Artykuł metodologiczny

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61775

⸱

2 października 2020

 ,  ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Streszczenie

Komórki macierzyste raka piersi (BCSC) to komórki rakowe z dziedzicznymi lub nabytymi cechami podobnymi do komórek macierzystych. Pomimo niskiej częstości występowania są głównym czynnikiem przyczyniającym się do inicjacji raka piersi, nawrotu, przerzutów i oporności na leczenie. Konieczne jest zrozumienie biologii komórek macierzystych raka piersi w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu raka piersi. Komórki macierzyste raka piersi są izolowane i charakteryzowane w oparciu o ekspresję unikalnych markerów powierzchniowych komórek, takich jak CD44, CD24 i aktywność enzymatyczną dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). Te komórki CD44 + CD24- o wysokiej zawartościALDH stanowią populację BCSC i mogą być izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do dalszych badań funkcjonalnych. W zależności od kwestii naukowej, do oceny cech funkcjonalnych BCSC można stosować różne metody in vitro i in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny izolacji ludzkich BCSC zarówno z heterogennych populacji komórek raka piersi, jak i pierwotnej tkanki nowotworowej uzyskanej od pacjentek z rakiem piersi. Ponadto zwracamy uwagę na dalsze testy funkcjonalne in vitro i in vivo, w tym testy tworzenia kolonii, testy mammosfery, modele hodowli 3D i testy ksenoprzeszczepów nowotworowych, które można wykorzystać do oceny funkcji BCSC.

Wprowadzenie

Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów komórek macierzystych ludzkiego raka piersi (BCSC) jest kluczowe dla sprostania wyzwaniom napotkanym w leczeniu raka piersi. Pojawienie się koncepcji BCSC datuje się na początek XXI wieku, gdzie stwierdzono, że niewielka populacja komórek raka piersi CD44 + CD24 / niskiego poziomu piersi jest zdolna do generowania heterogennych guzów u myszy 1,2. Następnie zaobserwowano, że ludzkie komórki raka piersi o wysokiej aktywności enzymatycznej dehydrogenazy aldehydowej (ALDH high) również wykazywały podobne właściwości podobne do komórek macierzystych3. Te BCSC reprezentują niewielką populację komórek zdolnych do samoodnawiania i różnicowania, przyczyniając się do niejednorodnego charakteru guzów masowych1,2,3. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w ewolucyjnie zachowanych szlakach sygnałowych napędzają przetrwanie i utrzymanie BCSC4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14. Ponadto wykazano, że zewnętrzne mikrośrodowisko komórki odgrywa kluczową rolę w dyktowaniu różnych funkcji BCSC15,16,17. Te szlaki molekularne i czynniki zewnętrzne regulujące funkcję BCSC przyczyniają się do nawrotu raka piersi, przerzutów18 i rozwoju oporności na terapie19,20,21, przy czym szczątkowe istnienie BCSC po leczeniu stanowi poważne wyzwanie dla całkowitego przeżycia pacjentek z rakiem piersi22,23. Przedkliniczna ocena tych czynników jest zatem bardzo ważna dla identyfikacji terapii ukierunkowanych na BCSC, które mogą być korzystne dla osiągnięcia lepszych wyników leczenia i poprawy całkowitego przeżycia u pacjentek z rakiem piersi.

Kilka modeli linii komórkowych ludzkiego raka piersi in vitro oraz modeli ludzkich ksenoprzeszczepów in vivo zostało wykorzystanych do scharakteryzowania BCSCs24,25,26,27,28,29. Zdolność linii komórkowych do ciągłego zasiedlania po każdym kolejnym pasażu sprawia, że jest to idealny system modelowy do wykonywania badań omicznych i farmakogenomicznych. Jednak linie komórkowe często nie są w stanie oddać niejednorodności obserwowanej w próbkach pobranych od pacjentów. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić dane z linii komórkowych próbkami pochodzącymi od pacjentów. Izolacja BCSC w ich najczystszej postaci jest ważna dla umożliwienia szczegółowej charakterystyki BCSC. Osiągnięcie tej czystości zależy od wyboru markerów fenotypowych, które są specyficzne dla BCSC. Obecnie wysoki fenotyp komórek ALDH CD44 + CD24- jest najczęściej używany do rozróżniania i izolowania ludzkich BCSC z masowych populacji komórek raka piersi przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu uzyskania maksymalnej czystości1,3,26. Ponadto właściwości wyizolowanych BCSC, takie jak samoodnawianie, proliferacja i różnicowanie, można ocenić za pomocą technik in vitro i in vivo.

