Artykuł metodologiczny

Identyfikacja, izolacja i charakterystyka włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) i miogennych progenitorów (MP) w mięśniach szkieletowych u szczura

DOI:

10.3791/61750

⸱

9 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę izolowania komórek progenitorowych fibro-adipogennych (FAP) i miogennych (MP) z mięśni szkieletowych szczurów. Wykorzystanie szczura w modelach urazów mięśni zapewnia zwiększoną dostępność tkanek z mięśni zanikowych do analizy oraz szerszy repertuar zwalidowanych metod oceny siły mięśni i chodu u zwierząt poruszających się swobodnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogenne Progenitory (FAP) to rezydujące komórki śródmiąższowe w mięśniach szkieletowych, które wraz z miogennymi przodkami (MP) odgrywają kluczową rolę w homeostazie, urazach i naprawie mięśni. Obecne protokoły identyfikacji i izolacji FAP, cytometria przepływowa/sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) oraz badania oceniające ich funkcję in vivo, zostały przeprowadzone wyłącznie na myszach. Większy wrodzony rozmiar szczura pozwala na bardziej wszechstronną analizę FAP w modelach uszkodzeń mięśni szkieletowych, zwłaszcza w mięśniach poważnie zanikowych lub gdy badacze wymagają znacznej masy tkankowej do przeprowadzenia wielu dalszych testów. Szczur dodatkowo zapewnia większy wybór testów funkcjonalnych mięśni, które nie wymagają uspokojenia ani poświęcenia zwierząt, minimalizując w ten sposób zachorowalność i wykorzystanie zwierząt poprzez umożliwienie seryjnych ocen. Protokoły cytometrii przepływowej/FACS zoptymalizowane dla myszy są specyficzne dla gatunku, w szczególności ograniczone charakterystyką dostępnych na rynku przeciwciał. Nie zostały one zoptymalizowane pod kątem oddzielania FAP od szczurów lub silnie zwłókniałych mięśni. Opracowano protokół cytometrii przepływowej/FACS do identyfikacji i izolacji FAP i MP zarówno ze zdrowych, jak i odnerwionych mięśni szkieletowych szczurów, opierając się na zróżnicowanej ekspresji markerów powierzchniowych CD31, CD45, Sca-1 i VCAM-1. Ponieważ specyficzne dla szczurów, zwalidowane cytometrią przepływową przeciwciała pierwszorzędowe są poważnie ograniczone, przeprowadzono wewnętrzną koniugację przeciwciała skierowanego przeciwko Sca-1. Korzystając z tego protokołu, potwierdzono udaną koniugację Sca-1, a identyfikację FAP i MP za pomocą cytometrii przepływowej zwalidowano za pomocą hodowli komórkowej i barwienia immunologicznego FAP i MP izolowanych przez FACS. Na koniec przedstawiamy nowy przebieg czasowy FAP w przedłużonym (14 tygodni) modelu denerwacji szczurów. Metoda ta daje badaczom możliwość badania FAP w nowym modelu zwierzęcym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) to populacja rezydujących multipotencjalnych komórek progenitorowych w mięśniach szkieletowych, które odgrywają kluczową rolę w homeostazie, naprawie i regeneracji mięśni, a także pośredniczą w patologicznych reakcjach na uszkodzenie mięśni. Jak sama nazwa wskazuje, FAP zostały pierwotnie zidentyfikowane jako populacja progenitorowa z potencjałem do różnicowania się w fibroblasty i adipocyty1 i miały być kluczowymi mediatorami infiltracji włóknisto-tłuszczowej mięśni szkieletowych w przewlekłych urazach i chorobach. Dalsze badania wykazały, że FAP są dodatkowo zdolne do osteogenezy i chondrogenezy2,3,4. W związku z tym są one szerzej zapisywane w literaturze jako przodkowie mezenchymalni lub zrębowiskowe3,5,6,7,8. W ostrym uszkodzeniu mięśni szkieletowych FAP pośrednio wspomagają regeneracyjną miogenezę poprzez przejściową proliferację, aby zapewnić korzystne środowisko dla aktywowanych komórek satelitarnych mięśni i ich dalszych miogennych odpowiedników progenitorowych (MPS) 1,9,10. Równolegle z udaną regeneracją, FAP przechodzą apoptozę, przywracając swoją liczebność do poziomów wyjściowych1,9,10,11. Natomiast w przewlekłych urazach mięśni FAP zastępują sygnały proapoptotyczne, co skutkuje ich trwałością9,10,11 i nieprawidłową naprawą mięśni.

Badania in vivo oceniające komórkowe i molekularne mechanizmy, za pomocą których FAP pośredniczą w reakcjach mięśni, wykorzystywały do tej pory mysie modele zwierzęce1,7,9,10,11,12,13,14. Podczas gdy genetycznie modyfikowane myszy są potężnymi narzędziami do wykorzystania w tych analizach, mały rozmiar zwierzęcia ogranicza dostępność tkanek do badań w długoterminowych modelach miejscowych urazów, w których atrofia mięśni może być głęboka, takich jak odnerwienie pourazowe. Ponadto pomiar siły mięśniowej i funkcji fizycznych wymaga pomiarów ex vivo lub in situ, które wymagają przerwania myszy, lub metod in vivo, które wymagają operacji i/lub znieczulenia ogólnego, aby umożliwić ocenę zdolności skurczowej mięśni15,16,17,18,19,20. U szczurów istnieją dobrze zweryfikowane i globalnie wykorzystywane analizy funkcjonalne mięśni, a także analizy bardziej złożonych zachowań motorycznych, takich jak analiza chodu (np. wskaźnik funkcji kulszowych, analiza CatWalk) i są one wykonywane u zwierząt obudzonych i poruszających się spontanicznie21,22,23,24. To dodatkowo optymalizuje zasady minimalnej zachorowalności w doświadczeniach na zwierzętach oraz liczby wykorzystywanych zwierząt badawczych. W ten sposób szczur zapewnia badaczowi FAP dodatkową elastyczność w postaci większej objętości uszkodzonych mięśni do analiz białek i komórek oraz zdolność do przeprowadzania seryjnych ocen statycznej i dynamicznej aktywności funkcjonalnej i zachowań kompleksu mięśniowego u czujnego zwierzęcia.

