Method Article

Generowanie ostrych i przewlekłych eksperymentalnych modeli ekspresji tików motorycznych u szczurów

DOI:

10.3791/61743

⸱

May 27th, 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokoły do generowania ostrych i przewlekłych eksperymentalnych modeli ekspresji tików u swobodnie zachowujących się szczurów. Modele opierają się na implantacji kaniuli prążkowia, a następnie zastosowaniu antagonisty GABAA. Model ostry wykorzystuje przejściowe zastrzyki, podczas gdy model przewlekły wykorzystuje przedłużone wlewy za pomocą podskórnej wszczepionej mini-pompy osmotycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tiki motoryczne to nagłe, szybkie, powtarzające się ruchy, które są kluczowymi objawami zespołu Tourette'a i innych tików. Patofizjologia powstawania tików jest związana z nieprawidłowym hamowaniem zwojów podstawy, a zwłaszcza ich pierwotnej struktury wejściowej, prążkowia. W modelach zwierzęcych zarówno gryzoni, jak i naczelnych innych niż ludzie, miejscowe stosowanie antagonistów GABAA, takich jak bicukulina i pikrotoksyna, do ruchomych części prążkowia indukuje miejscowe odhamowanie, powodując ekspresję tików motorycznych.

Tutaj prezentujemy modele ostrych i przewlekłych tików motorycznych u szczurów. W modelu ostrym mikroiniekcje bicukuliny przez kaniulę wszczepioną w prążkowie grzbietowe wywołują ekspresję tików trwających przez krótki czas do godziny. Model przewlekły jest alternatywą umożliwiającą rozszerzenie ekspresji tików na okresy kilku dni lub nawet tygodni, wykorzystując ciągły wlew bicukuliny za pomocą podskórnej minipompy osmotycznej.

Modele umożliwiają badanie behawioralnych i neuronalnych mechanizmów generowania tików na całej ścieżce korowo-podstawno-zwojowej. Modele te umożliwiają wszczepienie dodatkowych urządzeń rejestrujących i stymulujących oprócz kaniul iniekcyjnych, co pozwala na szeroką gamę zastosowań, takich jak stymulacja elektryczna i optyczna oraz zapisy elektrofizjologiczne. Każda metoda ma inne zalety i wady: model ostry umożliwia porównanie właściwości kinematycznych ruchu i odpowiadających im zmian elektrofizjologicznych przed, w trakcie i po ekspresji tików oraz wpływu krótkoterminowych modulatorów na ekspresję tików. Ten ostry model jest łatwy do ustalenia; Jest on jednak ograniczony do krótkiego okresu czasu. Model przewlekły, choć bardziej złożony, umożliwia badanie dynamiki tików i wpływu zachowania na ekspresję tików przez dłuższy czas. Tak więc rodzaj zapytania empirycznego napędza wybór między tymi dwoma uzupełniającymi się modelami wyrażania tików.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tiki są charakterystycznym objawem zespołu Tourette'a (TS) i innych tików. Tiki są opisywane jako nagłe, szybkie, powtarzające się ruchy (tiki motoryczne) lub wokalizacje (tiki wokalne)1. Wyrażenie tikowe zazwyczaj zmienia swoje właściwości czasowe (częstotliwość)2 i przestrzenne (intensywność, lokalizacja ciała)3 w wielu skalach czasowych (godziny, dni, miesiące i lata). Na te zmiany mają wpływ różne czynniki, takie jak cechy środowiskowe4,5, stany zachowania6,7 oraz dobrowolne i tymczasowe tłumienie8.

Chociaż mechanizm neuronalny rządzący tikami motorycznymi nie jest jeszcze w pełni zrozumiały, coraz więcej badań teoretycznych i eksperymentalnych dostarczyło nowych dowodów na jego naturę9. Obecnie uważa się, że patofizjologia powstawania tików obejmuje pętlę korowo-podstawną (CBG), a konkretnie jest związana z nieprawidłowym hamowaniem prążkowia, pierwotnego jądra wejściowego zwojów podstawy10,11,12. Wcześniejsze badania na gryzoniach i naczelnych wykazały, że prążkowie może być odhamowane przez miejscowe stosowanie różnych antagonistów GABAA, takich jak bicukulina i pikrotoksyna13,14,15,16,17,18. Ta interwencja farmakologiczna prowadzi do przejściowej ekspresji tików motorycznych po stronie przeciwnej do wstrzyknięcia, ustanawiając w ten sposób solidny ostry model zaburzeń tików z trafnością twarzy i konstrukcji. Model ostry jest łatwy do wywołania i umożliwia badanie skutków krótkotrwałej modulacji, takiej jak stymulacja elektryczna i optyczna równolegle z zapisami elektrofizjologicznymi i kinematycznym przed, w trakcie i po ekspresji tików. Jednak model ostry jest ograniczony do krótkiego okresu po wstrzyknięciu. Opierając się na modelu ostrym, niedawno zaproponowaliśmy przewlekły model generowania tików u szczurów, który wykorzystuje przedłużony, stały wlew bicukuliny do prążkowia za pomocą podskórnie wszczepionej mini-pompy osmotycznej19. Model ten wydłuża okres ekspresji tików do wielu dni/tygodni. Ciągłe uwalnianie bicukuliny przez długi czas pozwala na badanie wpływu różnych czynników, takich jak leczenie farmakologiczne i stany behawioralne na ekspresję tików.

