Artykuł metodologiczny

Metody spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej do charakteryzowania korony białkowej i metabolitowej uzyskanej przez nanomateriały

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61760

⸱

27 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do scharakteryzowania kompletnej korony biomolekularnej, białek i metabolitów, uzyskanych przez nanomateriały z biopłynów przy użyciu elektroforezy kapilarnej - podejścia spektrometrii mas.

Streszczenie

Adsorpcja biomolekuł z otaczających matryc biologicznych na powierzchnię nanomateriałów (NM) w celu utworzenia korony była przedmiotem zainteresowania przez ostatnie dziesięć lat. Zainteresowanie interfejsem bio-nano wynika z faktu, że korona biomolekularna nadaje NM biologiczną tożsamość, a tym samym powoduje, że organizm identyfikuje je jako "ja". Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że białka w koronie są zdolne do interakcji z receptorami błonowymi w celu wpływania na wychwyt komórkowy i ustaliły, że korona jest odpowiedzialna za transport komórkowy NM i ich ostateczną toksyczność. Do tej pory większość badań koncentrowała się na koronie białkowej i pomijała możliwy wpływ metabolitów zawartych w koronie lub efekty synergiczne między składnikami całej korony biomolekularnej. W związku z tym praca ta demonstruje metodologie charakteryzowania zarówno białkowych, jak i metabolitowych składników korony biomolekularnej przy użyciu równoległych podejść proteomicznych i metabolomicznych. Obejmuje to trawienie korony białkowej na cząstkach za pomocą środka powierzchniowo czynnego stosowanego w celu zwiększenia odzysku białka oraz pasywną charakterystykę korony metabolitowej poprzez analizę matryc metabolitów przed i po ekspozycji na NM. W pracy przedstawiono elektroforezę kapilarną – spektrometrię mas (CESI-MS) jako nową technikę charakterystyki korony NM. Przedstawione tutaj protokoły pokazują, w jaki sposób CESI-MS może być wykorzystany do wiarygodnej charakterystyki zarówno białka, jak i metabolitu koronowego nabytego przez NM. Przejście na CESI-MS znacznie zmniejsza wymaganą objętość próbki (w porównaniu z tradycyjną chromatografią cieczową – spektrometrią mas (LC-MS)) z możliwością wielokrotnego wstrzykiwania już od 5 μl próbki, co czyni ją idealną dla próbek o ograniczonej objętości. Ponadto konsekwencje środowiskowe analizy są zmniejszone w odniesieniu do LC-MS ze względu na niskie natężenia przepływu (<20 nL/min) w CESI-MS oraz zastosowanie wodnych elektrolitów, co eliminuje potrzebę stosowania rozpuszczalników organicznych.

Wprowadzenie

Interakcje bio-nano, na styku powierzchni nanomateriałów (NM) i matryc biologicznych, z których biomolekuły adsorbują się do NM, to intensywny obszar badań leżący u podstaw nanobezpieczeństwa i nanomedycyny1. Ta warstwa zaadsorbowanych biomolekuł nadaje NM biologiczną tożsamość, dlatego komórki identyfikują je jako "własne", a następnie wpływają na wychwyt, dystrybucję komórkową i biologiczne punkty końcowe2,3,4. Zdecydowana większość badań bio-nano koncentrowała się na białkach w koronie i wykazała, że białka różnią się ilościowo i jakościowo między NM o różnym składzie5. Ta zmienność jest zależna zarówno od właściwości NM, takich jak rozmiar, funkcjonalizacja i materiał, jak i od właściwości matrycy biologicznej, w tym składu i zawartości soli5. Rosnącym obszarem zainteresowania interfejsem bio-nano są metabolity, które adsorbują się do NMs6. Kilka badań wykazało, że podobnie jak w przypadku białek, właściwości NM są kluczowym czynnikiem określającym skład metabolitów w koronie i że mogą wpływać na biologiczne wyniki ekspozycji na NM6,7,8.

