku 4. Z wyjątkiem Laboratorium 6, powtarzalność między 5 powtórzeniami pomiaru była dobra, jednak w kilku laboratoriach odnotowano rozmiar modowy wyższy od oczekiwanego. Wyniki Laboratorium 6 wykazały słabą powtarzalność oraz znacznie wyższy zmierzony rozmiar modowy. Po przeprowadzeniu dochodzenia ustalono, że systemy wykazujące największe różnice w rozmiarach były albo niekonserwowane zgodnie z zaleceniami, albo analiza została zaburzona przez niespójność w przygotowaniu próbek, gdzie etap rozcieńczania mógł spowodować zmienność wynikającą z zastosowania innego sprzętu do pipetowania, sposobu pracy i techniki użytkownika oraz/lub konfiguracji pomiaru, w tym zanieczyszczenia celi przepływowej, użycia niewłaściwego poziomu kamery, nieprawidłowego ustawienia ostrości obrazu lub błędnego ustawienia progu detekcji (Detection Threshold) podczas analizy.

Rysunek 4: Wyniki pomiarów rozmiaru trybu w 1. rundzie ILC. Wyniki rozmiaru mody od wszystkich partnerów benchmarkingu NTA dla 1. rundy dyspersji nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm, przeprowadzonej na różnych instrumentach NTA (oznaczonych skrótami na osi X). 

Dokładność wyników NTA z rundy 3 uległa poprawie we wszystkich laboratoriach wdrażających tę samą SOP oraz ustawienia instrumentu. Wyniki rozmiaru modowego uzyskane w tej rundzie 3 ILC przedstawiono na rysunku 5. Średnia moda we wszystkich laboratoriach wyniosła 62,02 ± 1,97 nm. Wszystkie wyniki pomiarów z rundy 3 były bardziej spójne niż wyniki z pierwszego etapu, a uzyskane wartości mieściły się w granicach 10% średniego rozmiaru partii wynoszącego 60,5 nm, zgodnie z deklaracją producenta. Współczynnik zmienności dla próbek złota podany przez producenta wynosił ≤8%.

Rysunek 5: Wyniki rozmiaru mody z 3. rundy ILC. Wyniki rozmiaru modu z wszystkich laboratoriów partnerskich biorących udział w walidacji NTA dla 60 nm złotych cząstek ILC w 3. rundzie, analizowanych na tym samym urządzeniu NTA. Średnia wartość modu we wszystkich laboratoriach wyniosła 62,02 ± 1,97 nm. 

Aby zweryfikować rozmiar cząsteczek podany przez producenta, niewielką liczbę (N=82) cząsteczek poddano analizie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Około 10 µl nierozcieńczonej dyspersji naniesiono metodą drop-casting na miedzianą siatkę TEM powleczoną węglem i wysuszono na powietrzu przed obrazowaniem w analitycznym TEM przy napięciu 20 kV. Zdjęcia, takie jak Rycina uzupełniająca 1, wykonano w obszarach z minimalnym nakładaniem się cząsteczek, a następnie poddano je półautomatycznej analizie obrazu. Zastosowano automatyczną metodę watershed w celu rozdzielenia cząsteczek; artefakty powstałe w tym procesie oraz cząsteczki znajdujące się na krawędziach zostały wykluczone z analizy¹⁸. Średnicę średnią obliczono albo jako średnią z osi głównej i pomocniczej (61 ± 7 nm), albo poprzez przeliczenie zmierzonej powierzchni (62 ± 6 nm), zakładając sferyczny kształt cząsteczek. Cząsteczki wydają się być w większości sferyczne, przy średnim stosunku wymiarów (aspect ratio) wynoszącym 1,1. Wyniki TEM wskazują na nieco większą średnicę niż wartość podana przez producenta (60,5 nm), jednak mieszczą się one w granicach tolerancji. Ponadto odnotowano bardzo dobrą zgodność z wartością średnicy hydrodynamicznej wyznaczoną metodą NTA.

