Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie asymetrycznego frakcjonowania przepływu w połączeniu z detekcją UV-vis do określenia wielkości próbki nieznanej próbki nanocząstek złota.

Streszczenie

Wielkość cząstek jest prawdopodobnie najważniejszym parametrem fizykochemicznym związanym z pojęciem nanocząstki. Precyzyjna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości nanocząstek ma ogromne znaczenie dla różnych zastosowań. Ważny jest również zakres rozmiarów, ponieważ określa on najbardziej "aktywny" składnik dawki nanocząstek.

Frakcjonowanie przepływu asymetrycznego (AF4) to potężna technika wymiarowania cząstek w zawiesinie w zakresie wielkości około 1–1000 nm. Istnieje kilka sposobów uzyskiwania informacji o rozmiarze z eksperymentu AF4. Oprócz sprzężenia AF4 online z detektorami wrażliwymi na rozmiar w oparciu o zasady wielokątowego rozpraszania światła lub dynamicznego rozpraszania światła, istnieje również możliwość skorelowania wielkości próbki z czasem jej retencji przy użyciu ugruntowanego podejścia teoretycznego (teoria FFF) lub poprzez porównanie jej z czasami retencji dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości cząstek (kalibracja wielkości zewnętrznej).

Opisujemy tutaj rozwój i wewnętrzną walidację standardowej procedury operacyjnej (SOP) do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis przy użyciu zewnętrznej kalibracji rozmiaru za pomocą wzorców nanocząstek złota w zakresie wielkości 20-100 nm. Procedura ta zawiera szczegółowy opis opracowanego przepływu pracy, w tym przygotowania próbki, konfiguracji i kwalifikacji przyrządu AF4, opracowania metody AF4 i frakcjonowania nieznanej próbki nanocząstek złota, a także korelacji uzyskanych wyników z ustaloną kalibracją wielkości zewnętrznej. Opisana tutaj procedura SOP została ostatecznie pomyślnie zwalidowana w ramach międzylaboratoryjnego badania porównawczego, podkreślając doskonałą wytrzymałość i niezawodność AF4 do wymiarowania próbek nanocząstek w zawiesinie.

Wprowadzenie

Nanocząstki złota (AuNP) w postaci złota koloidalnego były częścią ludzkiej kultury na długo zanim zaczęto rozumieć, czym są nanocząstki i zanim termin nanocząstka znalazł drogę do współczesnego, naukowego słownictwa. Bez wyraźnej wiedzy na temat ich wyglądu w nanoskali, zawieszony AuNP był już używany do celów medycznych i innych w starożytnych Chinach, Arabii i Indiach w V–VI wieku p.n.e.¹, a także starożytni Rzymianie wykorzystali ich rubinowy kolor, aby słynnie zabarwić swoją ceramikę na wystawie Pucharu Likurga w British Museum². W świecie zachodnim, przez wieki od średniowiecza do ery nowożytnej, zawieszone AuNP były głównie używane jako środki barwiące do szkła i emalii (Purple of Cassius)³, a także do leczenia różnych chorób (Pitable Gold), zwłaszcza syfilis⁴.

Jednak wszystkie te badania skupiały się głównie na zastosowaniu zawieszonych AuNP i to Michael Faraday w 1857 roku wprowadził pierwsze racjonalne podejście do badania ich powstawania, natury oraz właściwości⁵. Chociaż Faraday już wtedy zdawał sobie sprawę, że te AuNP muszą mieć bardzo małe wymiary, dopiero rozwój mikroskopii elektronowej sprawił, że jawne informacje o ich rozkładzie wielkości stały się dostępne^6,7, co ostatecznie umożliwiło korelację między rozmiarem a innymi właściwościami AuNP.

Obecnie, dzięki dość łatwej i prostej syntezie, niezwykłym właściwościom optycznym (powierzchniowy rezonans plazmonowy), dobrej stabilności chemicznej, a tym samym niewielkiej toksyczności, a także dużej wszechstronności pod względem dostępnych rozmiarów i modyfikacji powierzchni, AuNP znalazły szerokie zastosowanie w dziedzinach takich jak nanoelektronika⁸, diagnostics⁹, terapia raka¹⁰, czy dostarczanie leków¹¹. Oczywiście, dla tych zastosowań, dokładna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości zastosowanego AuNP jest podstawowym warunkiem zapewnienia optymalnej skuteczności¹² i istnieje duże zapotrzebowanie na solidne i niezawodne narzędzia do określenia tego kluczowego parametru fizykochemicznego. Obecnie istnieje mnóstwo technik analitycznych zdolnych do wymiarowania AuNP w zawiesinie, w tym na przykład spektroskopia UV-vis (UV-vis)¹³, dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)¹⁴ lub spektrometria masowa plazmy sprzężonej indukcyjnie z pojedynczymi cząstkami (spICP-MS)¹⁵, przy czym frakcjonowanie przepływu pola (FFF) jest kluczowym graczem w tej dziedzinie^{16,17,18,19,20}.

Po raz pierwszy opracowany w 1966 roku przez J. Calvina Giddingsa²¹, FFF obejmuje rodzinę technik frakcjonowania opartych na elucji, gdzie separacja odbywa się w cienkim, przypominającym wstęgę kanale bez fazy stacjonarnej^22,23. W FFF separacja jest indukowana przez oddziaływanie próbki z zewnętrznym polem siłowym, które działa prostopadle do kierunku przepływu w kanale laminarnym, w którym próbka jest transportowana w dół zwykle w kierunku odpowiednich detektorów in-line. Wśród tych pokrewnych technik FFF, Asymetryczne Frakcjonowanie Pola Przepływu (AF4), w którym drugi przepływ (przepływ krzyżowy) działa jako pole siłowe, stał się najczęściej używanym podtypem²⁴. W AF4 dno kanału (ściana akumulacyjna) jest wyposażone w półprzepuszczalną membranę ultrafiltracyjną, która jest w stanie zatrzymać próbkę, jednocześnie umożliwiając przepływ krzyżowy przez membranę i opuszczenie kanału przez dodatkowy wylot. W ten sposób przepływ krzyżowy może popchnąć próbkę w kierunku ściany akumulacji, przeciwdziałając w ten sposób jej strumieniowi indukowanemu dyfuzją (ruchy Browna). W wynikowej równowadze strumieni wywołanych polem i dyfuzją; Mniejsze składniki próbki wykazujące wyższe współczynniki dyfuzji ustawiają się bliżej środka kanału, podczas gdy większe składniki próbki wykazujące niższe współczynniki dyfuzji znajdują się bliżej ściany akumulacji. Ze względu na paraboliczny profil przepływu wewnątrz kanału, mniejsze składniki próbki są zatem transportowane w szybszych blaszkach przepływu kanału i eluują przed większymi składnikami próbki. Korzystając z parametru retencji FFF i równań współczynnika dyfuzji Stokesa-Einsteina, czas elucji i odpowiednio objętość elucji próbki w AF4 można następnie bezpośrednio przełożyć na jej rozmiar hydrodynamiczny²². Tutaj opisane zachowanie elucji odnosi się do normalnego trybu elucji i jest zwykle ważne dla AF4 w zakresie wielkości cząstek od około 1 do 500 nm (czasami do 2000 nm w zależności od właściwości cząstek i parametrów frakcjonowania), podczas gdy elucja steryczno-hiperwarstwowa zwykle zachodzi powyżej tego progu wielkości²⁵.