FAP zostały przede wszystkim zidentyfikowane i wyizolowane z próbek całych mięśni za pomocą cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Są to testy laserowe, które są w stanie zidentyfikować wiele określonych populacji komórek na podstawie charakterystycznych cech, takich jak rozmiar, ziarnistość i specyficzna kombinacja powierzchni komórki lub markerów wewnątrzkomórkowych25. Jest to bardzo korzystne w badaniu układu narządów, takiego jak mięśnie szkieletowe, ponieważ homeostaza i regeneracja są złożonymi, wieloczynnikowymi procesami koordynowanymi przez wiele typów komórek. W badaniu przeprowadzono nowatorskie badanie, w którym zidentyfikowano FAP, a także MP, przy użyciu metod cytometrii przepływowej w myszy1. Wykazali, że FAP mają charakter mezenchymalny, ponieważ brakuje im antygenów powierzchniowych specyficznych dla komórek pochodzenia śródbłonkowego (CD31), krwiotwórczego (CD45) lub miogennego (Integryna-α7 [ITGA7]), ale wykazują ekspresję mezenchymalnego markera komórek macierzystych Sca-1 (antygen komórek macierzystych 1)1 i różnicują się w hodowli na komórki fibrogenne i adipogenne. Inne badania wykazały udaną izolację mezenchymalnych komórek progenitorowych w mięśniach w oparciu o ekspresję alternatywnego markera komórek macierzystych, receptora alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα)2,7,8, a dalsza analiza wykazała, że prawdopodobnie jest to ta sama populacja komórek, co FAPs3. FAP są obecnie powszechnie identyfikowane w cytometrii przepływowej przy użyciu Sca-1 lub PDGFRα jako markera selekcji pozytywnej1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31. Stosowanie PDGFRα jest jednak preferowane dla tkanek ludzkich, ponieważ bezpośredni ludzki homolog mysiego Sca-1 nie został jeszcze zidentyfikowany32. Ponadto inne białka powierzchniowe komórek zostały zgłoszone jako markery MP (np. VCAM-1), stanowiąc potencjalną alternatywę dla ITGA7 jako wskaźnika komórek linii miogennej podczas izolacji FAPs33.

Chociaż cytometria przepływowa/FACS jest potężną metodologią badania roli i potencjału patogennego FAP w mięśniach szkieletowych1,9,10,11,13,29, jest ograniczony technicznie przez specyfikę i optymalizację wymaganych odczynników. Ponieważ cytometria przepływowa i izolacja FAP została opracowana i przeprowadzona na mysich modelach zwierzęcych1,9,10,11,29, stanowi to wyzwanie dla badaczy, którzy chcą badać FAP w innych organizmach modelowych. Wiele czynników, takich jak optymalna wielkość tkanki do przetworzenia, a także swoistość i dostępność odczynników i/lub przeciwciał, różni się w zależności od użytego gatunku.

Oprócz technicznych przeszkód w badaniu FAPów w nowym modelu zwierzęcym, były one w dużej mierze badane w ostrym, toksycznym otoczeniu - zwykle za pomocą domięśniowego zastrzyku chemicznego lub kardiotoksyny. Ocena długoterminowej dynamiki FAP ogranicza się przede wszystkim do oceny dystrofii mięśniowej Duchenne'a, przy użyciu modelu myszy mdx9,10,11, oraz modeli złożonych uszkodzeń mięśni, takich jak masywne naderwanie stożka rotatorów, gdzie równoczesne przecięcie ścięgna i odnerwienie jest wykonywane na mięśniach barku26,27,28. Reakcja FAPs na wyłączną zniewagę przewlekłego odnerwienia pourazowego, częstego zjawiska w wypadkach przy pracy w przemyśle ciężkim, rolnictwie i urazach okołoporodowych (uraz splotu ramiennego)34,35,36,37 ze znaczną zachorowalnością, nie została tak dobrze scharakteryzowana, często ograniczona do krótkoterminowego przedziału czasowego11,38.

Opisujemy metodę identyfikacji i izolowania FAPów i MP od zdrowych, jak również poważnie zanikowych i zwłóknieniowych mięśni szkieletowych u szczurów. Po pierwsze, wykazano identyfikację CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAP i CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MP przy użyciu protokołu barwienia trawienia tkanek i cytometrii przepływowej, a następnie walidację naszych wyników przeprowadza się poprzez hodowlę i barwienie immunocytochemiczne komórek izolowanych FACS. Korzystając z tej metody, opisujemy również nowy przebieg czasowy FAP w długoterminowym izolowanym modelu uszkodzenia odnerwionego u szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badacze przeprowadzający ten protokół muszą otrzymać pozwolenie od lokalnej komisji etyki zwierząt/komisji ds. opieki. Wszystkie prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Canadian Council on Animal Care (CCAC). Schemat protokołu cytometrii przepływowej jest pokazany na Rysunek 1. Jeśli dalsza aplikacja to FACS, a następnie hodowla komórkowa, wszystkie etapy powinny być wykonane z zachowaniem odpowiedniej techniki aseptycznej.