W badaniach nad koroną biomolekularną istnieją cztery odrębne fazy jej charakterystyki, tworzenie korony, izolacja biomolekuł wewnątrz korony, ich wykrywanie za pomocą jakościowej lub ilościowej spektrometrii mas i identyfikacja9. Do tej pory do izolacji korony białkowej zastosowano szereg technik, w tym gotowanie w SDS-PAGE z uruchomieniem bufora, ekstrakcji rozpuszczalnikiem i solą lub bezpośrednie trawienie białek in situ na powierzchni NM. Jeśli chodzi o metabolity w koronie, izolacja jest bardziej złożona przy użyciu różnych metod wykorzystujących rozpuszczalniki, a nawet rozpuszczanie NM proponowane jako roztwory8,10,11. Jednak w przeciwieństwie do korony białkowej, jest mało prawdopodobne, aby podejście "jeden rozmiar dla wszystkich" miało zastosowanie do izolacji metabolitów z NM, ze względu na szeroką przestrzeń chemiczną zajmowaną przez metabolom i różnorodność możliwych NM. Alternatywnym podejściem jest scharakteryzowanie matrycy biologicznej przed i po ekspozycji na NM z różnicą w stężeniach metabolitów przypisywaną adsorpcji metabolitów do NMs.12

To alternatywne podejście miałoby zastosowanie do wszystkich płynów biologicznych i NM i chociaż wymaga dwa razy więcej analiz, w konsekwencji oferuje znacznie dokładniejszy pomiar korony metabolitu i nie stwarza ryzyka, że niskie poziomy odzysku metabolitów z powierzchni NM zostaną pomylone ze słabym wiązaniem określonego metabolitu.

Drugim krokiem do analizy korony biomolekularnej jest wykrycie biomolekuł. Tradycyjnie, w przypadku białek w koronie, jest to kompetencja nano-LC-MS, konia roboczego proteomiki; Zastosowano również inne podejścia, takie jak NMR13, 1D i 2D SDS-PAGE. Jeśli chodzi o koronę metabolitową, wykorzystano LC-MS7, GC-MS8 i spektrometrię mas z bezpośrednią infuzją14. Jednak ostatnio zaczęło zyskiwać na popularności nowe podejście, a mianowicie elektroforeza kapilarna ze spektrometrią mas (CE-MS)11,15 i jest obecna w laboratoriach NM jako samodzielna technika charakteryzowania różnych właściwości fizycznych i chemicznych NMs16. CE-MS jest techniką ortogonalnej separacji nanoLC-MS i GC-MS i jest w stanie umożliwić wykrywanie wysoce polarnych i naładowanych metabolitów17,18. Ponadto CE-MS doskonale nadaje się do analizy białek i ich modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja i glikozylacja19,20,21,22. Ostatni krok, identyfikacja i analiza danych, może być przeprowadzona na kilka sposobów w zależności od tego, czy stosowane jest podejście ilościowe / jakościowe czy ukierunkowane / nieukierunkowane, co jednak wykracza poza zakres tego protokołu.

CESI-MS, połączenie interfejsu CE i nanoESI, to niedawny postęp w technologii CE wykorzystujący interfejs bez osłony. Umożliwia to bezpośrednie połączenie CE o bardzo niskim przepływie (<20 nL/min) ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości bez rozcieńczania, co skutkuje znacznie lepszą czułością wykrywania23,24,25. CESI-MS umożliwia analizę próbek o ograniczonej objętości (< 10 μl) przy zachowaniu bardzo czułej analizy26. CESI-MS wypada również korzystnie w porównaniu z tradycyjnymi podejściami nanoLC-MS o niskim natężeniu przepływu stosowanymi w proteomice i metabolomice pod względem odtwarzalności27,28, przepustowości i przeniesienia, co czyni go ekscytującą perspektywą dla pełnej charakterystyki korony biomolekularnej.

Aby podkreślić potencjał CESI-MS do analiz interakcji bio-nano, ta praca opisuje przygotowanie próbki wymagane do wyizolowania korony biomolekularnej NM z pojedynczej próbki ludzkiego osocza w taki sposób, aby zmaksymalizować dane zarówno z aspektów białkowych, jak i metabolitowych całej biomolekularnej korony NM. Chociaż informujemy o stosowaniu ludzkiego osocza, protokół ten byłby równie odpowiedni dla innych płynów biologicznych, takich jak surowica krwi, pożywka do hodowli komórkowych, lizat komórkowy, płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz. Analizy tych dwóch składników (białek i metabolitów) zostaną następnie opisane przy użyciu obojętnych kapilar powlekanych CESI dla korony białkowej i kapilar z gołej stopionej krzemionki zarówno dla metabolitów kationowych, jak i anionowych.

Protokół

Użycie ludzkiego płynu biologicznego zostało zatwierdzone zgodnie z wytycznymi protokołu IRB z Uniwersytetu w Lejdzie i Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku. W przypadku badania płynów biologicznych dla ludzi lub zwierząt wymagana jest zgoda etyczna instytucji badawczej, która została uzyskana w przypadku wyników przedstawionych w niniejszym protokole. Ponadto należy również przeprowadzić odpowiednie raportowanie, aby zapewnić przejrzystość i możliwość ponownego wykorzystania danych w przyszłych pracach9,29,30.

