Artykuł metodologiczny

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

21.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61753

⸱

22 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Streszczenie

Hipokamp to wysoce zorganizowana struktura w mózgu, która jest częścią układu limbicznego i bierze udział w tworzeniu i konsolidacji pamięci, a także w manifestacji poważnych zaburzeń mózgu, w tym choroby Alzheimera i epilepsji. Hipokamp otrzymuje wysoki stopień połączeń wewnętrznych i wzajemnych, zapewniając prawidłową komunikację z wewnętrznymi i zewnętrznymi strukturami mózgu. Ta łączność jest realizowana za pośrednictwem różnych przepływów informacyjnych w postaci ścieżek światłowodowych. Plasterki mózgu są często stosowaną metodologią podczas badania neurofizjologicznych funkcji hipokampa. Wycinki mózgu z hipokampa mogą być wykorzystywane do kilku różnych zastosowań, w tym do zapisów elektrofizjologicznych, pomiarów mikroskopowych światła, a także do kilku technik molekularnych, biologicznych i histochemicznych. W związku z tym wycinki mózgu stanowią idealny system modelowy do oceny funkcji białek, do badania procesów patofizjologicznych związanych z zaburzeniami neurologicznymi, a także do celów odkrywania leków.

Istnieje kilka różnych sposobów przygotowania plastrów. Preparaty do wycinania mózgu z wibratomem pozwalają na lepsze zachowanie struktury tkanki i gwarantują wystarczające zaopatrzenie w tlen podczas krojenia, co ma przewagę nad tradycyjnym użyciem rozdrabniacza tkanek. Co więcej, różne płaszczyzny cięcia mogą być stosowane do przygotowywania wibratomu w postaci plastrów mózgu. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół udanego przygotowania poziomych wycinków hipokampa mózgów myszy wyciętych wibratomem. W przeciwieństwie do innych preparatów plastrowych, krojenie poziome pozwala utrzymać włókna ścieżki wejściowej hipokampa (ścieżki perforacyjnej) w całkowicie nienaruszonym stanie w plasterku, co ułatwia badanie interakcji śródwęchowo-hipokampowych. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół preparacji, ekstrakcji i ostrego poziomego krojenia mózgu myszy oraz omawiamy wyzwania i potencjalne pułapki tej techniki. Na koniec pokażemy kilka przykładów wykorzystania wycinków mózgu w dalszych zastosowaniach.

Wprowadzenie

Szeroko zakrojona eksploracja hipokampa rozpoczęła się, gdy Scoville i Milner zgłosili niezdolność pacjenta (H.M.) do tworzenia nowych wspomnień deklaratywnych po chirurgicznym usunięciu hipokampa oraz pobliskich struktur płata skroniowego w ramach leczenia ciężkiej postaci epilepsji1. Od tego momentu hipokamp był intensywnie badany, poczynając od ogólnych właściwości i funkcji neuronów, aż po rozwój ciężkich zaburzeń mózgu, takich jak epilepsja i choroba Alzheimera2,3,4,5. Hipokamp jest częścią układu limbicznego, składającego się z grupy powiązanych struktur mózgu zaangażowanych w emocje i tworzenie pamięci6,7. Gęsta sieć kilku szlaków włókien zapewnia ścisłą łączność hipokampa ze strukturami mózgu wewnętrznymi i zewnętrznymi. Szlaki te obejmują przyśrodienną i boczną drogę perforującą (z kory entorynalnej do zakrętu zębatego, CA3 – CA1 i subiculum)8, drogę włókien mszystych (z zakrętu zębatego do CA3)9 oraz szlak kolaterali Schaffa/komisuralny asocjacyjny (z CA3 do CA1)10 (Rycina 1). Hipokamp jest jednym z najszerzej zbadanych obszarów mózgu ze względu na wysoce konserwatywną lamelarną organizację formowania warstw neuronów oraz możliwość stosunkowo łatwego pozyskania żywych kultur neuronów i skrawków mózgu5.

Schemat dróg neuronów hipokampa, pokazujący połączenia CA1, CA2, CA3, DG i EC dla przepływu sygnałów.
Rysunek 1: Schemat ilustrujący poszczególne obszary hipokampa i główne drogi włókien. Poszczególne obszary hipokampa są oznaczone jednolitymi kolorowymi liniami: kora entorynalna (EC; czarny), zakręt zębaty (DG; pomarańczowy), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyjan), 2 (żółty) i 1 (magenta) oraz subikulum (zielony). Drogi włókien przedstawiono kolorowymi liniami przerywanymi: przyśrodna (MPP, czerwony) i boczna droga perforanta (LPP, niebieski) (z kory entorynalnej do zakrętu zębatego, CA3, CA1 i subikulum), droga włókien mszystych (MF, fioletowy) (z zakrętu zębatego do CA3) oraz kolaterale Schaffera (SC, brązowy) (ipsilateralne z CA3 do CA1)/drogi komisuralne asocjacyjne (AC, jasnozielony) (kontralateralne z CA3 do CA1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokoły przygotowania skrawków mózgu często prowadzą do utraty połączeń z obszarów mózgu oddalonych od obszaru zainteresowania5. Co więcej, naczynia włosowate przestają być funkcjonalne5, a krążenie krwi zostaje przerwane11. Pomimo tych ograniczeń, skrawki mózgu są nadal powszechnie wykorzystywane do badania funkcji neurofizjologicznych hipokampa ze względu na szereg zalet. Po pierwsze, wypreparowanie hipokampa jest szybkie12 i nie wymaga wielu materiałów. Jedynymi niezbędnymi instrumentami są zestaw do sekcji, laboratoryjna łaźnia wodna, dostęp do karbogenu oraz wibrotom13. Innymi atutami techniki skrawków mózgowych są ominięcie bariery krew-mózg (BBB) oraz wypłukanie endogennie uwalnianych cząsteczek przed rozpoczęciem eksperymentu5, co umożliwia badanie działania leków przy stosunkowo precyzyjnej kontroli dawkowania14. Ponadto skrawki mózgu zachowują cytoarchitekturę i obwody synaptyczne w obrębie hipokampa15,16, gdzie zachowana zostaje neuroanatomia oraz lokalne środowisko z łącznością neuronalną i złożonymi interakcjami neuron-gleja4,11,17. Dodatkowo połączenia włókien hipokampa są w przeważającej mierze jednokierunkowe, a neurony hipokampa wykazują wysoką plastyczność synaptyczną, co znacznie ułatwia gromadzenie i interpretację wysokiej jakości rejestracji elektrofizjologicznych w celu zrozumienia procesów neurologicznych18,19. Co istotne, skrawki mózgu stanowią cenny zasób możliwy do zastosowania w szerokim zakresie różnych technik naukowych, od metod biologii molekularnej, przez obrazowanie, aż po pomiary elektrofizjologiczne12,20,21,22,23,24,25,26.

Jak opisano powyżej, skrawki hipokampa stanowią potężne narzędzie eksperymentalne do badania strukturalnych i funkcjonalnych cech łączności synaptycznej. Pozwala to na ocenę wpływu substancji chemicznych lub mutacji na pobudliwość i plastyczność neuronów16.

Przygotowanie ostrych przekrojów mózgu jest techniką stosunkowo wrażliwą, a optymalna jakość skrawków w dużym stopniu zależy od idealnych warunków eksperymentalnych, w tym od wieku zwierzęcia, metody eutanazji, szybkości sekcji i cięcia, roztworów i parametrów krojenia (np. prędkości cięcia) oraz warunków rekuperacji skrawków4. Dlatego też dobrze opracowany protokół ma kluczowe znaczenie i zapewnia powtarzalność wyników w różnych jednostkach badawczych13.

