Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61757

⸱

11 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1Research & Development, Postnova Analytics GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie asymetrycznego frakcjonowania przepływu w połączeniu z detekcją UV-vis do określenia wielkości próbki nieznanej próbki nanocząstek złota.

Streszczenie

Wielkość cząstek jest prawdopodobnie najważniejszym parametrem fizykochemicznym związanym z pojęciem nanocząstki. Precyzyjna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości nanocząstek ma ogromne znaczenie dla różnych zastosowań. Ważny jest również zakres rozmiarów, ponieważ określa on najbardziej "aktywny" składnik dawki nanocząstek.

Frakcjonowanie przepływu asymetrycznego (AF4) to potężna technika wymiarowania cząstek w zawiesinie w zakresie wielkości około 1–1000 nm. Istnieje kilka sposobów uzyskiwania informacji o rozmiarze z eksperymentu AF4. Oprócz sprzężenia AF4 online z detektorami wrażliwymi na rozmiar w oparciu o zasady wielokątowego rozpraszania światła lub dynamicznego rozpraszania światła, istnieje również możliwość skorelowania wielkości próbki z czasem jej retencji przy użyciu ugruntowanego podejścia teoretycznego (teoria FFF) lub poprzez porównanie jej z czasami retencji dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości cząstek (kalibracja wielkości zewnętrznej).

Opisujemy tutaj rozwój i wewnętrzną walidację standardowej procedury operacyjnej (SOP) do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis przy użyciu zewnętrznej kalibracji rozmiaru za pomocą wzorców nanocząstek złota w zakresie wielkości 20-100 nm. Procedura ta zawiera szczegółowy opis opracowanego przepływu pracy, w tym przygotowania próbki, konfiguracji i kwalifikacji przyrządu AF4, opracowania metody AF4 i frakcjonowania nieznanej próbki nanocząstek złota, a także korelacji uzyskanych wyników z ustaloną kalibracją wielkości zewnętrznej. Opisana tutaj procedura SOP została ostatecznie pomyślnie zwalidowana w ramach międzylaboratoryjnego badania porównawczego, podkreślając doskonałą wytrzymałość i niezawodność AF4 do wymiarowania próbek nanocząstek w zawiesinie.

Wprowadzenie

Nanocząstki złota (AuNP) w postaci złota koloidalnego były częścią ludzkiej kultury na długo zanim zaczęto rozumieć, czym są nanocząstki i zanim termin nanocząstka znalazł drogę do współczesnego, naukowego słownictwa. Bez wyraźnej wiedzy na temat ich wyglądu w nanoskali, zawieszony AuNP był już używany do celów medycznych i innych w starożytnych Chinach, Arabii i Indiach w V–VI wieku p.n.e.1, a także starożytni Rzymianie wykorzystali ich rubinowy kolor, aby słynnie zabarwić swoją ceramikę na wystawie Pucharu Likurga w British Museum2. W świecie zachodnim, przez wieki od średniowiecza do ery nowożytnej, zawieszone AuNP były głównie używane jako środki barwiące do szkła i emalii (Purple of Cassius)3, a także do leczenia różnych chorób (Pitable Gold), zwłaszcza syfilis4.

Jednak wszystkie te badania skupiały się głównie na zastosowaniu zawieszonych AuNP i to Michael Faraday w 1857 roku wprowadził pierwsze racjonalne podejście do badania ich powstawania, natury oraz właściwości5. Chociaż Faraday już wtedy zdawał sobie sprawę, że te AuNP muszą mieć bardzo małe wymiary, dopiero rozwój mikroskopii elektronowej sprawił, że jawne informacje o ich rozkładzie wielkości stały się dostępne6,7, co ostatecznie umożliwiło korelację między rozmiarem a innymi właściwościami AuNP.

Obecnie, dzięki dość łatwej i prostej syntezie, niezwykłym właściwościom optycznym (powierzchniowy rezonans plazmonowy), dobrej stabilności chemicznej, a tym samym niewielkiej toksyczności, a także dużej wszechstronności pod względem dostępnych rozmiarów i modyfikacji powierzchni, AuNP znalazły szerokie zastosowanie w dziedzinach takich jak nanoelektronika8, diagnostics9, terapia raka10, czy dostarczanie leków11. Oczywiście, dla tych zastosowań, dokładna wiedza na temat wielkości i rozkładu wielkości zastosowanego AuNP jest podstawowym warunkiem zapewnienia optymalnej skuteczności12 i istnieje duże zapotrzebowanie na solidne i niezawodne narzędzia do określenia tego kluczowego parametru fizykochemicznego. Obecnie istnieje mnóstwo technik analitycznych zdolnych do wymiarowania AuNP w zawiesinie, w tym na przykład spektroskopia UV-vis (UV-vis)13, dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)14 lub spektrometria masowa plazmy sprzężonej indukcyjnie z pojedynczymi cząstkami (spICP-MS)15, przy czym frakcjonowanie przepływu pola (FFF) jest kluczowym graczem w tej dziedzinie16,17,18,19,20.

Po raz pierwszy opracowany w 1966 roku przez J. Calvina Giddingsa21, FFF obejmuje rodzinę technik frakcjonowania opartych na elucji, gdzie separacja odbywa się w cienkim, przypominającym wstęgę kanale bez fazy stacjonarnej22,23. W FFF separacja jest indukowana przez oddziaływanie próbki z zewnętrznym polem siłowym, które działa prostopadle do kierunku przepływu w kanale laminarnym, w którym próbka jest transportowana w dół zwykle w kierunku odpowiednich detektorów in-line. Wśród tych pokrewnych technik FFF, Asymetryczne Frakcjonowanie Pola Przepływu (AF4), w którym drugi przepływ (przepływ krzyżowy) działa jako pole siłowe, stał się najczęściej używanym podtypem24. W AF4 dno kanału (ściana akumulacyjna) jest wyposażone w półprzepuszczalną membranę ultrafiltracyjną, która jest w stanie zatrzymać próbkę, jednocześnie umożliwiając przepływ krzyżowy przez membranę i opuszczenie kanału przez dodatkowy wylot. W ten sposób przepływ krzyżowy może popchnąć próbkę w kierunku ściany akumulacji, przeciwdziałając w ten sposób jej strumieniowi indukowanemu dyfuzją (ruchy Browna). W wynikowej równowadze strumieni wywołanych polem i dyfuzją; Mniejsze składniki próbki wykazujące wyższe współczynniki dyfuzji ustawiają się bliżej środka kanału, podczas gdy większe składniki próbki wykazujące niższe współczynniki dyfuzji znajdują się bliżej ściany akumulacji. Ze względu na paraboliczny profil przepływu wewnątrz kanału, mniejsze składniki próbki są zatem transportowane w szybszych blaszkach przepływu kanału i eluują przed większymi składnikami próbki. Korzystając z parametru retencji FFF i równań współczynnika dyfuzji Stokesa-Einsteina, czas elucji i odpowiednio objętość elucji próbki w AF4 można następnie bezpośrednio przełożyć na jej rozmiar hydrodynamiczny22. Tutaj opisane zachowanie elucji odnosi się do normalnego trybu elucji i jest zwykle ważne dla AF4 w zakresie wielkości cząstek od około 1 do 500 nm (czasami do 2000 nm w zależności od właściwości cząstek i parametrów frakcjonowania), podczas gdy elucja steryczno-hiperwarstwowa zwykle zachodzi powyżej tego progu wielkości25.