1. Przygotowanie elektrolitów tła (BGE)

UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki powinny być przygotowane w odpowiednim dygestoriach, a odpowiednie środki ochrony osobistej muszą być używane na wszystkich etapach (fartuch laboratoryjny, rękawice i gogle). Na każdym etapie wymagane są fiolki z tworzywa sztucznego o niskim stopniu wiązania, aby zminimalizować straty analitu i zanieczyszczenie próbki solami wypłukiwanymi z naczyń szklanych.

  1. Przygotuj 10% kwas octowy BGE (v/v), pH 2,2 na co dzień do metabolomiki.
    1. Do kolby miarowej o pojemności 10 ml dodać 1 ml kwasu octowego, a następnie dodać wodę dejonizowaną (DI) do zaznaczonej linii i dokładnie wymieszać.
  2. Przygotuj codziennie 100 mM kwasu octowego o pH 2,9 do proteomiki.
    1. Do kolby miarowej o pojemności 10 ml dodać 57 μl kwasu octowego, a następnie dodać wodę demineralizowaną do zaznaczonej linii i dokładnie wymieszać.

2. Przygotowanie NM

  1. Energicznie rozpraszaj NM w wodzie, korzystając z opublikowanych wytycznych31,32,33.
    UWAGA: Przy opracowywaniu tego protokołu użyto 7 NM w następujący sposób: 100 i 1000 nm karboksylowanego polistyrenu użyto odpowiednio do korony białkowej i metabolitowej. Niemodyfikowane NM polistyrenu 100 nm, anataz TiO2 NM 13 nm, które były niemodyfikowane lub pokryte polimerami poliakrylowymi lub PVP, oraz niemodyfikowane SiO2 NM 22 nm były używane zarówno do koron białkowych, jak i metabolitowych. Chociaż metoda została opracowana i zademonstrowana przy użyciu tych NM, należy zauważyć, że podejście to miałoby zastosowanie do szerokiej gamy kompozycji, rozmiarów, kształtów i morfologii NM.
  2. Scharakteryzuj wielkość cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła34,35, spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z pojedynczą cząstką36, analiza śledzenia nanocząstek37, lub transmisyjna mikroskopia elektronowa i ładunek powierzchniowy jako potencjał zeta przy użyciu sizera zeta34.

3. Powstawanie korony biomolekularnej

  1. Podzielić 2 ml ludzkiego osocza (lub biopłynu z wyboru) na 1 ml podwielokrotności, jedną do metabolitu i korony białkowej, a drugą do charakterystyki metabolomu osocza.
  2. Inkubować 1 mg/ml NM w osoczu ludzkim przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając z prędkością 500 obr./min w termomikserze. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia NM.
  3. Pobrać supernatant osocza do analizy koronowej metabolitów. Zachowaj kompleks koronowy białka NM do charakterystyki korony białkowej.

4. Izolacja korony białkowej

  1. Ponownie zawiesić kompleks białka NM (osad) w 1 ml buforu 10x PBS i energicznie wirować przez 2 minuty w celu usunięcia niezwiązanych białek. Odwirować roztwór PBS o stężeniu 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia NM i ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu.
  2. Zawiesić osad w 1 ml buforu wodorowęglanowego amonu (ABC) (100 mM, pH 8,0) i energicznie wirować przez 2 minuty w celu usunięcia niezwiązanych białek i niepożądanych soli. Wirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia NMs; Usunąć i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok.
  3. Zredukować wiązania dwusiarczkowe białek poprzez rozpuszczenie osadu białka NM w 20 μl buforu ABC (100 mM pH 8) zawierającego 10 mM ditioteritolu. Inkubować roztwór redukcyjny przez 30 minut w temperaturze 56 °C.
  4. Aby strawić białka, dodaj 2 μg trypsyny klasy sekwencjonowania do 20 μl ABC zawierającego 0,1% środka powierzchniowo czynnego. Inkubować roztwór trawiący przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
  5. Alkilować próbkę przez dodanie 20 μl jodoacetamidu w 55 mM w 100 mM ABC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  6. Dodać 20 μl 0,1 M HCl, aby rozszczepić środek powierzchniowo czynny i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wzbogacić i odsolić peptydy za pomocą końcówki pipety odsalającej z wypełnieniem C18.
    1. Zwilżyć końcówkę 80 μl 0,1% kwasu mrówkowego 50% acetonitrylu 5 razy, oczyścić 80 μl 0,1% kwasu mrówkowego 5 razy, pobrać i wymyć próbkę 10 razy, odsolić próbkę przez przepłukanie 80 μl 0,1% kwasu mrówkowego 5 razy i wymyć próbkę 2 razy 80 μl 0,1% kwasu mrówkowego 70% acetonitrylu do czystej probówki PCR o niskim poziomie wiązania.
  8. Liofilizować próbki i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