Tutaj prezentujemy protokoły generowania ostrych i przewlekłych modeli ekspresji tików u szczurów. W zależności od konkretnego pytania badawczego, protokoły umożliwiają precyzyjne dostrojenie parametrów, w tym implantacji jednostronnej i obustronnej, miejsca tików (zgodnie z organizacją somatotopową prążkowia)18 oraz kąta implantu-kaniuli (w zależności od lokalizacji dodatkowych wszczepionych urządzeń). Metoda zastosowana w modelu przewlekłym jest częściowo oparta na produktach komercyjnych, ale z krytycznymi poprawkami w celu dopasowania do modelu tikowego. W tym artykule szczegółowo opisano zmiany potrzebne do niestandardowego dostosowania tych modeli tików.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz przestrzegały Przewodnika Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Wytycznych Uniwersytetu Bar-Ilan dotyczących użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi w badaniach. Protokół ten został zatwierdzony przez Krajową Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach Laboratoryjnych przy Ministerstwie Zdrowia.

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje samice szczurów Long-Evans (modele ostre i przewlekłe) oraz samice szczurów Sprague Dawley (model ostry) w wieku 3-10 miesięcy, 280-350 g. Implementacja tych modeli w innych szczepach, wagach lub wieku powinna być dokładnie przetestowana pod kątem różnych reakcji.