Istnieją trzy popularne sposoby uzyskiwania informacji o rozmiarze po rozdzieleniu przez FFF. Ponieważ FFF jest instrumentem modułowym, można go łączyć z wieloma detektorami, takimi jak detektory rozpraszania światła wrażliwe na rozmiar oparte na zasadzie wielokątowego rozpraszania światła (MALS)^26,27, Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)^28,29, a nawet kombinację obu, aby uzyskać dodatkowe informacje o kształcie^30,31. Jednakże, ponieważ zachowanie retencji próbki w kanale FFF jest generalnie regulowane przez dobrze zdefiniowane siły fizyczne, rozmiar można również obliczyć przy użyciu podejścia matematycznego (teoria FFF), gdzie prosty detektor stężenia (np. detektor UV-vis) jest wystarczający do wskazania obecności próbki elucyjnej^32,33.

Jako trzecią opcję, tutaj zgłaszamy zastosowanie zewnętrznej kalibracji rozmiaru^34,35 przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów AuNP w zakresie wielkości 20–100 nm do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota w zawiesinie za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis. Ta prosta konfiguracja eksperymentalna została wybrana celowo, aby umożliwić jak największej liczbie laboratoriów dołączenie do międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które zostało następnie przeprowadzone w ramach projektu Unii Europejskiej ACEnano w ramach programu Horyzont 2020 w oparciu o przedstawiony tutaj protokół.

Protokół

1. Ustawienia systemu AF4

1. Zmontuj wkład AF4 i podłącz wszystkie elementy sprzętowe systemu AF4 oraz detektor UV-vis (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji producenta.
2. Zainstaluj wszystkie niezbędne pakiety oprogramowania do sterowania, akwizycji, przetwarzania i oceny danych zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji producenta.
3. Upewnij się, że wszystkie niezbędne połączenia sygnałowe między systemem AF4 a detektorem UV-vis zostały wykonane.
4. Upewnij się, że ustalone połączenia AF4-UV-vis są szczelne i bez wycieków, przepłukując zestaw ultraczystą wodą (UPW) przez 15 minut (natężenie przepływu końcówki 1 ml∙^min-1, natężenie przepływu ostrości 1 mL∙^min-1 i natężenie przepływu krzyżowego 1.5 mL∙^min-1). W tym celu należy otworzyć oprogramowanie sterujące AF4 i wprowadzić natężenia przepływu do odpowiednich paneli w prawym górnym rogu strony docelowej. W razie potrzeby dokręć odpowiednie złącza (złączki) i powtarzaj procedurę, aż nie będzie można zaobserwować żadnych wycieków.
   UWAGA: Ciśnienie wewnętrzne w układzie podczas wszystkich pomiarów powinno być monitorowane i musi mieścić się w zakresie od 4 do 12 barów. W przypadku, gdy ciśnienie jest wyższe lub niższe, należy wyregulować przewody zwrotne. Ponadto trend ciśnienia w kanale powinien być stały przez cały czas pomiaru.
   UWAGA: Jeśli dostępny jest piec kanałowy, ustaw jego temperaturę na 25 °C, aby zapewnić porównywalne warunki pomiaru we wszystkich eksperymentach AF4.

2. Przygotowanie roztworów i zawiesin do kwalifikacji systemu AF4-UV-vis i analizy próbek

1. Roztwór czyszczący
   1. Dodać 8 g stałego wodorotlenku sodu (NaOH) i 2 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 1 l wody ultraczystej i mieszać roztwór aż do całkowitego rozpuszczenia.
2. Eluentu
   1. Dodać 500 μl przefiltrowanej mieszaniny środków powierzchniowo czynnych do 2 l przefiltrowanej i odgazowanej wody ultraczystej w celu uzyskania eluentu (0,025% (v/v), pH około 9,4).
      UWAGA: Szczegółowy opis związków mieszaniny środków powierzchniowo czynnych znajduje się w Tabeli 1 (również Tabeli Materiałów).
3. Dowolny wzorzec wielkości AuNP do wyznaczania odzysku masy
   1. Przez 2 minuty należy wirować dowolny wzorzec wielkości AuNP (50 mg∙^L-1) i rozcieńczyć go w stosunku 1:4 z UPW, aby uzyskać końcowe stężenie masowe 12,5 mg∙^L-1. Wirować przez dodatkowe 2 minuty po rozcieńczeniu w celu homogenizacji otrzymanej zawiesiny.
      UWAGA: Podczas pracy z chemikaliami, zwłaszcza granulkami NaOH.
      wymagane są niezbędne środki ostrożności i odpowiedni sprzęt ochronny. UWAGA: Ogólnie zaleca się odgazowanie i przefiltrowanie wszystkich niezbędnych roztworów (z wyjątkiem roztworu czyszczącego) za pomocą filtra membranowego 0,1 μm (hydrofilowego PVDF lub podobnego), aby zapewnić niską zawartość cząstek tła podczas eksperymentów AF4-UV-vis. Można to ustalić za pomocą dedykowanej jednostki filtracji próżniowej lub za pomocą filtrów strzykawkowych.