Istnieją trzy popularne sposoby uzyskiwania informacji o rozmiarze po rozdzieleniu przez FFF. Ponieważ FFF jest instrumentem modułowym, można go łączyć z wieloma detektorami, takimi jak detektory rozpraszania światła wrażliwe na rozmiar oparte na zasadzie wielokątowego rozpraszania światła (MALS)26,27, Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)28,29, a nawet kombinację obu, aby uzyskać dodatkowe informacje o kształcie30,31. Jednakże, ponieważ zachowanie retencji próbki w kanale FFF jest generalnie regulowane przez dobrze zdefiniowane siły fizyczne, rozmiar można również obliczyć przy użyciu podejścia matematycznego (teoria FFF), gdzie prosty detektor stężenia (np. detektor UV-vis) jest wystarczający do wskazania obecności próbki elucyjnej32,33.

Jako trzecią opcję, tutaj zgłaszamy zastosowanie zewnętrznej kalibracji rozmiaru34,35 przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów AuNP w zakresie wielkości 20–100 nm do wymiarowania nieznanej próbki nanocząstek złota w zawiesinie za pomocą AF4 w połączeniu z detekcją UV-vis. Ta prosta konfiguracja eksperymentalna została wybrana celowo, aby umożliwić jak największej liczbie laboratoriów dołączenie do międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które zostało następnie przeprowadzone w ramach projektu Unii Europejskiej ACEnano w ramach programu Horyzont 2020 w oparciu o przedstawiony tutaj protokół.

Protokół

1. Konfiguracja systemu AF4

  1. Złożyć kartridż AF4 i połączyć wszystkie komponenty sprzętowe systemu AF4 oraz detektora UV-vis (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji obsługi producenta.
  2. Zainstalować wszystkie niezbędne pakiety oprogramowania do sterowania, akwizycji, przetwarzania i ewaluacji danych zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcji obsługi producenta.
  3. Upewnić się, że ustanowiono wszystkie niezbędne połączenia sygnałowe pomiędzy systemem AF4 a detektorem UV-vis.
  4. Upewnić się, że ustanowione połączenia AF4-UV-vis są szczelne i pozbawione wycieków, przepłukując układ wodą ultrapurystyczną (UPW) przez 15 min (przepływ tip flow rate 1 mL∙min-1, przepływ focus flow rate 1 mL∙min-1 oraz przepływ cross flow rate 1.5 mL∙min-1). W tym celu należy otworzyć oprogramowanie sterujące AF4 i wprowadzić wartości przepływów w odpowiednich panelach w prawym górnym rogu strony głównej. W razie potrzeby dokręcić odpowiednie złączki i powtórzyć procedurę, aż do momentu, gdy nie będą widoczne żadne wycieki.
    UWAGA: Wewnętrzne ciśnienie systemu podczas wszystkich pomiarów powinno być monitorowane i musi mieścić się w zakresie od 4 do 12 bar. W przypadku, gdy ciśnienie jest wyższe lub niższe, należy dostosować rurkę przeciwciśnieniową. Ponadto trend ciśnienia w kanale powinien być stały przez cały czas trwania pomiaru.
    UWAGA: Jeśli dostępna jest komora termostatyczna kanału, należy ustawić jej temperaturę na 25 °C, aby zapewnić porównywalne warunki pomiarowe we wszystkich eksperymentach AF4.

2. Przygotowanie roztworów i zawiesin do kwalifikacji systemu AF4-UV-vis oraz analizy próbek

  1. Roztwór czyszczący
    1. Do 1 L UPW dodać 8 g stałego wodorotlenku sodu (NaOH) oraz 2 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i mieszać roztwór do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Eluent
    1. Do 2 L przefiltrowanej i odgazowanej UPW dodać 500 μL przefiltrowanej mieszaniny surfaktantów, aby otrzymać eluent (0.025% (v/v), pH około 9.4).
      UWAGA: Szczegółowy opis składników mieszaniny surfaktantów znajduje się w Tabeli 1 (również w Tabeli materiałów).
  3. Standard AuNP o dowolnej wielkości do oznaczania odzysku masy
    1. Standard AuNP o dowolnej wielkości (50 mg∙L-1) mieszać w vortexie przez 2 min, a następnie rozcieńczyć w UPW w stosunku 1:4, aby uzyskać końcowe stężenie masy 12.5 mg∙L-1. Po rozcieńczeniu mieszać w vortexie przez kolejne 2 min w celu homogenizacji otrzymanej zawiesiny.
      OSTROŻNIE: Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi, zwłaszcza z granulatem NaOH, wymagane jest stosowanie niezbędnych środków ostrożności oraz odpowiedniego sprzętu ochronnego.
      UWAGA: W celu zapewnienia niskiego tła cząstek podczas eksperymentów AF4-UV-vis, ogólnie zaleca się odgazowanie i filtrowanie wszystkich niezbędnych roztworów (z wyjątkiem roztworu czyszczącego) za pomocą filtra membranowego 0.1 µm (hydrofilowy PVDF lub podobny). Można to przeprowadzić za pomocą dedykowanej jednostki do filtracji próżniowej lub filtrów strzykawkowych.