1. Model ostry

  1. Przygotowanie przedoperacyjne
    1. Preparat do implantu-kaniuli
      UWAGA: Implant-kaniula umożliwia miejscowe wstrzyknięcia bicukuliny do prążkowia.
      1. Wytnij hiporurkę ze stali nierdzewnej o średnicy zewnętrznej 25 G (OD 0,02 '', ID 0,015 ''), aby uzyskać kaniulę implantu (Rysunek 1, urządzenie #1). Użyj narzędzia obrotowego, aby uzyskać proste krawędzie. Długość kaniuli zależy od docelowej głębokości implantacji, kąta implantacji kaniuli i końcowej wysokości zacementowanej nasadki. Głębokość docelowa implantacji musi być o 2 mm (0,079 cala) wyższa niż końcowa docelowa iniekcja, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek.
        UWAGA: Najwyższy wszczepiony przedmiot określa wysokość nasadki.
      2. Przeszlifuj i wygładź krawędzie implantu-kaniuli, zapobiegając dodatkowemu mechanicznemu tarciu mózgu. Przełóż przez niego igłę 30 G (0,01''), aby usunąć wszelkie wewnętrzne przeszkody.
    2. Przygotowanie manekina
      UWAGA: Manekin jest wyjmowanym drutem wewnętrznym umieszczonym wewnątrz wszczepionej kaniuli. Manekin uszczelnia wszczepioną kaniulę, zapobiegając w ten sposób jej niedrożności.
      1. Zrób manekina, przecinając drut o średnicy 0,013 cala za pomocą narzędzia obrotowego. Manekin powinien być o 3 mm (0,118'') dłuższy niż długość implantu-kaniuli (Rysunek 1, urządzenie #2).
      2. Włożyć manekin do implantu-kaniuli, aż dotrze do końca. Zegnij nadmiar drutu, ściskając go przy kaniuli. Wygięta część powinna być zlicowana z kaniulą implantu, aby zapobiec wypadnięciu manekina z wszczepionej kaniuli i uniemożliwić szczurowi jego usunięcie.
    3. Przygotowanie wtryskiwacza
      UWAGA: Wstrzykiwacz, składający się z elastycznej rurki i kaniuli iniekcyjnej (Rysunek 1, urządzenie #3), umożliwia bezpośrednie wstrzyknięcie bicukuliny do prążkowia.
      1. Wytnij elastyczną rurkę polimerową o średnicy 70 cm (27,559 '') (OD 0,06 '', ID 0,02 '') (Rysunek 1, urządzenie #3.1).
        UWAGA: Długość elastycznej rurki jest określana przez odległość między klatką doświadczalną a lokalizacją pompy infuzyjnej. Musi być wystarczająco długa, aby umożliwić szczurowi swobodne poruszanie się w okresie wstrzykiwania, ale nie za długa, aby szczur nie zaplątał się w nią (patrz Rysunek 3A).
      2. Wytnij hiporurkę ze stali nierdzewnej 30 G (OD 0,012'', ID 0,007''), aby uzyskać kaniulę iniekcyjną (Rysunek 1, urządzenie #3.2). Użyj narzędzia obrotowego, aby uzyskać proste krawędzie. Powinna być o 5 mm (0,197 cala) dłuższa niż implant-kaniula: o 2 mm (0,079 cala) dłuższa niż wszczepiona kaniula w mózgu, aby dotrzeć do ostatecznego miejsca wstrzyknięcia, i 3 mm (0,118 cala), aby wprowadzić ją do elastycznej rurki.
      3. Przeszlifuj i wygładź końcówkę kaniuli iniekcyjnej, zapobiegając dodatkowemu mechanicznemu tarciu mózgu. Włóż drut o średnicy 0,005 cala, aby sprawdzić, czy jest drożny.
      4. Włóż 3 mm (0,118'') kaniuli iniekcyjnej do elastycznej rurki i sklej połączenie między nimi, aby uzyskać wtryskiwacz. Użyj kleju cyjanoakrylowego (CA) i akceleratora CA.
      5. Podłączyć strzykawkę z igłą 25 G (0,018'') wypełnioną sterylną wodą do wstrzykiwacza i przemyć ją. Gwarantuje to, że orientacja przepływu wychodząca z kaniuli iniekcyjnej jest prosta i bezproblemowa. Co najważniejsze, jeśli przepływ nie jest prosty, użyj końcówki igły o średnicy zewnętrznej 30 G (OD 0,01 ''), aby usunąć wszelkie przeszkody i powiększyć otwór kaniuli iniekcyjnej, a następnie ponownie sprawdź przepływ.
    4. Preparat do podgrzewania kaniuli
      UWAGA: Uchwyt kaniuli jest połączony z ramieniem stereotaktycznym i utrzymuje kaniulę implantu podczas implantacji. Uchwyt kaniuli składa się z podstawy uchwytu kaniuli i przewodu uchwytu kaniuli, które są ze sobą sklejone (Rysunek 1, urządzenie #4). Podczas implantacji podstawa uchwytu kaniuli jest przymocowana do ramienia stereotaktycznego, a przewód uchwytu kaniuli jest przymocowany do implantu-kaniuli.
      1. Podstawa uchwytu kaniuli: Wytnij 10 cm (3,947 '') ze stali nierdzewnej, 22 G (OD 0,028 '', ID 0,017 '') hiporurkę (Rysunek 1, urządzenie #4.1).