3. Kwalifikacja systemu AF4-UV-vis

1. Użyj ustawień oprogramowania opisanych w kroku 1.4, aby przepłukać system roztworem czyszczącym przez 30 minut (natężenie przepływu końcówki 1 ml∙^min-1, natężenie przepływu ostrości 1 ml∙^min-1 i natężenie przepływu krzyżowego 1.5 ml∙^min-1).
2. Wymień odpowiednią butelkę z eluentem i przepłucz system wodą ultraczystą przez 20 minut (natężenie przepływu końcówki 1 ml∙^min-1, natężenie przepływu ostrości 1 mL∙^min-1 i natężenie przepływu krzyżowego 1,5 mL∙^min-1).
3. Wymień odpowiednie filtry pompy liniowej.
4. Otwórz wkład AF4 i wymień membranę AF4. Zmontuj wkład AF4 i ponownie podłącz go do systemu AF4-UV-vis.
5. Przepłukać oczyszczony system AF4-UV-vis eluentem przez co najmniej 30 minut w celu wyrównania membrany i ustabilizowania systemu (natężenie przepływu końcówki 1 ml∙^min-1, natężenie przepływu ostrości 1 mL∙^min-1 i natężenie przepływu krzyżowego 1,5 mL∙^min-1). Ponownie sprawdź, czy nie ma potencjalnych wycieków (patrz krok 1.4).
6. Kwalifikacja systemu AF4-UV-vis poprzez określenie odzysku masy i zmiany czasu retencji przy użyciu dowolnego wzorca wielkości AuNP.
   1. Wykonać wtrysk bezpośredni bez przykładania siły rozdzielającej.
      1. Utwórz nowy plik pomiarowy, otwierając punkt menu Plik | Nowość | Uruchom w oprogramowaniu sterującym AF4.
      2. Zdefiniuj opis próbki i pomiaru, a także objętość wtrysku i nazwę próbki w zakładce Uruchom. Warunki pomiaru przedstawiono w tabeli 2.
      3. Ustaw parametry pomiaru w drugiej zakładce Metoda FFF zgodnie z Tabelą 2.
      4. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pomiar.
   2. Wykonać przebieg frakcjonowania z przyłożeniem siły rozdzielającej (przepływ krzyżowy).
      1. Określić metodę frakcjonowania zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale, stosując warunki frakcjonowania określone w tabeli 3.
      2. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pomiar.
      3. Wykonaj pomiar w poczwórnym rozmiarze.
         UWAGA: Pierwszy przebieg ma na celu kondycjonowanie systemu (tj. membrany AF4) i zostanie wykluczony z końcowej oceny wyników kwalifikacji systemu.
         UWAGA: Zaleca się zapisanie wszystkich wygenerowanych plików uruchamiania, otwierając punkt menu Plik | Zapisz w oprogramowaniu sterującym AF4.
      4. Rozważmy, że system AF4-UV-vis jest kwalifikowany, jeśli uzyskuje się odzysk masy na poziomie >80% i zmianę czasu retencji <2% dla dowolnego wzorca wielkości AuNP.
      5. W przypadku korzystania z automatycznego podajnika próbek jako systemu iniekcyjnego, należy napełnić butelkę zbiornika do mycia igieł automatycznego podajnika igieł tym samym roztworem, który jest pompowany przez system AF4-UV-vis (np. roztworem czyszczącym, wodą ultraczystą lub odpowiednim eluentem), aby zapewnić optymalne warunki pracy. Podczas zmiany eluentu ogólnie zaleca się przestrzeganie re-equilibracji systemu AF4 poprzez monitorowanie sygnału detektora UV-vis do momentu, gdy jego linia podstawowa pozostanie stabilna na stałym poziomie.

4. Analiza próbki AF4-UV-vis

1. Przygotować wszystkie wzorce wielkości AuNP do zewnętrznej kalibracji wielkości poprzez wirowanie odpowiedniej zawiesiny AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, każda 50 mg. ^L-1) przez 2 minuty i rozcieńczyć w stosunku 1:4 roztworem ultraczystej wody do uzyskania końcowego stężenia masowego 12,5 mg∙^L-1. Wirować przez dodatkowe 2 minuty po rozcieńczeniu, aby ujednorodnić otrzymane zawiesiny.
2. Przygotować nieznaną próbkę AuNP do analizy, stosując tę samą procedurę, co w przypadku wzorców kalibracyjnych opisanych w kroku 4.1.
3. Wykonać pomiar wtrysku bezpośredniego wszystkich wzorców wielkości AuNP przy użyciu metody AF4 przedstawionej w tabeli 2.
   1. W tym celu należy wprowadzić odpowiednie wartości podsumowane w tabeli 2 do oprogramowania producenta w odpowiednich pozycjach w celu zdefiniowania parametrów separacji i próbki, a następnie nacisnąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment.
4. Frakcjonować każdy wzorzec wielkości AuNP indywidualnie przy użyciu metody AF4 przedstawionej w tabeli 3, aby ustalić funkcję zewnętrznej kalibracji wielkości.
   1. Wprowadź odpowiednie wartości podsumowane w tabeli 3 do oprogramowania producenta w odpowiednich pozycjach. Metoda frakcjonowania jest zdefiniowana przez etap ogniskowania, kilka etapów elucji i etap płukania. Po skonfigurowaniu metody naciśnij przycisk Uruchom, aby rozpocząć eksperyment.
5. Wykonać pomiar metodą wtrysku bezpośredniego nieznanej próbki AuNP przy użyciu metody AF4 przedstawionej w tabeli 2.
6. Przeprowadzić frakcjonowanie nieznanej próbki AuNP, przeprowadzając metodę AF4 wymienioną w tabeli 3.
7. O ile nie zaznaczono inaczej, należy wykonać wszystkie pomiary, o których mowa w sekcjach 3 i 4, w trzech egzemplarzach, w celu uzyskania miarodajnych i statystycznie istotnych wyników.
   1. Przed użyciem przechowywać 50 mg∙^L-1 zawiesiny wyjściowej AuNP w temperaturze 4–8 °C. Rozcieńczone zawiesiny AuNP najlepiej przygotować w ciągu 30 minut przed aplikacją.
      UWAGA: Wirowanie jest zwykle wystarczające i nie jest konieczne stosowanie ultradźwięków zawiesin
   .
   2. Aby umożliwić korelację czasu retencji nieznanej próbki AuNP z czasami retencji uzyskanymi dla wzorców wielkości AuNP, należy zmierzyć wszystkie próbki tą samą metodą AF4.
      UWAGA: Aby zapewnić stałe i ważne warunki separacji, należy uwzględnić/powtórzyć etap frakcjonowania opisany w rozdziale dotyczącym kwalifikacji systemu (patrz krok 3.6.2) po określonej liczbie pomiarów próbki (np. 10 pomiarów). Ponadto rejestruj ciśnienie w układzie i stabilność linii bazowej detektora UV-vis. Powinny one pozostać stabilne i stałe przez cały przebieg AF4-UV-vis.
      UWAGA: Membranę ultrafiltracyjną należy zwykle wymienić, gdy detektor UV-vis (lub detektor Multi Angle Light Scattering (MALS), jeśli jest dostępny) wykazuje zwiększony poziom szumów lub pominięte są zdefiniowane kryteria kwalifikacji systemu, takie jak odzysk, kształt piku próbki lub powtarzalność (lub system AF4-UV-vis został poddany dokładnej procedurze czyszczenia). W opisanych tutaj warunkach kwalifikowany system AF4-UV-vis jest zwykle stabilny przez co najmniej 50 pomiarów przy użyciu tej samej membrany; Jednak liczba możliwych kolejnych pomiarów spełniających określone kryteria jakości może się znacznie różnić w zależności od próbki, matrycy próbki i składu eluentu.

