Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Samice ssaków rozmnażające się płciowo rodzą się z zapasem oocytów przez całe życie. Niedojrzałe, spoczynkowe oocyty znajdują się w pierwotnych pęcherzykach, jednostce magazynującej żeńskiej linii rozrodczej. Są nieodnawialne, dlatego ich liczba przy urodzeniu i późniejsze tempo utraty w dużej mierze decyduje o długości płodnego życia kobiet. Dokładne określenie ilościowe liczby pęcherzyków jajnikowych u kobiet i zwierząt ma zasadnicze znaczenie dla określenia wpływu leków i substancji toksycznych na rezerwę jajnikową. Jest to również niezbędne do oceny zapotrzebowania i sukcesu istniejących i pojawiających się technik zachowania płodności. Obecnie nie istnieją metody pozwalające na dokładny pomiar liczby pęcherzyków pierwotnych składających się na rezerwę jajnikową u kobiet. Co więcej, pozyskanie tkanki jajnikowej od dużych zwierząt lub gatunków zagrożonych wyginięciem w celach doświadczalnych jest często niewykonalne. W związku z tym myszy stały się niezbędnym modelem dla takich badań, a zdolność do oceny pierwotnej liczby pęcherzyków w całych jajnikach myszy jest kluczowym narzędziem. Jednak doniesienia o bezwzględnej liczbie pęcherzyków w jajnikach myszy w literaturze są bardzo zmienne, co utrudnia porównywanie i/lub replikowanie danych. Wynika to z wielu czynników, w tym szczepu, wieku, grup leczenia, a także różnic technicznych w stosowanych metodach liczenia. W tym artykule przedstawiamy przewodnik instruktażowy krok po kroku dotyczący przygotowania wycinków histologicznych i liczenia pęcherzyków pierwotnych w jajnikach myszy przy użyciu dwóch różnych metod: [1] stereologii, która opiera się na technice frakcjonowania/dysekcji optycznej; oraz [2] technika bezpośredniego liczenia. Podkreślone zostaną niektóre z kluczowych zalet i wad każdej z metod, tak aby można było poprawić odtwarzalność w tej dziedzinie i umożliwić naukowcom wybór najbardziej odpowiedniej metody dla ich badań.
Wprowadzenie
Niedojrzałe, meiotycznie zatrzymane oocyty przechowywane w pierwotnych pęcherzykach w jajniku są jednostką pamięci dla żeńskiej linii zarodkowej i stanowią dożywotnią rezerwę jajnikową danej osoby. Pierwotna liczba pęcherzyków włosowych zmniejsza się naturalnie wraz z wiekiem1, lub alternatywnie, może zostać przedwcześnie uszczuplona w wyniku ekspozycji na egzogenne chemikalia, w tym niektóre farmaceutyki i toksyny środowiskowe w powietrzu, żywności i wodzie2. Biorąc pod uwagę, że pierwotna liczba pęcherzyków jest skończona, ilość i jakość pęcherzyków obecnych w jajniku w dużej mierze decyduje o płodności samic i zdrowiu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Jajniki pobrano od samic myszy C57BL6J. Wszystkie procedury i eksperymenty z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z australijskim kodeksem praktyk NHMRC dotyczącym opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania (NHMRC Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals) oraz zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Zwierząt Monash Animal Research Platform.
UWAGA: W niniejszym raporcie, w celu porównania dwóch metod liczenia w tym samym zwierzęciu, zastosowano środek chemioterapeutyczny, który według badań stereologicznych1 oraz bezpośrednich zliczeń12,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystano dobrze scharakteryzowany model wyczerpania pęcherzyków, w którym młodym dorosłym myszom żeńskim podano pojedynczą dawkę chemioterapii cyklofosfamidem lub kontrolną sól fizjologiczną (n=5/grupa), a po 48 godzinach pobrano oba jajniki od każdego zwierzęcia. Jeden jajnik od każdego zwierzęcia przygotowano zgodnie z opisem w Kroku 1 dla każdej z dwóch metod: stereologii lub bezpośredniego przeliczania. Lewy i prawy jajnik od każdego zwierzęcia przypisano losowo do każdej grupy. Dane te pokazują, że przy zastosow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku dla złotego standardu techniki liczenia pierwotnych pęcherzyków myszy , stereologii i częściej stosowanej metody bezpośredniego liczenia mieszków włosowych. Chemioterapię zastosowano w celu porównania i skontrastowania wyników uzyskanych za pomocą tych dwóch różnych metod w obrębie lewego i prawego jajnika tego samego zwierzęcia. Obie metody wykazały dużą zmienność międzyzwierzęcą w liczbie pierwotnych pęcherzyków włosowych. Znaczne wyczerpanie rezerwy jajnikowej zarejestrowano .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była możliwa dzięki Wsparciu Infrastruktury Operacyjnej Rządu Stanu Wiktoria i Rządowi Australijskiemu NHMRC IRIISS oraz wspierana przez fundusze z National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) oraz Australian Research Council (KJH #FT190100265). Autorzy pragną podziękować za wsparcie techniczne ze strony Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform oraz Monash Micro Imaging Facility.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1-butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Alkohol kwasowy | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin' s utrwalacz | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Kwas pikrynowy 0,9% (w/v), formaldehyd 9% (v/v), kwas octowy 5% (w/v) |
| Cyklofosfamid | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Ftalan dibutylu Polistyren ksylen (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Etanol | Bursztyn Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather skalpel optalmiczny z aluminiową rękojeścią | Projekty dla Vision | #FEA-745-SR | Ostrze z piór do sekcji (widoczne na rysunku 1) |
| Utrwalacz formaliny | Australijski Biostain | #ANBFC | |
| Szkiełko nakrywkowe | szklane Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Żywica glikometakrylanowa RM2165 mikrotom | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glikol-metakrylan DPX | *wyprodukowano we własnym zakresie | *Mieszaj 1,5 l ksylenu; 800 g granulek polistyrenu; 100 ml ftalanu dibutylu przez 3 tygodnie | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer' s haematoksylina | Bursztyn Naukowy | #MH | |
| Mikroskop Olympus BX50 | Olympus | #BX50 | Mikroskop Brightfield wyposażony w 10-krotny obiektyw zanurzeniowy na sucho i 100-krotny w oleju (apertura numeryczna 1,3) |
| Olejek immersyjny Olympus typ F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 źródło światła | Olympus | #TH4-200 | |
| Wosk | parafinowySigma-Aldrich | #03987 | |
| Kwas okresowy | Trajan | #PERI1% | Kwas okresowy 1% |
| Mikrotom rotacyjny CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Służy do cięcia skrawków parafinowych |
| Schiff' s odczynnik | Trajan | #SCHF | |
| Woda z kranu Scotta | Bursztyn Naukowy | #SCOT | Węglan potasu, siarczan magnezu, woda |
| System stereologiczny StereoInvestigator | MBF Bioscience | Zawiera oprogramowanie StereoInvestigator, jednostkę sterującą, automatyczny stolik i joystick | |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 szt |
| Technovit 7100 Plastikowy system do zatapiania | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 żółty | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 ml |
Bibliografia
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