Na przykład, testy tworzenia kolonii in vitro mogą być użyte do oceny zdolności pojedynczej komórki do samoodnawiania się w celu utworzenia kolonii złożonej z 50 lub więcej komórek w obecności różnych warunków leczenia30. Testy mammosfery mogą być również wykorzystywane do oceny potencjału samoodnawiania się komórek raka piersi w warunkach niezależnych od zakotwiczenia. Ten test mierzy zdolność pojedynczych komórek do generowania i wzrostu jako kulek (mieszanina BCSC i nie-BCSC) przy każdym kolejnym pasażu w warunkach hodowli bez surowicy, nieprzylegających31. Dodatkowo, trójwymiarowe (3D) modele hodowli mogą być wykorzystywane do oceny funkcji BCSC, w tym interakcji komórka-komórka i komórka-macierz, które dokładnie odwzorowują mikrośrodowisko in vivo i umożliwiają badanie aktywności potencjalnych terapii ukierunkowanych na BCSC32. Pomimo różnorodnych zastosowań modeli in vitro, trudno jest modelować złożoność warunków in vivo przy użyciu wyłącznie testów in vitro. Temu wyzwaniu można sprostać, wykorzystując mysie modele ksenoprzeszczepów do oceny zachowania BCSC in vivo. W szczególności takie modele służą jako idealny system do oceny przerzutów raka piersi33, badania interakcji z mikrośrodowiskiem podczas progresji choroby34, obrazowania in vivo35, oraz do przewidywania specyficznej dla pacjenta toksyczności i skuteczności leków przeciwnowotworowych34.

Ten protokół zawiera szczegółowy opis izolacji ludzkich BCSCo wysokimpoziomie ALDH CD44+CD24- o maksymalnej czystości z dużych populacji heterogennych komórek raka piersi. Przedstawiamy również szczegółowy opis trzech technik in vitro (test tworzenia kolonii, test mammosfery i model hodowli 3D) oraz test ksenoprzeszczepu guza in vivo, który można wykorzystać do oceny różnych funkcji BCSC. Metody te byłyby odpowiednie do stosowania przez badaczy zainteresowanych izolacją i charakteryzacją BCSC z linii komórkowych ludzkiego raka piersi lub komórek raka piersi i tkanki nowotworowej pochodzących od pierwotnego pacjenta w celu zrozumienia biologii BCSC i / lub zbadania nowych terapii ukierunkowanych na BCSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobieranie chirurgicznych próbek lub biopsji od pacjentek z rakiem piersi, które wyraziły na to zgodę, przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym protokołem etycznym dotyczącym badań z udziałem ludzi, zaakceptowanym przez instytucjonalną komisję etyki. Wszystkie myszy wykorzystane do stworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów były utrzymywane i kwaterowane w zatwierdzonym przez instytucję pomieszczeniu dla zwierząt. Tkanka nowotworowa z modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów, wytworzona z wykorzystaniem myszy, została uzyskana zgodnie z zatwierdzonym protokołem etycznym zaakceptowanym przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie linii komórkowych

  1. Wszystkie procedury hodowli komórkowej i barwienia należy przeprowadzać w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy używać sterylnych naczyń/kolb do hodowli komórkowej oraz sterylnych odczynników.
  2. Ludzkie komórki raka piersi należy hodować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w zdefiniowanych pożywkach uzupełnionych płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz niezbędnymi czynnikami wzrostu specyficznymi dla każdej linii komórkowej.
  3. Kultury fibroblastów mysich NIH3T3 (do wykorzystania w testach tworzenia kolonii) należy utrzymywać w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnionej o 10% FBS.
  4. W przypadku wszystkich kultur stare pożywki należy wymieniać na świeże co 2-3 dni. Po osiągnięciu przez kultury 75-80% konfluencji należy przeprowadzić pasaż do wielu sterylnych kolb do hodowli komórkowej.

2. Przygotowanie tkanki guza raka piersi

  1. Pobrać chirurgiczne lub biopsyjne próbki od pacjentów bezpośrednio od osób z rakiem piersi, które wyraziły zgodę, zgodnie z protokołem etycznym dotyczącym ludzi zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyki.
  2. Następnie pobrać i wygenerować tkankę nowotworową z modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów, wykorzystując myszy zgodnie z protokołem etycznym dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.
  3. Wszystkie tkanki nowotworowe pobrać w warunkach sterylnych do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 30 mL pożywki DMEM:F12, przechowywać w lodzie i przetworzyć próbki zgodnie z poniższym opisem w ciągu 2 h od momentu pobrania.

3. Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek raka piersi

  1. Odssać pożywkę z kolby zawierającej monowarstwę komórek raka piersi o konfluencji 60-80% (wybrane linie komórkowe). Przemyć komórki 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Odssać PBS i dodać odpowiedni roztwór do dysocjacji komórek (np. Trypsyna:EDTA; w ilości wystarczającej do pokrycia monowarstwy komórek), a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej (zalecane) lub w 37 °C.
  2. Dodać 5 mL pożywki hodowlanej w celu zneutralizowania aktywności roztworu do dysocjacji komórek.
  3. Przenieść otrzymany roztwór zdysocjowanych komórek do stożkowej probówki 50 mL i wirować przy 1000 x g przez 5 min.
  4. Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 5 mL 1x PBS. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu.
    UWAGA: Zwrócić uwagę na obecność agregatów komórkowych w hemocytometrze. Powtórzyć etap dysocjacji komórek, jeśli nie utworzyła się zawiesina pojedynczych komórek.
  5. Po policzeniu komórek ponownie odwirować zawiesinę komórkową przy 1000 x g przez 5 min, odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w buforze do substratu ALDH do uzyskania stężenia 1 x 106 komórek/mL.

4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z próbek tkanek

  1. Posiekaj tkankę guza skalpelami, stosując technikę krzyżową, aby uzyskać mniejsze fragmenty o wielkości około 1 mm. Przenieś kawałki tkanki do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 10 mL buforu do dysocjacji (1X Collagenase w DMEM:F12). Zamknij probówkę stożkową parafilmem i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przez 40 min.
    UWAGA: W przypadku braku inkubatora z wytrząsarką, umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i mieszaj zawartość probówki za pomocą vortexa co 5-10 min.
  2. Osadź strawioną tkankę poprzez wirowanie próbki przy 530 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i dodaj 5 mL trypsyny. Pipetuj zawiesinę w górę i w dół za pomocą pipety 1 mL (ustawionej na 750 µL), aby rozbić osad, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min. Po inkubacji intensywnie pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić pojedyncze komórki.
  3. Uzupełnij całkowitą objętość w probówce do 25 mL za pomocą pożywki DMEM:F12 i wiruj przy 1000 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 1 mL roztworu dispase-DNase. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  4. Uzupełnij całkowitą objętość w probówce do 10 mL za pomocą PBS. Wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przepuść otrzymaną zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm przymocowane do nowej probówki stożkowej 50 mL. Wiruj przy 1000 x g przez 5 min.
  5. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 5 mL 1x PBS. Policz komórki i dokończ przygotowanie zawiesiny komórkowej zgodnie z opisem w krokach 3.4 i 3.5.

5. Izolacja komórek macierzystych raka piersi (BCSCs)

  1. Oznakuj probówki do przepływu dla kontroli niebarwionej, kontroli barwienia pojedynczego (kontrola DEAB, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), probówki kontroli negatywnej (barwionej DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 i 7AAD), kontroli FMO (fluorescent minus one) oraz probówki do sortowania (barwionej ALDH, CD44, CD24 i 7AAD).
  2. Przenieś 500 μL (0,5 x 106 komórek) zawiesin komórkowych z kroku 3.5 lub 4.5 do każdej probówki oznakowanej jako „same komórki”, „CD44”, „CD24” i „7AAD”. Umieść probówki na lodzie do czasu użycia.
  3. Przenieś 2 mL próbki (2 x 106 komórek) do odpowiedniej probówki „ALDH”. Dodaj 5 μL DEAB do probówek „kontrola DEAB” i „kontrola negatywna”, a następnie szczelnie zakręć. Dodaj 10 μL substratu ALDH do probówki „ALDH”, wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa i natychmiast przenieś 500 μL do odpowiadających im probówek „kontrola DEAB” i „kontrola negatywna”. Zakręć probówki „kontrola DEAB”, „kontrola negatywna” i „ALDH” i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30-60 min (nie przekraczać 60 min).
    UWAGA: Optymalny czas inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od linii komórkowej. Zawsze chronić substrat ALDH oraz probówki zawierające barwione komórki przed światłem.
  4. Po inkubacji odwiruj wszystkie próbki przez 5 min przy 250 x g. Resuspenduj komórki w 500 μL buforu do substratu ALDH. Dodaj zalecaną przez producenta lub zoptymalizowaną przez użytkownika koncentrację koktajlu przeciwciał anty-CD44-PE i anty-CD24-PE-Cy7 i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 min. Dodaj przeciwciała anty-CD44-PE i anty-CD24-PE-Cy7 do odpowiednich probówek oznakowanych jako „CD44” i „CD24”.
  5. Po inkubacji odwiruj wszystkie próbki przy 250 x g przez 5 min. Resuspenduj komórki w 500 μL buforu do substratu ALDH. Inkubuj probówkę „kontrola negatywna”, „probówkę do sortowania” oraz probówkę „7AAD” z 7AAD (sugerowana koncentracja: 0,25 µg/1 x 106 komórek) przez 10 min na lodzie.
    UWAGA: Aktywność ALDH jest wykrywana w zielonym kanale fluorescencyjnym, dlatego należy użyć fluorochromu o innym, kompatybilnym widmie emisji. W przypadku zaobserwowania nakładania się widm podczas wieloparametrycznej cytometrii przepływowej, należy posłużyć się kontrolami jednobarwnymi i kontrolą FMO w celu przeprowadzenia kompensacji między fluorochromami, aby zminimalizować przenikanie sygnału fluorescencyjnego do innych kanałów.
  6. Skonfiguruj protokół analizy na urządzeniu FACS w przygotowaniu do analizy próbek. Stwórz wykresy rozrzutu (forward scatter vs side scatter, forward scatter vs kanały fluorescencyjne).
  7. Korzystając z kontroli niebarwionej, dostrój fotopowielacz, aby oddzielić debris od populacji całych komórek, i dostrój napięcie fluorescencyjne, aby przesunąć populację całych komórek w okolice pierwszej skali logarytmicznej (101). Korzystając z kontroli DEAB, przesuń całą populację komórek w obręb drugiej skali logarytmicznej (102), regulując napięcie zielonego kanału fluorescencyjnego.
  8. Przeanalizuj najpierw wszystkie kontrole barwienia pojedynczego (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7), 7AAD oraz kontrolę FMO, dostosowując napięcie tak, aby oddzielić komórki barwione od niebarwionych i zminimalizować przenikanie sygnałów fluorescencyjnych do innych kanałów.
  9. Wyznacz bramkę (gate) dla populacji pozytywnej w każdej próbce komórek barwionych pojedynczo. Korzystając z probówki kontroli negatywnej, wyznacz bramki dla żywotności (7AAD negatywne) oraz populacji komórek ALDHlow i ALDHhigh (reprezentatywna strategia bramkowania przedstawiona na Rysunku 1B).
  10. Przeanalizuj wieloparametrycznie barwione próbki w celu wyizolowania BCSC. Korzystając z bramek dla żywotnych komórek ALDHlow i ALDHhigh, wybierz odpowiednio populacje komórek CD44+CD24- (BCSC) i CD44-CD24+ (non-BCSC) (Rysunek 1B).
  11. Zbierz żywotne BCSC i non-BCSC do mediów zbiorczych w sterylnych probówkach zbiorczych (populacje z dwóch reprezentatywnych linii komórkowych pokazane na Rysunku 2A&B). Posortowane komórki wykorzystaj do dalszych analiz in vitro i in vivo, zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Oprócz opisanych poniżej analiz in vitro i in vivo, BCSC można zweryfikować poprzez pomiar ekspresji markerów pluripotencyjnych, takich jak SOX2, OCT4 i NANOG, przy użyciu standardowych technik immunoblottingu.