5. Ocena danych

1. Obliczenia odzysku masy należy wykonać za pomocą oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4-UV-vis lub analizy arkusza kalkulacyjnego po wyeksportowaniu wszystkich niezbędnych danych pierwotnych (tj. obszaru piku UV-vis) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji producenta.
   1. Obliczyć odzysk masy AuNP, porównując obszary pod odpowiednimi pikami UV-vis pomiaru frakcjonowania (_{frakcjonowanie} A) i pomiaru wtrysku bezpośredniego (wtrysk_bezpośredni) przy użyciu następującego równania:
      
      UWAGA: Podczas pomiaru bezpośredniego wtrysku nie jest stosowana żadna siła rozdzielająca, a zatem potencjalne interakcje gatunku analitu ze ścianą akumulacji można pominąć. Obszar pod odpowiednim pikiem UV-vis może być bezpośrednio skorelowany z masą AuNP przy użyciu prawa Beera-Lamberta, przy założeniu, że żadne inne gatunki w próbce nie absorbują na odpowiedniej długości fali i/lub i) eluują w innym czasie retencji w warunkach frakcjonowania ii) są usuwane przez membranę AF4.
   2. Zaimportuj pliki danych uzyskane zarówno z wtrysku bezpośredniego, jak i z przebiegu frakcjonowania.
   3. Wybierz ślad detektora UV-vis w zakładce Przegląd.
   4. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) i linię bazową w widoku sygnału i linii bazowej dla wszystkich pomiarów.
   5. Włóż kalibrację wtrysku bezpośredniego za pomocą wkładki.
   6. Zaznacz wszystkie przebiegi wtrysku bezpośredniego w widoku Ustawienia kalibracji wtrysku bezpośredniego i wprowadź współczynnik ekstynkcji UV.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać tego samego współczynnika ekstynkcji UV-vis zarówno do kalibracji, jak i pomiaru frakcjonowania.
   7. Ustal linię kalibracyjną, wykorzystując obszar pod ścieżką sygnału UV-vis w ROI i wstrzykniętą ilość obliczoną na podstawie wprowadzonego stężenia i objętości wtrysku. Uzyskana kalibracja zostanie pokazana w osobnym oknie Funkcja kalibracji wtrysku bezpośredniego.
   8. Przypisz funkcję kalibracji do odpowiednich pomiarów frakcjonowania.
      UWAGA: Dla każdego wzorca wielkości kalibracji i nieznanej próbki AuNP należy ustanowić oddzielną funkcję kalibracji ze względu na zależną od wielkości absorbancję UV-vis AuNP. Tę wadę detektora UV-vis można obejść za pomocą detektora wrażliwego na masę, takiego jak ICP-MS.
   9. Wykonaj analizy, wprowadzając obliczenie wyników ilościowych, a wyniki zostaną wyświetlone w tabeli po prawej stronie jako wartości stężenia i wstrzykniętej ilości.
2. Obliczyć zmienność czasu retencji za pomocą oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4 lub analizy w arkuszu kalkulacyjnym po wyeksportowaniu wszystkich niezbędnych danych pierwotnych (tj. czasów retencji wzorców kalibracyjnych AuNP przy odpowiednich maksimach szczytowych UV-vis i odpowiednich czasach void) z odpowiedniego oprogramowania do gromadzenia danych, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji producenta.
   1. Otwórz okno Przegląd, aby wyświetlić odpowiednie ślady UV dla wszystkich zaimportowanych pomiarów.
   2. Wykrywanie wartości szczytowych zostanie przeprowadzone automatycznie; dostosuj parametry wykrywania wartości szczytowych w zestawie narzędzi do przetwarzania sygnału, aby zoptymalizować wydajność. Wyodrębnij odpowiednie maksima pików, przechodząc przez wszystkie pliki pomiarowe.
   3. Oblicz względne odchylenie standardowe dla wszystkich pomiarów, korzystając z następującego równania:
      
      Obliczenia można również wykonać za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
3. Wykonaj określenie rozmiaru za pomocą oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta lub analizy arkusza kalkulacyjnego po wyeksportowaniu wszystkich niezbędnych danych surowych (czas retencji przy maksymalnym szczycie UV-vis analitu i odpowiedni czas pustki) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji producenta. Zewnętrzną funkcję kalibracji wielkości można ustanowić, wykreślając czasy retencji skorygowane o czas pustki (czasy retencji netto, patrz tabela 5) wzorców wielkości AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) w stosunku do ich rozmiarów hydrodynamicznych uzyskanych z poprzednio wykonanych pomiarów DLS (patrz tabela 4).
   UWAGA: Pomiary DLS powinny być przeprowadzone najlepiej tego samego dnia, co odpowiednie pomiary frakcjonowania, aby zapewnić porównywalne właściwości próbki.
   1. Po zaimportowaniu plików .dat wszystkie pomiary są wyświetlane w zakładce Przegląd. Wybierz sygnał detektora UV-vis z listy czujników, która jest wyświetlana pod oknem nakładki. Zdefiniuj zwrot z inwestycji i linię bazową dla każdego pomiaru, które można dostosować w widoku Sygnał i Linia bazowa. Użyj przybornika Przetwarzanie sygnału po prawej stronie, aby wygładzić zaszumione sygnały. Użyj funkcji Przypisz parametry przetwarzania do innych przebiegów, aby umożliwić przypisanie parametrów do innych pomiarów lub sygnałów.
   2. Wybierz opcję Kalibracja wielkości cząstek z zakładki Wstaw.
   3. Wybierz wszystkie przebiegi kalibracji, klikając odpowiedni pomiar w tabeli Wybierz odniesienia do kalibracji w prawym górnym rogu. Wszystkie wybrane pomiary zostaną wyświetlone w poniższej tabeli. Wprowadź promień hydrodynamiczny dla wszystkich pomiarów kalibracyjnych, które są określone w tabeli 4. Funkcja zostanie wyświetlona w oknie Kalibracja wielkości cząstek – Funkcja, a równanie również zostanie wyświetlone.
      UWAGA: Współczynnik korelacji (R²) ustalonej funkcji kalibracji rozmiaru musi wynosić ≥0,990.
   4. Przypisz funkcję kalibracji do pomiarów nieznanej próbki AuNP, wybierając odpowiednie frakcje z listy Wybierz przebiegi do przypisania.
   5. Wyświetl wyniki, otwierając obliczenie rozkładu wielkości cząstek na karcie wstawki. Poprzednio utworzona kalibracja wielkości cząstek zostanie wyświetlona jako Kalibracja dla nieznanych pomiarów próbki AuNP, która jest wyświetlana w ustawieniach po prawej stronie. Obliczony rozmiar zostanie wyświetlony w oknie rozkładu rozmiarów oznaczonym etykietą do maksimum szczytu. Zaznacz pole wyboru Uśrednij sygnały dla próbki, aby uśrednić wszystkie pomiary jednej próbki i podać wynik na etykiecie maksimum piku.
   6. Dodatkowo narysuj linię kalibracji nad fraktogramem, zaznaczając pole wyboru Pokaż krzywą kalibracji. Skumulowany rozkład rozmiaru jest dostępny po zaznaczeniu pola wyboru Pokaż rozkład skumulowany.
      UWAGA: W przypadku korzystania z oprogramowania producenta do oceny danych zaleca się dodanie wszystkich wyników do raportu, który można wygenerować, klikając przycisk Raport w zakładce Wstaw. Przycisk Raport powoduje dodanie wszystkich wyników, tabel i diagramów do dokumentu. Na karcie Raport ustawienia raportu można zmienić, otwierając Ustawienia raportu w sekcji Dokument.