1. Zbieranie mięśni

  1. Znieczulenie szczurów za pomocą odpowiedniego środka znieczulającego i poświęcenie zgodnie z lokalnymi wytycznymi wiwarium i komisji etyki zwierząt. W tym protokole pobiera się mięsień brzuchaty łydki od dorosłych samic szczurów Lewisa (200-250 g), na przykład. Szczury znieczulono przy użyciu 2-3% izofluranu i uśmiercono przez dosercowe wstrzyknięcie T61.
  2. Po uśmierceniu zwierzęcia należy ogolić całą tylną kończynę, aby ułatwić lokalizację mięśnia i zminimalizować zanieczyszczenie futra pobranej tkanki.
  3. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj dwa nacięcia w skórze: pierwsze wokół obwodu stawu skokowego, a drugie wzdłuż linii środkowej przyśrodkowej części kończyny tylnej od kostki do biodra.
  4. Oderwij skórę i powierzchowne warstwy mięśni, aby odsłonić leżący pod spodem brzuchaty łydki, który zaczyna się w kłykciach przyśrodkowych i bocznych kości udowej i przyczepia się do ścięgna Achillesa.
  5. Użyj sekcji, aby oddzielić mięsień brzuchaty łydki od otaczającej tkanki, dotykając mięśnia tylko ścięgnem, aby uniknąć zmiażdżenia.
  6. Oddziel mięsień brzuchaty łydki od jego przyczepu, przecinając ścięgno Achillesa tak dystalnie, jak to możliwe, ostrymi nożyczkami. Po przecięciu chwyć ścięgno Achillesa kleszczami i delikatnie oderwij mięsień brzuchaty łydki od kości podstawowej. Nadal trzymając mięsień kleszczami w jednej ręce, zlokalizuj dwa źródła mięśnia brzuchatego łydki i przetnij przyśrodkowe i boczne kłykcie kości udowej.
  7. Delikatnie osusz wycięty brzuchaty łydki o sterylny kawałek gazy, aby usunąć jak najwięcej krwi. Przytnij mięsień na sterylnej powierzchni i usuń nadmiar tkanki łącznej, a także ścięgno Achillesa.
  8. Umieść mięśnie w łodzi do ważenia i zważ za pomocą precyzyjnej wagi. Protokół ten jest zoptymalizowany do trawienia mięśni o mokrej masie w zakresie 200-600 mg. W razie potrzeby podmioty gospodarcze mogą podzielić nadmiar pobranych tkanek do innych dalszych testów.
  9. Delikatnie dalej podzielić pobrany mięsień, który ma być użyty do cytometrii przepływowej, na 3-4 mniejsze kawałki (około 1-2 cm3) i zanurzyć w lodowatym 1x PBS. Przechowywać w chłodnym miejscu na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zebrane.

2. Trawienie mięśni

  1. Usuń mięśnie z PBS i umieść w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm. Delikatnie rozerwij i zmiel tkankę kleszczami, aż kawałki będą miały około 3-4 mm3 3, usuwając jak najwięcej tkanki łącznej. Po dokładnym zmieleniu przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 6 ml DMEM + 1% penicyliny/streptomycyny (P/S).
  2. Dodać 10 μl 300 mM roztworu CaCl2 do 365 μl roztworu kolagenazy II (stężenie podstawowe 4800 U/ml) w celu aktywacji enzymu kolagenazy. Dodać aktywowany roztwór kolagenazy II do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę tkankową. Końcowe stężenie kolagenazy II wynosi 250 U/ml.
  3. Inkubować probówki w wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 240 x g, upewniając się, że ręcznie obracasz co 15 minut, aby usunąć tkankę, która przykleiła się do boku probówki.
  4. Po 1 godzinie wyjmij probówki z wytrząsarki i dodaj następujące ilości na próbkę: 100 μl kolagenazy II (4,800 U/ml) i 50 μl dypazy (4,8 U/ml).
  5. Odpipetować próbki za pomocą pipety serologicznej 15-20 razy, aż roztwór będzie jednorodny. W przypadku przetwarzania wielu próbek należy użyć oddzielnej sterylnej pipety dla każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki.
  6. Ponownie inkubować w wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 240 x g. Po 15 minutach należy ręcznie wstrząsnąć próbkami, aby usunąć przylegającą tkankę z boku probówki.

3. Generowanie zawiesiny jednokomórkowej

  1. Powoli ścinać próbki przez strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 20 G przez 10 cykli.
    UWAGA: Jeden cykl polega na pobraniu roztworu mięśniowego do strzykawki i wstrzyknięciu go z powrotem do probówki. Upewnij się, że zminimalizujesz wszelkie pęcherzyki, kończąc strzyżenie powoli, ponieważ nadmierne spienianie może spowodować dodatkową śmierć komórki39.
  2. Umieść sitko o pojemności 40 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż je pipetując 5 ml DMEM + 10% FBS i 1% P/S.
  3. Jednorazowo pipetować 1 ml próbki przez sitko do komórek.
  4. Przemyć sitko do komórek, pipetując DMEM z 10% FBS i 1% P/S przez sitko, aby uzyskać całkowitą objętość w probówce do 25 ml.
  5. Podzielić 25 ml próbki równo na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 15 °C, 400 x g przez 15 min.
    UWAGA: Podział roztworu mięśniowego na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml zapewnia lepszą regenerację komórek po odwirowaniu w porównaniu z pojedynczą probówką.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x bufor do lizy RBC (patrz plik uzupełniający) w temperaturze pokojowej na 7 minut w celu wyeliminowania erytrocytów.
  7. Zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą 9 ml buforu do przemywania (patrz plik uzupełniający) i wirować probówki w temperaturze 400 x g, 15 °C przez 15 minut.
  8. Odessać supernatant i ponownie połączyć granulki, ponownie zawieszając je w 1 ml buforu do przemywania .
  9. Przenieś odpowiednią objętość komórek do oddzielnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wymieszaj z barwnikiem błękitu trypanowego. Policz żywe komórki pod mikroskopem świetlnym za pomocą hemocytometru.

4. Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej

UWAGA: Przeciwciało Sca-1 musi być sprzężone z APC przed eksperymentami cytometrii przepływowej/FACS, zgodnie z instrukcjami producenta. Wydajność musi być zweryfikowana dla każdej partii koniugatów (Rysunek 2). Końcowe koniugacje mogą być przechowywane w 20 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C i są stabilne przez trzy tygodnie. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym, aby zapoznać się z pełnym protokołem koniugacji.