3. Kwalifikacja systemu AF4-UV-vis

  1. Przy zastosowaniu ustawień oprogramowania opisanych w kroku 1.4 należy przepłukać system roztworem czyszczącym przez 30 min (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1).
  2. Należy zmienić odpowiednią butelkę z eluentem i przepłukać system wodą UPW przez 20 min (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1).
  3. Należy wymienić odpowiednie filtry pomp liniowych.
  4. Należy otworzyć kartridż AF4 i wymienić membranę AF4. Następnie należy złożyć kartridż AF4 i ponownie podłączyć go do systemu AF4-UV-vis.
  5. Oczyszczony system AF4-UV-vis należy przepłukać eluentem przez co najmniej 30 min w celu równoważenia membrany i stabilizacji systemu (przepływ Tip 1 mL∙min-1, przepływ Focus 1 mL∙min-1 oraz przepływ Cross 1.5 mL∙min-1). Należy ponownie sprawdzić system pod kątem potencjalnych wycieków (patrz krok 1.4).
  6. Należy przeprowadzić kwalifikację systemu AF4-UV-vis poprzez wyznaczenie odzysku masy oraz zmienności czasu retencji przy użyciu dowolnego wzorca wielkości AuNP.
    1. Należy przeprowadzić pomiar z bezpośrednim wtryskiem bez przyłożenia siły separacji.
      1. W oprogramowaniu sterującym AF4 należy utworzyć nowy plik pomiarowy, wybierając File | New | Run.
      2. W karcie Run należy zdefiniować opis próbki i pomiaru, a także objętość wtrysku i nazwę próbki. Warunki pomiarowe przedstawiono w Tabeli 2.
      3. W drugiej karcie FFF method należy ustawić parametry pomiarowe zgodnie z Tabelą 2.
      4. Należy kliknąć przycisk Run, aby rozpocząć pomiar.
    2. Należy przeprowadzić pomiar frakcjonowania z przyłożeniem siły separacji (przepływ Cross).
      1. Metodę frakcjonowania należy zdefiniować zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, stosując warunki frakcjonowania określone w Tabeli 3.
      2. Należy kliknąć przycisk Run, aby rozpocząć pomiar.
      3. Pomiar należy wykonać w czterech powtórzeniach.
        UWAGA: Pierwszy pomiar służy kondycjonowaniu systemu (tj. membrany AF4) i zostanie wykluczony z końcowej oceny wyników kwalifikacji systemu.
        UWAGA: Zaleca się zapisywanie wszystkich wygenerowanych plików pomiarowych poprzez wybór File | Save w oprogramowaniu sterującym AF4.
      4. System AF4-UV-vis uznaje się za zakwalifikowany, jeśli dla wybranego wzorca wielkości AuNP uzyskano odzysk masy >80% oraz zmienność czasu retencji <2%.
      5. W przypadku stosowania autosamplera jako systemu wtryskowego, należy napełnić butelkę z roztworem do mycia igły autosamplera tym samym roztworem, który jest pompowany przez system AF4-UV-vis (np. roztworem czyszczącym, wodą UPW lub odpowiednim eluentem), aby zapewnić optymalne warunki pomiaru. Przy zmianie eluentu zazwyczaj zaleca się monitorowanie sygnału detektora UV-vis aż do momentu stabilizacji linii bazowej na stałym poziomie, co potwierdzi ponowne równoważenie systemu AF4.

4. Analiza próbek metodą AF4-UV-vis

  1. Przygotować wszystkie wzorce wielkości AuNP do zewnętrznej kalibracji wielkości poprzez mieszanie w wirówce (vortex) odpowiedniej zawiesiny AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, każda 50 mg∙L-1) przez 2 min, a następnie rozcieńczyć ją w stosunku 1:4 wodą UPW, aby uzyskać końcowe stężenie masowe 12,5 mg∙L-1. Po rozcieńczeniu mieszać w wirówce przez kolejne 2 min w celu homogenizacji uzyskanych zawiesin.
  2. Przygotować nieznaną próbkę AuNP do analizy, stosując tę samą procedurę, co w przypadku wzorców kalibracyjnych opisanych w kroku 4.1.
  3. Wykonać pomiar z bezpośrednim wtryskiem wszystkich wzorców wielkości AuNP, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 2.
    1. W tym celu wprowadzić odpowiednie wartości podsumowane w Tabeli 2 w odpowiednie miejsca w oprogramowaniu producenta, aby zdefiniować parametry rozdziału i próbki, a następnie nacisnąć przycisk Run, aby rozpocząć eksperyment.
  4. Przeprowadzić frakcjonowanie każdego wzorca wielkości AuNP z osobna, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 3, w celu ustalenia funkcji zewnętrznej kalibracji wielkości.
    1. Wprowadzić odpowiednie wartości podsumowane w Tabeli 3 w odpowiednie miejsca w oprogramowaniu producenta. Metoda frakcjonowania składa się z etapu ogniskowania, kilku etapów elucji oraz etapu płukania. Po skonfigurowaniu metody nacisnąć przycisk Run, aby rozpocząć eksperyment.
  5. Wykonać pomiar z bezpośrednim wtryskiem nieznanej próbki AuNP, stosując metodę AF4 przedstawioną w Tabeli 2.
  6. Przeprowadzić frakcjonowanie nieznanej próbki AuNP, wykonując metodę AF4 wymienioną w Tabeli 3.
  7. Wszystkie pomiary wspomniane w Sekcji 3 i 4 przeprowadzić w trzech powtórzeniach, chyba że zaznaczono inaczej, aby zapewnić wiarygodne i istotne statystycznie wyniki.
    1. Przechowywać zawiesiny AuNP o stężeniu 50 mg∙L-1 w temperaturze 4–8 °C przed użyciem. Rozcieńczone zawiesiny AuNP najlepiej przygotować w ciągu 30 min przed zastosowaniem.
      UWAGA: Mieszanie w wirówce jest zazwyczaj wystarczające i nie ma potrzeby przeprowadzania sonikacji zawiesin.
    2. Aby umożliwić korelację czasu retencji nieznanej próbki AuNP z czasami retencji uzyskanymi dla wzorców wielkości AuNP, wszystkie próbki należy mierzyć przy użyciu tej samej metody AF4.
      UWAGA: Aby zapewnić stałe i prawidłowe warunki rozdziału, należy dołączyć/powtórzyć etap frakcjonowania opisany w sekcji kwalifikacji systemu (patrz krok 3.6.2) po określonej liczbie pomiarów próbek (np. 10 pomiarów). Dodatkowo należy rejestrować ciśnienie systemu i stabilność linii bazowej detektora UV-vis. Powinny one pozostać stabilne i stałe podczas całego cyklu AF4-UV-vis.
      UWAGA: Zazwyczaj należy wymienić membranę ultrafiltracyjną, gdy detektor UV-vis (lub detektor wielokątowego rozpraszania światła (MALS), jeśli jest dostępny) wykazuje zwiększony poziom szumów lub gdy nie są spełnione określone kryteria kwalifikacji systemu, takie jak odzysk, kształt piku próbki lub powtarzalność (lub gdy system AF4-UV-vis został poddany dokładnej procedurze czyszczenia). W opisanych tutaj warunkach zakwalifikowany system AF4-UV-vis jest zazwyczaj stabilny przez co najmniej 50 pomiarów przy użyciu tej samej membrany; jednak liczba możliwych kolejnych pomiarów spełniających określone kryteria jakości może się znacznie różnić w zależności od próbki, matrycy próbki i składu eluentu.