Wyniki

Po pierwsze, wzorce wielkości AuNP zostały pofrakcjonowane przez AF4 i wykryte przez UV-vis mierzące absorbancję AuNP na długości fali 532 nm (powierzchniowy rezonans plazmonowy AuNP). Nakładka uzyskanych fraktogramów jest przedstawiona w Rysunek 1. Czasy retencji każdego AuNP przy odpowiednim maksimum piku UV-vis uzyskane z potrójnych pomiarów są wymienione w tabeli 5. Względne odchylenie standardowe wszystkich czasów przechowywania wynosiło poniżej 1,1%, przy czym wariancja pomiaru zmniejszała się wraz ze wzrostem rozmiaru. Ogólnie rzecz biorąc, osiągnięto doskonałą powtarzalność. Zastosowano stałą siłę separacji, co spowodowało liniową zależność czasu elucji od wielkości hydrodynamicznej. Zewnętrzna linia kalibracji wielkości została ustalona poprzez wykreślenie określonego promienia hydrodynamicznego w stosunku do czasu elucji skorygowanego o czas pustki (czas retencji netto). Analiza regresji liniowej dała w wyniku liniową funkcję kalibracji z punktem przecięcia a = -3,373 nm ± 1,716 nm i nachyleniem b = 1,209 nm∙^min-1 ± 0,055 nm∙^min-1. Liniowe zachowanie elucji zostało potwierdzone za pomocą kwadratowego współczynnika korelacji R² wynoszącego 0,9958. Odpowiednia funkcja kalibracji jest wizualnie wyświetlana w Rysunek 2.

Druga część dotyczyła analizy nieznanej próbki AuNP. Trzy podwielokrotności próbki przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w sekcji protokołu (sekcja 4.2). Każda z trzech podwielokrotności została zbadana trzykrotnie przy użyciu tej samej metody frakcjonowania AF4, która została również zastosowana do wzorców wielkości AuNP. Wszystkie dziewięć fraktogramów AF4-UV-vis, które uzyskano z nieznanej próbki AuNP, przedstawiono w Rysunek 3, a ich odpowiednie oceny podsumowano w Tabeli 6. Względne odchylenie standardowe odpowiednich czasów retencji było znacznie niskie i mieściło się w zakresie od 0,1% do 0,5%. Korzystając z funkcji kalibracji wielkości cząstek uzyskanej z frakcjonowania wzorców wielkości AuNP i korelując ją z uzyskanymi czasami retencji nieznanej próbki AuNP przy maksimum piku UV-vis, można obliczyć ogólny średni promień hydrodynamiczny wynoszący 29,4 nm ± 0,2 nm. Ponadto uzyskano rozsądny odzysk masy wynoszący 83,1% ± 1,2%, co wskazuje na brak znaczącej aglomeracji lub rozpuszczenia próbki AuNP lub znacznej adsorpcji cząstek na powierzchni membrany. Rysunek 4 przedstawia uzyskany rozkład wielkości cząstek ze wszystkimi dziewięcioma uśrednionymi śladami sygnału UV-vis, podkreślając doskonałą wytrzymałość zastosowanej metody AF4.

Rysunek 1: Fraktogramy AF4-UV-vis uzyskane z potrójnej analizy czterech indywidualnych wzorców kalibracyjnych wielkości AuNP ze znormalizowanymi natężeniami sygnału i zastosowanym stałym natężeniem przepływu krzyżowego (linia). Szczyt pustki jest podświetlony na szaro po około 5,9 minucie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Uzyskana funkcja zewnętrznej kalibracji wielkości, w tym słupki błędów wynikające z odpowiednich odchyleń standardowych pomiarów DLS (tabela 4) i odchylenia w uzyskanych czasach retencji AF4 (tabela 5), po wykreśleniu określonego promienia hydrodynamicznego w stosunku do czasu retencji każdego indywidualnego wzorca kalibracji wielkości AuNP w odpowiednim maksimum piku. Z analizy regresji liniowej obliczono liniową funkcję kalibracyjną z błędami standardowymi w postaci y = a + bx przy a = -3,373 nm ± 1,716 nm i b = 1,209 nm·^min-1 ± 0,055 nm·^min-1. Wyznaczono kwadrat współczynnika korelacji z R² = 0,9958, co wskazuje na zależność liniową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: AF4-UV-vis fraktogramy z potrójnymi pomiarami trzech podwielokrotności przedstawiających nieznaną wartość AuNP. Zastosowane stałe natężenie przepływu krzyżowego w czasie pomiaru jest zilustrowane czarną linią. Szczyt pustki po około 5,9 minutach jest podświetlony na szaro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Nałożenie uzyskanego średniego rozkładu wielkości cząstek (kolor czerwony) nieznanej próbki AuNP i zastosowanej liniowej funkcji kalibracyjnej (linia przerywana). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt.

Komponent		Nr CAS	Waga (%)
Woda		Nr kat. 7732-18-5	88,8
9-kwas oktadecenowy (Z)-, związek z 2,2',2''-nitrolotris[etanol](1:1)		2717-15-9	3.8
Węglan sodu		497-19-8	2.7
Alkohole, C12-14-wtórne, etoksylowane		84133-50-6	1.8
Tetrasodowy EDTA		64-02-8	1.4
Glikol polietylenowy		Nr kat. 25322-68-3	0,9
Oleinian sodu		143-19-1	0,5
Wodorowęglan sodu		144-55-8	0,1

Tabela 1: Lista składników mieszaniny środków powierzchniowo czynnych użytej do przygotowania eluentu (zobacz również Tabelę materiałów).

szt. TGL pkt.