      2. Przewód uchwytu kaniuli: Przytnij drut 0,013 cala na długość 3 mm (0,118 cala) dłuższą niż pożądana kaniula implantu (Rysunek 1, urządzenie #4.2).
      3. Włóż przewód uchwytu kaniuli do podstawy uchwytu kaniuli i przyklej połączenie między nimi za pomocą kleju CA i akceleratora CA. Przewód powinien być o 1 mm (0,039'') krótszy niż implant-kaniula, aby uniknąć uszkodzenia tkanek podczas implantacji.
    5. Przygotowanie bicukuliny: rozpuścić metiodek bicukuliny w soli fizjologicznej lub sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) do końcowego stężenia 1 μg/μl. Rozpuszczoną bicukulinę podzielić na strzykawki o pojemności 1 ml, przykryć folią aluminiową i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebna. W razie potrzeby rozmrozić strzykawkę przed użyciem.
  2. chirurgia
    1. Wywołaj znieczulenie wstępne, umieszczając szczura w przeznaczonej do tego komorze i podając 4-5% izofluranu zmieszanego z tlenem w tempie 0,5-1 l/min. Następnie wstrzyknąć szczurowi domięśniowo (IM lub IP) mieszaninę ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 i 10 mg/kg).
    2. Ogol głowę szczura za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.
    3. Włóż żel lidokainowy do uszu szczura. Połóż wazelinę na oczach szczura, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i urazom.
    4. Zabezpiecz szczura w ramie stereotaktycznej za pomocą nauszników i listwy do zębów.
    5. Przetrzyj skórę głowy szczura jodem powidonu, a następnie chusteczką nasączoną alkoholem, aby wysterylizować obszar. Naciekać wzdłuż pożądanej linii nacięcia 0,5 - 1% roztworem lidokainy podskórnie (SC). Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż skóry głowy.
    6. Pociągnij powięź w kierunku krawędzi, aby otworzyć obszar operacyjny.
    7. Oczyść czaszkę sterylną solą fizjologiczną za pomocą bawełnianych wacików. W przypadku krwawienia użyj kauteryzatora, aby kauteryzować naczynia włosowate krwi. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla stabilności nasadki w czasie.
    8. Zacisnąć powięź za pomocą czterech zakrzywionych hemostatów (dwóch przednich, dwóch tylnych), aby powiększyć pole operacyjne.
    9. Zmierz współrzędne bregma i lambda. Wyrównaj współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV) dwóch punktów, tak aby mieściły się w zakresie 100 μm.
    10. Za pomocą aparatu stereotaktycznego zmierz i zaznacz współrzędne obszarów zainteresowania oraz kotwiących, które mają zostać wszczepione. Współrzędne kaniuli implantacyjnej prostej dla indukcji tików w okolicy kończyny przedniej to: AP: +1 do +1,5, mL: ±2,5, DV: 3; obszar kończyn tylnych: AP: -0,4 do -0,5, mL: ±3,5, DV:318,20,
      UWAGA: W przypadku implantacji wielu urządzeń, które uniemożliwiają wszczepienie kaniuli prosto, należy odpowiednio zmienić kąt implantacji kaniuli i jej współrzędne (współrzędne kończyny przedniej: AP: +2,7, mL: ±2,5, DV: 3, kąt 15° od przodu do tyłu).
    11. Wywierć otwory w czaszce pod mikroskopem. Użyj wiertarki dentystycznej z okrągłymi wiertłami z węglika spiekanego 1/4-1/2 bitu. Aby zminimalizować ryzyko obrażeń mózgu, dostosuj prędkość wiertła do umiejętności wiercenia i unikaj nacisku mechanicznego. Wiercić, aż mózg będzie widoczny, na około 1 mm. Wchłonąć krew bawełnianym wacikiem i przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
      UWAGA: kotwiące służą do stabilizacji nasadki. Upewnij się, że znajdują się na obu półkulach i wzdłuż osi przednio-tylnej.
    12. Implantacja kaniuli
      1. Wkręć kotwiące w otwory. Użyj ze stali nierdzewnej #0 x 1/8.
        UWAGA: Liczba kotwiących zależy od całkowitej liczby wszczepionych urządzeń. uziemiające (np. do nagrań elektrycznych lub stymulacji elektrycznej) powinny sięgać do powierzchni mózgu.
      2. Przymocuj uchwyt kaniuli do ramienia stereotaktycznego.
      3. Wsuń kaniulę implantu na uchwyt kaniuli. Powoli umieść implant-kaniulę nad otworem, aż dotrze do mózgu.