Rysunek uzupełniający 1: Obraz TEM nanocząsteczek złota o rozmiarze 60 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Plik uzupełniający 1: Skrypt pomiarowy. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 2: Przykład raportu z wynikami w formacie PDF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niespójne wyniki uzyskane w ramach rundy 1 ILC uwypukliły potrzebę kontroli stanu urządzeń w przypadku starszych systemów, a także opracowania bardziej szczegółowych standardowych procedur operacyjnych, potrzebę praktycznego szkolenia oraz lepszego zrozumienia ustawień pomiarów i analizy, aby zapewnić bardziej spójne wyniki w różnych laboratoriach. W rzeczywistości Hole i in. stwierdzili, że brak wspólnych wytycznych dotyczących korzystania z systemu NTA i przygotowywania próbek skutkował zmiennością między laboratoriami, nawet w przypadku próbek stosunkowo monorozproszonych¹⁶. W związku z tym wszyscy uczestnicy ILC wzięli udział w warsztatach szkoleniowych obejmujących najlepsze praktyki dotyczące warunków działania systemu i pomiarów, a także wskazówki dotyczące czyszczenia i konserwacji konkretnego instrumentu NTA. Wszyscy uczestnicy wykonywali również pomiary na tym samym instrumencie we własnych laboratoriach na potrzeby kolejnych rund ILC. Procedura obejmowała najpierw rundę, w której przetestowano system lokalnie w każdym laboratorium, przeprowadzając ILC na standardowych próbkach lateksu (ILC Runda 2), a następnie wykorzystano go przez partnerów do powtórzenia pomiarów złota (ILC Runda 3). Celem pomiaru tych próbek złota za pomocą NTA było wprowadzenie pewności i jasności do metod i praktyk oceny ryzyka związanego z nanomateriałami, które są niezbędne do wywarcia wpływu na protokoły wytycznych dotyczących nanobezpieczeństwa.

NTA to technika, która może mierzyć hydrodynamiczną sferyczną równoważną średnicę cząstek i może być stosowana do analizy wizualnej cząstka po cząstce w czasie rzeczywistym układów polirozproszonych w zakresie od 10 nm do 50 nm do około 1000 nm (w zależności od właściwości próbki i konfiguracji urządzenia). Wymagane jest minimalne przygotowanie próbki. Pomimo minimalnego przygotowania próbki, ten krok ma kluczowe znaczenie dla protokołu i należy zachować dużą ostrożność podczas rozcieńczania próbki i wyboru rozcieńczalnika. Kształt może być czynnikiem ograniczającym w odniesieniu do NTA, ponieważ uzyskuje się pomiary równoważnej wielkości sferycznej, a cząstki niesferyczne będą miały mniej dokładną wartość rozmiaru.

W przypadku technologii NTA zawsze należy spodziewać się pewnych zmian w wynikach, ponieważ z całej próbki obserwuje się tylko reprezentatywną próbkę. Niezależnie od tego, wszystkie wyniki są zgodne z normą ISO 19430 dotyczącą wymiarowania cząstek. Optymalne stężenie, które należy zapewnić, wynosi zwykle około 10-8 cząstek/ml w czasie analizy 30-60 sekund. W przypadku próbek o niższych stężeniach cząstek wymagany będzie dłuższy czas analizy, aby zapewnić powtarzalne wyniki. W przypadku próbek zawierających cząstki o stężeniu większym niż 10⁹ cząstek/ml istnieje większe prawdopodobieństwo wystąpienia problemów ze śledzeniem, a próbki będą musiały zostać rozcieńczone do odpowiedniego zakresu do pomiaru NTA.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki 3. rundy ILC wskazują na dobrą odtwarzalność pomiarów nanocząstek złota za pomocą NTA ze zwiększoną dokładnością i powtarzalnością. Wszystkie pomiary NTA zostały przeprowadzone przy użyciu automatycznych ustawień poziomu kamery i ostrości w celu dostosowania obrazu, zgodnie z wyborem funkcji Auto-Setup w oprogramowaniu. Poziom kamery ustawiony przez oprogramowanie był bardzo spójny, przy czym poziom kamery 10 lub 11 był ustawiany we wszystkich przypadkach, co pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami, im więcej automatyzacji obejmuje proces, tym większa spójność jest osiągana. Wyniki wymiarowania były porównywalne z wynikami uzyskanymi przez producenta za pomocą TEM, co wskazuje, że wyniki były odtwarzalne, jednak należy oczekiwać minimalnych różnic w przypadku różnych technik, ponieważ TEM nie określa średnicy hydrodynamicznej. Znaczna poprawa spójności wyników pokazuje znaczenie i korzyści płynące z konserwacji urządzeń, szczegółowych procedur SOP, aktualizacji najlepszych praktyk, wiedzy użytkowników i stosowanej automatyzacji pomiarów dla NTA. Podsumowując, Komisja Zarządzania Iloką zatwierdziła tę konkretną standardową procedurę operacyjną NTA, a tym samym wprowadziła pewność i jasność do tej konkretnej metody oceny ryzyka związanego z nanomateriałami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dyspersja koloidowa złota 60 nm	BBI Solutions OEM Ltd.	Produkt EM. GC60, Numer serii 024650
0,02 µ m filtr strzykawkowy - Sterylne filtry strzykawkowe Whatman Anotop 25	Sigma Aldrich	WHA68092102
NanoSight	Malvern Panalytical Ltd.	Oprogramowanie NS300
NanoSight NTA v3.4	Malvern Panalytical Ltd.	v3.4
Strzykawka PP/PE bez końcówki ślizgowej luer igły, wyśrodkowana, pojemność 1  ml, z podziałką, 0,01  ml, sterylne	Sigma Aldrich	Z230723