5. Ocena danych

  1. Oblicz odzysk masy, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4-UV-vis lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (tj. powierzchni piku UV-vis) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta.
    1. Oblicz odzysk masy AuNP, porównując powierzchnie pod odpowiednimi pikami UV-vis pomiaru frakcjonowania (Afractionation) i pomiaru bezpośredniego wtrysku (Adirect injection) przy użyciu następującego równania:
      Wzór na obliczenie odzysku, recovery % = (A_f/A_d) x 100, schemat równania, metoda analityczna.
      UWAGA: Podczas pomiaru bezpośredniego wtrysku nie jest przykładana żadna siła separacyjna, w związku z czym można pominąć potencjalne oddziaływania gatunków analitu ze ścianką akumulacji. Powierzchnię pod odpowiednim pikiem UV-vis można bezpośrednio skorelować z masą AuNP, stosując prawo Beer-Lamberta, przy założeniu, że żadne inne gatunki w próbce nie absorbują przy danej długości fali i/lub i) eluuą w innym czasie retencji w warunkach frakcjonowania, ii) są usuwane przez membranę AF4.
    2. Zaimportuj pliki .dat uzyskane z obu przebiegów: bezpośredniego wtrysku oraz frakcjonowania.
    3. Wybierz ślad detektora UV-vis w karcie Overview.
    4. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) oraz linię bazową w widoku sygnału i linii bazowej dla wszystkich pomiarów.
    5. Wstaw Direct Injection Calibration za pomocą opcji Insert.
    6. Wybierz wszystkie przebiegi bezpośredniego wtrysku w widoku Direct Injection Calibration Settings i wprowadź współczynnik ekstynkcji UV.
      UWAGA: Ważne jest użycie tego samego współczynnika ekstynkcji UV-vis zarówno dla kalibracji, jak i dla pomiaru frakcjonowania.
    7. Ustal linię kalibracyjną, wykorzystując powierzchnię pod śladem sygnału UV-vis w obszarze ROI oraz ilość wstrzykniętą, obliczoną z wprowadzonego stężenia i objętości wtrysku. Uzyskana kalibracja zostanie wyświetlona w osobnym oknie Direct Injection Calibration Function.
    8. Przypisz funkcję kalibracyjną do odpowiednich pomiarów frakcjonowania.
      UWAGA: Dla każdego standardu wielkości kalibracyjnej oraz dla nieznanej próbki AuNP należy ustanowić osobną funkcję kalibracyjną ze względu na zależność absorbancji UV-vis AuNP od wielkości. Tą wadą detektora UV-vis można uniknąć, stosując detektor czuły na masę, taki jak ICP-MS.
    9. Wykonaj analizy, wstawiając obliczenia Quantitative Results; wyniki zostaną wyświetlone w tabeli po prawej stronie jako wartości stężenia i ilości wstrzykniętej.
  2. Oblicz zmienność czasu retencji, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta systemu AF4 lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (tj. czasów retencji standardów kalibracyjnych AuNP w odpowiednich maksimach piku UV-vis oraz odpowiednich czasów martwych) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta.
    1. Otwórz okno Overview, aby wyświetlić odpowiednie ślady UV dla wszystkich zaimportowanych pomiarów.
    2. Detekcja piku zostanie wykonana automatycznie; dostosuj parametry detekcji piku w narzędziach przetwarzania sygnału, aby zoptymalizować wydajność. Wyodrębnij odpowiednie maksima piku, przeglądając wszystkie pliki pomiarowe.
    3. Oblicz względne odchylenie standardowe dla wszystkich pomiarów przy użyciu następującego równania:
      Równanie względnego odchylenia standardowego; analiza statystyczna; wzór na zmienność danych; obliczanie RSD.
      Obliczenia można również wykonać za pomocą odpowiedniego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.
  3. Wykonaj oznaczenie wielkości, korzystając z oprogramowania do oceny danych dostarczonego przez producenta lub poprzez analizę w arkuszu kalkulacyjnym po eksporcie wszystkich niezbędnych danych surowych (czas retencji w maksimum piku UV-vis analitu oraz odpowiedni czas martwy) z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji danych, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi producenta. Zewnętrzną funkcję kalibracji wielkości można ustanowić, wykreślając czasy retencji skorygowane o czas martwy (netto czasy retencji, patrz Tabela 5) standardów wielkości AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) w funkcji ich wielkości hydrodynamicznej uzyskanej z wcześniej wykonanych pomiarów DLS (patrz Tabela 4).
    UWAGA: Pomiary DLS powinny być idealnie przeprowadzone w tym samym dniu, co odpowiednie pomiary frakcjonowania, aby zapewnić porównywalne właściwości próbek.
    1. Po zaimportowaniu plików .dat wszystkie pomiary są wyświetlane w karcie Overview. Z listy detektorów wyświetlanej poniżej okna nakładania wybierz sygnał detektora UV-vis. Zdefiniuj ROI i linię bazową dla każdego pomiaru, które można dostosować w widoku Signal and Baseline. Użyj narzędzi Signal processing po prawej stronie, aby wygładzić zaszumione sygnały. Użyj funkcji Assign Processing Parameters to other Runs, aby przypisać parametry do innych pomiarów lub sygnałów.
    2. Wybierz Particle Size Calibration z karty Insert.
    3. Wybierz wszystkie przebiegi kalibracyjne, klikając w odpowiedni pomiar w tabeli Select References for Calibration w prawym górnym rogu. Wszystkie wybrane pomiary zostaną wyświetlone w tabeli poniżej. Wprowadź promień hydrodynamiczny dla wszystkich pomiarów kalibracyjnych określonych w Tabeli 4. Funkcja zostanie wyświetlona w oknie Particle size calibration – Function, a wyświetlone zostanie również równanie.
      UWAGA: Współczynnik korelacji (R2) ustanowionej funkcji kalibracji wielkości musi wynosić ≥0,990.
    4. Przypisz funkcję kalibracyjną do pomiarów nieznanej próbki AuNP, wybierając odpowiednie frakcjonowania z listy Select Runs for Assignment.
    5. Wyświetl wyniki, otwierając obliczenia particle size distribution w karcie insert. Wcześniej utworzona kalibracja wielkości cząstek zostanie wymieniona jako Calibration dla pomiarów nieznanej próbki AuNP, co jest wyświetlane w prawym oknie settings. Obliczona wielkość zostanie pokazana w oknie size distribution window z etykietą w maksimum piku. Zaznacz pole wyboru Average Signals for Sample, aby uśrednić wszystkie pomiary jednej próbki i wypisać wynik w etykiecie maksimum piku.
    6. Dodatkowo wykreśl linię kalibracyjną nad fraktogramem, zaznaczając pole wyboru Show calibration curve. Kumulatywny rozkład wielkości jest dostępny po zaznaczeniu pola wyboru Show cumulative distribution.
      UWAGA: Przy użyciu oprogramowania producenta do oceny danych zaleca się dodanie wszystkich wyników do raportu, który można wygenerować, klikając Report w karcie Insert. Przycisk Report dodaje wszystkie wyniki, tabele i diagramy do dokumentu. W karcie Report ustawienia raportu można zmienić, otwierając Report setup w sekcji Document.