Parametry AF4-UV-vis	jednostka	wartość
Grubość podkładki dystansowej	μm	350
Natężenie przepływu detektora	ml min-1	0,5
Natężenie przepływu krzyżowego	ml min-1	0 (stałe przez 8 min)
Natężenie przepływu ostrości	ml min-1	0
Czas opóźnienia / czas stabilizacji	Min	0
Natężenie przepływu wtrysku	ml min-1	0,5
Czas przejścia	Min	0
Czas wtrysku	Min	0,1
Etap elucji	Min	8
Czas kroku płukania	Min	0,1
Natężenie przepływu w kroku płukania	ml min-1	0,1
Objętość wtrysku	μL	10
Stężenie próbki	mg L-1	Rozdział 12,5
Typ membrany		Celuloza regenerowana
Odcięcie masy cząsteczkowej membrany	kDa	10
Eluentu		0,025% (v/v) mieszanina środków powierzchniowo czynnych
Długość fali UV-vis	Nm	Okręg wyborczy 532
Wrażliwość na promieniowanie UV-vis	-	0,001

Tabela 2: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis w celu przeprowadzenia bezpośredniego wtrysku bez użycia siły rozdzielającej.

szt. pkt. pkt. Rozdział TGL pkt.

Parametry AF4-UV-vis	jednostka	wartość
Grubość podkładki dystansowej	μm	350
Natężenie przepływu detektora	ml min-1	0,5
Natężenie przepływu krzyżowego	ml min-1	1 (stała 60 min, 10 min liniowa)
Natężenie przepływu ostrości	ml min-1	1.3
Czas opóźnienia / czas stabilizacji	Min	cyfra arabska
Natężenie przepływu wtrysku	ml min-1	0,2
Czas przejścia	Min	0,2
Czas wtrysku	Min	5
Etap elucji	Min	70 (60 min stała, 10 min liniowa)
Krok płukania	Min	9
Natężenie przepływu w kroku płukania	ml min-1	0,5
Objętość wtrysku	μL	50
Stężenie próbki	mg L-1	Rozdział 12,5
Typ membrany		Celuloza regenerowana
Odcięcie masy cząsteczkowej membrany	kDa	10
Eluentu		0,025% (v/v) mieszanina środków powierzchniowo czynnych
Długość fali UV-vis	Nm	Okręg wyborczy 532
Wrażliwość na promieniowanie UV-vis	-	0,001

Tabela 3: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis do przeprowadzenia przebiegu frakcjonowania z zastosowaniem przepływu krzyżowego jako siły separacji.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. punktu pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Wzorzec kalibracji	Środek zamykający	Średnia wielkość (TEM) (nm)	CV (średnia wielkość TEM) (%)	Potencjał Zeta (mV)	SD (potencjał zeta) (mV)	Promień hydrodynamiczny (DLS) (nm)	SD (promień hydrodynamiczny) (nm)	Pdi	SD (PDI)
AuNP 20 nm	Cytrynian	20,1	≤ 8	-48,9	1,5	Godzina 10,95	0,12	0,082	0,009
AuNP 40 nm	Cytrynian	40,8	≤ 8	-30,4	1,0	Godzina 20.30	0,13	0,127	0,006
AuNP 80 nm	Cytrynian	79,2	≤ 8	-51,5	1.3	Dnia 38,85	0,23	0,138	0,013
AuNP 100 nm	Cytrynian	102,2	≤ 8	-50,9	0,9	Godzina 52,30	0,37	0,078	0,009

Tabela 4: Podsumowanie parametrów fizykochemicznych zastosowanych wzorców kalibracji AuNP, w tym czynnika zamykającego, średniej wielkości TEM, potencjału Zeta wyznaczonego w natywnej zawiesinie, jak również promienia hydrodynamicznego DLS i wskaźnika polidyspersyjności (PDI) wyznaczonego w eluencie.

TGL zł TGL TGL Rozdział TGL TGL szt. Nasion Pręty szt. szt. TGL szt. TGL TGL szt. pkt. TGL TGL szt.

Wzorzec kalibracji	biegać	Czas retencji przy maksimum szczytu (min)	Czas retencji netto przy maksimum szczytu (min)	Średni czas retencji netto (min)	SD (%) (czas retencji netto)	SD (min) (czas retencji netto)
AuNP 20 nm	1	17 368	Z dnia 11 468	11.56	1.02	0.12
	cyfra arabska	17.409	11 509
	3	17.589	11 689
AuNP 40 nm	1	Dnia 25,316	19 416	19.49	0.68	0.13
	cyfra arabska	O godz. 25.32	godz. 19.42
	3	25 548	19.648
AuNP 80 nm	1	42 095	Klasa 36,195	36.29	0.23	0.08
	cyfra arabska	42 219	Klasa 36 319
	3	42 257	Klasa 36 357
AuNP 100 nm	1	50,975	45 075	45.06	0.07	0.03
	cyfra arabska	50,924	45.024
	3	50,986	45.086

Tabela 5: Czasy retencji wzorców kalibracji AuNP przy odpowiednim maksimum piku UV-Vis wyprowadzone z odpowiednich fraktogramów AF4-UV-vis przy użyciu metody opisanej w Tabeli 3.

TGL TGL szt. zł jedn. TGL TGL szt. zł szt. TGL zł TGL zł

Alicytat	biegać	Maksymalny czas retencji (min)	Średni czas retencji przy maksimum szczytu (min)	Czas retencji netto przy maksimum szczytu (min)	Czas przechowywania SD (%)	Promień hydrodynamiczny (nm)	Odzysk (%)
1	1	32.689	32.70	Z dnia 26 789	0.07	29.03	85.34
	cyfra arabska	32 687		Z dnia 26 787
	3	Nr kat. 32 719		Nr kat. 26.819
2	1	32 989	33.08	27.089	0.37	29.49	81.73
	cyfra arabska	33 073		Rozdział 27.173
	3	33 187		Z dnia 27 287
3	1	33 053	33.14	Godzina 27 153	0.49	29.56	82.14
	cyfra arabska	Nr kat. 33.071		Z dnia 27 171
	3	Klasa 33 291		Z dnia 27 391

Tabela 6: Podsumowanie czasów retencji przy odpowiednim maksimum piku UV-Vis, promień hydrodynamiczny obliczony na podstawie zewnętrznej kalibracji rozmiaru (Rysunek 2) oraz wskaźnik odzysku nieznanej próbki AuNP uzyskanej z analizy AF4-UV-vis.

Dyskusja

Rozmiar hydrodynamiczny nieznanego AuNP został dokładnie oceniony za pomocą AF4 sprzężonego z detektorem UV-vis przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów wielkości AuNP w zakresie od 20 nm do 100 nm. Opracowana metoda AF4 została zoptymalizowana przy użyciu stałego profilu przepływu krzyżowego w celu ustalenia liniowej zależności między zmierzonym czasem retencji a rozmiarem AuNP, umożliwiając w ten sposób proste określenie wielkości na podstawie analizy regresji liniowej. Szczególny nacisk położono również na osiągnięcie wystarczająco wysokich wskaźników odzysku, które wskazują na brak znacznych strat próbki podczas frakcjonowania, oraz na to, aby opracowana metoda AF4, obejmująca zastosowany eluent i membranę, dobrze pasowała do wszystkich frakcjonowanych próbek AuNP.