Proces izolacji komórek raka piersi za pomocą cytometrii przepływowej; schemat i wykresy kropkowe dla wyników analizy.
Rycina 1: Strategia bramkowania FACS dla izolacji BCSC z linii komórkowych raka piersi oraz próbek tkankowych.(A) Schemat blokowy opisujący procedurę izolacji BCSC. (B) Reprezentatywne wykresy FACS przedstawiające strategię sortowania zastosowaną w celu izolacji żywych BCSC i komórek nie-BCSC z heterogennej puli komórek. Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231 są jednocześnie znakowane 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE oraz substratem ALDH. Podgrupy komórek zostały wyizolowane przy użyciu protokołu czterokolorowego na urządzeniu FACS. Komórki są wybierane na podstawie oczekiwanego rozproszenia światła, następnie pod kątem singletów oraz żywotności na podstawie wykluczenia 7-AAD. Następnie analizowana jest aktywność ALDH i górne 20% komórek najbardziej pozytywnych jest wybieranych jako populacja ALDHhigh, podczas gdy dolne 20% komórek z najniższą aktywnością ALDH uznano za ALDHlow. Na koniec 50% komórek ALDHlow jest dalej selekcjonowanych na podstawie fenotypu CD44low/-CD24+, a 50% komórek ALDHhigh jest wybieranych na podstawie fenotypu CD44+CD24-. Rycina ta została zaadaptowana z pracy Chu et al.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy cytometrii przepływowej; rozróżnienie BCSC i non-BCSC przy użyciu markerów ALDH, CD44, CD24.
Rycina 2: Proporcje BCSC są zmienne w różnych liniach komórkowych raka piersi. Reprezentatywny obraz pokazujący różną proporcję BCSC i non-BCSC w (A) SUM159 oraz (B) MDA-MD-468 liniach komórkowych potrójnie ujemnego raka piersi po znakowaniu i sortowaniu zgodnie z opisem na Rycini 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Test tworzenia kolonii