5. Izolacja korony metabolitowej

  1. Pobrać osocze kontrolne i supernatant z inkubacji plazmy NM z kroku 3.3 i trzymać na lodzie podczas przygotowywania próbki.
  2. Pobrać 50 μl z każdej z nich do oddzielnych fiolek i rozcieńczyć 1:10 wodą DI. Pobrać 50 μl każdej rozcieńczonej próbki i przenieść do nowych fiolek dla kroku 5.3.
  3. Dodać 200 μl chloroformu, 250 μl metanolu i 350 μl wody demineralizowanej i energicznie wirować mieszaninę przez 2 min. Wirować przez 10 min przy 20 800 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Pobrać 500 μl supernatantu i przefiltrować przez filtr odśrodkowy o sile 3 kDa przez 2 godziny przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Weź 430 μl ultrafiltratu i wysusz w szybkim odkurzaczu. Próbki można teraz zamrozić przed analizą.

6. Przygotowanie systemu CESI-MS38

UWAGA: Przed zainstalowaniem kapilar sprawdź, czy końcówka wlotowa i wylotowa kapilar jest nienaruszona i czy nie ma widocznych pęknięć w kapilarnej.

  1. Instalacja kapilary z powłoką obojętną do analizy korony białkowej39.
    1. Umieść nową kapilarnę z powłoką neutralną (długość 90 cm i średnica wewnętrzna 30 μm) w urządzeniu CESI zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Przygotowanie naczyń włosowatych CESI do analizy proteomicznej.
    1. Przepłukać kapilarę separacyjną w kierunku do przodu za pomocą 100 mM HCl przez 5 minut przy ciśnieniu 100 psi i sprawdzić, czy na wylocie kapilary nie tworzy się kropelka. Przepłukać kapilarnę separacyjną BGE przy ciśnieniu 100 psi przez 10 minut, a następnie wodą DI o ciśnieniu 100 psi przez 30 minut (jest to wymagane tylko w przypadku nowych naczyń włosowatych).
    2. Przepłukać zarówno kapilę separacyjną, jak i kapilarnę przewodzącą BGE przy ciśnieniu 90 psi przez 5 minut i upewnić się, że na końcu wylotowym obu kapilar tworzą się kropelki.
    3. Przepłukać kapilarnę separacyjną wodą DI o ciśnieniu 90 psi przez 10 minut, następnie 50 psi przez 10 minut 0,1 M HCl, a następnie ponownie 90 psi przez 10 minut wodą DI i na koniec BGE przy 90 psi przez 10 min. Połącz CESI z MS za pomocą źródła nanospray i adaptera, jak opisano wcześniej38.
  3. Instalacja kapilary z gołej stopionej krzemionki do charakterystyki korony metabolitowej38.
    1. Umieść nową kapilę z gołej stopionej krzemionki (o długości 90 cm i średnicy wewnętrznej 30 μm) w urządzeniu CESI zgodnie z wytycznymi producenta.
  4. Przygotowanie naczyń włosowatych CESI do analizy metabolomicznej.
    1. Przepłukać kapilę separacyjną w kierunku do przodu za pomocą 100% MeOH przy ciśnieniu 50 psi przez 15 minut i sprawdzić, czy na wylocie kapilary nie tworzy się kropelka. Przepłukać zarówno kapilarnę separacyjną, jak i kapilarnę przewodzącą BGE pod ciśnieniem 90 psi przez 5 minut i upewnić się, że na wylocie z obu kapilar tworzą się kropelki.
    2. Przepłukać kapilarę separacyjną wodą DI o ciśnieniu 90 psi przez 10 minut, następnie 50 psi przez 10 minut 0,1 M NaOH, a następnie ponownie 90 psi przez 10 minut wodą DI i na koniec BGE przy 90 psi przez 10 min. Połączyć CESI z ESI-MS za pomocą źródła nanosprayu i adaptera, jak opisano wcześniej. 38

7. CE-MS do analizy koron białkowych

  1. Zawiesić próbki z kroku 4.8 w 20 μl 50 mM octanu amonu o pH 4,0.
  2. Wykonać iniekcję hydrodynamiczną próbki pod ciśnieniem 5 psi i 10 s. Oddzielić za pomocą napięcia separacji 30 kV o następującym gradiencie ciśnienia: 0-10 min przy 1 psi, 10-35 min przy 1,5 psi i 35-45 min przy 5 psi przy użyciu 100 mM, pH 2,9 kwasu octowego jako BGE.
  3. Zbieraj widma masowe w zakresie 250-2000 m/z dzięki akwizycji fragmentacji zależnej od 10 danych.
  4. Pomiędzy próbkami płukać kapilarnę 0,1 M HCl przez 3 minuty przy ciśnieniu 100 psi i 10 minut 100 psi BGE w przypadku kapilary rozdzielającej oraz przez 3 minuty przy ciśnieniu 100 psi w przypadku kapilary przewodzącej cieczy.