W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania ostrych poziomych skrawków hipokampa, mający na celu zachowanie integralności bocznej i przyśrodkowej drogi perforacyjnej hipokampa oraz drogi włókien mszystych, co umożliwia badanie procesów związanych z zakrętem zębatym9. Szczegółowo opiszemy kluczowe etapy preparowania, wyodrębniania i poziomego krojenia mózgu myszy, a następnie zaprezentujemy reprezentatywne wyniki mikrofluorymetrycznych pomiarów wapnia oraz rejestracji polowych potencjałów postsynaptycznych pobudzających (fEPSPs) w warunkach bazowych oraz podczas protokołów indukcji LTP w skrawkach mózgu myszy linii C57BL/6J typu dzikiego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komisję oceny etycznej KU Leuven (Belgia) (P021/2012).

1. Przygotowanie roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)

  1. Przed dniem eksperymentalnym
    1. Przygotować 1 l 10-krotnego roztworu wstępnego z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabela 1). Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli mieszać chemikalia w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub pokojowej (RT).
  2. W dniu eksperymentu
    1. Przygotować 1 l 1x ACSF z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tabela 2). Użyj osmometru ciśnienia pary, aby sprawdzić osmolarność w zakresie 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
      UWAGA: Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli wymieszać wszystkie stałe substancje chemiczne w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Na samym końcu dodaćMgSO4 i CaCl2, powoli ociekając w niezbędnej ilości z 1 M roztworów podstawowych.
    2. Ciągle bąbelkować 1x roztwór ACSF w temperaturze pokojowej z karbogenem, aby ustawić pH w zakresie 7,3–7.4,
      UWAGA: Jeśli pH jest nieco za wysokie lub za niskie, wystarczą niewielkie korekty siły karbonowania. Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonowaniem, dostosuj je, dodając kilka kropli 1 M NaH2PO4 roztworu.
    3. Przygotować 250 ml (na mózg) 1x roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy w zlewce zawierającej 25 ml 10-krotnego roztworu w plastrach i (w mM): 252 sacharozy, 26 NaHCO3 i 10 glukozy (Tabela 3). Sprawdź, czy osmolarność wynosi 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
    4. Pęcherzykować roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 10–15 minut z karbogenem, aby kontrolować pH w zakresie 7,3–7.4.
      UWAGA: Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonacją, dostosuj je, dodając kilka kropli roztworu 1 M KH2PO4
      5. .
    5. Przechowuj roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 20–30 minut w ultrazamrażarce (-80 °C), aż zostanie częściowo zamrożony.

2. Przygotowanie miejsca do przeprowadzenia sekcji mózgu

  1. Podczas schładzania roztworu w plasterkach sacharozy należy przygotować następujące składniki.
    1. Rozgrzać łaźnię wodną do temperatury 32 °C.
    2. Napełnij komorę odzysku (Rysunek 2A) roztworem karbonogennego ACSF i umieść komorę w łaźni wodnej. Stale nakładać karbogen na główną butlę ACSF i ACSF w komorze odzyskiwania.
    3. Zaprowadź zwierzę do pokoju doświadczalnego.
      UWAGA: Wiek, płeć i szczep zwierzęcia muszą być określone przez indywidualnego eksperymentatora i zależą od konkretnego pytania badawczego. Jednakże parametry zwierzęcia powinny pozostać stałe w ramach jednego badania, aby zagwarantować porównywalność między różnymi dniami doświadczalnymi. Protokół ten został opracowany do użytku samców myszy C57BL/6J w wieku 2-6 tygodni. Jeśli będą wykorzystywane starsze zwierzęta, może być konieczne odpowiednie dostosowanie roztworów do warstw i odzyskiwania4,27 (np. rozwiązania oparte na NMDG+23,28) w celu zachowania zdrowia mózgu ostrych plastrów.
    4. Przygotuj komorę anestezjologiczną.
    5. Rozłóż bibułkę, plastikową pipetę Pasteura z szerokim otworem (rozciętą), 90 mm naczynie hodowlane wypełnione lodem, kwadrat bibuły filtracyjnej na schłodzonej misce hodowlanej, mocne nożyczki do dekapitacji, nożyczki do preparacji, zakrzywione kleszcze, szpatułkę, naczynie hodowlane 35 mm, cienką szczoteczkę, ostrze, płytkę próbki (w zestawie z wibratomem), super klej, końcówkę pipety, cztery paski bibuły filtracyjnej (~ 2 cm x 0,5 cm) (Rysunek 2A).
    6. Ustaw wibratom: Najpierw zaprogramuj wibratom na prawidłowe ustawienia (prędkość przesuwu ostrza: 0,08 mm/s, amplituda cięcia: 1,4 mm, częstotliwość cięcia: 85 Hz) i zamocuj żyłkę karbogeniczną w komorze plastrowania. Następnie umieść komorę na plastry w uchwycie, napełnij uchwyt otaczający komorę na plastry lodem i przymocuj wszystko do wibratomu. Na koniec umieść żyletkę w uchwycie ostrza wibratomu (Rysunek 2B).
  2. Po zamrożeniu roztworu o wysokiej zawartości sacharozy wykonaj następujące czynności.
    1. Po 20–30 minutach wyjmij roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy z ultrazamrażarki o temperaturze -80 °C i trzymaj zlewkę na lodzie.
    2. Umieść roztwór o wysokiej zawartości sacharozy obok wibratomu na swojej ławce, zmiażdż i wymieszaj częściowo zamrożony roztwór szpatułką, aby uzyskać ładną breję i zacznij bulgotać karbogenem.
    3. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura nabierz trochę roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy, aby namoczyć kwadratową bibułę filtracyjną na schłodzonej naczyniu hodowlanym o średnicy 90 mm.
    4. Napełnić naczynie hodowlane o średnicy 35 mm (lub inny równoważny mały pojemnik, który jest odpowiedni do przechowywania całego mózgu) do 75% roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy (wystarczającym do pokrycia całego mózgu) i schłodzić szalkę hodowlaną na lodzie umieszczonym obok zlewki z resztą roztworu. Skarbonować roztwór w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.

3. Sekcja i umiejscowienie mysiego mózgu

  1. Znieczulić zwierzę 5% izofluranem. Określ odpowiednią głębokość znieczulenia, ściskając łapę. Nie powinien wystąpić odruch wycofania łapy.
  2. Przenieś zwierzę na bibułę i odetnij mu głowę silnymi nożyczkami lub gilotyną dla małych zwierząt.
  3. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby rozciąć skórę głowy.
  4. Rozetnij kalwarię wzdłuż szwu strzałkowego i usuń ją za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż cały mózg, w tym opuszki węchowe, będzie widoczny.
    UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu ostrymi krawędziami kalwarii lub kleszczykami.
  5. Użyj szpatułki, aby ostrożnie zgarnąć mózg (opuszki węchowe powinny pozostać przyczepione).
  6. Przenieś mózg do schłodzonego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i usuń wszystkie włosy lub cząsteczki krwi z tkanki, delikatnie myjąc mózg pipetą Pasteura wypełnioną ACSF (krew ma działanie cytotoksyczne na tkankę mózgową29).
  7. Przenieś mózg za pomocą szpatułki na nasączoną bibułę filtracyjną na schłodzonej naczyniu hodowlanym 90 mm (Rysunek 2A).
  8. Użyj ostrza, aby przeciąć mózg na pół, oddzielając dwie półkule, i umieść obie półkule na świeżo odciętej środkowej stronie.
  9. Użyj ostrza, aby usunąć grzbietową część (5%-10%) mózgu z każdej półkuli z równoległym cięciem do grzbietowej górnej części (Rysunek 2C)30 i umieść obie półkule po świeżo odciętej stronie z brzuszną częścią mózgu skierowaną do góry.
  10. Umieść kroplę super kleju na płytce próbki i odpowiednio rozprowadź końcówką pipety, aby pomieścić obie półkule.
  11. Użyj paska z bibuły filtracyjnej, aby podnieść jedną półkulę z siłami kapilarnymi, dotykając strony brzusznej paskiem z bibuły filtracyjnej, nie uszkadzając w ten sposób tkanki.
  12. Użyj innego paska z bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie częściowo wysuszyć grzbietową stronę mózgu przed umieszczeniem półkuli grzbietową stroną do dołu na kleju na płytce próbki. Powtórz tę samą procedurę z drugą półkulą.
    UWAGA: Półkule powinny być ustawione w linii poziomej w lustrzanym odbiciu na płycie wibratomowej, przy czym boki rostralne są skierowane na zewnątrz, a boki ogonowe zwrócone do siebie (ale nie stykają się) pośrodku. Przyśrodkowe strony obu półkul powinny być skierowane w stronę ostrza wibratomu, a boczne boki w stronę eksperymentatora (Rysunek 2D).
  13. Umieść płytkę próbki w komorze krojenia i szybko, ale ostrożnie, przykryj ją lodowatym roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy. Gdy tylko roztwór dotknie kleju, zestali się i prawidłowo przyklei półkule do płytki próbki.
  14. Upewnij się, że półkule są odpowiednio pokryte roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i potwierdź, że roztwór jest bąbelkowany karbogenem.
    UWAGA: Cała procedura preparacji powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe. Proszę upewnić się, że mózg nie pozostaje bez dopływu tlenu przez bardzo długi czas. Od dekapitacji do zanurzenia mózgu w roztworze o wysokiej zawartości sacharozy powinno upłynąć tylko około 1–1,5 minuty. Jest to najważniejszy wymóg dla preparatów z ostrymi plastrami mózgu, aby zagwarantować wysoką jakość wycinka.