Wyniki

W pierwszej kolejności standardy wielkości AuNP poddano frakcjonowaniu za pomocą AF4, a następnie wykryto je metodą UV-vis, mierząc absorbancję AuNP przy długości fali 532 nm (powierzchniowy rezonans plazmonowy AuNP). Nałożenie uzyskanych fraktogramów przedstawiono w Rysunek 1Czasy retencji każdej AuNP przy odpowiadającym jej maksimum piku w widmie UV-vis, uzyskane z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach, wymieniono w Tabela 5Względne odchylenie standardowe wszystkich czasów retencji było mniejsze niż 1,1%, przy czym wariancja pomiaru malała wraz ze wzrostem rozmiaru. Ogólnie osiągnięto doskonałą powtarzalność. Zastosowano stałą siłę separacji, co zaowocowało liniową zależnością między czasem elucji a rozmiarem hydrodynamicznym. Zewnętrzną krzywą kalibracji rozmiaru wyznaczono poprzez naniesienie określonego promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu elucji skorygowanego o czas martwy (netto czasu retencji). Analiza regresji liniowej pozwoliła na wyznaczenie liniowej funkcji kalibracyjnej z wyrazem wolnym a = -3,373 nm ± 1,716 nm oraz nachyleniem b = 1,209 nm∙min-1 ± 0,055 nm∙min-1Liniowość procesu elucji została potwierdzona za pomocą współczynnika korelacji R²2 wynoszącej 0,9958. Odpowiednia funkcja kalibracyjna jest przedstawiona graficznie w Rycina 2.

Druga część dotyczyła analizy nieznanej próbki AuNP. Trzy alikwoty próbki przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w sekcji protokołu (sekcja 4.2). Każdy z trzech alikwotów badano w trzech powtórzeniach, stosując tę samą metodę frakcjonowania AF4, która została zastosowana dla wzorców wielkości AuNP. Wszystkie dziewięć fraktogramów AF4-UV-vis uzyskanych dla nieznanej próbki AuNP przedstawiono na Rysunku 3, a ich odpowiednie oceny podsumowano w Tabeli 6>. Względne odchylenie standardowe odpowiednich czasów retencji było znacząco niskie i mieściło się w przedziale od 0,1% do 0,5%. Wykorzystując funkcję kalibracji wielkości cząstek uzyskaną z frakcjonowania wzorców wielkości AuNP i korelując ją z uzyskanymi czasami retencji nieznanej próbki AuNP w maksimum piku UV-vis, obliczono ogólną średnią promień hydrodynamiczny wynoszący 29,4 nm ± 0,2 nm. Ponadto uzyskano zadowalający odzysk masy na poziomie 83,1% ± 1,2%, co wskazuje na brak istotnej aglomeracji lub rozpuszczania się próbki AuNP oraz brak znacznej adsorpcji cząstek na powierzchni membrany. Rysunek 4 przedstawia uzyskany rozkład wielkości cząstek z uśrednionymi wszystkimi dziewięcioma śladami sygnału UV-vis, co podkreśla doskonałą powtarzalność zastosowanej metody AF4.

Wykres chromatografii wykluczania; znormalizowany sygnał UV-vis % w funkcji czasu, przedstawiający rozdział białek.
Rycina 1: Fraktogramy AF4-UV-vis uzyskane z analizy trzech powtórzeń czterech indywidualnych wzorców kalibracyjnych wielkości AuNP z znormalizowaną intensywnością sygnału i zastosowaną stałą szybkością przepływu krzyżowego (linia czarna). Piki martwej objętości zaznaczono na szaro w okolicy 5,9 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu; analiza danych dyfuzji; dopasowanie liniowe; wyznaczanie rozmiaru cząstek.
Rysunek 2: Uzyskana funkcja zewnętrznej kalibracji rozmiaru, zawierająca słupki błędów wyznaczone na podstawie odpowiednich odchyleń standardowych pomiarów DLS (Tabela 4) oraz wariancji uzyskanych czasów retencji AF4 (Tabela 5), po naniesieniu określonego promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu retencji każdego poszczególnego standardu kalibracji rozmiaru AuNP w maksimum jego piku. Na podstawie analizy regresji liniowej obliczono liniową funkcję kalibracyjną z błędami standardowymi w formie y = a + bx, gdzie a = -3,373 nm ± 1,716 nm oraz b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1. Wyznaczono współczynnik korelacji R2 = 0,9958, co wskazuje na liniową zależność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatografii UV-vis, pik martwy, ocena metody, analiza spektralna rozdziału związków.
Rysunek 3: Fraktogramy AF4-UV-vis z pomiarów trzykrotnych trzech alikwotów zawierających nieznane AuNP. Zastosowana stała szybkość przepływu poprzecznego w czasie pomiaru przedstawiono czarną linią. Pik martwy w okolicach 5,9 min zaznaczono kolorem szarym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres rozkładu promienia hydrodynamicznego; krzywa rozkładu różnicowego w funkcji czasu, skala nm.
Rycina 4: Nałożenie uzyskanego średniego rozkładu wielkości cząstek (kolor czerwony) dla nieznanej próbki AuNP oraz zastosowanej liniowej funkcji kalibracyjnej (linia przerywana). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

KomponentNr CASWaga (%)
Woda7732-18-588.8
Kwas 9-oktadecenowy (Z)-, związek z 2,2',2''-nitrilotris[etanolem](1:1)2717-15-93.8
Węglan sodu497-19-82.7
Alkohole, C12-14, wtórne, etoksylowane84133-50-61.8
Tetrasodowy EDTA64-02-81.4
Glikol polietylenowy25322-68-30.9
Oleinian sodu143-19-10.5
Wodorowęglan sodu144-55-80.1

Tabela 1: Lista składników mieszaniny surfaktantów użytej do przygotowania eluentu (patrz również Tabela materiałów).

Parametry AF4-UV-visJednostkaWartość
Grubość dystanseraµm350
Przepływ detektoramL min-10.5
Przepływ krzyżowymL min-10 (stały przez 8 min)
Przepływ ogniskującymL min-10
Czas opóźnienia / czas stabilizacjimin0
Przepływ wtryskumL min-10.5
Czas przejściamin0
Czas wtryskumin0.1
Krok elucjimin8
Czas kroku płukaniamin0.1
Przepływ kroku płukaniamL min-10.1
Objętość wtryskuµL10
Stężenie próbkimg L-112.5
Typ membranyCeluloza regenerowana
Próg odcięcia masy cząsteczkowej membranykDa10
Eluent0.025% (v/v) mieszanina surfaktantów
Długość fali UV-visnm532
Czułość UV-vis-0.001

Tabela 2: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis w celu przeprowadzenia pomiaru z bezpośrednim wtryskiem bez zastosowania siły separacji.