  1. Resuspenduj odpowiednie komórki (posortowane z kroku 5.11 lub nieposortowane z kroków 3.5 lub 4.5) w pożywce kompletnej.
  2. Oznakuj trzy probówki do cytometrii dla 1 x 102, 2 x 102 i 5 x 102 komórek. Dodaj 2 mL pożywki kompletnej i przenieś odpowiednią liczbę komórek (posortowanych z kroku 5.11 lub nieposortowanych z kroków 3.5 lub 4.5) do odpowiednich probówek. Dokładnie wymieszaj zawiesiny komórkowe, pipetując je w górę i w dół 5 razy.
  3. Wysiej komórki na płytkę 6-dołkową i rozprowadź zawiesinę, delikatnie obracając płytki, aby uzyskać jednorodne rozmieszczenie komórek.
  4. Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do pojawienia się kolonii (gdzie kolonia = ≥50 komórek na kolonię). Ostrożnie uzupełniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, nie zakłócając formowania się kolonii.
  5. Odsącz pożywkę i przemyj raz 1 mL PBS. Dodaj 0,5 mL 0,05% roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka i inkubuj płytkę przez 30 minut. Usuń nadmiar barwnika fioletu krystalicznego, płucząc 2 mL wody. Powtarzaj etap płukania do momentu usunięcia zabarwienia tła.
  6. Za pomocą mikroskopu przy powiększeniu 4x i 10x policz i zapisz całkowitą liczbę utworzonych kolonii (reprezentatywne obrazy przedstawiono na Ryc. 3A).
  7. Oblicz częstotliwość tworzenia kolonii według następującego wzoru: Częstotliwość (%) = (liczba utworzonych kolonii/liczba wysianych komórek) x 100. Na przykład, jeśli z 1 x 102 komórek powstanie 25 kolonii, to częstotliwość tworzenia kolonii wynosi: Częstotliwość = (25/100) x 100 = 25%.
  8. Alternatywnie, zastąp kroki od 6.1 do 6.4 inną metodą obejmującą ko-kulturę z fibroblastami, które zapewniają wsparcie mikrośrodowiskowe dla BCSC poprzez produkcję niezbędnych czynników wzrostu i przeżycia.
  9. Pokryj wcześniej 60 mm szalki hodowlane kolagenem bydlęcym typu I (roztwór 3 mg/mL kolagenu w rozcieńczeniu 1:30). Pozostaw kolagen do polimeryzacji na 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Odsącz nie spolimeryzowany kolagen i przemyj płytkę dwukrotnie 1x PBS. Przykryj płytkę pokrytą kolagenem 1 mL PBS i odstaw w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
  10. Oznakuj trzy probówki do cytometrii dla 1 x 103, 5 x 103 i 1 x 104 komórek. Dodaj 4 mL pożywki do testu tworzenia kolonii i przenieś odpowiednią liczbę komórek (posortowanych z kroku 5.11 lub nieposortowanych z kroków 3.5 lub 4.5) do odpowiednich probówek. Dodaj napromieniowane fibroblasty mysie NIH3T3 (4 x 104 komórek/mL pożywki). Dokładnie wymieszaj zawiesiny komórkowe, pipetując je w górę i w dół 5 razy.
  11. Odsącz PBS z pokrytej kolagenem szalki hodowlanej z kroku 6.1 i wysiej mieszaninę komórek na każdą z płytek hodowlanych, zgodnie z opisem w kroku 6.3.
  12. Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozostaw je bez zakłóceń na 7-10 dni lub do momentu utworzenia się kolonii, bez uzupełniania pożywki. Policz i zapisz całkowitą liczbę utworzonych kolonii zgodnie z opisem w krokach 6.6 i 6.7.

7. Test mammosfer

  1. Resuspenduj odpowiednie komórki (posortowane komórki z kroku 5.11 lub nieposortowane z kroków 3.5 lub 4.5) w pełnej pożywce do hodowli mammosfer i wysiej komórki z gęstością 5 x 102 komórek/cm2 powierzchni na 96-dołkową płytkę hodowlaną o ultra-niskiej adhezji (ultra-low attachment).
    UWAGA: Gęstość siewu komórek powinna zostać zoptymalizowana dla różnych linii komórkowych.
  2. Inkubuj płytki hodowlane przez 5-10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Ostrożnie uzupełniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, aby nie zakłócać formowania się mammosfer.
  3. Po inkubacji policz liczbę powstałych w każdym dołku mammosfer za pomocą mikroskopu; mammosfery definiuje się jako skupiska komórek raka piersi o średnicy większej niż 100 μm (reprezentatywne obrazy przedstawiono na Ryc. 3B).
  4. Oblicz wydajność formowania mammosfer (MFE) według następującego wzoru: MFE (%) = (liczba mammosfer na dołek) / (liczba wysianych komórek na dołek) x 100 (np. jeśli z 1 x 102 komórek w dołku powstało 5 mammosfer, to MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. Aby przeprowadzić pasaż mammosfer, ostrożnie przenieś pożywkę zawierającą mammosfery do świeżej probówki stożkowej 50 mL i odwiruj pożywkę przy 1000 x g przez 5 min. Ostrożnie odlej nadsącz, resuspenduj osad komórkowy w 500 μL trypsyny i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 1 mL pełnej pożywki do hodowli mammosfer. Policz komórki za pomocą hemocytometru i wysiej je ponownie na płytkę hodowlaną o ultra-niskiej adhezji zgodnie z opisem w kroku 7.1.
    UWAGA: Oprócz pasażowania, komórki pochodzące z mammosfer mogą być dalej analizowane metodą FACS w celu oceny fenotypu BCSC i/lub uzyskania czystych populacji BCSC do innych analiz następczych.
  7. Aby określić liczbę komórek inicjujących mammosfery w populacjach komórkowych, zastosuj alternatywną metodę obejmującą analizę rozcieńczeń ograniczających sfer (SLDA). Wysiej komórki w rozcieńczeniach szeregowych od wysokiej do niskiej liczby komórek na 96-dołkową płytkę hodowlaną o ultra-niskiej adhezji, tak aby w najwyższym rozcieńczeniu przypadało mniej niż jedna komórka na dołek.
  8. Inkubuj płytkę hodowlaną przez 10-14 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, pozostawiając ją w spokoju, aby uniknąć agregacji komórek.
  9. Po inkubacji policz liczbę powstałych w każdym dołku mammosfer za pomocą mikroskopu; mammosfery definiuje się jako skupiska komórek raka piersi o średnicy większej niż 100 μm. Oblicz częstotliwość inicjacji sfer oraz istotność statystyczną za pomocą oprogramowania online Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8. Model hodowli 3D