Opracowanie metody jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem w AF4 i kilka parametrów, w tym wymiary kanału, parametry przepływu, a także eluent, membrana, wysokość przekładki, a nawet właściwości próbki, muszą być brane pod uwagę, aby poprawić frakcjonowanie w danym oknie czasowym elucji. Celem tego akapitu jest przeprowadzenie czytelnika przez krytyczne kroki, które zostały zoptymalizowane w celu pomyślnego określenia wielkości omawianej tutaj nieznanej próbki AuNP. Bardziej szczegółowy opis tego, jak ogólnie opracować metodę AF4, odsyłam czytelnika do sekcji AF4 w dokumencie "ISO/TS21362:2018 – Nanotechnologie – Analiza nanoobiektów z wykorzystaniem asymetrycznego przepływu i frakcjonowania w polu odśrodkowym"²⁵. Po bliższym przyjrzeniu się zastosowanym warunkom frakcjonowania podanym w tabeli 3, pierwszym krytycznym krokiem jest wprowadzenie i rozluźnienie próbki AuNP w kanale AF4. Ten etap jest regulowany przez przepływ iniekcji, przepływ skupienia i przepływ krzyżowy, których wzajemne oddziaływanie zmusza próbkę do umieszczenia blisko powierzchni membrany i skoncentrowania jej w wąskim paśmie w pobliżu portu iniekcyjnego kanału AF4, zasadniczo określając punkt początkowy frakcjonowania. Konieczne jest odpowiednie rozluźnienie próbki, ponieważ na tym etapie składniki próbki o różnych rozmiarach znajdują się na różnych wysokościach kanału AF4, zapewniając w ten sposób podstawę do udanego frakcjonowania według wielkości. Niepełna relaksacja próbki jest zwykle widoczna jako zwiększona powierzchnia piku pustki wynikająca z niezatrzymanych (tj. niezrelaksowanych) składników próbki. Efekt ten można złagodzić poprzez wydłużenie czasu iniekcji i/lub zastosowanego natężenia przepływu krzyżowego. Oba parametry wymagają jednak starannej optymalizacji, szczególnie w przypadku próbek, które są podatne na aglomerację i adsorpcję na membranie AF4 i mogą być monitorowane za pomocą odpowiednich współczynników odzysku uzyskanych dla różnych ustawień parametrów^36,37. Zastosowany czas iniekcji wynoszący 5 minut wraz z natężeniem przepływu krzyżowego 1,0 mL∙^min-1 ujawnił wskaźniki odzysku >80% dla wszystkich próbek AuNP i znikomą powierzchnię piku pustego, co wskazuje na bliskie optymalnym warunkom relaksacji. Po wystarczającym rozluźnieniu próbki AuNP zatrzymano przepływ ogniskowania i zainicjowano transport próbki wzdłuż długości kanału AF4 do odpowiedniego detektora UV-vis, co stanowiło drugi krytyczny krok. W celu zapewnienia wystarczająco wysokiej mocy frakcjonowania w rozsądnych czasach analiz zastosowano stałe natężenie przepływu krzyżowego 1,0 ml∙^min-1 przez 30–50 minut (w zależności od odpowiedniego wzorca frakcjonowanego rozmiaru AuNP), a następnie 10-minutowy liniowy zanik przepływu krzyżowego przy natężeniu przepływu detektora 0,5 mL.min-1. Zastosowanie stałego profilu przepływu krzyżowego w poprzek separacji wszystkich wzorców wielkości AuNP ujawniło liniową zależność między czasem retencji a rozmiarem AuNP zgodnie z teorią FFF²², umożliwiając w ten sposób określenie wielkości nieznanej próbki AuNP za pomocą prostej analizy regresji liniowej. Jednak profile inne niż stały przepływ krzyżowy zostały również wykorzystane do wymiarowania nanocząstek, co ostatecznie doprowadziło do nieliniowej zależności między czasem retencji a wielkością cząstek^38,39. Ponadto oznaczanie wielkości w AF4 przy użyciu dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości nie ogranicza się do AuNP, ale może być również stosowane do nanocząstek o innych rozmiarach i składzie pierwiastkowym (np. nanocząstki srebra^38,40 lub krzemionki^41,42). Ponadto, podczas pracy z rozcieńczonymi próbkami, ICP-MS jest bardzo czułym detektorem elementarnym, który może być sprzężony z AF4, co zwiększa wszechstronność tego podejścia analitycznego do wymiarowania dużej różnorodności nanocząstek w zawiesinie.

Pomimo szerokiego zastosowania, zewnętrzna kalibracja rozmiaru przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów rozmiaru w AF4 ma pewne cechy szczególne, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z niego w celu dokładnego wymiarowania nieznanych próbek. Przede wszystkim w dużym stopniu opiera się na zastosowaniu porównywalnych warunków podczas frakcjonowania odpowiednich wzorców wielkości i rzeczywistej próbki. W przedstawionym tutaj przypadku obowiązkowe jest zatem, aby zarówno wzorce wielkości AuNP, jak i nieznana próbka AuNP były frakcjonowane przy użyciu tej samej metody AF4, a także tego samego eluentu i tej samej membrany, co sprawia, że podejście to jest dość mało elastyczne. Ponadto, nie mając pod ręką detektorów wrażliwych na rozmiar, np. rozpraszania światła (MALS i DLS), trudno jest określić, czy dana metoda AF4 wykorzystująca wzorce wielkości działa wystarczająco dobrze, czy nie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku nieznanych próbek, które wykazują bardzo szeroki rozkład wielkości, gdzie nie jest jasne, czy wszystkie składniki próbki przebiegają zgodnie z normalnym wzorcem elucji: frakcjonowanie od mniejszych do większych cząstek, czy też większe składniki próbki już eluują w trybie steryczno-hiperwarstwowym, co może potencjalnie koeluować z mniejszymi składnikami próbki^43,44. Ponadto, mimo że teoria FFF podkreśla, że AF4 rozdziela się wyłącznie na podstawie różnic w rozmiarach hydrodynamicznych, przy czym cząstki są uważane za masy punktowe bez żadnych interakcji z ich otoczeniem²², rzeczywistość mówi co innego, ponieważ oddziaływania cząstka-cząstka i cząstka-membrana (takie jak przyciąganie/odpychanie elektrostatyczne lub przyciąganie van-der-Waalsa) mogą odgrywać znaczącą rolę i mogą potencjalnie wprowadzać mierzalne odchylenie do określania wielkości za pomocą zewnętrznych Kalibracja rozmiaru^45,46. W związku z tym zaleca się stosowanie wzorców wielkości, które idealnie pasują do składu i właściwości powierzchniowych (potencjał Zeta) cząstki będącej przedmiotem zainteresowania^40,42 lub, jeśli nie są one dostępne, przynajmniej stosowanie dobrze scharakteryzowanych wzorców wielkości cząstek (np. cząstki polistyrenu lateksowego) i staranną ocenę ich porównywalności z cząstką będącą przedmiotem zainteresowania, zwłaszcza pod względem ich powierzchniowego potencjału Zeta w danym środowisku, w którym przeprowadza się analizę^41,47.