8. CESI-MS do analizy korony metabolitowej

UWAGA: Wszystkie próbki muszą być analizowane dwukrotnie, raz w trybie dodatnim w celu wykrycia kationów i raz w trybie ujemnym w celu wykrycia anionów. Kontrolne próbki osocza muszą być analizowane co najmniej 5 razy.

  1. Zawiesić próbki osocza naświetlone i nienaświetlone NM z kroku 5.4 w 430 μl wody DI i energicznie wirować przez 2 minuty. Przefiltrować przez filtr membranowy 0,1 μm.
  2. Pobrać 95 μl filtratu i dodać 5 μl wzorców wewnętrznych w temperaturze 200 μM dla kationów (sulfon L-metioniny) i 400 μM dla anionów (kwas 2,2,4,4-D4-cytrynowy) i energicznie wirować. Wirować przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut przed analizą CESI-MS.
  3. Wstrzykiwać próbkę hydrodynamicznie przez 30 s (kationy) i 40 s (aniony) przy 2 psi.
  4. Rozdzielić metabolity w 10% kwasie octowym o napięciu rozdzielania 30 kV w trybie do przodu (kationy) i do tyłu (aniony). Tryb odwrotnej separacji jest wspomagany ciśnieniem 0,5 psi do przodu na kapilarze separacyjnej.
  5. Ustaw spektrometr mas do zbierania danych w trybie dodatnim (kationy) lub ujemnym (aniony) w zakresie mas 65-1000 m/z. Pomiędzy próbkami płukać kapilary 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, wodą DI i BGE przy ciśnieniu 50 psi przez 2 minuty.

Wyniki

Opisana metoda jest pierwszą, która charakteryzuje zarówno białka, jak i metabolity w biomolekularnej koronie nanomateriałów (NM), wykorzystując tę samą próbkę ludzkiej osocza. Metoda ta pozwala na wykrycie >20 białek i >150 metabolitów, co umożliwia uzyskanie najbardziej kompleksowego przeglądu pełnej korony biomolekularnej i pozwala na lepsze zrozumienie przyłączania do komórek, pobierania oraz wpływu NM.

Zastosowanie metody CESI-MS do rozdziału i detekcji zarówno w proteomice (Rycina 1), jak i metabolomice (Rycina 2) wykazuje korzystne okna rozdziału w obu kapilarach dla każdego z tych podejść.

Metoda ta pozwala na rozróżnienie białek w koronie w szerokim zakresie składów NM, wykazując tym samym możliwość zastosowania tej metody w odniesieniu do NM o szerokim spektrum właściwości fizycznych i chemicznych (Tabela 1).

Unikalne sygnatury korony metabolitów mogą być również rozróżniane przy użyciu metabolomicznej gałęzi tej metodologii (Rycina 3). Chociaż podejście to opiera się na pasywnej charakterystyce korony metabolitów NM, pozwala ono mimo wszystko na uzyskanie interesujących informacji na temat roli metabolitów w koronie biomolekularnej, takich jak różnicowa adsorpcja izomerów (Rycina 4).