      4. Zmierz współrzędne DV, zaczynając od powierzchni mózgu. Opuść implant-kaniulę aż do miejsca docelowego implantacji. Wchłonąć krew wypływającą z otworu bawełnianym wacikiem, przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie dokładnie wysuszyć.
      5. Przyklej wszczepioną kaniulę do czaszki za pomocą kleju żelowego. Poczekaj, aż wyschnie.
      6. Nałóż cement dentystyczny wzdłuż wszczepionej kaniuli, aby przymocować ją do czaszki. Pozostaw 2 mm (0,079 '') wysunięte od górnego końca, aby umożliwić włożenie manekina. Poczekaj, aż wyschnie.
        UWAGA: Nie kłać cementu na uchwyt kaniuli.
      7. Podnieś uchwyt kaniuli, pozostawiając wszczepioną kaniulę na miejscu.
      8. Wprowadzić manekin do wszczepionej kaniuli.
      9. Wszczepić wszystkie inne urządzenia, takie jak matryce rejestrujące, światłowody, elektrody stymulacyjne itp. Nałóż cement dentystyczny na resztę czaszki, pokrywając wszystkie implanty.
      10. Wstrzyknąć 3 ml roztworu Ringera o temperaturze pokojowej i karprofenu 5 mg/kg SC21.
      11. Monitoruj szczura, aż odzyska przytomność (zwierzę jest wyprostowane, ma kontrolę nad drogami oddechowymi i nie grozi mu zachłyśnięcie). Zwróć szczura do jego domowej klatki, aby w pełni wyzdrowieć.
  3. Mikroiniekcje
    UWAGA: Podczas wstrzykiwania ważne jest, aby sprawdzić, czy przepływ bicukuliny jest nienaruszony. Można to zrobić, pozwalając na utworzenie się małego pęcherzyka powietrza we wtryskiwaczu i monitorując jego ruch. Pozostałą objętość wstrzykiwacza można napełnić solą fizjologiczną, aby nie marnować bicukuliny.
    1. Podłączyć wstrzykiwacz do strzykawki dwukierunkowej z igłą 25 G (średnica zewnętrzna 0,018''). Napełnij ~1/3-1/2 wtryskiwacza i wyjmij strzykawkę, co pozwoli na utworzenie małego pęcherzyka powietrza.
    2. Podłączyć wstrzykiwacz do sterylnej strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną za pomocą igły 25 G (średnica zewnętrzna 0,018''). Napełnij wtryskiwacz, aż dwubiegunowość dotrze do końca i wypłynie z niej niewielka kropla.
    3. Usunąć tłok precyzyjnej szklanej mikrostrzykawki o pojemności 10 μl.
    4. Wytnij i przymocuj krótką, elastyczną rurkę polimerową (~3 cm, 1,181 '') do precyzyjnej szklanej mikrostrzykawki.
    5. Podłącz drugi koniec krótkiej, elastycznej rurki do strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25 G (średnica zewnętrzna 0,018 '') wypełnionej sterylną wodą.
    6. Wstrzyknąć wodę przez krótką, elastyczną rurkę do precyzyjnej szklanej mikrostrzykawki, aż wypłynie z niej woda. Odłącz krótką elastyczną rurkę.
    7. Ponownie włożyć tłok, aż osiągnie oznaczenie ~7 μl na precyzyjnej szklanej mikrostrzykawce.
    8. Włożyć precyzyjną szklaną mikrostrzykawkę do przeznaczonej szczeliny w pompie infuzyjnej.
    9. Podłącz wtryskiwacz do precyzyjnej szklanej mikrostrzykawki i skonfiguruj ustawienia na szybkość 0,35 μl/min i całkowitą objętość 0,35 μl.
    10. Umieść papierową chusteczkę pod końcówką wtryskiwacza. Zaznacz miejsce pęcherzyków powietrza na wtryskiwaczu, uruchom pompę infuzyjną i sprawdź, czy pojawiła się kropla dwubiegunowa. Po wstrzyknięciu należy ponownie zaznaczyć położenie pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Różnica między tymi dwoma znakami odpowiada pożądanej różnicy podczas eksperymentalnego wstrzyknięcia.
    11. Umieść szczura w klatce eksperymentalnej i wyjmij manekina.
    12. Włóż wstrzykiwacz do wszczepionej kaniuli przez koniec (patrz Rysunek 3A).
    13. Uruchomić pompę infuzyjną. Sprawdź, czy pęcherzyk powietrza się porusza. Uruchom stoper, aby śledzić czasy inicjowania i kończenia tików.
    14. Minutę po wstrzyknięciu należy wyjąć wstrzykiwacz i powoli ponownie włożyć manekinek.
      UWAGA: Wprowadzenie smoczku po wstrzyknięciu powoduje wciśnięcie bicukuliny w miejsce wstrzyknięcia.
  4. Po wstrzyknięciu
    1. Odłączyć wstrzykiwacz od precyzyjnej szklanej mikrostrzykawki.
    2. Wypłukać pozostały roztwór z wstrzykiwacza za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem. Wyczyść wtryskiwacz sterylną wodą, a następnie opróżnij go, wstrzykując powietrze przez wtryskiwacz.
    3. Odłączyć precyzyjną szklaną mikrostrzykawkę od pompy infuzyjnej i umyć ją sterylną wodą.