4. Poziome krojenie mózgu

  1. Umieść ostrze wibratomu przed przyśrodkową stroną półkul i opuść je na tę samą wysokość, co brzuszne strony półkul, które są teraz skierowane do góry. Opuść ostrze za pomocą regulatora wibratomu do 600 μm dalej w kierunku grzbietowym i rozpocznij krojenie. Ostrze powinno uderzyć w tkankę (jeśli nie, odwróć ostrze i opuść je nieco bardziej). Kroj, aż pierwsze dwa plasterki zostaną całkowicie oddzielone od dwóch półkul.
  2. Odwróć ostrze i opuść o kolejne 300 μm i ponownie pokrój.
  3. Kiedy hipokamp stanie się widoczny (w razie potrzeby użyj atlasu mózgu mouse31, aby uzyskać pomoc) (Rysunek 2E) zbierz plastry za pomocą poszerzonej plastikowej pipety Pasteura. Zbieraj plastry, aż skorupa ogoniasta stanie się widoczna obok hipokampa. Zazwyczaj do mózgu myszy można zebrać od 8 do 12 plastrów o wielkości 300 μm (4 – 6 na półkulę).
  4. Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać plastry i przenieść je do komory rekuperacji w łaźni wodnej (Rysunek 2F) (zbieraj plastry po każdej rundzie krojenia, aby zapobiec ich unoszeniu się w komorze krojenia).
    UWAGA: Pracuj tak szybko, jak to możliwe i upewnij się, że roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy jest lodowaty i karbonogenowany podczas całej procedury. W razie potrzeby uzupełnij lód otaczający komorę na plastry.

5. Odzyskiwanie wycinków mózgu do zapisów elektrofizjologicznych

  1. Pozostawić plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 1 godz.
    UWAGA: Komory odzysku są również dostępne na rynku.
  2. Wyjmij komorę regeneracyjną z łaźni wodnej.
  3. Umieść plastry w temperaturze pokojowej na co najmniej kolejne 30 minut w celu wyzdrowienia przed rozpoczęciem dalszej aplikacji.

6. Zapisy fEPSP w przyśrodkowej ścieżce perforacji (MPP) hipokampa

  1. Wyciągnąć pipety rejestrujące z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą poziomego ściągacza do pipet, aby otrzymać pipety o wielkości ~2 MΩ po napełnieniu roztworem ACSF i zanurzeniu w komorze zapisu wypełnionej ACSF.
  2. Napełnij roztwór do kąpieli ACSF i roztwór ACSF zawierający odpowiednie substancje chemiczne (np. bicukulinę) w sterowanym grawitacyjnie wielolufowym systemie perfuzyjnym, który jest podłączony do komory rejestrującej. Ciągłe karbonowanie wszystkich roztworów.
  3. Włączyć pompę perystaltyczną lub próżniową, która jest podłączona do rurki ssącej, która kończy się naprzeciwko linii perfuzyjnej w komorze nagrywania. Otwórz beczkę wypełnioną ACSF i zacznij ustalać ciągły przepływ (1-2 krople na sekundę). Sprawdź, czy elektroda referencyjna jest zanurzona w roztworze ACSF.
  4. Włącz komputer konfiguracyjny, amplifier, mikromanipulator, stymulator, światło mikroskopu, kamerę i monitor (jeśli dotyczy).
  5. Otwórz odpowiednie oprogramowanie do zapisów elektrofizjologicznych (istnieje kilku różnych dostawców sprzętu i oprogramowania dla sprzętu elektrofizjologicznego).
  6. Przenieś jedną półkulę wycinka mózgu z komory odzyskiwania do komory rejestracyjnej zestawu wycinków i ustaw ją we właściwej orientacji z warstwą komórek ziarnistych zakrętu zębatego i warstwą molekularną w polu widzenia. Upewnij się, że elektroda stymulacyjna może dotrzeć do MPP w wycinku od kierunku kory śródwęchowej i że elektroda rejestrująca ma dostęp do MPP dokładnie po przeciwnej stronie niż kierunek CA3.
  7. Ustabilizuj wycinek w komorze nagrywającej za pomocą spinacza do papieru (Rysunek 3A) lub dostępnej na rynku siatki do wycinania mózgu.
    UWAGA: Pomocne może być wyłączenie perfuzji podczas przenoszenia i pozycjonowania plasterka. Nie powinno to jednak zająć zbyt dużo czasu, aby zagwarantować jakość wycinka mózgu.
  8. Obniż i umieść elektrody rejestrujące i stymulujące w MPP w dolnej jednej trzeciej warstwy molekularnej w pobliżu warstwy komórek ziarnistych (Rysunek 3B), zwrócone do siebie w odległości około 100–150 μm. Elektroda stymulująca powinna minimalnie stykać się z powierzchnią, podczas gdy elektroda rejestrująca powinna lekko infiltrować górną warstwę warstwy.
  9. Zastosuj bodziec o niskiej intensywności (30–50 μA przez 0,1 ms) do wycinka mózgu, aby uzyskać sygnał fEPSP. W razie potrzeby dostosuj położenie elektrod (np. niski lub nietypowy kształt sygnału fEPSP).
  10. Rozpocznij nagrywanie krzywych wejścia-wyjścia: stosuj rosnącą intensywność bodźców do wycinka mózgu w odstępach 30 sekund.
  11. Ustaw intensywność bodźca na 50% maksymalnej odpowiedzi fEPSP i rozpocznij podstawowe zapisy fEPSP, stosując 50% intensywność bodźca przez 20–40 minut w odstępach 30 s do wycinka mózgu.
  12. Jeśli linia wyjściowa wydaje się być stabilna, należy przeprowadzić dodatkowe zapisy (np. protokoły LTP/LTD i/lub aplikacje leków). (Do indukcji LTP w MPP zastosowano tutaj protokół składający się z czterokrotnych impulsów 1 s 100 Hz zastosowanych w odstępie 5 minut. Bicuculline zastosowano 10 minut przed i w trakcie fazy kondycjonowania.)
    UWAGA: Wszystkie nagrania powinny być wykonywane w aktualnym trybie cęgowym z odpowiednim filtrowaniem dolnoprzepustowym (<5 kHz) i częstotliwościami próbkowania (>10 kHz).
  13. Wyodrębnij dane w odpowiednim formacie pliku i przeanalizuj parametry fEPSP, takie jak salwa światłowodowa, amplituda fEPSP i nachylenie fEPSP.