Parametry AF4-UV-visJednostkaWartość
Grubość dystanseraµm350
Przepływ detektoramL min-10,5
Przepływ krzyżowymL min-11 (60 min stały, 10 min liniowy)
Przepływ ogniskującymL min-11,3
Czas opóźnienia / czas stabilizacjimin2
Przepływ wstrzykiwaniamL min-10,2
Czas przejściamin0,2
Czas wstrzykiwaniamin5
Krok elucjimin70 (60 min stały, 10 min liniowy)
Krok płukaniamin9
Przepływ w kroku płukaniamL min-10,5
Objętość wstrzykiwaniaµL50
Stężenie próbkimg L-112,5
Typ membranyRegenerowana celuloza
Próg odcięcia masy cząsteczkowej membranykDa10
Eluent0,025% (v/v) mieszanina surfaktantów
Długość fali UV-visnm532
Czułość UV-vis-0,001

Tabela 3: Podsumowanie parametrów metody frakcjonowania AF4-UV-vis w celu przeprowadzenia procesu frakcjonowania z zastosowaniem przepływu krzyżowego jako siły separacji.

Wzorzec kalibracyjnyŚrodek stabilizującyŚrednia wielkość (TEM) (nm)CV (średnia wielkość TEM) (%)Potencjał zeta (mV)SD (potencjał zeta) (mV)Promień hydrodynamiczny (DLS) (nm)SD (promień hydrodynamiczny) (nm)PDISD (PDI)
AuNP 20 nmCytrynian20.1≤ 8-48.91.510.950.120.0820.009
AuNP 40 nmCytrynian40.8≤ 8-30.41.020.300.130.1270.006
AuNP 80 nmCytrynian79.2≤ 8-51.51.338.850.230.1380.013
AuNP 100 nmCytrynian102.2≤ 8-50.90.952.300.370.0780.009

Tabela 4: Podsumowanie parametrów fizykochemicznych zastosowanych wzorców kalibracyjnych AuNP, w tym czynnika stabilizującego, średniej wielkości w TEM, potencjału Zeta wyznaczonego w zawiesinie natywnej, a także promienia hydrodynamicznego DLS i indeksu polidyspersyjności (PDI) wyznaczonego w eluencie.

Wzorzec kalibracyjnyPomiarCzas retencji w maksimum piku (min)Netto czas retencji w maksimum piku (min)Średni netto czas retencji (min)SD (%) (netto czas retencji)SD (min) (netto czas retencji)
AuNP 20 nm117.36811.46811.561.020.12
217.40911.509
317.58911.689
AuNP 40 nm125.31619.41619.490.680.13
225.3219.42
325.54819.648
AuNP 80 nm142.09536.19536.290.230.08
242.21936.319
342.25736.357
AuNP 100 nm150.97545.07545.060.070.03
250.92445.024
350.98645.086

Tabela 5: Czasy retencji wzorców kalibracyjnych AuNP w odpowiednich maksimach piku UV-Vis, wyznaczone z odpowiednich fraktogramów AF4-UV-vis przy użyciu metody opisanej w Tabeli 3.

AlikwotPomiarCzas retencji maksimum piku (min)Średni czas retencji maksimum piku (min)Właściwy czas retencji maksimum piku (min)SD (%) czasu retencjiPromień hydrodynamiczny (nm)Odzysk (%)
1132.68932.7026.7890.0729.0385.34
232.68726.787
332.71926.819
2132.98933.0827.0890.3729.4981.73
233.07327.173
333.18727.287
3133.05333.1427.1530.4929.5682.14
233.07127.171
333.29127.391

Tabela 6: Podsumowanie czasów retencji przy odpowiednich maksimach piku UV-Vis, promienia hydrodynamicznego obliczonego z zewnętrznej kalibracji wielkości (Rysunek 2) oraz stopnia odzysku nieznanej próbki AuNP uzyskanych z analizy AF4-UV-vis.

Dyskusja

Rozmiar hydrodynamiczny nieznanego AuNP został dokładnie oceniony za pomocą AF4 sprzężonego z detektorem UV-vis przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów wielkości AuNP w zakresie od 20 nm do 100 nm. Opracowana metoda AF4 została zoptymalizowana przy użyciu stałego profilu przepływu krzyżowego w celu ustalenia liniowej zależności między zmierzonym czasem retencji a rozmiarem AuNP, umożliwiając w ten sposób proste określenie wielkości na podstawie analizy regresji liniowej. Szczególny nacisk położono również na osiągnięcie wystarczająco wysokich wskaźników odzysku, które wskazują na brak znacznych strat próbki podczas frakcjonowania, oraz na to, aby opracowana metoda AF4, obejmująca zastosowany eluent i membranę, dobrze pasowała do wszystkich frakcjonowanych próbek AuNP.