2. Model chroniczny

  1. Przygotowanie przedoperacyjne
    1. Preparat do prowadnicy kaniuli
      UWAGA: Prowadnica kaniuli jest częścią rurki infuzyjnej i służy do mocowania kaniuli infuzyjnej do uchwytu kaniuli podczas implantacji.
      1. Wytnij 12 mm (0,472'') ze stali nierdzewnej, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hipo-rurkę, aby uzyskać prowadnicę kaniuli (Rysunek 2, urządzenie #1). Użyj narzędzia obrotowego, aby uzyskać proste krawędzie.
      2. Przygotuj uchwyt do kaniuli zgodnie z opisem w kroku 1.1.4. Włóż uchwyt kaniuli do prowadnicy kaniuli, aby sprawdzić, czy jest prawidłowo zamocowany i wyjmij go.
    2. Preparat kaniuli infuzyjnej
      UWAGA: Kaniula infuzyjna jest również częścią rurki infuzyjnej. Jest on wszczepiany do końcowego celu prążkowia i umożliwia ogniskową infuzję bicukuliny.
      1. Wytnij hiporurkę ze stali nierdzewnej 30 G (OD 0,012 '', ID 0,007 ''), aby uzyskać kaniulę infuzyjną. Użyj narzędzia obrotowego, aby uzyskać proste krawędzie. Całkowita długość kaniuli infuzyjnej jest sumą pożądanej głębokości implantacji plus współczynnik bezpieczeństwa (~1-2 mm, 0,039''-0,079''), część zgięta w infuzji-kaniuli (2 mm, 0,079''), zakładka z prowadem kaniuli (3 mm, 0,118'') i część pozioma (4 mm, 0,157'') (Rysunek 2, urządzenie #2).
        UWAGA: W przeciwieństwie do modelu ostrego, głębokość implantacji jest równa końcowemu celowi infuzji.
      2. Włóż drut o średnicy 0,005 cala do kaniuli infuzyjnej i zegnij je w kształt litery L w zamierzonym miejscu. Część pionowa odpowiada pożądanej głębokości implantacji plus 4-5 mm (0,157''-0,197''), a część pozioma ma 4 mm (0,157'') długości.
        UWAGA: Włożenie drutu wewnętrznego zapobiega zatykaniu się kaniuli podczas zginania.
    3. Elastyczny preparat do rurki cewnika
      UWAGA: Jest również składnikiem rurki infuzyjnej. Łączy kaniulę infuzyjną z minipompą osmotyczną za pomocą adaptera rurki.
      1. Wytnij 8 cm (3,149 '') rurki z polietylenu (PE)-10 (ID 0,011 '', OD 0,025 '') (Rysunek 2, urządzenie #3).
        UWAGA: Długość cewnika zależy od odległości między celem implantacji a lokalizacją pompy, co umożliwia swobodny ruch głowy i szyi szczura (patrz Rysunek 3B).
    4. Montaż rurki infuzyjnej
      UWAGA: Rurka infuzyjna przewodzi bicukulinę z minipompy osmotycznej do mózgu. Składa się z prowadnicy kaniuli, kaniuli infuzyjnej, elastycznej rurki cewnika, łącznika rurki i moderatora przepływu (Rysunek 2).
      1. Usuń wewnętrzny drut z kaniuli infuzyjnej. Sprawdź kaniulę pod mikroskopem, aby upewnić się, że jej krawędzie są otwarte i czyste po obu stronach; jeśli nie, użyj igły 30 G (OD 0,01''), aby go otworzyć.
      2. Przyklej prowadnicę kaniuli do pionowej części kaniuli infuzyjnej, w pobliżu zgiętej części, na zakładkę 3 mm (0,118''), za pomocą kleju CA i akceleratora CA.
      3. Włożyć poziomą część kaniuli infuzyjnej do elastycznego cewnika. Zakładka powinna wynosić co najmniej 2 mm (0,079'').
      4. Wysunąć półprzezroczystą nasadkę regulatora przepływu pompy. Spowoduje to ujawnienie krótkiej rurki kaniuli ze stali nierdzewnej (Rysunek 2, urządzenie #5.1).
        UWAGA: Moderator przepływu jest częścią zestawu minipompy osmotycznej. Składa się z półprzezroczystej nasadki, krótkiej części kaniuli, białego kołnierza i długiej części kaniuli. Długa część kaniuli jest wprowadzana do minipompy osmotycznej, a krótka część kaniuli jest podłączona do rurki cewnika za pomocą adaptera rurki.
      5. Zanurz adapter rurki (Rysunek 2, urządzenie #4) w 70% alkoholu. Odczekaj kilka minut, aby materiał pęczniał.
      6. Przymocuj adapter rurki do krótkiej części kaniuli moderatora przepływu, aż dotknie białego kołnierza (Rysunek 2, urządzenie #5.2). Adapter rurki skurczy się w powietrzu, tworząc szczelne, szczelne połączenie.
      7. Włóż elastyczną rurkę cewnika do otwartego końca adaptera rurki, aż dotknie krótkiej części kaniuli moderatora przepływu.
      8. Przytrzymaj długą część kaniuli (Rysunek 2, urządzenie #5.3) za pomocą stojaka na klips i sklej wszystkie połączenia. Połączenia znajdują się między adapterem rurki a białym kołnierzem, adapterem rurki i elastycznym wężykiem cewnika, a na końcu elastycznym wężykiem cewnika i poziomą częścią kaniuli infuzyjnej. Odczekaj kilka godzin, aż klej całkowicie wyschnie (w zależności od rodzaju kleju).
        UWAGA: Użyj kleju kompatybilnego z PE, aby zapobiec poluzowaniu połączeń.