  1. W zależności od pytania badawczego należy użyć ekstraktu z błony podstawnej (BME) z czynnikami wzrostu lub bez nich (zredukowany). Aby ocenić wpływ pojedynczego czynnika wzrostu na komórki nowotworowe, należy zastosować BME z zredukowaną zawartością czynników wzrostu. Pomaga to również w minimalizacji niespecyficznych efektów endogennych czynników wzrostu obecnych w BME.
    UWAGA: BME tężeje powyżej 10 °C. BME należy zawsze przechowywać w lodzie, nawet podczas etapu rozmrażania.
  2. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej należy ostrożnie dodać 50 μL BME, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie pozostawić do polimeryzacji w temperaturze 37 °C przez 1 h. Po 10 min inkubacji należy dodać 100 μL PBS, aby zapobiec wysychaniu warstwy żelu.
  3. Posortowane komórki z kroku 5.11 lub niesortowane komórki z kroków 3.5 lub 4.5 należy resuspendować w pożywce do hodowli 3D w stężeniu od 5 x 103 do 5 x 104/200 μL.
  4. Po spolimeryzowaniu BME należy usunąć PBS, dodać 200 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Do sąsiednich dołków należy dodać PBS, aby zapobiec odparowywaniu pożywki.
    UWAGA: Optymalną liczbę komórek do wysiania należy ustalić przed rozpoczęciem eksperymentu. W zależności od pytania badawczego, BCSCs można hodować samodzielnie lub z innymi typami komórek (fibroblastami/komórkami śródbłonka/komórkami odpornościowymi itp.).
  5. Świeżą pożywkę należy dodawać do płytek hodowlanych dwa razy w tygodniu. Hodowle należy utrzymywać przez 10-14 dni przed analizą formowania organoidów (reprezentatywne obrazy przedstawiono na Rysunku 3C).
  6. W celu pasażowania należy ostrożnie odessać pożywkę i dodać 200 μL dyspazy do każdego dołka zawierającego komórki. Płytkę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. W połowie czasu inkubacji (po 30 min) należy wyjąć płytkę, delikatnie pipetować roztwór dyspazy w górę i w dół 5 razy, a następnie umieścić z powrotem w inkubatorze na kolejne 30 min.
  7. Po 1 h roztwór zdysocjowanych komórek należy przenieść do probówki do wirowania. Dołek należy przemyć 1x PBS z dodatkiem 2% FBS (fPBS) i przenieść ciecz do probówki. Probówkę należy wirować przy 1000 x g przez 5 min. Należy ostrożnie odessać nadsącz i dodać 500 μL trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Trypsynę należy inaktywować, dodając równą ilość fPBS, i wirować przy 1000 x g przez 5 min.
  8. Nadsącz należy odrzucić, a osad resuspendować w 1 mL pożywki do hodowli 3D. Należy policzyć komórki i wysiać wymaganą liczbę komórek w BME zgodnie z krokami od 8.2 do 8.4.
    UWAGA: Treść z wielu dołków można połączyć w celu dalszej analizy lub sortowania interesującej populacji komórek.