Opracowanie metody jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem w AF4 i kilka parametrów, w tym wymiary kanału, parametry przepływu, a także eluent, membrana, wysokość przekładki, a nawet właściwości próbki, muszą być brane pod uwagę, aby poprawić frakcjonowanie w danym oknie czasowym elucji. Celem tego akapitu jest przeprowadzenie czytelnika przez krytyczne kroki, które zostały zoptymalizowane w celu pomyślnego określenia wielkości omawianej tutaj nieznanej próbki AuNP. Bardziej szczegółowy opis tego, jak ogólnie opracować metodę AF4, odsyłam czytelnika do sekcji AF4 w dokumencie "ISO/TS21362:2018 – Nanotechnologie – Analiza nanoobiektów z wykorzystaniem asymetrycznego przepływu i frakcjonowania w polu odśrodkowym"25. Po bliższym przyjrzeniu się zastosowanym warunkom frakcjonowania podanym w tabeli 3, pierwszym krytycznym krokiem jest wprowadzenie i rozluźnienie próbki AuNP w kanale AF4. Ten etap jest regulowany przez przepływ iniekcji, przepływ skupienia i przepływ krzyżowy, których wzajemne oddziaływanie zmusza próbkę do umieszczenia blisko powierzchni membrany i skoncentrowania jej w wąskim paśmie w pobliżu portu iniekcyjnego kanału AF4, zasadniczo określając punkt początkowy frakcjonowania. Konieczne jest odpowiednie rozluźnienie próbki, ponieważ na tym etapie składniki próbki o różnych rozmiarach znajdują się na różnych wysokościach kanału AF4, zapewniając w ten sposób podstawę do udanego frakcjonowania według wielkości. Niepełna relaksacja próbki jest zwykle widoczna jako zwiększona powierzchnia piku pustki wynikająca z niezatrzymanych (tj. niezrelaksowanych) składników próbki. Efekt ten można złagodzić poprzez wydłużenie czasu iniekcji i/lub zastosowanego natężenia przepływu krzyżowego. Oba parametry wymagają jednak starannej optymalizacji, szczególnie w przypadku próbek, które są podatne na aglomerację i adsorpcję na membranie AF4 i mogą być monitorowane za pomocą odpowiednich współczynników odzysku uzyskanych dla różnych ustawień parametrów36,37. Zastosowany czas iniekcji wynoszący 5 minut wraz z natężeniem przepływu krzyżowego 1,0 mL∙min-1 ujawnił wskaźniki odzysku >80% dla wszystkich próbek AuNP i znikomą powierzchnię piku pustego, co wskazuje na bliskie optymalnym warunkom relaksacji. Po wystarczającym rozluźnieniu próbki AuNP zatrzymano przepływ ogniskowania i zainicjowano transport próbki wzdłuż długości kanału AF4 do odpowiedniego detektora UV-vis, co stanowiło drugi krytyczny krok. W celu zapewnienia wystarczająco wysokiej mocy frakcjonowania w rozsądnych czasach analiz zastosowano stałe natężenie przepływu krzyżowego 1,0 ml∙min-1 przez 30–50 minut (w zależności od odpowiedniego wzorca frakcjonowanego rozmiaru AuNP), a następnie 10-minutowy liniowy zanik przepływu krzyżowego przy natężeniu przepływu detektora 0,5 mL.min-1. Zastosowanie stałego profilu przepływu krzyżowego w poprzek separacji wszystkich wzorców wielkości AuNP ujawniło liniową zależność między czasem retencji a rozmiarem AuNP zgodnie z teorią FFF22, umożliwiając w ten sposób określenie wielkości nieznanej próbki AuNP za pomocą prostej analizy regresji liniowej. Jednak profile inne niż stały przepływ krzyżowy zostały również wykorzystane do wymiarowania nanocząstek, co ostatecznie doprowadziło do nieliniowej zależności między czasem retencji a wielkością cząstek38,39. Ponadto oznaczanie wielkości w AF4 przy użyciu dobrze zdefiniowanych wzorców wielkości nie ogranicza się do AuNP, ale może być również stosowane do nanocząstek o innych rozmiarach i składzie pierwiastkowym (np. nanocząstki srebra38,40 lub krzemionki41,42). Ponadto, podczas pracy z rozcieńczonymi próbkami, ICP-MS jest bardzo czułym detektorem elementarnym, który może być sprzężony z AF4, co zwiększa wszechstronność tego podejścia analitycznego do wymiarowania dużej różnorodności nanocząstek w zawiesinie.

Pomimo szerokiego zastosowania, zewnętrzna kalibracja rozmiaru przy użyciu dobrze zdefiniowanych standardów rozmiaru w AF4 ma pewne cechy szczególne, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z niego w celu dokładnego wymiarowania nieznanych próbek. Przede wszystkim w dużym stopniu opiera się na zastosowaniu porównywalnych warunków podczas frakcjonowania odpowiednich wzorców wielkości i rzeczywistej próbki. W przedstawionym tutaj przypadku obowiązkowe jest zatem, aby zarówno wzorce wielkości AuNP, jak i nieznana próbka AuNP były frakcjonowane przy użyciu tej samej metody AF4, a także tego samego eluentu i tej samej membrany, co sprawia, że podejście to jest dość mało elastyczne. Ponadto, nie mając pod ręką detektorów wrażliwych na rozmiar, np. rozpraszania światła (MALS i DLS), trudno jest określić, czy dana metoda AF4 wykorzystująca wzorce wielkości działa wystarczająco dobrze, czy nie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku nieznanych próbek, które wykazują bardzo szeroki rozkład wielkości, gdzie nie jest jasne, czy wszystkie składniki próbki przebiegają zgodnie z normalnym wzorcem elucji: frakcjonowanie od mniejszych do większych cząstek, czy też większe składniki próbki już eluują w trybie steryczno-hiperwarstwowym, co może potencjalnie koeluować z mniejszymi składnikami próbki43,44. Ponadto, mimo że teoria FFF podkreśla, że AF4 rozdziela się wyłącznie na podstawie różnic w rozmiarach hydrodynamicznych, przy czym cząstki są uważane za masy punktowe bez żadnych interakcji z ich otoczeniem22, rzeczywistość mówi co innego, ponieważ oddziaływania cząstka-cząstka i cząstka-membrana (takie jak przyciąganie/odpychanie elektrostatyczne lub przyciąganie van-der-Waalsa) mogą odgrywać znaczącą rolę i mogą potencjalnie wprowadzać mierzalne odchylenie do określania wielkości za pomocą zewnętrznych Kalibracja rozmiaru45,46. W związku z tym zaleca się stosowanie wzorców wielkości, które idealnie pasują do składu i właściwości powierzchniowych (potencjał Zeta) cząstki będącej przedmiotem zainteresowania40,42 lub, jeśli nie są one dostępne, przynajmniej stosowanie dobrze scharakteryzowanych wzorców wielkości cząstek (np. cząstki polistyrenu lateksowego) i staranną ocenę ich porównywalności z cząstką będącą przedmiotem zainteresowania, zwłaszcza pod względem ich powierzchniowego potencjału Zeta w danym środowisku, w którym przeprowadza się analizę41,47.

Wszechstronność AF4 jest często uważana za jego największą zaletę, ponieważ oferuje zakres zastosowań, który wykracza poza większość innych popularnych technik wymiarowania w tej dziedzinie 22,48,49. Jednocześnie, ze względu na związaną z tym przypuszczalną złożoność, może być również uważany za jego najważniejszą wadę, zwłaszcza w przypadku szybkich i pozornie łatwych w użyciu technik wymiarowania, takich jak DLS, Nanoparticle Tracking Analysis lub ICP-MS dla pojedynczych cząstek. Niemniej jednak, gdy spojrzymy na AF4 z perspektywy tych popularnych technik wymiarowania, staje się jasne, że wszystkie techniki mają swoje wady i zalety, ale wszystkie z nich przyczyniają się do bardziej wszechstronnego zrozumienia fizykochemicznej natury nanocząstek i dlatego powinny być uważane za komplementarne, a nie konkurencyjne.