7. Zapisy obrazowania wapnia wycinków mózgu

  1. Przenieś jedną półkulę wycinka mózgu do 12-dołkowej komory i załaduj ją na 30 minut do 1 godziny odpowiednim barwnikiem wapniowym. Roztwor ładujący należy w sposób ciągły karbonować, wkładając rurkę karbonizacyjną przez samodzielnie wykonany otwór (z gorącą igłą 18G) w pokrywie płytki 12-dołkowej.
    UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku preparatów z wycinkami mózgu pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, które endogennie eksprymują fluorescencyjny reporter, taki jak GCaMP.
  2. Przygotuj konfigurację nagrywania zgodnie z opisem w krokach 6.2–6.5.
    UWAGA: Do eksperymentów z obrazowaniem mikrofluorymetrycznym nie jest potrzebny wzmacniacz ani mikromanipulator. Użycie stymulatora jest zależne od eksperymentu. Niezbędne jest specjalne oprogramowanie do eksperymentów z obrazowaniem fluorescencyjnym.
  3. Dostosuj oprogramowanie do prawidłowych ustawień obrazowania: obejmuje to ustawienie wzmacniacza kamery i binningu, ustawienie długości fali, czasu ekspozycji i protokołu czasowego. Ustawienia mogą się różnić w zależności od konkretnych eksperymentów. (Dla przykładowych ścieżek użyto 1 x 1 binning, 2,4x wzmocnienia przedwzmacniacza, wzmocnienia kamery 300 EM, ekspozycji 50 ms przy 488 nm powtarzanej co 500 ms przez czas trwania eksperymentu.)
  4. Po załadowaniu barwnikiem wapniowym przenieś półkulę wycinka mózgu z 12-dołka do komory zapisu i umieść ją na stoliku mikroskopu.
  5. Ustabilizuj wycinek w komorze zapisu za pomocą spinacza do papieru (Rysunek 3A) lub dostępnej na rynku siatki do wycinania mózgu, podobnej do tej opisanej w kroku 6.7.
  6. Upewnij się, że obszar zainteresowania znajduje się w odpowiednim polu mikroskopowym i jest ostry.
  7. Użyj oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego, aby wybrać kilka obszarów zainteresowania (ROI) na swoim plasterku.
    UWAGA: Przydatne może być wybranie całego pola widzenia, aby śledzić ogólne wahania jasności spowodowane fotowybielaniem.
  8. Rozpocznij nagrywanie i zastosuj eksperymentalne leki testowe w wybranych punktach czasowych.
    UWAGA: Zaleca się zastosowanie roztworu o wysokiej zawartości K+ na końcu każdego eksperymentu, aby zweryfikować neuronalny charakter komórek i jakość plasterka.
  9. Wyodrębnij dane w odpowiednim formacie pliku i przeanalizuj zmiany sygnału fluorescencji, które zachodzą w ROI w całym pomiarze. Zwroty z inwestycji mogą być również dostosowywane podczas analizy off-line.
    UWAGA: Inne protokoły opisujące zapisy fEPSP i mikrofluorymetrię wapnia w wycinkach mózgu są dostępne w literaturze24,32,33,34,35.

Wyniki

Ogólny przegląd narzędzi i krytycznych etapów niezbędnych do wykonania protokołu
Rysunek 2 przedstawia wszystkie niezbędne narzędzia i krytyczne etapy przygotowania poziomych ostrych skrawków hipokampa mózgu, opisane w niniejszym protokole. Generalnie wymagana jest ograniczona liczba kluczowych instrumentów, w tym kilka narzędzi do sekcji i komora do regeneracji skrawków (Rysunek 2A), laboratoryjna łaźnia wodna oraz wibratom (Rysunek 2B). Rysunek 2C–E obrazuje ważne etapy i orientację mózgu oraz półkul podczas protokołu przygotowania skrawków. Rysunek 2F stanowi ilustrację oczekiwanego wyniku przygotowania poziomych skrawków mózgu.

Rejestracja fEPSP w przyśrodkowej drodze perforantnej
Po okresie rekonwalescencji skrawki mózgu można wykorzystać do elektrofizjologicznej rejestracji fEPSP. W tym przypadku zastosowano mikroskop pionowy wyposażony w wielokanałowy system perfuzji sterowany grawitacyjnie (Rycina 3A i Rycina 3B). Szklaną mikropipetę (~ 2 MΩ) napełniono roztworem ACSF i przymocowano do pokrytej chlorkiem elektrody srebrowej, która jest podłączona do wzmacniacza operacyjnego w obwodzie z chlorowaną elektrodą kąpielową. Rejestrację i wizualizację fEPSP przeprowadzono za pomocą wzmacniacza oraz odpowiedniego oprogramowania rejestrującego, wprowadzając szklaną mikropipetę do MPP hipokampa w górnej warstwie skrawka mózgu. fEPSP indukowano poprzez stymulację za pomocą mikroelektrody z klastrem dwóch kontaktów, przy stosowaniu różnych natężeń prądu w MPP powyżej elektrody rejestrującej. Należy zauważyć, że niniejszy protokół nie ma na celu wyjaśnienia sposobu uzyskiwania zapisów z MPP, lecz jedynie wykorzystuje rejestrację w MPP jako przykład w celu zademonstrowania skuteczności opisanego tutaj protokołu przygotowania skrawków. W przypadku podejmowania prób rejestracji w MPP konieczne może być zastosowanie określonych kontroli (np. rejestracji podwójnych impulsów), aby upewnić się co do prawidłowego miejsca rejestracji i odróżnić MPP od LPP8,36,37.

Rysunek 3C przedstawia negatywny (lewy panel, plaster niskiej jakości) i pozytywny (prawy panel, plaster wysokiej jakości) przykład zapisu fEPSP. Ślad w przykładzie negatywnym wykazuje dużą amplitudę wolty włókien (FV), która jest nawet wyższa niż rzeczywista amplituda fEPSP (≈0.5 mV). W przeciwieństwie do niego, przykład plastra wysokiej jakości (prawy panel) wykazuje niski stosunek FV do fEPSP oraz wysoką amplitudę fEPSP (>0.5 mV). Wolta włókien to sygnał powstający podczas depolaryzacji stymulowanych włókien neuronalnych, który zatem poprzedza potencjał postsynaptyczny (fEPSP). Relacja między właściwościami FV a fEPSP dostarcza istotnych informacji o zachowaniu właściwości aksonalnych i synaptycznych. Plastry wysokiej jakości z nienaruszonymi włóknami nerwowymi powinny wykazywać wysoki stosunek amplitudy fEPSP do FV. Z kolei plastry niskiej jakości z upośledzonymi właściwościami przewodzenia będą miały zmniejszony stosunek fEPSP do FV. Podobnie żywotność plastra mózgu można analizować, wykreślając nachylenia fEPSP w funkcji amplitud wolty włókien (Rysunek 3D).

Ponadto, w celu oceny jakości skrawka standardowo wykorzystuje się krzywe wejście-wyjście (nachylenie fEPSP oraz amplituda FV w zależności od natężenia bodźca). Krzywe te uzyskuje się poprzez przyłożenie do skrawka mózgu bodźców prądowych o rosnącym natężeniu i monitorowanie następujących po nich odpowiedzi fEPSP. Skrawki mózgu niskiej jakości wykazują obniżoną krzywą wejście-wyjście ze względu na suboptymalne właściwości przewodzenia słabo zachowanej tkanki mózgowej (Rysunek 3E,F). Co więcej, krzywe wejście-wyjście są niezbędne do określenia optymalnego zakresu natężenia stymulacji dla badania procesów synaptycznych. Idealnie natężenie bodźca powinno zostać ustawione na poziomie około 50% natężenia wywołującego odpowiedzi maksymalne. Przy wybranym w ten sposób natężeniu bodźca odpowiedzi fEPSP są wysoce czułe na wszelkie zmiany w plastyczności synaptycznej, co stwarza możliwość badania zarówno długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP), jak i długotrwałej depresji synaptycznej (LTD).