Test tworzenia kolonii, obrazy hodowli komórkowych, zróżnicowane gęstości wysiewu, analiza mikroskopowa.
Rycina 3: Testy in vitro w celu oceny funkcji komórek BCSC.Testy in vitro przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcjach protokołu od 6.1 do 6.5 (A), od 7.1 do 7.4 (B) lub od 8.1 do 8.4 + 8.6 (C). (A) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające kolonie utworzone przez ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231; (B) Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające tworzenie mammosfer przez ludzkie linie komórkowe MCF7, SUM159 lub MDA-MB-468, a także komórki raka piersi LRCP17 pochodzące od pacjenta. (C) Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające struktury 3D utworzone przez komórki raka piersi MCF7 i MDA-MB-231 w modelach hodowli 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Eksperymenty na zwierzętach należy przeprowadzać zgodnie z protokołem etycznym zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami.

9. Model ksenoprzeszczepu in vivo

  1. Aby określić zdolność do inicjacji guza przez macierzyste komórki raka piersi, należy przygotować komórki (populację sortowaną z kroku 5.7 lub populacje niesortowane z kroków 3.5 lub 4.5), stosując metodę rozcieńczeń ograniczających. Komórki należy rozcieńczać seryjnie w PBS, tworząc od 1 do 5 różnych grup rozcieńczeń, z dawkami tak niskimi jak 0,01–0,2 x 102 komórki/100 µL i tak wysokie jak 1 x 106 komórki/100 µL.
    UWAGA: Jako kontrolę można wykorzystać nieposortowane komórki z całej populacji. Liczba użytych grup rozcieńczeń zależy od pożądanego wyniku naukowego (np. w przypadku badania wyłącznie tumorigenności można zastosować jedną grupę z większą liczbą komórek, natomiast przy obliczaniu zdolności do inicjowania nowotworów optymalne jest przetestowanie 5 dawek rozcieńczeń ograniczających).
  2. Aby wytworzyć modele ksenoprzeszczepów z ludzkich komórek raka piersi, należy użyć immunokompromitowanych myszy samic (beztymusowych nude [nu/nu], szczepach nieotyłych cukrzycowych z ciężkim złożonym niedoborem odporności [NOD/SCID] lub NOD/SCID IL2γ [NGS]).
    UWAGA: Chociaż można zastosować minimum 4 zwierzęta na grupę, zaleca się użycie 8–12 zwierząt na grupę w celu uzyskania wiarygodnych wyników, w szczególności w przypadku analizy rozcieńczeń ograniczających.
  3. Wykonaj standardowe iniekcje do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego (MFP) przy użyciu 100 µL/mouskażdej preparacji komórkowej, w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: W celu optymalnego wzrostu guza piersi oraz spontanicznej przerzutowości do odległych narządów zaleca się stosowanie MFP w klatce piersiowej. Alternatywnie można zastosować MFP w pachwinie.
  4. Po wstrzyknięciu należy codziennie monitorować stan ogólny myszy oraz wzrost guza w miejscu iniekcji. Po wykryciu wyczuwalnego guza należy rozpocząć pomiar jego rozmiaru za pomocą suwmiarki w dwóch prostopadłych wymiarach i rejestrować wyniki co tydzień aż do osiągnięcia punktu końcowego.
    UWAGA: Punkt końcowy eksperymentu określa się na podstawie regulacji zawartych w instytucjonalnym protokole etyki badań na zwierzętach; zazwyczaj wymagany jest punkt końcowy w postaci eutanazji, gdy objętość guza osiągnie 1500 mm³3. Dla populacji BCSC i/lub wyższych dawek komórek (np. >(1 x 10⁴ komórek), punkt końcowy ten zostanie prawdopodobnie osiągnięty w ciągu 4–8 tygodni od wstrzyknięcia MFP. W przypadku bardzo niskich dawek komórek i/lub populacji komórek niebędących BCSC, należy pozwolić na wzrost guza do 8 miesięcy po wstrzyknięciu.
  5. Na podstawie tych pomiarów oblicz objętość guza, korzystając z następującego wzoru: Objętość w mm3 = 0,52 x (szerokość)2 długość x. W przypadku zastosowania metody rozcieńczeń ograniczających, należy obliczyć zdolność do inicjowania nowotworu oraz istotność statystyczną przy użyciu oprogramowania online ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. Alternatywnie, aby w sposób humanitarny wydłużyć punkt końcowy, należy chirurgicznie usunąć guzy pierwotne i kontynuować monitorowanie stanu zdrowia myszy oraz/lub rozwoju przerzutów spontanicznych w odległych organach. Wyciętą tkankę nowotworową należy wykorzystać do generowania seryjnych ksenotransplantatów.