Przedstawiona tutaj standardowa procedura operacyjna (SOP) podkreśla doskonałą przydatność AF4-UV-vis z zewnętrzną kalibracją wielkości do wymiarowania nieznanej próbki AuNP w zawiesinie i ostatecznie została zastosowana jako zalecana wytyczna do analizy AF4 nieznanej próbki AuNP w ramach międzynarodowego porównania międzylaboratoryjnego (ILC), które przeprowadzono w ramach projektu Horyzont 2020. ACEnano (wyniki tego ILC będą przedmiotem przyszłej publikacji). Protokół ten wpisuje się zatem w zachęcające i trwające międzynarodowe wysiłki na rzecz walidacji i standaryzacji metodologii AF4 25,50,51,52, podkreślając obiecujący potencjał AF4 w dziedzinie charakteryzacji nanocząstek.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy tego manuskryptu są pracownikami firmy Postnova Analytics GmbH, której produkty są wykorzystywane w tym protokole.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować całemu konsorcjum ACEnano za owocne dyskusje na wszystkich etapach przygotowania przedstawionego tutaj protokołu. Autorzy doceniają również dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020) w ramach umowy o grant nr 720952 w ramach projektu ACEnano.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m Filtry membranowe (hydrofilowe PVDF)Postnova Analytics GmbHZ-FIL-TEF-002Służy do filtracji roztworów wodnych
0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy PVDF (d = 33 mm)Merck MilliporeDurapore MillexSłuży do filtracji pipet o regulowanej objętości NovaChem100
(1000 µ L)Eppendorf AGResearch PlusSłuży do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP
Kartridż AF4Postnova Analytics GmbHAF2000 MF - Kanał analityczny AF4Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako AF4-system
AF4 Membrana - Regenerowana celuloza (10 kDa MWCO)Postnova Analytics GmbHZ-AF4-MEM-612-10KDElement zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4
Waga analityczna (dokładność 0,1 mg)SartoriusENTRIS124I-1SSłuży do ważenia granulek SDS i NaOH do przygotowania roztworu czyszczącego
Automatyczny podajnik próbekPostnova Analytics GmbHPN5300Element zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Piece kanałowejPostnova Analytics GmbHPN4020Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie jest opisany jako system AF4
Moduł CrossflowPostnova Analytics GmbHAF2000 MF Moduł sterującyAF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Jednorazowe końcówki do pipet (1000 µ L)Eppendorf AGep T.I.P.SSłuży do przygotowania rozcieńczonych zawiesin AuNP
Kolby (np. o objętości 2 litrów)neoLab1-0199Używany do przechowywania eluentu
Pompa ostrościPostnova Analytics GmbHPN1131Składnik zestawu AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Szklane fiolki (np. objętość 1,5 ml)Postnova Analytics GmbHVIA-002Służy do przechowywania próbek
Złote wzorce wielkości nanocząstek (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)Postnova Analytics GmbHNovaCal Gold50 mg L-1 każdy, służy do ustalenia funkcji kalibracji wielkości
Mieszadło magnetyczneIKAVIBRAX-VXRSłuży do przyspieszania rozpuszczania granulek SDS i NaOH w komputerze
osobistym (PC)Technologies/Jednostka do sterowania przebiegami AF4, nagrywania i oceny zebranych danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000
Środki ochrony indywidualnej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary itp.)//Zgodnie z odpowiednim laboratorium" s zasady bezpieczeństwa pracy z chemikaliami, w tym z nanomateriałami inżynieryjnymi
Zakrętka do szklanych fiolek (np. o objętości 1,5 ml)Postnova Analytics GmbHZ-VIA-09150868Służy do przechowywania próbek
Dodecylosiarczan sodu (SDS), ≥ 99 %, Klasa bibułyCarl Roth GmbH & Co KG2326.1Stosowany do przygotowania roztworu czyszczącego
Granulki wodorotlenku sodu (NaOH), ≥ 98 %, p.aCarl Roth GmbH & Co KG6771.1Służy do przygotowania roztworu czyszczącego
Pakiet oprogramowania do sterowania i akwizycji danychPostnova Analytics GmbHNovaFFF AF2000 OprogramowanieOprogramowanie do wykonywania przebiegów Af4 i akwizycji danych, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytnik jest odsyłany do instrukcji Postnova AF2000
Pakiet oprogramowania do oceny danychPostnova Analytics GmbHOprogramowanieNovaAnalysisOprogramowanie do oceny danych AF4, w przypadku niezbędnych wymagań sprzętowych i programowych czytelnik jest odsyłany do instrukcji obsługi Postnova NovaAnalysis
Pakiet oprogramowania do końcowego przetwarzania danychOriginLab CorporationOrigin 2019Używany do końcowego przetwarzania danych
Solvent DegasserPostnova Analytics GmbHPN7520Komponent konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który w manuskrypcie
jest opisany jako system AF4Solvent SelectorPostnova Analytics GmbHPN7310Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Solvent OrganizerPostnova Analytics GmbHPN7140Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Mieszanina środków powierzchniowo czynnychPostnova Analytics GmbHNovaChem100Mieszanina różnych środków powierzchniowo czynnych i soli stosowanych do przygotowania eluentu
Pompa końcówkowaPostnova Analytics GmbHPN1130Składnik konfiguracji AF2000 MF - MultiFlow FFF, który jest opisany jako system AF4 w manuskrypcie
Nieznana próbka AuNPBBI SolutionsEM. GC6060 nm Próbka AuNP używana do oznaczania wielkości za pomocą funkcji kalibracji wielkości
Detektor UV-visPostnova Analytics GmbHDetektor UV-vis PN3211Do dalszego sprzężenia z systemem AF4
Jednostka filtracji próżniowejfiltracji eluentówPostnova Analytics GmbHSłuży do zapewnienia niskiej zawartości cząstek tła i usuwania rozpuszczonego powietrza w stosowanych eluentach w celu zapewnienia optymalnych warunków
VortexIKAVortex Genie 2Służy do homogenizacji rozcieńczonych zawiesin AuNP
System oczyszczania wodyMerck MilliporeMilli-Q Integral 5Służy do wytwarzania wody ultraczystej (UPW, 18.2 MΩ cm rezystywności) do przygotowania roztworu czyszczącego, eluentów i rozcieńczania zawiesin AuNP
konfiguracji z wodą ultranową.Dell System frakcjonowania AF4

Bibliografia

  1. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
  2. Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
  3. Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
  4. Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
  5. Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
  6. Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
  7. Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
  8. Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
  9. Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43(2016).
  10. Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167(2019).
  11. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
  12. Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
  13. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  14. Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
  15. Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
  16. Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
  17. Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
  18. Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
  19. Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
  20. López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
  21. Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
  22. Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
  23. Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
  24. Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
  25. ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
  26. Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
  27. Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
  28. Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
  29. Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
  30. Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
  31. Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
  32. Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
  33. de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
  34. Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
  35. Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
  36. Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
  37. Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
  38. Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
  39. Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
  40. Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
  41. Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
  42. Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
  43. Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
  44. Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
  45. Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
  46. Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
  47. Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292(2016).
  48. Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
  49. Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
  50. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
  51. Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
  52. ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wyznaczanie rozmiaru nanocząstek złotazewnętrzna kalibracja rozmiarusystem AF4-UV-visrozkład wielkości cząstekpomiar promienia hydrodynamicznegoobliczanie odzysku masywzorce rozmiaru nanocząstekprotokół kwalifikacji systemuschemat analizy danych
Frakcjonowanie w polu przepływu asymetrycznego do wymiarowania nanocząstek złota w zawiesinie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.