      9. Wstrzyknąć sterylną wodę przez długą kaniulę rurki infuzyjnej za pomocą strzykawki z igłą igłą o masie 27 G (0,014''). Sprawdź, czy woda płynnie przepływa przez kaniulę infuzyjną. Wstrzyknąć powietrze przez rurkę infuzyjną, aby spuścić wodę.
    5. Zalewanie minipompy osmotycznej
      UWAGA: Przygotowanie jest procedurą rozruchową, która umożliwia pompie rozpoczęcie infuzji natychmiast po implantacji.
      1. Napełnij łaźnię grzewczą wodą o temperaturze ciała (~37 °C). Napełnij małą zlewkę sterylną solą fizjologiczną i umieść ją w łaźni grzewczej.
      2. Owiń mini pompę osmotyczną papierową chusteczką i zamocuj ją pionowo otworem skierowanym do góry, używając stojaka z klipsem.
      3. Napełnij pompę ACSF za pomocą strzykawki z igłą igłą o masie 27 G (0,014''). Wyjmując strzykawkę, należy kontynuować wstrzykiwanie ACSF, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza. W otworze pompy pojawi się pęcherzyk ACSF.
        UWAGA: Początkowy wlew ACSF umożliwia szczurowi pełne wyzdrowienie po operacji przed wywołaniem tików. Opcjonalnie pompa wypełniona bicukuliną może zostać wszczepiona podczas pierwszej operacji, aby uniknąć późniejszej wymiany pompy, ale nie jest to optymalne19.
      4. Przymocować strzykawkę z igłą igłą o wadze 27 G (0,014'') do długiej części kaniuli rurki infuzyjnej i wstrzyknąć przez nią ACSF. Wyjmując strzykawkę, należy kontynuować wstrzykiwanie ACSF, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza. W długiej części kaniuli pojawi się pęcherzyk ACSF.
      5. Włóż długą część kaniuli do pompy, bańka po bańce. Na końcu kaniuli infuzyjnej powinien pojawić się pęcherzyk ACSF.
      6. Umieść pompę w zlewce. Zalać pompę, podłączoną do rurki infuzyjnej, przez co najmniej 4-6 godzin (w temperaturze ~37 °C) przed implantacją pompy. Upewnij się, że tylko pompa styka się z solą fizjologiczną.
    6. Operacja implantacji pompy
      1. Znieczulij szczura zgodnie z protokołem anestezjologicznym. Patrz krok 1.2.1.
      2. Ogol głowę i grzbiet szczura za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia, nieco z tyłu łopatek.
      3. Wykonaj podstawowe kroki chirurgiczne, zgodnie z opisem w krokach 1.2.3-1.2.11. Nacięcie powinno przebiegać wzdłuż skóry głowy aż do kości potylicznej.
      4. Wysterylizuj duży hemostat (~14 cm długości, 5,512'') w autoklawie. Włóż hemostat przez nacięcie i utwórz podskórną kieszeń na grzbiecie szczura, naprzemiennie otwierając i zamykając ją pod skórą przez linię środkową łopatki.
        UWAGA: Kieszeń powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić pompkę i pozwolić jej na lekkie poruszanie się.
    7. Implantacja minipompy osmotycznej i rurki infuzyjnej
      1. Przymocuj uchwyt kaniuli do ramienia stereotaktycznego i umieść go w żądanej pozycji do implantacji.
      2. Wyjmij pompę z łaźni grzewczej i umieść ją na grzbiecie szczura pokrytym papierową chusteczką.
      3. Wsuń prowadnik kaniuli rurki infuzyjnej na uchwyt kaniuli.
      4. Chwyć pompkę z hemostatem i delikatnie włóż ją do kieszonki podskórnej.
      5. Wszczepić kotwiące.
        UWAGA: Wszczepić kotwiące po włożeniu pompy, aby uniknąć zablokowania otworu kieszeni, a przed implantacją kaniuli, aby uniknąć przemieszczenia kaniuli.
      6. Wszczepić kaniulę infuzyjną w cel i przykleić ją do czaszki za pomocą kleju żelowego. Poczekaj, aż wyschnie. Współrzędne indukcji tików kończyn przednich to: AP: +1 do +1,5, mL: ±2,5, DV: 5.
      7. Nałóż cement dentystyczny wzdłuż kaniuli infuzyjnej, aby przymocować ją do czaszki. Poczekaj, aż wyschnie.
      8. Podnieś uchwyt kaniuli, pozostawiając wszczepioną kaniulę na miejscu.
      9. Wszczep wszystkie inne urządzenia. Nałóż cement dentystyczny na resztę czaszki, pokrywając wszystkie implanty. Pozostawić wystarczającą ilość elastycznego rurki cewnika w kieszonce podskórnej niezamocowanej, aby umożliwić szczurowi swobodny ruch.
        UWAGA: Upewnij się, że między czaszką a otworem kieszeni nie ma odsłoniętych obszarów i że cewnik nie jest zgięty.
      10. Zakończ operację zgodnie z opisem w krokach 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Chirurgia wymiany pompy
    UWAGA: Każdy typ minipompy osmotycznej ma swój własny, z góry określony okres infuzji. W związku z tym zabieg wymiany pompy należy wykonać przed upływem terminu ważności.
    1. Przygotowanie przedoperacyjne
      1. Powtórz kroki 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Napełnij pompę bicukuliną za pomocą strzykawki z igłą o masie 27 g (0,014''). Podczas wyjmowania strzykawki należy kontynuować wstrzykiwanie bicukuliny, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza.