  1. W przypadku cytometrii przepływowej przenieść 1-2 x 106 komórek na próbkę doświadczalną do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić objętość do 1 ml za pomocą buforu do przemywania i umieścić na lodzie.
  2. Dla każdego eksperymentu należy skonfigurować następujące wymagane kontrole: i) niebarwione i ii) kontrole żywotności, aby dokładnie wybrać populację żywych komórek; iii) kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) na zawiesinach pojedynczych komórek w celu ustawienia dokładnych bramek dla frakcji CD31-/CD45-, FAP i MP; oraz iv) pojedynczo barwione kulki kompensacyjne w celu skorygowania rozlewania się fluorescencji między kanałami.
    1. Dla wszystkich kontrolnych komórek, podwielokrotność 5 x 105 - 1 x 106 komórek w 1 ml buforu do przemywania w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
    2. W przypadku kontroli kulek dodaj 1 kroplę dodatnich kulek kompensacyjnych (~1,5 x 105 kulek na kroplę) do każdej oznaczonej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Pełny zestaw kontrolny przedstawiono w tabeli 1.
      UWAGA: Jeśli eksperyment jest przeprowadzany po raz pierwszy, należy przeprowadzić pojedyncze barwione kontrole dla każdego sprzężonego przeciwciała na zawiesinach pojedynczych komórek (oprócz niebarwionych, żywotności, jednobarwnych kulek kompensacyjnych i kontroli FMO), aby ocenić dodatnio zabarwioną populację w komórkach i zweryfikować barwienie zaobserwowane na kulkach kompensacyjnych. Walidację każdego świeżo sprzężonego preparatu Sca-1::APC należy przeprowadzić pojedyncze barwienie na kulkach kompensacyjnych i zawiesinach pojedynczych komórek. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby uzyskać pełną listę kontroli barwienia.
  3. Aby przygotować kontrolę żywotności, przenieś połowę objętości komórek z probówki "żywotności" do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Oznacz tę rurkę jako "Martwy".
  4. Inkubować "martwą" probówkę w temperaturze 65 °C przez 2-3 minuty w celu zabicia komórek, a następnie umieścić na lodzie. Po 2-3 minutach ponownie połącz martwe komórki z żywymi komórkami pozostałymi w probówce kontrolnej żywotności. Ta populacja komórek zostanie wykorzystana do ustawienia wartości kompensacji (w razie potrzeby) i prawidłowego ustawienia bramek dla barwnika żywotności.
  5. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe (próbki doświadczalne i kontrole) w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 100 μl buforu do przemywania .
  7. Dodaj przeciwciała, w zależności od próbki doświadczalnej lub kontroli. Zapoznaj się z matrycą barwienia (Tabela 2) w celu uzyskania informacji na temat kombinacji i ilości przeciwciał.
  8. Delikatnie strzepnąć każdą próbkę, aby zapewnić całkowite wymieszanie i inkubować na lodzie w ciemności przez 15 minut. W celu uzyskania koralików kompensacyjnych inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut.
  9. W przypadku zawiesiny jednokomórkowej próbek eksperymentalnych i kontrolnych należy zwiększyć objętość do 1 ml, dodając 900 μl buforu do przemywania wody. W celu kontroli kulek kompensacyjnych należy zwiększyć objętość do 1 ml za pomocą 900 μl 1x PBS.
  10. Odwirować próbki zawiesiny jednokomórkowej przy 500 x g, 4 °C przez 5 min. Kontrole koralików kompensacyjnych wirówki przy 300 x g, 4 °C przez 5 min.
  11. W przypadku wszystkich próbek zawiesiny jednokomórkowej należy odessać i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforze do przemywania . W celu kontroli kulek kompensacyjnych należy odessać i wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 300 μl 1x PBS, a następnie dodać 1 kroplę (~1,5 x 105) ujemnych kulek kompensacyjnych.
  12. Trzymaj wszystkie próbki zawiesiny pojedynczej komórek na lodzie pod folią aluminiową i przystąp do akwizycji metodą cytometrii przepływowej. Regulatory koralików kompensacyjnych powinny być również chronione przed światłem, ale można je przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli eksperymentalnym punktem końcowym jest identyfikacja FAP za pomocą cytometrii przepływowej, należy postępować zgodnie z krokami 5.1.1-5.1.11. Jeśli punktem końcowym jest izolacja komórek za pomocą FACS w celu hodowli i barwienia, postępuj zgodnie z krokami 5.2.1-5.2.9 i sekcjami 6-7.

5. Cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)

  1. Cytometria przepływowa
    UWAGA: W tym protokole wykorzystuje stacjonarny cytometr przepływowy wyposażony w lasery o długości fali 405 nm, 488 nm i 640 nm, które są w stanie jednocześnie rozróżniać 10 różnych kolorów. Filtry pasmowoprzepustowe i związane z nimi fluorochromy używane w tym protokole są następujące: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) i 670/30 (APC). Napięcia dla każdego detektora są następujące: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-CY7 600; SYTOX Niebieski 360; Transporter opancerzony 570. Przed użyciem upewnij się, że zostałeś przeszkolony w zakresie prawidłowej obsługi cytometru przepływowego lub sortera komórek.
    1. Upewnij się, że cytometr był włączony na 10-20 minut przed użyciem i został zagruntowany przez sekwencyjne czyszczenie roztworami płynu czystego, płukania i osłonki przez 30-45 sekund każdy. Na koniec przepłukać wodą dH2O. Upewnij się, że do pojemnika do przechowywania dodano odpowiednią ilość płynu w osłonie, aby utrzymać prawidłowy przepływ próbki przez cały czas jej pozyskiwania.
    2. Ustaw strategię bramkowania, aby zidentyfikować FAP i MP zgodnie z opisem w Rysunek 3.
      UWAGA: FAP i MP są identyfikowane za pomocą następującej hierarchicznej strategii bramkowania: i) SSC-A vs FSC-A (obszar rozproszenia komórek bocznych kontra obszar rozproszenia komórek do przodu w celu oddzielenia komórek i szczątków), ii) FSC-W vs FSC-H (szerokość rozproszenia komórki do przodu w stosunku do wysokości rozproszenia komórki do przodu w celu odróżnienia podkoszulków od dubletów w parametrze FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (szerokość rozproszenia komórki bocznej w stosunku do wysokości rozproszenia komórki bocznej w celu odróżnienia singli od dubletów w parametrze SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (w celu rozróżnienia żywych i martwych singletów), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (w celu wykluczenia komórek CD31+ i CD45+ z dalszej analizy) oraz vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E z CD31-/CD45- (Linia; Lin-) populacji (identyfikacja FAP i MP). FAP są identyfikowane jako zdarzenia CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-, a MP są identyfikowane jako zdarzenia CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Najpierw przeprowadź każdą pojedynczą kontrolę koralików kompensacyjnych przez cytometr z niską prędkością, aby wygenerować wartości kompensacji używane do korygowania rozlewania się fluorescencji między kanałami. Oceń kompensację, porównując sygnał fluorescencyjny każdej kontroli w jej własnym detektorze (np. SSC-A vs APC dla pojedynczo barwionych kulek Sca-1::APC), a także we wszystkich innych detektorach. W odpowiednim detektorze powinny istnieć dwie odrębne populacje (jedna z sygnałem ujemnym i jedna z sygnałem dodatnim) i tylko populacja ujemna we wszystkich innych detektorach. Ustaw bramkę zatrzymującą na 10 000 zdarzeń koralików kompensacyjnych i zapisz dane.
      UWAGA: Pomiędzy pobraniem każdej próbki należy przepuścić dH2O przez cytometr przez 10-20 sekund, aby uniknąć zanieczyszczenia między próbkami.
    4. Następnie przetwarzaj niebarwione i kontrolne próbki żywotności, aby prawidłowo przebramować żywe pojedyncze komórki. Ustaw bramkę zatrzymującą na 10 000 zdarzeń singlet i zapisz dane.
      UWAGA: Około 5 minut przed pobraniem każdej próbki zawiesiny pojedynczej komórki, z wyjątkiem próbki niebarwionej, dodać 1 μl barwnika żywotności SYTOX Blue (300 μM stężenie robocze rozcieńczone z 1 mM roztworu podstawowego) do każdej próbki i delikatnie strzepnąć do wymieszania (stężenie końcowe 1 μM).
    5. Następnie należy pobrać pozostałe próbki kontrolne zawiesiny jednokomórkowej. Oceń każdą kontrolkę FMO za pomocą odpowiedniego wykresu w strategii bramkowania (Rysunek 3). Na przykład oceń sygnał FITC FMO CD31+CD45, aby zapewnić dokładną bramkę CD31-/CD45-. Optymalny przykład jest pokazany w Rysunek 3G. Jeśli protokół jest wykonywany po raz pierwszy, przed nabyciem kontroli FMO należy przeprowadzić jednobarwne kontrole na komórkach.
    6. Oceń sygnał fluorescencyjny każdej pojedynczej wybarwionej próbki komórki w odpowiednim detektorze, a także we wszystkich innych detektorach, aby potwierdzić prawidłową kompensację. Ustaw bramkę zatrzymania na 10 000 wydarzeń singlet na żywo i nagrywaj w oprogramowaniu.
    7. Po przetworzeniu wszystkich próbek kontrolnych (zawiesiny jednokomórkowe i kulki) należy przygotować wszystkie próbki doświadczalne, najpierw mierząc i rejestrując objętość każdej próbki. Pomiary te zostaną wykorzystane do dokładnego określenia ilościowego FAP i MP, zgodnie z opisem w kroku 5.1.11. Następnie dodaj 50 μl precyzyjnych kulek do liczenia i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
    8. Pokrótce uruchom pierwszą próbkę eksperymentalną, aby zweryfikować identyfikację populacji kulek do liczenia. Populacja ta pojawia się jako mały, odrębny klaster oddzielony od ogólnej populacji komórek na wykresie FSC-A vs SSC-A (Rysunek 3A, czerwona ramka). Utwórz bramkę wokół populacji zliczających ściegi. Następnie uzyskaj dane dla każdej próbki eksperymentalnej, przetwarzając ją przez cytometr z małą prędkością. Ustaw bramkę zatrzymującą na 10 000 zdarzeń zliczania ściegów i zapisz.