Chromatogram chromatograficzny, wykres względnej liczności w funkcji czasu, analiza piku, rozdział chemiczny.
Rycina 1: Przykładowy elektroferegram SiO2 separacja korony białkowej z wykorzystaniem CESI-MS po trawieniu na cząstce. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki chromatografii, wykres intensywności w funkcji czasu migracji, identyfikacja pików w analizie składników.
Rysunek 2: Przykład elektroforegramów jonów ekstrahowanych otrzymanych z endogennych związków w osoczu za pomocą CE-MS. Ponumerowane związki to: 1. ornityna; 2. lizyna; 3. arginina; 4. histydyna; 5. kreatyna; 6. glicyna; 7. alanina; 8. walina; 9. izoleucyna; 10. leucyna; 1. seryna; 12. treonina; 13. asparagina; 14. metionina; 15. glutamina; 16. kwas glutaminowy; 17. fenylo-D5-alanina; 18. fenyloalanina; 19. tyrozyna; 20. prolina; 21. sulfone metioniny (standard wewnętrzny). Opublikowano na zasadach otwartego dostępu na licencji Creative Commons CC BY, powielono z Zhang et al17. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Analiza korony białkowej dla zestawu 6 NM. Mapa ciepła klas białek zidentyfikowanych na NM z krzemionki (SiO2), tytanowej (TiO2), tytanowej z powłoką PVP (TiO2-PVP), tytanowej z powłoką Dispex (TiO2-Dispex), polistyrenowej oraz karboksylowanej polistyrenowej. Procenty odnoszą się do zawartości białek względem całkowitej ilości białek na podstawie zawartości 3 najważniejszych peptydów dla każdego białka. Biorąc pod uwagę różnice zaobserwowane w względnej zawartości białek w koronach różnych NM, jasne jest, że proponowany protokół jest wystarczająco czuły, aby odróżnić koronę białkową różnych NM. Rysunek powielony z analizy CESI-MS korony białkowej, opublikowany na licencji open access Creative Commons CC BY11. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wykresy pudełkowe stężeń aminokwasów w krzemionce, TiO2-un, TiO2-Dispex, TiO2-PVP; analiza porównawcza.
Rycina 3: Analiza celowana kationowych metabolitów w koronie NM. Adsorpcja kationów do SiO₂2 oraz TiO2 NMs. Kolor czerwony oznacza początkowe stężenie metabolitów, natomiast kolor niebieski stężenie metabolitów po 1-godzinnej inkubacji z NM w temperaturze 37 ˚C. Spadek stężenia metabolitów w roztworze jest wynikiem adsorpcji metabolitów na powierzchni NM. W przypadku NM z polistyrenu nie zaobserwowano istotnej adsorpcji metabolitów. Wykresy pudełkowe przedstawiają wartości minimalne i maksymalne, medianę oraz rozstępy międzykwartylowe. Rysunek powielony z ukierunkowanej analizy korony metabolicznej metodą CESI-MS, opublikowanej na licencji open access Creative Commons CC BY15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres porównawczy stężeń TiO₂ ze stabilizatorami: un, PVP, Dispex; wynik analizy danych.
Rysunek 4: Celowana analiza anionowych metabolitów w koronie NM z uwzględnieniem adsorpcji izomerów. Adsorpcja anionów na szeregu nanomateriałów (NM) z tlenku tytanu wykazuje wyraźne różnice między poszczególnymi izomerami, takimi jak fosforany cukrów. Kolor czerwony oznacza początkowe stężenie metabolitów, natomiast kolor niebieski stężenie metabolitów po 1-godzinnej inkubacji z NM w temperaturze 37 ˚C. Spadek stężenia metabolitów w roztworze jest wynikiem ich adsorpcji na powierzchni NM. W przypadku SiO nie zaobserwowano istotnej adsorpcji metabolitów.2 or polistyrenowe NM. Wykresy pudełkowe przedstawiają wartości minimalne i maksymalne, medianę oraz rozstępy międzykwartylowe. Rysunek powielony z ukierunkowanej analizy korony metabolitów metodą CESI-MS, opublikowanej na licencji open access Creative Commons CC BY15. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

AnalitŚrednie RSD pola pikuŚrednie RSD czasu migracji
1928 peptydów w obrębie jednego dnia (n=3)15%0.30%
27 kationów w obrębie jednego dnia (n=16)5.80%2.20%
27 kationów między różnymi dniami (n=36)8.60%1.80%

Tabela 2: Powtarzalność technicznych powtórzeń CESI-MS dla peptydów i metabolitów kationowych. RSD: względne odchylenie standardowe, jako miara powtarzalności. Powtarzalność CESI-MS pod względem pól powierzchni pików i czasów migracji jest bardzo dobra, przy czym wszystkie anality mają średnie RSD <15%, a czasy migracji <2,2%. Wyniki te wykazują wysoki stopień pewności, jaką można przypisać danym zebranym za pomocą tej techniki, i potwierdzają, że wykryte zmienności wynikają z rzeczywistych różnic w składzie próbek (wzbogacenie na NMs), a nie ze zmienności analitycznej. Tabela 2 została opracowana na podstawie wyników przedstawionych wcześniej1,15.