W celu zbadania plastyczności synaptycznej, transmisję synaptyczną w skrawku mózgu (nachylenie fEPSP) przy wybranej 50% intensywności bodźca monitoruje się przez dłuższy czas (zazwyczaj od 20 do 40 min) przed fazą kondycjonowania. Żywotne skrawki mózgu będą wykazywać stabilną linię bazową, natomiast skrawki z niestabilną linią bazową nie mogą być wykorzystane w dalszych protokołach kondycjonowania służących do badania plastyczności synaptycznej obwodów mózgowych (Rysunek 3G, panel górny). Rejestracje linii bazowej fEPSP mogą być również przydatne do monitorowania wpływu leków na samą transmisję synaptyczną (Rysunek 3G, panel dolny). Średnia z zarejestrowanych sygnałów linii bazowej fEPSP jest zazwyczaj wykorzystywana do normalizacji przebiegu fEPSP w czasie i standardowo przyjmuje wartość 100%.

Plastyczność synaptyczną można badać poprzez stosowanie specyficznych protokołów warunkowania w skrawkach mózgu. Protokoły te zależą od badanego obwodu mózgowego oraz interesującego nas mechanizmu (np. LTP lub LTD). W celu indukcji LTP w MPP zakrętu zębatego konieczne jest zastosowanie silnego protokołu warunkowania ze względu na silne hamowanie GABAergiczne występujące w synapsach MPP38. Donosi się, że hamowanie GABAergiczne jest jeszcze bardziej wyraźne w skrawkach mózgu przygotowanych z użyciem roztworów do krojenia o wysokiej zawartości sacharozy39. W niniejszym przypadku stosujemy protokół składający się z czterech stymulacji impulsami o częstotliwości 100 Hz i czasie trwania 1 s, podawanych w 5-minutowych odstępach, przy jednoczesnym zastosowaniu bikukuliny, która jest antagonistą receptora GABAA (Rycyna 3H). Wspólne dodanie NMDA i bikukuliny podczas okresu warunkowania prowadzi do zwiększenia LTP (Rycyna 3H). Niska jakość skrawka oraz niestabilna transmisja synaptyczna (linia bazowa fEPSP) mogą skutkować zmienioną lub nieudaną indukcją LTP i LTD. Dlatego podczas badania procesów synaptycznych bardzo ważne jest praca na wysokiej jakości preparatach skrawków oraz stosowanie rygorystycznych kryteriów wykluczenia dla skrawków niewydolnych (niski stosunek amplitudy fEPSP do wolty włókien (<3), małe nachylenie fEPSP (<0,5 mV/ms) lub amplituda (<0,5 mV) oraz niestabilna linia bazowa fEPSP (zmiana powyżej 5%)).

Pomiary mikrofluorymetryczne wapnia w warstwie ziarnistej zakrętu zębatego
Po regeneracji skrawek mózgu inkubowano w temperaturze pokojowej z 2 µM barwnika wrażliwego na wapń przez 1 h w nasyconym karbogenem ASCF, chroniąc go przed światłem. Skrawek przeniesiono do komory rejestracyjnej (Rysunek 3A) w pionowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w wielokanałowy system perfuzji sterowany grawitacyjnie. Obrazy emisji fluorescencji rejestrowano co 500 milisekund po naświetleniu falą o długości 488 nm (Rysunek 4A,B). Wzbudzanie przeprowadzano za pomocą lampy ksenonowej i zamontowanego na skanerze monochromatora z siatką dyfrakcyjną, a akwizycję obrazu realizowano przy użyciu sterowanej komputerowo kamery CCD. Podczas pomiarów skrawek traktowano APV, antagonistą receptora NMDA, co doprowadziło do spadku wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Stymulacja skrawka za pomocą roztworu pozakomórkowego o wysokim stężeniu potasu (50 mM) spowodowała masywny napływ wapnia z przestrzeni pozakomórkowej w wyniku depolaryzacji neuronów i otwarcia napięciowo zależnych kanałów jonowych (Rysunek 4C).

ZwiązekStężenie (mM)Masa cząsteczkowa (g/mol)Ilość (g)
KCl2574.551.86
CaCl₂2 * 2H2O20147.012.94
MgSO₄4 * 7H2O10246.482.46
KH2PO412.5136.081.7

Tabela 1: 10-krotny roztwór wstępny do plastrów (1 L).

ZwiązekStężenie (mM)Masa cząsteczkowa (g/mol)Ilość (g)
NaCl12558.447.3
KCl2.574.550.19
CaCl22 * 2H2O2z 1 M CaCl22 roztwór2 ml
MgSO₄4 * 7H2O1z 1 M MgSO44 roztwór1 ml
NaH2PO4 * 2H2O1.25156.020.2
NaHCO₃32684.012.18
Glukoza * H2O25198.174.95

Tabela 2: 1x ACSF (1 L) (osmolarność między 305–315 mOsm).

ZwiązekStężenie (mM)Masa cząsteczkowa (g/mol)Ilość (g)
10x roztwór do konserwacji skrawkówN/DN/D25 mL
Sacharoza252342.321.57
NaHCO32684.010.55
Glukoza * H2O10198.170.49

Tabela 3: 1x roztwór do skrawków z wysoką zawartością sacharozy (250 mL) (osmolarność między 320–325 mOsm).