  7. W punkcie końcowym należy pobrać tkanki z guzów pierwotnych oraz odległych narządów (węzłów chłonnych, płuc, wątroby, mózgu, kości) i przeprowadzić analizę histopatologiczną i/lub immunohistochemiczną lub poddać tkankę guza dysocjacji i wykorzystać ją w testach in vitro opisanych w sekcjach 6–8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany protokół umożliwia izolację ludzkich komórek macierzystych raka piersi (BCSCs) z heterogennej populacji komórek raka piersi, pochodzących albo z linii komórkowych, albo z dysocjowanej tkanki nowotworowej. W przypadku każdej linii komórkowej lub próbki tkanki kluczowe jest przygotowanie jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek, aby wyizolować BCSCs z maksymalną czystością, ponieważ zanieczyszczenie populacjami niebędącymi BCSCs mogłoby prowadzić do zmiennych odpowiedzi komórkowych, zwłaszcza jeśli celem badania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przerzuty raka piersi i oporność na terapię stały się główną przyczyną śmiertelności kobiet na całym świecie. Istnienie subpopulacji komórek macierzystych raka piersi (BCSC) przyczynia się do zwiększenia przerzutów 26,43,44,45,46 i oporności na terapię 21,47,48. W z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom naszego laboratorium za pomocne dyskusje i wsparcie. Nasze badania nad komórkami macierzystymi raka piersi i mikrośrodowiskiem guza są finansowane z grantów Instytutu Badawczego Kanadyjskiego Towarzystwa Badań nad Rakiem oraz Programu Walki z Rakiem Piersi Departamentu Obrony Armii Stanów Zjednoczonych (Grant #BC160912). V.B. jest wspierany przez Western Postdoctoral Fellowship (Western University), a zarówno A.L.A., jak i V.B. są wspierane przez Breast Cancer Society of Canada. CL jest wspierany przez stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship od rządu Kanady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7-Aminoaktynomycyna D (7AAD)BD51-68981Esugerowane: 0,25 &mikro; Komórki g/1x106
AcetonFisherA18-1
Podłoże dehydrogenazy aldehydowej (ALDH)Stemcell Technologies1700Sprzedawane komercyjnie jako część zestawu testowego ALDEFLOUR; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania podłoża ALDH
Ekstrakt z błony podstawnej (BME)Corning354234Sprzedawany pod nazwą handlową Matrigel
Płytki do hodowli komórkowych: 6-dołkoweCorning877218
Płytki do hodowli komórkowych: 60 mmCorning353002
Płytki do hodowli komórkowych: 96-dołkowe ultra niskie nasadkiCorning3474
Sitko do komórek: 40 mikronówBD352340
CollagenStemcell Technologies7001Przygotuj rozcieńczenie 3 mg / ml kolagenu w PBS
KolagenazaSigma110888070011x
Probówki stożkowe: 50 mlFisher scientific05-539-7
Fiolet krystalicznySigmaC6158Użyj 0,05% roztworu fioletu krystalicznego w wodzie do barwienia
DispaseStemcell Technologies79135U / ml
DMEM:F12Gibco11330-0321x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES
DNAseSigmaD50520,1 mg/ml stężenie końcowe
FBSAvantor Seradigm Lifescience97068-085 
Probówki przepływowe: 5 mlBD352063Polipropylenowe rurki okrągłodenne
MetanolFisher84124
mysie przeciwciało anty-ludzkie CD24BD561646R-fikoerytryna i barwnik cyjaninowy sprzężone Klon: ML5
mysie przeciwciało anty-ludzkie CD44BD555479R-fikoerytryna sprzężona, Klon: G44-26
N, N-dietyloaminobenzaldehyd (DEAB)Stemcell Technologies1700Sprzedawany komercyjnie jako część zestawu do testów ALDEFLOUR; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta Preparat DEAB
PBSBisent Inc311-425-CL1x, Bez wapnia i magnezu
Trypsyna-EDTAGibco25200-056
Mammosphere Media Skład
B27Gibco17504-441x
bFGFSigmaF200610 ng/mL
BSABioshopALB00304%
DMEM:F12Gibco11330-0321x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES
EGFSIGMAE964420 ng/ml
InsulinaSigma166345 & mikro; g / ml
3D Skład podłoża organoidowego
A8301Tocris2939500 nM
B27Gibco17504-441x
DMEM:F12Gibco11330-0321x, z L-glutaminą i 15 mM HEPES
EGFSigmaE96445 ng / ml
FGF10Peprotech100-2620 ng/ml
FGF7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMaxInvitrogen35050-0611x
HEPESGibco15630-08010 mM
N-acetylocysteinaSigmaA91651,25 mM
Neuregulina β 1Peprotech100-035 nM
NikotynamidSigmaN06365 mM
NogginPeprotech120-10C100 ng / ml
R-spondyna3R& D3500250 ng/ml
SB202190SigmaS7067500 nM
Y-27632Tocris12545 µ M
w 1:30

Bibliografia

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192(2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137(2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444(2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640(2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888(2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632(2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145(2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991(2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117(2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108(2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99(2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Markery powierzchniowe kom rekdehydrogenaza aldehydowasortowanie kom rek aktywowane fluorescencjtest tworzenia koloniitest mammosfermodel hodowli 3Dtest ksenoprzeszczep w nowotworowychzawiesina pojedynczych kom rektrawienie tkanki

Powiązane artykuły