Dyskusja

Jest to pierwsza metoda zaproponowana do scharakteryzowania kompletnej korony biomolekularnej zawierającej białka i metabolity, z tej samej próbki, przy użyciu CESI-MS. Możliwość scharakteryzowania zarówno białek, jak i metabolitów z tej samej próbki znacznie zwiększy ilość danych zebranych z pojedynczej ekspozycji eksperymentalnej, umożliwiając nowy wgląd w proces powstawania korony i jego wpływ na toksyczność i skuteczność nanoleków na nanoleki. Co więcej, CESI-MS jest idealną platformą do charakteryzowania obu klas biomolekuł przy wymaganej jedynie zmianie kapilary. Idąc dalej, nowe metody opracowane dla niewodnego CE umożliwią lipidomikę przy użyciu CE-MS40 , dzięki czemu możliwa jest teraz analiza białek, metabolitów i lipidów przy użyciu jednej platformy. Obecne konwencjonalne podejścia wymagałyby dwóch dedykowanych platform LC-MS, jednej dla korony białkowej, a drugiej dla korony metabolitowej. Dzięki temu takie podejście może zebrać dwa razy więcej danych za pomocą jednej platformy analitycznej.

Istnieją pewne zastrzeżenia do tego podejścia, szczególnie w przypadku korony metabolitowej, ponieważ protokół ten proponuje pośredni pomiar korony. W związku z tym problem może się pojawić, gdy poziomy metabolitów są obecne w wysokich stężeniach w stosunku do NM, a wynikający z tego spadek stężenia metabolitów w matrycy jest niewielki. Jednak w przeciwieństwie do korony białkowej, jest mało prawdopodobne, że opracowane zostanie uniwersalne podejście do izolowania korony metabolitowej ze względu na to, że każdy NM ma unikalną chemię powierzchni. Idąc dalej, bardziej prawdopodobne jest, że specyficzne dla NM podejścia do izolacji korony metabolitowej zostaną opracowane i zwalidowane; będzie to miało zastosowanie tylko do tego konkretnego NM. Mimo to CESI-MS nadal będzie wysoce odpowiednią platformą do charakteryzowania polarnych naładowanych metabolitów, niezależnie od tego, w jaki sposób zostaną one wyizolowane. Warto również zauważyć, że jeśli osad nie utworzy się podczas etapów wirowania przeznaczonych do osadzania NM, może być wymagana większa siła odśrodkowa; jest to najbardziej prawdopodobne w przypadku mniej gęstych NM. Bardzo ważne jest również, aby wszystkie etapy filtrowania były przestrzegane w protokole, ze względu na wąski otwór kapilarn, które mogą łatwo zostać zablokowane, jeśli jakiekolwiek cząstki stałe nie zostaną odpowiednio wyeliminowane z próbki.

Podczas gdy korona białkowa jest intensywnym obszarem badań od wielu lat, zdolność do łączenia jej z koroną metabolitową jest nowym obszarem zainteresowania naukowców badających interfejs bio-nano 6,14. Do tej pory większość tych badań koncentrowała się na niepolarnej, lipidowej frakcji metabolitu korony 9,28. Ta obecna metoda umożliwia scharakteryzowanie wysoce polarnych i naładowanych metabolitów w koronie, która obejmuje ważne metabolity biorące udział w metabolizmie energetycznym, glikolizie i syntezie DNA. W rezultacie, w połączeniu z przepływem pracy proteomiki, możliwa jest bardziej holistyczna charakterystyka korony biomolekularnej. Umożliwia to bardziej dogłębną analizę interakcji bio-nano w przyszłości. Metoda ta umożliwia lepszy mechanistyczny wgląd w endocytozę za pośrednictwem receptorów poprzez interakcje białek i metabolitów z receptorami błonowymi. Ponadto można badać interakcje między i wewnątrz korony między białkami a małymi cząsteczkami; Na przykład niedawno wykazano, że białka w koronie odgrywają kluczową rolę w rekrutacji metabolitów15. Warto zauważyć, że reprezentatywne wyniki na rycinie 3 i rycinie 4 są bezwzględną kwantyfikacją metabolitów, jednak nieukierunkowane podejście wykorzystujące wieloczynnikową analizę danych w celu porównania wszystkich cech CE-MS w grupie kontrolnej w porównaniu z narażonym osoczem również wyjaśniłoby wiązanie metabolitów. W związku z tym istnieje znaczny zakres do zbadania, w jaki sposób i które metabolity i białka wpływają na ich odpowiednią rekrutację do koron NM. Te dodatkowe badania mogą pomóc w projektowaniu koron w celu optymalizacji dostarczania nanoleków lub odkrycia dalszych przeszkód w ich opracowywaniu, takich jak tłumienie działania farmaceutycznego ze względu na biomolekularne funkcje blokowania lub maskowania korony.