Przebieg procesu sekcjonowania histologicznego; obejmuje narzędzia, konfigurację mikrotomu oraz schemat orientacji cięcia mózgu.
Rysunek 2: Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania poziomych skrawków mózgu z obszaru hipokampa. (A) Zdjęcie narzędzi niezbędnych do preparatyki i sekcjonowania mózgu gryzonia: (a) paski papieru filtracyjnego (np. stopień 413) o długości ±2 cm i szerokości ±0,5 cm; (b) ostrze; (c) superglue; (d) końcówka do pipety; (e) płytka do preparatu (dołączona do wibratomu); (f) 35 mm szalka hodowlana; (g) pędzelek; (h) szpatułka; (i) pęseta zakrzywiona; (j) nożyczki anatomiczne; (k) nożyczki wzmocnione (długość ostrza powyżej 10 cm); (l) plastikowa pipeta Pasteura z szerokim otworem (o średnicy od 0,6 do 0,8 cm); (m) komora regeneracyjna (wykonana własnym sposobem z zlewki 250 mL, plastikowego pierścienia, nylonowej siatki i fragmentu pipety serologicznej 10 mL); (n) 90 mm szalka hodowlana wypełniona lodem oraz (o) kwadrat papieru filtracyjnego umieszczony na schłodzonej szalce hodowlanej. (B) Zdjęcie wibratomu z (a) uchwytem komory do skrawków wypełnionym lodem; (b) komorą do skrawków; (c) linią z karbogenem oraz (d) ostrzem do sekcjonowania. (C) Schemat ilustrujący orientację cięcia strony grzbietowej jednej półkuli w celu przygotowania mózgu do sekcjonowania poziomego (patrz krok 3.9). (D) Projekcja izometryczna orientacji mózgu na płytce do preparatu wibratomu. (E) Schemat przedstawiający widok z góry na położenie dwóch półkul na płytce do preparatu. (F) Schemat pokazujący położenie hipokampa w poziomym skrawku mózgu. Oznaczone są zakręt zębaty (DG) oraz obszary Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) hipokampa. (G) Zdjęcie komory regeneracyjnej z nasyconym karbogenem ACSF zawierającej dziesięć świeżo wyciętych poziomych skrawków mózgu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ elektrofizjologiczny z elektrodami do skrawka mózgu; wykresy przedstawiające wyniki fEPSP w stosunku do wolty włókien.
Rysunek 3: Rejestracje elektrofizjologiczne skrawków hipokampa mózgu. (A) Zdjęcie komory rejestracyjnej z systemem perfuzji i ssania, stosowanej pod mikroskopem pionowym. Przed rozpoczęciem rejestracji skrawka mózgu umieszcza się w komorze i unieruchamia fragmentem spinacza biurowego. (B) Zdjęcie w polu jasnym skrawka hipokampa mózgu pod mikroskopem pionowym (obiektyw 10x). Wskazano zakręt zębaty (DG) i obszar CA3, a także elektrody stymulujące (lewy dolny róg) i rejestrujące (prawy dolny róg), nakierowane na przyśrodkową drogę perforującą podczas rejestracji fEPSP. (C) Lewo: przykład rejestracji fEPSP z niskiej jakości skrawka z wyraźną woltą włókien i małą amplitudą. Prawo: przykład rejestracji fEPSP z wysokiej jakości skrawka. Szara linia wskazuje poziom bazowy. Linie przerywane wyznaczają amplitudę odcięcia 0,5 mV. (D) Wykres nachylenia fEPSP w funkcji amplitudy FV dla skrawków mózgu wysokiej jakości (czarny; n=10) i niskiej jakości (szary; n=4). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. (E) Wykres wejście-wyjście (nachylenie fEPSP) dla różnych intensywności stymulacji (µA) dla skrawków wysokiej jakości (czarny; n = 10) i niskiej jakości (szary; n = 4)). (F) Analogicznie jak w (E), ale dla amplitud FV w funkcji intensywności bodźca. (G) Przebieg czasowy trzech różnych rejestracji bazowych fEPSP (nachylenie fEPSP w %; znormalizowane do średniego nachylenia fEPSP z pierwszych 5 min). Górny panel przedstawia przykład dodatni (czarny) i ujemny (czerwony), gdzie ten drugi wykazuje niestabilną linię bazową z powodu pominięcia karbogenu podczas rejestracji. Dolny panel pokazuje dwa stabilne rejestry bazowe w warunkach traktowanych (po 20 min stabilnej linii bazowej receptory AMPA zostały zablokowane poprzez zastosowanie antagonisty receptora AMPA DNQX (10 µM)) (niebieski) oraz nietraktowanych (czarny). (H) Przebieg czasowy rejestracji LTP dla różnych warunków traktowania (wskazanych w dolnym panelu). Kolor czarny oznacza zastosowanie Bicuculline (20 µM) podczas kondycjonowania, a niebieski współzastosowanie Bicuculline (20 µM) i NMDA (10 µM) podczas kondycjonowania. Strzałki w górnym panelu wskazują punkty czasowe, w których zastosowano stymulację o wysokiej częstotliwości (4 x 1s 100Hz). Wykres słupkowy w dolnym panelu przedstawia średnie nachylenia fEPSP (%) przez 50–60 min po indukcji LTP dla eksperymentów pokazanych w górnym panelu (pojedyncza reprezentatywna rejestracja dla każdego warunku). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie i analiza fluorescencji hipokampa; schemat, obraz mikroskopowy, wykres fluorescencji.
Rycina 4: Mikrofluorymetria wapnia w skrawkach mózgu z hipokampa. (A i B) Obraz fluorescencyjny (wzbudzenie przy 488 nm) (A) oraz odpowiadająca mu mapa ciepła (B) poziomego skrawka hipokampa mózgu myszy. Na panelu A zaznaczono zakręt zębaty (DG), obszar CA3 oraz przykład obszaru zainteresowania (ROI). (C) Przebieg czasowy odpowiedzi wapniowych (F488 nm) z ROI w zakręcie zębatym świeżego skrawka hipokampa podczas traktowania antagonistą receptorów NMDA APV (50 µM) oraz roztworem zawierającym wysokie stężenie pozakomórkowego potasu (K+) (50 mM). Krzywa została znormalizowana do najwyższej odpowiedzi wapniowej podczas perfuzji wysokim stężeniem K+ i skorygowana o tło w celu uwzględnienia fotowybielania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Chociaż powszechnie stosowane w społeczności neuronaukowej, preparaty do wycinania mózgu mają również kilka wad. Na przykład połączenia wejściowe i wyjściowe z obszarami zainteresowania mózgu nie są już połączone w wycinku mózgu. Co więcej, po wyizolowaniu tkanka zaczyna z czasem powoli ulegać degradacji, a proces ten może zmienić warunki fizjologiczne wycinka mózgu. Ten temat jest szczególnie niepokojący, ponieważ większość zapisów wycinków mózgu trwa od kilku minut do godzin, co skutkuje długimi dniami eksperymentalnymi z nagraniami wykonywanymi na tkance, która została wyizolowana do 6-8 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Co więcej, płyn mózgowo-rdzeniowy i krążenie krwi zostają przerwane podczas przygotowywania plastrów, co może prowadzić do braku ważnych związków endogennych w wycinku mózgu. A co najbardziej oczywiste, sama procedura krojenia może spowodować mechaniczne uszkodzenie tkanek, które może zagrozić uzyskanym wynikom. Jednak rzeczywiste korzyści płynące z preparatów typu brain slice nadal przeważają nad ich wadami, dlatego stanowią one wysoko cenioną i stosowaną technikę w badaniach neurobiologicznych.

Ostre wycinki mózgu w hipokampie stanowią potężną, a zatem szeroko stosowaną technikę badania procesów neuronalnych od poziomu molekularnego do złożonych badań obwodów mózgu. Opiera się to na idealnej neuroanatomii hipokampa, którą można łatwo zachować w preparacie plastrów18. W związku z tym wycinki mózgu hipokampa są wykorzystywane w wielu różnych projektach naukowo-badawczych, w tym w badaniach przesiewowych leków17, badaniach właściwości neuronalnych i synaptycznych związanych z funkcjami poznawczymi40,41 oraz badaniach patologicznych stanów mózgu 14,42,43. Jednak szerokie spektrum różnych zastosowań powoduje również szeroką gamę dostępnych protokołów przygotowania plastrów, które mogą różnić się różnymi parametrami, takimi jak m.in. warunki rozwarstwienia i orientacja płaszczyzny cięcia. W związku z tym należy określić dokładne pytanie badawcze projektu naukowego, aby wybrać odpowiedni protokół przygotowania plastrów.

Rozdrabniacz tkanek jest jedną z najstarszych technik stosowanych w celu przygotowania wycinków mózgu z hipokampa44,45. Do głównych zalet tej metody przygotowania należy niski koszt rozdrabniacza oraz szybkie i łatwe użycie46. Jednak rozdrabniacze tkanek powodują naprężenia mechaniczne, które powodują zmiany morfologiczne i śmierć komórki47. Dla porównania, wibratom jest dość drogim urządzeniem, a czas przygotowania plastra znacznie się wydłuża, co może mieć wpływ na jakość plastra. Jednak wibratom zwykle oferuje łagodniejszy sposób oddzielania plastrów od tkanki i pozwala utrzymać mózg w przyjemnym chłodzie i dotlenieniu przez całą procedurę izolacji, poprawiając w ten sposób właściwości plasterków46. Dlatego kilka grup standardowo stosuje tę technikę i opracowało protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu hipokampa za pomocą wibratomu 16,30,48. Podczas gdy niektóre protokoły zawierają tylko kilka szczegółów dotyczących samego krojenia, ale raczej koncentrują się na konkretnym zastosowaniu takiego przygotowania plastrów48, inne zawierają szczegółowe protokoły krojenia, które różnią się płaszczyzną cięcia lub innymi szczegółami protokołu (np. osadzanie agarozy lub roztwory do odzysku plastrów) podane w tym artykule27,30.