      3. Włóż moderator przepływu (przymocowany do półprzezroczystej nasadki) do wnętrza pompy.
      4. Umieść pompę w zlewce. Zalać pompę przez co najmniej 4-6 godzin (w temperaturze ~37 °C) przed wymianą pompy.
    2. chirurgia
      1. Znieczulij szczura (patrz krok 1.2.1.1) i ogol jego grzbiet za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.
      2. Przetrzyj grzbiet szczura jodem powidonu, a następnie chusteczką nasączoną alkoholem, aby wysterylizować obszar. Naciekać wzdłuż pożądanej linii nacięcia 0,5-1% roztworem lidokainy (SC).
      3. Wykonaj nacięcie na skórze nad wszczepioną pompą. Umyj kieszeń środkiem ACSF o temperaturze pokojowej i osusz gazikami. Użyj autoklawowanych jednorazowych zasłon, aby zakryć obszar w pobliżu nacięcia.
      4. Odłączyć pompę wypełnioną ACSF od moderatora przepływu za pomocą hemostatu i wyrzucić.
      5. Wyjąć pompę wypełnioną dwukuliną z łaźni grzewczej. Odłączyć i wyrzucić moderator przepływu od pompy wypełnionej dwukuliną.
      6. Delikatnie przymocuj pompę wypełnioną bicukuliną do wszczepionego moderatora przepływu. Unikaj dotykania otaczającej skóry.
        UWAGA: Kroki 2.2.2.4-2.2.2.6 należy wykonać szybko, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Jednak pompa powinna być wprowadzana powoli, aby zapobiec szybkiemu przedostawaniu się bicuculline do mózgu.
      7. Ściśnij dwa brzegi nacięcia blisko siebie za pomocą kleszczy. Przyklej linię nacięcia za pomocą kleju tkankowego. Alternatywnie zamknij nacięcie za pomocą szwów.
      8. Przetrzyj obszar jodem powidonu i zakończ operację zgodnie z opisem w krokach 1.2.12.10-1.2.12.11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyżej przedstawiono protokoły generowania modeli ostrych i przewlekłych indukcji tików u szczurów. Protokoły obejmują pełne przygotowanie do operacji i eksperymentów (Rysunek 1 dla modelu ostrego, Rysunek 2 dla modelu przewlekłego). Zastosowanie bicuculline do obszarów motorycznych prążkowia powoduje ekspresję trwających tików motorycznych. Tiki pojawiają się po stronie przeciwnej do aplikacji i charakteryzują się krótkimi i powtarzającymi się skurczami mięśni. Po zastosowaniu bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie szczegółowo opisaliśmy protokoły ostrych i przewlekłych modeli indukcji tików u swobodnie zachowującego się szczura. Protokoły te opisują przygotowanie wszystkich komponentów, operację i proces eksperymentalny, które można dostosować do konkretnych potrzeb badawczych. Podstawową zasadą leżącą u podstaw tych modeli jest bezpośrednie miejscowe zastosowanie bicukuliny do obszarów motorycznych prążkowia, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w patofizjologii zaburzeń tikowych 10,11,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF) (297/18). Autorzy dziękują M. Bronfeld za stworzenie modelu ostrego gryzonia oraz M. Israelashvili za komentarze.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
kotwiąceMikrołącznikiSMPPS0002#0 x 1/8 - Wkręty do blachy z stożkowym
Bicuculline methiodideSigma Aldrich14343
Akcelerator cyjanoakrylanu (CA)ZapPT29
Klej cyjanoakrylowy (CA)BSIIC-2000Stwierdzono, że ten klej jest mocniejszy niż inne
Cement dentystycznyColteneH00322Higieniczny materiał naprawczy do trwałej ondulacji Reline Samoutwardzalny
żel klejowyLoctiteUltra Gel Control
HemostatWPI501242Wystarczy dowolny hemostat o wielkości około 14 cm
Hypo-tube, bardzo cienkościenna 25GFirma dostarczająca komponentyHTX-25X
Hypo-tube, zwykła ściana 22GFirma dostarczająca komponentyHTX-22R
Hiporurka, normalna ścianka 30GFirma dostarczająca komponentyHTX-30R
Pompa infuzyjnaNew Era Pump SystemsNE-1000
Mini-pompa osmotycznaALZET20011.0µ l na godzinę, 7 dni
Klej kompatybilny z PECEYSSpecjalne trudne tworzywa sztuczne (odpowiednie do PE)
Rurka cewnika PE-10ALZETPE-10ID = 0,28 mm, OD = 0,61 mm
Precyzyjna szklana mikrostrzykawka, 10 i mikro; lHamilton800651701 RNR 10µ l syr (22s/51/3)
Klej tkankowy3M1469Sb
Vetbond Adapter rurkiCMA3409500
Rurka z mikrootworem Tygon, 0,02 cala ID * 0,06 ODFirma dostarczająca komponentyTND80-020
Drut 0,005 calaFirma dostarczająca komponentyGWX-0050
Drut 0,013 calaFirma dostarczająca komponentyGWX-0130

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50(2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120(2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor TicsBicuculline MicroinjectionStriatal DisinhibitionChronic Infusion ModelAcute Tic ModelCannula ImplantationMini Osmotic PumpCortico Basal GangliaElectrophysiological RecordingsBehavioral Analysis

Related Articles