CESI-MS z natężeniem przepływu w skali nano wynoszącym około 20 nL/min i minimalnym zużyciem rozpuszczalników organicznych oferuje poprawę ekologicznych i ekonomicznych referencji w porównaniu ze standardowymi LC-MS i nanoLC-MS pod względem stosowania rozpuszczalników, które są głównymi wyzwaniami dla badań metabolomicznych i proteomicznych. CESI-MS oferuje wysoce powtarzalne wyniki zarówno dla czasu migracji, jak i obszaru piku, które wypadają korzystnie w porównaniu z metodami opartymi na LC-MS11,15. Ponadto, w porównaniu z nanoLC-MS, przeniesienie nie stanowi problemu w CESI-MS. W związku z tym nie jest wymagane intensywne czyszczenie systemu między analizami próbek, co znacznie poprawia przepustowość próbek11.

Podsumowując, proponowany przepływ pracy jest pierwszym, który szczegółowo opisuje podejście do charakteryzowania zarówno składników białkowych, jak i metabolitowych kompletnej biomolekularnej korony NM. Otwiera to nowy aspekt interakcji bio-nano, koronę metabolitową, umożliwiając w ten sposób zebranie dwukrotnie większej ilości danych z tej samej próbki, umożliwiając pełniejsze zrozumienie interakcji na granicy bio-nano.

Oświadczenia

J.A.T jest pracownikiem firmy AB Sciex UK Ltd, która uczestniczy jako partner przemysłowy w projekcie ACEnano, J.A.T i wszyscy inni autorzy nie mają konfliktu interesów w tej pracy.

Podziękowania

A.J.C, J.A.T i I.L potwierdzają dofinansowanie z Komisji Europejskiej w ramach projektu ACEnano realizowanego w ramach programu Horyzont 2020 (nr grantu H2020-NMBP-2016-720952). W.Z potwierdza finansowanie studiów doktoranckich przez Chińską Radę Stypendialną (CSC, nr 201507060011). R.R przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe w ramach programu grantów Vidi Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO Vidi 723.0160330).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-DithiothreitolSigma 10197777001
2,2,4,4-D4-cytrynowySimga485438-1GWewnętrzny wzorzec anionu
Octan amonu >98%SigmaA1542
Wodorowęglan amonu >99,5%Sigma09830
Płyn chłodzący z wkładem kapilarnymSciex359976
CESI 8000 instrumentSciexA98089
Czapka CESISciexB24699
Fiolki CESISciexB11648
ChloroformSigma650498Toksyczny, stosować w dygestorii
Lodowaty kwas octowySigmaA6283
Kwas solny 1mol/LSigma43617
JozoacetamidSigmaI1149
L-metionina sulfonSigmaM0876-1GWewnętrzny standardowy kation
Metonal (LC-MS Ultra Chromasolve)Sigma14262Zastosowanie w dygestoriach
MikrofiolkiSciex144709
nanoFiolkiSciex5043467
Neutralny wkład powierzchniowy 30 i mikro; M ID x 90 cm długości całkowitejSciexB07368
Adapter OptiMS do źródła Sciex Nanospray IIISciexB07363B07366 i B83386 do spektrometrów termomasowych, B85397 do spektrometrów masowych Waters, B86099 do spektrometrów masowych Bruker
OptiMS Wkład z topioną krzemionką 30 i mikro; m ID x 90 cm długość całkowitaSciexB07367
Buforowana sól fizjologiczna Phospahte 10xSigmaP7059
Pierce C18 Końcówki, 100 &mikro; Łóżko LThermo Fisher Scientific87784
Polistyren 100 nmPolysciences Inc876
Polistyren karboksylowany 100 nmPolysciences Inc16688
Polistyren karboksylowany 1000 nmPolysciences Inc08226
Rapigest SF (środek powierzchniowo czynny)Wody186001860
Stopień sekwencjonowania zmodyfikowany TrypsynaPromegaV5111
SiO2 Ludox TM-40Sigma420786
roztwór wodorotlenku soduSimga72079
Cząstki Promethionpokryte TiO2 DispexCząstki
Cząstki Promethionpokryte TiO2 PVPzamówienie
NiepowlekanecząstkiPromethion TiO2Cząstki
na zamówienie Cząstki na na zamówienie

Bibliografia

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758(2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898(2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99(2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126(2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269(2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644(2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107(2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074(2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535(2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka korony bia kowejanaliza korony metabolit wbiomolekularna korona nanomateria wproteomika bottom uppodej cia metabolomicznetrawienie na cz stkachcharakterystyka pasywnatechnika CESI MSredukcja obj to ci pr bki
Metody spektrometrii mas elektroforezy kapilarnej do charakteryzowania korony białkowej i metabolitowej uzyskanej przez nanomateriały
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.