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą metodę przygotowania wysokiej jakości ostrych poziomych wycinków mózgu myszy z hipokampa z młodych zwierząt. Protokół jest szczególnie przydatny do zachowania ścieżki perforacyjnej (przyśrodkowej i bocznej), która przedstawia szlak wejściowy hipokampa, który wystaje z kory śródwęchowej do hipokampa 8,49,50. Strzałkowe, czołowe, a także izolowane preparaty przekroju poprzecznego hipokampa nie zachowują prawidłowo ścieżki perforacji, która pochodzi głównie z warstw II i V kory śródwęchowej i rzutuje na kilka obszarów w obrębie hipokampa18. Ze względu na anatomiczne umiejscowienie kory śródwęchowej w stosunku do hipokampa, poziome wycinki mózgu są niezbędne w celu utrzymania w pełni nienaruszonych włókien ścieżki perforacji w preparacji plastra31. Dodatkowo, poziome krojenie idealnie zachowuje omszałe włókna, które wystają z zakrętu zębatego do neuronów CA3 w hipokampie 9,30,50. Dlatego ta metoda przygotowania ma dużą wartość dla badań, które badają szlaki wejściowe hipokampa i procesy związane z DG. Ponadto protokół ten pozwala na zbadanie ścieżki pobocznej Schaffera50. Jednak preparaty krzyżowe i koronalne z wycinków mózgu są częściej stosowane podczas badania projekcji włókien CA3 do CA1, prawdopodobnie ze względu na ich nieco szybszy czas przygotowania, który może zwiększyć szansę na uzyskanie wysokiej jakości plastrów. Niemniej jednak, poziome preparaty warstw hipokampa stanowią potężne narzędzie badawcze, ponieważ pozwalają na zachowanie i zbadanie wszystkich szlaków włókien hipokampa w obrębie jednej półkuli warstwowej. Może to być szczególnie przydatne, gdy badane są odpowiedzi obwodów, na przykład w zapisach testów wieloelektrodowych.

Głównym problemem podczas przygotowywania plasterków mózgu jest prawidłowa konserwacja tkanki mózgowej. Osiąga się to poprzez kilka krytycznych etapów naszego protokołu, w tym szybką preparację, ciągłe i wystarczające natlenienie i chłodzenie tkanki oraz ochronę tkanki mózgowej za pomocą ochronnej metody cięcia roztworem do krojenia o niskiej zawartości sodu i wysokiej zawartości sacharozy39,51. Pomimo faktu, że opisany tutaj protokół daje wskaźnik sukcesu około 90%, potencjalnie dodatkowe kroki ochronne mogą być wymagane podczas pracy z tkankami pochodzącymi ze starszych lub genetycznie zróżnicowanych zwierząt lub podczas próby zachowania określonej populacji komórek. Opisano już kilka metod ochrony wrażliwych preparatów tkanki mózgowej. Metody te obejmują stosowanie roztworów do krojenia na bazie NMDG w celu zmniejszenia przenikania sodu52, stosowanie wysokich poziomów magnezu w roztworze do krojenia w celu zablokowania aktywności receptora NMDA53 oraz przedłużone stosowanie roztworów ochronnych również w okresie rekonwalescencji23. Wszystkie te środki spowodują zmniejszenie ekscytotoksyczności. Ponadto perfuzja przezsercowa z lodowatymi roztworami ochronnymi ACSF jest często stosowana i konieczna podczas pracy ze starszymi zwierzętami27.

Ostre wycinki mózgu w hipokampie są idealnie dopasowane i szeroko stosowane do badań elektrofizjologicznych z powodów takich jak sygnały o dużej amplitudzie, które można uzyskać ze stosunkowo grubego (300–500 μm) ostrego wycinka mózgu, co gwarantuje wysoki stosunek sygnału do szumu11. Standardowo stosowane zastosowania elektrofizjologiczne obejmują zewnątrzkomórkowe zapisy pola i wewnątrzkomórkowe zapisy całych komórek w trybie cęgów napięciowych lub prądowych. W celu uzyskania wysokiej jakości danych elektrofizjologicznych, zdrowie plastra jest sprawą pierwszorzędną i może być zagwarantowane poprzez ścisłe przestrzeganie przedstawionego protokołu. Ponieważ jednak przygotowanie plastrów jest bardzo czułą techniką, przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy rutynowo przeprowadzać kontrolę jakości. Kilka parametrów może być wykorzystywanych do kontroli jakości wycinka i są standardowo oceniane za pomocą krzywych wejścia-wyjścia oraz bazowych nagrań fEPSP lub EPSC19. Niemniej jednak należy zauważyć, że nieoptymalne właściwości elektrofizjologiczne mogą wynikać z błędów eksperymentalnych, takich jak ustawienie elektrody, orientacja, a nawet uszkodzenie, i nie reprezentują wyłącznie zdrowia przygotowanego plastra. Dlatego zaleca się przeprowadzenie dodatkowych kontroli jakości, takich jak prosta wizualizacja i ocena komórek pod obiektywem 40x lub barwienie jądra DAPI. Takie kontrole jakości mogą być wykorzystane do potwierdzenia stałego stanu plastrów przez kilka sesji przygotowania plastrów.

Mikrofluorymetria wapnia jest rzadziej stosowaną techniką badania wycinków mózgu w hipokampie. Jednak technika ta ma dodatkową wartość w stosunku do standardowych zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych zapisów elektrod, ponieważ pozwala na wizualizację i ilościowe określenie wewnątrzkomórkowych strumieni wapnia, które mają duże znaczenie w sygnalizacji neuronalnej i synaptycznej. Zmiany wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia biorą udział w uwalnianiu pęcherzyków neuroprzekaźników, generowaniu potencjału postsynaptycznego, regulacji plastyczności synaptycznej i przewodnictwie nerwów aksonalnych 54,55,56. Jako ilustrację tej techniki (ryc. 4) użyliśmy dostępnego na rynku barwnika wapniowego. Nie ulega wątpliwości, że traktowanie wycinków tkanek barwnikami wapniowymi może powodować trudności, takie jak wydłużenie czasu eksperymentu, a także nieefektywne obciążenie niżej położonych komórek neuronalnych. Jednak różne warianty tej techniki mogą być wykorzystane do obejścia tych wyzwań technicznych. Na przykład możliwe jest połączenie pomiarów wapnia i zapisów klamer w wycinkach hipokampa. W ten sposób barwnik fluorescencyjny wapnia może zostać załadowany do określonej komórki za pomocą pipety krostowej, co pozwala na pomiary dynamiki wapnia w jednej konkretnej komórce będącej przedmiotem zainteresowania57. Alternatywnie, można zastosować genetycznie zmodyfikowane zwierzęta wykazujące ekspresję wskaźnika wapnia, GCaMP58, w całym mózgu lub napędzane przez specyficzny dla komórki promotor. Co ciekawe, tkanka mózgowa zwierząt z GCaMP z bezpośrednim łącznikiem z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania może dostarczyć możliwości określenia wzorca ekspresji neuronalnej lub zbadania udziału w iskrach i falach wapniowych.

Podsumowując, dostarczamy wytyczne dotyczące skutecznego przygotowania zdrowych i żywotnych poziomych wycinków mózgu hipokampa od myszy do zapisów elektrofizjologicznych i obrazowych. Ta metodologia jest bardzo przydatna w dostępie do zmian neurologicznych, które zachodzą w patologiach mózgu opisanych w zakręcie zębatym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy jednostce Elektrofizjologii Centrum Badań nad Mózgiem i Chorobami VIB-KU Leuven pod nadzorem dr Keimpe Wierda i prof. dr Jorisa De Wita za korzystanie z ich obiektów badawczych. Ponadto dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Badań Kanałów Jonowych oraz Laboratorium Endometrium, Endometriozy i Medycyny Rozrodu KU Leuven za ich pomocne dyskusje i komentarze.