      UWAGA: Badacze mogą alternatywnie zidentyfikować kulki do liczenia, ustawiając dodatkowy wykres oceniający SSC-A w porównaniu z dowolnym z detektorów, ponieważ kulki zliczające są fluorescencyjne we wszystkich detektorach.
    9. Po przetworzeniu wszystkich próbek wyczyść cytometr zgodnie z odpowiednimi protokołami. Eksportuj wszystkie dane do analizy.
    10. Otwórz wszystkie pliki danych w odpowiednim oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej. Ustaw strategię bramkowania używaną do pozyskiwania danych zgodnie z opisem w kroku 5.1.2. Zbadaj kontrole w tej samej kolejności, co w przypadku pozyskiwania danych (np. niebarwione, żywotność, pojedyncze barwienie, a następnie kontrole FMO), aby ponownie zweryfikować strategię bramkowania. Po ustawieniu dokładnych bramek za pomocą kontroli FMO, zastosuj bramki do wszystkich próbek eksperymentalnych. Eksportuj surowe dane jako arkusz kalkulacyjny w celu określenia ilościowego.
    11. Oblicz liczbę FAP i MP w każdej próbce doświadczalnej za pomocą koralików do liczenia:
      figure-protocol-1
      gdzie, liczba nabytych komórek oznacza liczbę zarejestrowanych zdarzeń związanych z odpowiednią populacją komórek (np. FAP lub MP) w oprogramowaniu do akwizycji; Nabyta liczba koralików to liczba zarejestrowanych zdarzeń liczenia koralików w oprogramowaniu do akwizycji; Objętość liczenia koralików to objętość roztworu do liczenia koralików dodanego w kroku 5.1.7; Objętość próbki to objętość każdej barwionej próbki doświadczalnej przed dodaniem kulek do liczenia; Stężenie kulek to liczba kulek na μl roztworu; Ta wartość znajduje się w karcie katalogowej produktu.
  2. FACS - sortowanie do hodowli komórkowych
    UWAGA: Ten protokół wykonuje FACS na sortowniku komórek wyposażonym w 4 lasery (UV, Fioletowy, Niebieski, Czerwony), który jest w stanie jednocześnie rozróżnić 11-14 kolorów. Postępuj zgodnie z protokołem barwienia próbki eksperymentalnej (sekcja 4) i cytometrii przepływowej, z wyjątkiem kroków od 1 do 3 opisanych poniżej, aby zoptymalizować przepływ pracy FACS:
    1. Zwiększ stężenie komórek w próbkach eksperymentalnych, które mają być sortowane, do 7 x 106 komórek/ml, aby uzyskać solidne wyniki FAP i MP.
    2. Aby uwzględnić ten znaczny wzrost stężenia w komórkach, należy podwoić wszystkie stężenia przeciwciał w próbkach eksperymentalnych, które mają być sortowane.
    3. Końcowe wybarwione próbki komórek należy przetworzyć przez nasadkę sitka o wielkości 40 μM umieszczoną w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml bezpośrednio przed sortowaniem, aby zmniejszyć zlepianie się komórek i zwiększyć wydajność sortowania.
    4. Zbierz pojedyncze, żywe FAP i MP szczurów bezpośrednio z sortownika komórek do 5 ml polipropylenowej probówki zbiorczej zawierającej 1 ml sterylnej, 100% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Trzymaj komórki na lodzie do momentu zakończenia sortowania.
      UWAGA: W przypadku przeprowadzania FACS w lokalizacji poza terenem zakładu, wszystkie posortowane komórki należy przenieść na lód i w bezpiecznym, zakrytym pojemniku.
    5. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), należy zwiększyć objętość posortowanych komórek do 7 ml za pomocą odpowiednich pożywek wzrostowych (np. pożywki wzrostowej FAP (FAP GM) dla posortowanych FAP i pożywki wzrostowej MP (MP GM) dla posortowanych MP; przepisy znajdują się w pliku uzupełniającym) i odwirować w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 7 minut, aby usunąć jak najwięcej pozostałości buforu do płukania.
    6. Zawiesić osady w 1 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej i płytki na 12-dołkowej płytce zawierającej sterylne, pokryte kolagenem szklane szkiełko nakrywkowe/basenik o średnicy 12 mm w celu późniejszego barwienia immunologicznego (patrz sekcja 6).
      UWAGA: W przypadku barwienia immunocytochemicznego kolagenu, płytki posortowały komórki na 12-dołkowej płytce zawierającej sterylne, pokryte lamininą 12 mm szklane szkiełko nakrywkowe/basenik, zamiast pokrytego kolagenem. Jeśli wymagane są eksperymenty immunocytochemiczne na natychmiast wyizolowanych progenitorach, wysiewaj FAP i MP o gęstości 15 000 komórek nacm2 i przejdź bezpośrednio do kroku 6.1. W przypadku długoterminowych hodowli w celu indukowania różnicowania progenitorów, FAP wysiewa się w gęstości 5,000 komórek nacm2, a MP w gęstości 7,500 komórek nacm2.
    7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 72 godzinach w kulturze zmień połowę pożywki. Zmieniaj media całkowicie co 2-4 dni po.
    8. Aby indukować rozwój miocytów, zmień hodowle MPS na pożywkę różnicowania MP (MD) w 9 dniu hodowli. Aby indukować adipocyty, należy zmienić hodowle FAP na pożywkę FAP do różnicowania adipogennego (AD) w 10 dniu hodowli.
    9. Aby indukować fibrogenezę, FAP mogą być przełączane na pożywki do różnicowania fibrogennego (FD) w różnych momentach hodowli lub alternatywnie mogą być wysiewane bezpośrednio do pożywek FD po izolacji (krok 5.2.6) (patrz plik uzupełniający dla wszystkich receptur pożywek).