Wszechstronność AF4 jest często uważana za jego największą zaletę, ponieważ oferuje zakres zastosowań, który wykracza poza większość innych popularnych technik wymiarowania w tej dziedzinie 22,48,49. Jednocześnie, ze względu na związaną z tym przypuszczalną złożoność, może być również uważany za jego najważniejszą wadę, zwłaszcza w przypadku szybkich i pozornie łatwych w użyciu technik wymiarowania, takich jak DLS, Nanoparticle Tracking Analysis lub ICP-MS dla pojedynczych cząstek. Niemniej jednak, gdy spojrzymy na AF4 z perspektywy tych popularnych technik wymiarowania, staje się jasne, że wszystkie techniki mają swoje wady i zalety, ale wszystkie z nich przyczyniają się do bardziej wszechstronnego zrozumienia fizykochemicznej natury nanocząstek i dlatego powinny być uważane za komplementarne, a nie konkurencyjne.

Przedstawiona tutaj standardowa procedura operacyjna (SOP) podkreśla doskonałą przydatność AF4-UV-vis z zewnętrzną kalibracją wielkości do wymiarowania nieznanej próbki AuNP w zawiesinie i ostatecznie została zastosowana jako zalecana wytyczna do analizy AF4 nieznanej próbki AuNP w ramach międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które przeprowadzono w ramach projektu Horyzont 2020. ACEnano (wyniki tego ILC będą przedmiotem przyszłej publikacji). Protokół ten wpisuje się zatem w zachęcające i trwające międzynarodowe wysiłki na rzecz walidacji i standaryzacji metodologii AF4 25,50,51,52, podkreślając obiecujący potencjał AF4 w dziedzinie charakteryzacji nanocząstek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1 &mikro; m Filtry membranowe (hydrofilowe PVDF)	Postnova Analytics GmbH	Z-FIL-TEF-002	Służy do filtracji roztworów wodnych
0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy PVDF (d = 33 mm)	Merck Millipore	Durapore Millex	Służy do filtracji pipet o regulowanej objętości NovaChem100
(1000 µ L)	Eppendorf AG	Research Plus	Służy do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP
Kartridż AF4	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF - Kanał analityczny AF4	Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako AF4-system
AF4 Membrana - Regenerowana celuloza (10 kDa MWCO)	Postnova Analytics GmbH	Z-AF4-MEM-612-10KD	Element zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4
Waga analityczna (dokładność 0,1 mg)	Sartorius	ENTRIS124I-1S	Służy do ważenia granulek SDS i NaOH do przygotowania roztworu czyszczącego
Automatyczny podajnik próbek	Postnova Analytics GmbH	PN5300	Element zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Piece kanałowej	Postnova Analytics GmbH	PN4020	Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4
Moduł Crossflow	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF Moduł sterujący	AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Jednorazowe końcówki do pipet (1000 µ L)	Eppendorf AG	ep T.I.P.S	Służy do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP
Kolby (np. o objętości 2 litrów)	neoLab	1-0199	Używany do przechowywania eluentu
Pompa ostrości	Postnova Analytics GmbH	PN1131	Składnik zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Szklane fiolki (np. objętość 1,5 ml)	Postnova Analytics GmbH	VIA-002	Służy do przechowywania próbek
Złote wzorce wielkości nanocząstek (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)	Postnova Analytics GmbH	NovaCal Gold	50 mg L-1 każdy, służy do ustalenia funkcji kalibracji wielkości
Mieszadło magnetyczne	IKA	VIBRAX-VXR	Służy do przyspieszania rozpuszczania granulek SDS i NaOH w komputerze
osobistym (PC)	Technologies	/	Jednostka do sterowania przebiegami AF4, nagrywania i oceny zebranych danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000
Środki ochrony indywidualnej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary itp.)	/	/	Zgodnie z odpowiednim laboratorium" s zasady bezpieczeństwa pracy z chemikaliami, w tym z nanomateriałami inżynieryjnymi
Zakrętka do szklanych fiolek (np. o objętości 1,5 ml)	Postnova Analytics GmbH	Z-VIA-09150868	Służy do przechowywania próbek
Dodecylosiarczan sodu (SDS), ≥ 99 %, Klasa bibuły	Carl Roth GmbH & Co KG	2326.1	Stosowany do przygotowania roztworu czyszczącego
Granulki wodorotlenku sodu (NaOH), ≥ 98 %, p.a	Carl Roth GmbH & Co KG	6771.1	Służy do przygotowania roztworu czyszczącego
Pakiet oprogramowania do sterowania i akwizycji danych	Postnova Analytics GmbH	NovaFFF AF2000 Oprogramowanie	Oprogramowanie do wykonywania przebiegów Af4 i akwizycji danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000
Pakiet oprogramowania do oceny danych	Postnova Analytics GmbH	Oprogramowanie	NovaAnalysisOprogramowanie do oceny danych AF4, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytelnik jest odsyłany do instrukcji obsługi Postnova NovaAnalysis
Pakiet oprogramowania do końcowego przetwarzania danych	OriginLab Corporation	Origin 2019	Używany do końcowego przetwarzania danych
Solvent Degasser	Postnova Analytics GmbH	PN7520	Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie
jest opisany jako system AF4Solvent Selector	Postnova Analytics GmbH	PN7310	Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Solvent Organizer	Postnova Analytics GmbH	PN7140	Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Mieszanina środków powierzchniowo czynnych	Postnova Analytics GmbH	NovaChem100	Mieszanina różnych środków powierzchniowo czynnych i soli stosowanych do przygotowania eluentu
Pompa końcówkowa	Postnova Analytics GmbH	PN1130	Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Nieznana próbka AuNP	BBI Solutions	EM. GC60	60 nm Próbka AuNP używana do oznaczania wielkości za pomocą funkcji kalibracji wielkości
Detektor UV-vis	Postnova Analytics GmbH	Detektor UV-vis PN3211	Do dalszego sprzężenia z systemem AF4
Jednostka filtracji próżniowej	filtracji eluentów	Postnova Analytics GmbH	Służy do zapewnienia niskiej zawartości cząstek tła i usuwania rozpuszczonego powietrza w stosowanych eluentach w celu zapewnienia optymalnych warunków
Vortex	IKA	Vortex Genie 2	Służy do homogenizacji rozcieńczonych zawiesin AuNP
System oczyszczania wody	Merck Millipore	Milli-Q Integral 5	Służy do wytwarzania wody ultraczystej (UPW, 18.2 MΩ cm rezystywności) do przygotowania roztworu czyszczącego, eluentów i rozcieńczania zawiesin AuNP