Ten projekt otrzymał finansowanie od Fundacji Badawczej Flandrii (G.084515N i G.0B1819N dla J.V.) oraz Rady Naukowej KU Leuven (C1-funding C14/18/106 dla J.V.). K.P. jest stypendystką FWO [PEGASUS]2 stypendystką Marie Skłodowskiej-Curie i otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej "Maria Skłodowska-Curie" (665501) z Fundacją Badawczą Flandria (FWO) (12T0317N). K.H. jest adiunktem Fundacji Badawczej Flandria, Belgia (12U7918N).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora anestezjologicznadomowej roboty - Generyczny
parownik anestezjologicznyN/A Drä ger & MSS International LtdIsofluran Vapor 19.3 & MSS Isoflurando odparowania izofluranu do znieczulenia gryzoni
Beczki do systemu perfuzyjnegoTERUMOStrzykawki podskórne bez igłyhttps://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodidehellobioHB0893https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoScience ProductsGB150F-8Phttps://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Dwuwodny chlorek wapniaMerck102382https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Oprogramowanie do obrazowania wapniaTill PhotonicsLiveAcquisition v2.3.0.18
Zbiornik karbonowyAir LiquideAlphagaz mix B50Mieszanina gazów CO2/O2: 5/95, czystość 5
Mikroelektroda klastrowaFHCCE2C55https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Naczynie hodowlane (35 mm)Corning Life Sciences353001https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Naczynie do hodowli (90 mm)Thermo Fisher Scientific101VR20https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Kleszcze zakrzywioneNarzędzia do naukiprecyzyjnej 11270-20https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5hellobioHB0225https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glukoza jednowodnaSigma Aldrich16301https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE
Cyfrowa kamera CMOSHAMAMATSUORCA-SPARK C11440-36Uhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Nożyczki preparacyjneNarzędzia do nauki precyzyjnej14058-09https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQXhellobioHB0262https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
Kamera EMCCDAndoriXon TM + DU-897E-CSO-#BVhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 Wzmacniacz USB z podwójnym zaciskiem krosowymHEKA Elektronik895278https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Bibuła filtracyjnaVWR516-0818klasa 413
Drobna szczotkaRaphael Kaerell8204Rozmiar #1
18G igłaHenke Sass Wolf Fine-Ject18G X 1 1/2" 4710012040https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
IsofluraneDechra Veterinary ProductsIso-Vet 1000mg/g250 ml butelka
Loctite 406Henkel Technologie klejeniaLoctite 406Super klej
Siarczan magnezu siedmiowodnyMerck105886https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MikromanipulatorLuigs & NeumannSM-10 z systemem zdalnego sterowania SM-7https://www.luigs-neumann.org
Mikroskop (do obrazowania wapnia)OlympusBX51WIhttps://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Mikroskop (do nagrań ephys)ZeissAxio Examiner.A1https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Źródło światłamikroskopu CAIRN Researchpodwójny zasilacz OptoLedhttps://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
MonochromatorTill PhotonicsPolychrome V
Kwas N-metylo-D-asparaginowy (NMDA)Sigma AldrichM3262https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1Sondy molekularne Invitrogen#0680710x50ug
Osmometrciśnienia pary Wescor5500do sprawdzania osmolarności roztworów soli
Pompa perystaltycznaThermo Fisher ScientificMasterflex C/L 77120-62https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH-metrWTWserii inoLab pH 720https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Ściągacz do pipetSutter InstrumentP-1000https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Chlorek potasuChem-labCL00.1133https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Diwodorofosforan potasuMerck104873https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Żyletka do przygotowania półkulSPI dostarczadozownik bezpiecznych wkładów - Pkg/10GEM Scientific Single Edge Żyletki
Żyletka do wibratomuTed Pella Inc121-6dwukrawędziowe łamliwe żyletki (stal nierdzewna pokryta PTFE)
Komora regeneracyjnadomowej roboty - GenericN/Ado zbierania i przechowywania plasterków mózgu (patrz szczegóły w rękopisie)
NożyczkiKażda firmaNie dotyczyOstrze powinno być dobrze naostrzone i mieć co najmniej 15 cm długości, aby ułatwić dekapitację
Srebrny drut elektrodowyDowolna firmazajmująca się elektrodami rejestrującymi i referencyjnymi
Diwodorofosforan sodu dwuwodnyMerck106342https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Wodorowęglan soduAlfa Aesar14707https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Chlorek soduFisher ScientificS/3160/60https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Oprogramowanie do nagrań terenowychHEKA ElektronikPatchMasterhttps://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
SpatulaSigma AldrichS9147-12EAhttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE
StymulatorA.M.P.IISO-FLEX
SacharozaVWR International Ltd.102745Chttps://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Rurki do przewodów karbogenicznych, perfuzyjnych i ssących 1Warner Instruments64-0167Rurka Tygon (TY-50) do standardowych systemów zaworów
Rurki do przewodów karbogenicznych, perfuzyjnych i ssących 2Fisher Scientific800/100/200 i 800/100/280Smiths Medical Portex Rurka LDPE z drobnym otworem
Pompapróżniowadomowej roboty - Ogólnyz 8 zaworami N/A
domowej robotyN / Askłada się z beczek, rurek i samodzielnie wykonanego automatycznego sterowania zaworem (specyfikacje wszystkich zakupionych części można znaleźć w tej tabeli)
Zawory magnetyczne (do sterowania liniami perfuzyjnymi)NResearch Inc.Nr kat. 161P011https://nresearch.com/
VibratomeLeica14912000001Półautomatyczne ostrze wibracyjne microomei VT1200
Łaźnia wodnaMemmertWNB 7https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
System oczyszczania wodyMerckSynergy milipordo uzyskania wysoce oczyszczonej wody
12-dołkowej talerze Greiner Bio-OneCELLSTAR, 665180http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf
z pleksi Osmometr http://www.ampi.co.il/isoflex.html wielolufowy system perfuzyjny

Bibliografia

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023(2018).
  3. Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
  4. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4 40-52 (2017).
  5. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. , 86-98 (2015).
  6. Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
  7. Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
  8. Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. Neuroscience. 252, 154-168 (2013).
  9. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  10. Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
  11. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330(2011).
  13. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699(2018).
  14. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  15. Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
  16. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, Clifton, N.J. 115-134 (2011).
  17. Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203(2018).
  18. Bliss, T. The hippocampus book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O'Keefe, J. , Oxford University Press. Ch. 3 37-114 (2007).
  19. Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
  20. Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209(2018).
  21. McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153(2017).
  22. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  23. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  24. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936(2018).
  25. Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
  26. Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
  27. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  28. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  29. Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 2 Suppl 759-762 (2007).
  30. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , Academic Press. 256(2008).
  32. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071(2012).
  33. Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213(2012).
  34. Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879(2019).
  35. Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411(2012).
  36. McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
  37. Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
  38. Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
  39. Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
  40. Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
  41. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  42. Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
  43. Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
  44. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  45. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
  46. Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, Clifton, N.J. 1-14 (1997).
  47. Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
  48. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706(2014).
  49. Aydin-Abidin, S., Abidin, İ 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
  50. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107(2017).
  51. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  52. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  53. Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
  54. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  55. Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
  56. Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
  57. Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223(2019).
  58. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krojenie m zgu w wibratomiesekcja m zgu myszyprzygotowanie roztworu ACSFroztw r do plastr w o wysokim st eniu sacharozyrejestracje elektrofizjologicznepolowy pobudzeniowy potencja postsynaptycznykrzywe wej cie wyj cieobrazowanie wska nikiem wapniaanaliza transmisji synaptycznej
Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.