6. Immunocytochemia hodowanych FAP i MP

  1. Aby zwalidować sortowanie komórek i wykazać czystość kultur FAP i MPs, barwienie immunologiczne markerami specyficznymi dla typu komórki, w tym PDGFRα (marker FAPs), Pax-7 (marker komórek macierzystych [satelitarnych] mięśni), białko specyficzne dla fibroblastów (FSP-1, marker fibroblastów), Perilipin-1 (Plin-1, marker adipocytów), kolagen typu 1 (Col1a1, wskaźnik zwłóknienia), łańcuch ciężki miozyny (MHC, marker dojrzałych miocytów).
    1. W celu barwienia immunologicznego świeżo posortowanych komórek, należy odwirować 12-dołkową płytkę o masie 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby ułatwić przyleganie komórek do szkiełka nakrywkowego/studzienki. Ten krok nie jest konieczny w przypadku kultur długotrwałych. Usuń pożywkę hodowlaną.
    2. W przypadku barwienia immunologicznego za pomocą FSP-1 utrwal komórki 1 ml 100% metanolu (MeOH) przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. W przypadku barwienia immunologicznego dla PDGFRα, Plin-1, Pax7 lub Col1a1, utrwal hodowle komórkowe za pomocą 1 ml 4% PFA w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie immunologiczne MHC toleruje utrwalacz.
      UWAGA: W przypadku ogniw z mocowaniem metanolem pomiń krok 6.2 i przejdź do kroku 6.3.
  2. Odessać 4% PFA i szybko przemyć kultury komórkowe 3-4 razy za pomocą 1x PBS. Dodaj 1 ml 100 mM glicyny do 1x PBS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu dezaktywacji resztkowego PFA. Odessać i umyć 1-2 razy za pomocą 1x PBS.
    UWAGA: Komórki można pozostawić na tym etapie w 2 ml 1x PBS, zawinąć w folię spożywczą i przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 7-10 dni.
  3. Po umyciu dodaj 1 ml 0,1% Triton-X do 1x PBS i inkubuj przez 20 minut, aby przepuszczalność błon komórkowych.
  4. Przemyj studzienki 2-3 razy 1-2 ml 1x PBS, a następnie zablokuj komórki 1 ml 1x PBS + 3% BSA na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Odpipetować 80 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) na kawałek parafilmu przyklejony taśmą do mobilnego pojemnika. Używając sterylnych cienkich kleszczyków, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z dołka i odwróć na kroplę roztworu przeciwciał. Inkubować szkiełko nakrywkowe z dwoma mokrymi kawałkami ręcznika papierowego i przykryć pojemnik folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć parowania roztworu przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Barwienie szkiełek nakrywkowych z dołka zużywa mniej przeciwciał (~80 μL) niż barwienie wewnątrz studzienki (minimum 500 μL).
  6. W dniu 2 pozostaw szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby się ogrzały. Używając kleszczy, ostrożnie w prawo i przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem do odpowiednich dołków (komórki skierowane do góry) i przemyj 2-3 razy 1-2 ml 1x PBS przez 2 minuty każdy, aby usunąć jak najwięcej przeciwciał pierwotnych.
  7. Stosując tę samą technikę barwienia, co w przypadku barwienia przeciwciałami pierwotnymi, wybarwić komórki przeciwciałem drugorzędowym kozy anty-króliczym Alexa Fluor 488 (1:400) w celu wykrycia FSP-1, Plin-1, Col1a1 lub PDGFRα i koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego Alexa Fluor 555 (1:300) w celu wykrycia MHC lub Pax-7. Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i chroń komórki przed światłem.
  8. Umieścić komórki z powrotem w studzience i inkubować komórki za pomocą Hoechst (1:10 000) przez 2-4 minuty w temperaturze pokojowej. Umyj komórki kolejne 2-3 razy 1x PBS przez 2 minuty każda, aby usunąć nadmiar Hoechst.
  9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą fluorescencyjnego środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

7. Barwienie czerwienią olejną O (ORO) kulturowych FAP i MP

  1. Barwienie ORO należy wykonać na komórkach nieprzepuszczalnych, ponieważ przepuszczalność błony komórkowej może powodować niespecyficzne/niepożądane barwienie typów komórek nietłuszczowych. Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować materiał roboczy ORO (przepis znajduje się w pliku uzupełniającym) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  2. Po 20 minutach przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczonych agregatów.
  3. Odessać pożywkę ze studzienki i dodać 1 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (10% NBF). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zbieg komórek może spowodować podniesienie się ze studzienki/szkiełka nakrywkowego. Zachowaj ostrożność podczas zasysania/dodawania roztworów.
  4. Odessać i dodać 1 ml świeżego 10% NBF i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym momencie protokół można zatrzymać, ponieważ komórki można pozostawić na noc w 10% NBF.
  5. Szybko umyj studzienki raz 1 ml 60% izopropanolu, a następnie odessaj i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia (około 2 min).
  6. Dodać 400 μl czerwonego oleju O do dołka i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, uważając, aby nie pipetować ORO na ściankach płytki.
  7. Usuń cały czerwony olej O i szybko umyj studzienkę 4 razy za pomocą dH2O.
    UWAGA: Jeśli poplamione studzienki zawierają szkiełka nakrywkowe, zamontuj je przy użyciu tej samej techniki, jak opisano w kroku 6.9.
  8. Obraz zamontowanych szkiełek nakrywkowych lub zabarwionej studzienki za pomocą mikroskopu jasnego pola.

8. Barwienie tkanek przeciwległych i odnerwionych odcinków brzuchatego łydki szczura

  1. Czerwony Picrosirius (PSR)
    1. Wykonaj barwienie PSR na przekrojach histologicznych szczura mięsnego brzuchatego łydki szczura o grubości 5 μm, utrwalonym w parafinie (FFPE), jak opisano wcześniej40.
  2. Olej czerwony O (ORO)
    1. Utrwalić skrawki histologiczne szczura zamrożonego izopentanem w 4% PFA o grubości 5 μm w 4% PFA przez 10 minut, inkubować w 60% alkoholu izopropylowym przez 1 min.
    2. Barwieć materiałem roboczym ORO przez 12 min. Inkubować w 60% alkoholu izopropylowym przez 1 min, myć przez 10 min w dH2O. Mocować na szkiełkach nakrywkowych za pomocą rozpuszczalnego w wodzie podłoża montażowego.
  3. Immunohistochemia fluorescencyjna tkanki Sca-1 i lamininy (IHC)
    1. Wykonaj fluorescencyjne IHC na przekrojach histologicznych żołądka łydki szczura o grubości 5 μm zamrożonych izopentanem.
    2. Uwodnić próbki w 1x PBS przez 5 minut, utrwalić w 4% PFA przez 10 minut, a następnie inkubować próbki w roztworze blokującym tkanki IF (patrz plik uzupełniający) przez 90 minut.
    3. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-Sca-1 (1:500) rozcieńczonym w 1x PBS + 0,05% Tween w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. W dniu 2 umyj trzy razy w 1x PBS + 0,05% Tween przez 5 minut każdy, a następnie inkubuj w kozie anty-króliku Alexa Fluor 555 (1:500) przez 1 godzinę.
    5. Przemyć ponownie (jak poprzednio), inkubować z roztworem blokującym przez 1 godzinę, następnie dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-lamininowe (1:500) rozcieńczone w 1x PBS + 0,05% Tween przez 1 godzinę.
    6. Umyj ponownie (jak poprzednio), a następnie inkubuj w kozie anty-króliku Alexa Fluor 488 (1:500) przez 1 godzinę (dla lamininy).
    7. Umyć ponownie (jak poprzednio), a następnie inkubować w DAPI (1:10 000) przez 4 minuty. Umyć i zamontować na szkiełkach nakrywkowych za pomocą środka mocującego zapobiegającego blaknięciu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja FAP i MP za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu nowego panelu przeciwciał, w tym Sca-1 i VCAM-1
Strategia bramkowania do identyfikacji FAP w mięśniach szczurów opiera się na protokołach cytometrii przepływowej w mouse29, które bramują na komórkach CD31 (śródbłonek) i CD45 (hematopoetycznych) (określanych jako linia [Lin]) i bada profil fluorescencyjny markera FAP Sca-1 i markera MPS ITGA7 z populacji line-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoptymalizowany, zwalidowany protokół izolacji FAP dla mięśni szczurów jest niezbędny dla badaczy, którzy chcą badać modele urazów, które nie są wykonalne u myszy z przyczyn biologicznych lub technicznych. Na przykład myszy nie są optymalnym modelem zwierzęcym do badania przewlekłych urazów miejscowych lub neurodegeneracyjnych, takich jak długotrwałe odnerwienie. Z biologicznego punktu widzenia krótka żywotność i szybkie starzenie się myszy utrudniają dokładne wyznaczenie mięśni równości z powodu odnerwienia spowodowaneg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Obiektom Cytometrii Przepływowej na Uniwersytecie w Ottawie oraz Centrum Badawczemu Keenan dla Nauk Biomedycznych (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto za ich wiedzę i wskazówki w zakresie optymalizacji protokołu cytometrii przepływowej/FACS przedstawionego w tym manuskrypcie. Praca ta została sfinansowana przez Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) na rzecz JB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 ml polipropylenowa probówka okrągłodennaFalcon352063
ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkowąFalcon352235
10 cm szalki do hodowli komórkowychSarstedt83.3902
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermoFisher130185
szklane szkiełka nakrywkowe 12 mm, nr 2VWR89015-724
Strzykawka 10 mlBeckton Dickenson302995
15 ml probówki wirówkoweFroggaBio91014
igła o rozmiarze 20 BecktonDickenson305176
25 ml Pipeta serologicznaSarstedt86.1685.001
40&mikro; m sitko do komórekFisher Scientific 22363547
50 ml probówki wirówkoweFroggaBioTB50
AbC Całkowita kompensacja przeciwciał Koraliki ThermoFisherA10497
Chlorek amonu, odczynnik klasyBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µ gBiotium92307
Aquatex Wodne podłoże montażoweMerck108562
Biolaminina 411 LNBiolaminaLN411
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BioshopALB001
Chlorek wapniaBioshopCCL444.500
Kolagenaza typu IIGibco17101015
CountBright Plus Absolutne koraliki do liczeniaThermoFisherC36995
DeksametazonMilipor SigmaD4902
RozpuszczalneGibco17105041
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4,5 g/L D-Glukoza
(+)L-glutamina
(+)110 mg/L Pirogronian sodu
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF1051
Cytometria przepływowa Płyn osłonkowyBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson-
Fluorescencyjne podłoże montażoweDakoS302380-2 Koza anty-mysie
przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 555InvitrogenA21424
Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488InvitrogenA11008
Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 555 Przeciwciało drugorzędoweInvitrogenA21429
Surowica koziaGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Czerwień fenolowa
(+) L-glutamina
(-) HEPES
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (1X)Wielokomórkowa311-513-CL
Inaktywowana termicznie surowica końskaGibco26050-088
HemocytometrReichertN/A
HEPES, minimum 99,5% miareczkowanieSigmaH3375
Surowica końskaThermoFisher16050130
Ludzki transformujący czynnik wzrostu β 1 (hTGF-β 1)Sygnalizacja komórkowa8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Znany również jako 3-izobutylo-1-metyloksantyna
IzopropanolSigmaI9516Znany również jako 2-propanol
Lewis Rat, samicaCharles River Kingston004 (kod szczepu)200-250 gramów używany
LSRFortessa X-20 Cytometr laboratoryjnyBeckton Dickenson-
MikrowirówkaEppendorfEP-5417R
Sortownik komórek MoFlo XDPBeckman Coulter-
Mysz Anti-CD31::FITC PrzeciwciałoAbcamab33858Klon TLD-3A12
Mysz Anti-CD45::FITC PrzeciwciałoBiolegend202205Klon myszy OX-1
Anti-CD106::P E PrzeciwciałoBiolegend200403Znany również jako VCAM-1
Mysie badania rozwojowe przeciwciał anty-MHCBank hybrydoma (DSHB)N/AZnany również jako MF20
Mysie badania rozwojowe przeciwciał anty-PAX7Bank Hybridoma (DSHB)N/A
Neutralna buforowana formalina, 10SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
Zestaw do koniugacji PE-Cy7 Abcamab102903
Penicylina-StreptomycynaSigma P4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4 (1X)Gibco10010-023(-) Chlorek wapnia
(-) Chlorek magnezu
Wodorowęglan potasu, klasa odczynnikaBioshopPBC401.250
Przeciwciało przeciw fibroblastom króliczym 1 (FSP-1)InvitrogenMA5-32347FSP-1 znany również jako S100A4
Królicze przeciwciałoanty-integrynowe-a7Abcamab203254
Królicze przeciwciało anty-lamininoweSigmaL9393
Królicze przeciwciało anty-perylipinowe-1Abcamab3526
Królicze przeciwciało anty-Sca-1Millipore SigmaAB4336
Rekombinowane przeciwciało anty-kolagenowe typu I królikaAbcamab260043Znany również jako Col1a1
Rekombinowany anty-PDGFR królika Przeciwciało alfaAbcamab203491
Rekombinowany ludzki FGF-basicGibcoPHG0266
Azydek soduSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazonMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510
5 340346%

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782(2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183(2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036(2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819(2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684(2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543(2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375(2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flow CytometryRat DenervationCell IsolationSurface MarkersSca 1 ConjugationCell CultureImmunostaining

Powiązane artykuły