Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

DOI:

10.3791/61783

⸱

22 stycznia 2021

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jelita grubego charakteryzuje się heterogenicznością i hierarchiczną organizacją składającą się z populacji nowotworowych komórek macierzystych (CSC) odpowiedzialnych za rozwój, utrzymanie i odporność guza na leki. Lepsze zrozumienie właściwości CSC dla ich specyficznego ukierunkowania jest zatem warunkiem wstępnym skutecznej terapii. Istnieje jednak niedobór odpowiednich modeli przedklinicznych do dogłębnych badań. Chociaż dwuwymiarowe (2D) linie komórek nowotworowych in vitro dostarczają cennych informacji na temat biologii guza, nie replikują one fenotypowej i genetycznej heterogeniczności guza. W przeciwieństwie do tego, modele trójwymiarowe (3D) odnoszą się do niemal fizjologicznej złożoności raka i niejednorodności komórek i odtwarzają je. Celem tej pracy było zaprojektowanie solidnego i powtarzalnego systemu hodowli 3D do badania biologii CSC. Niniejsza metodologia opisuje rozwój i optymalizację warunków generowania sferoid 3D, które są jednorodne pod względem wielkości, z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2, modelu, który można wykorzystać do długotrwałej hodowli. Co ważne, w obrębie sferoid komórki, które były zorganizowane wokół struktur przypominających światło, charakteryzowały się zróżnicowanymi wzorcami proliferacji komórek i obecnością CSC wyrażających panel markerów. Wyniki te stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia 3D do badania heterogeniczności komórek i biologii CSC, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jelita grubego (CRC) pozostaje drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie1. Rozwój CRC jest wynikiem postępującego nabywania i akumulacji mutacji genetycznych i/lub zmian epigenetycznych2,3, w tym aktywacji onkogenów i inaktywacji genów supresorowych nowotworów3,4. Co więcej, czynniki niegenetyczne (np. mikrośrodowisko) mogą przyczyniać się do transformacji onkogennej i ją promować, a tym samym uczestniczyć w ewolucji CRCs5. Co ważne, CRC składają się z różnych populacji komórek....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczegóły wszystkich odczynników i materiałów są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Formacja sferoidów

  1. Pożywki do hodowli sferoidalnych
    1. Przygotować podłoże podstawowe składające się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 4 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy.
    2. Przygotować kompletną pożywkę DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep) w podłożu podstawowym od kroku 1.1.1.
    3. Przygotuj pożywkę DMEM/macierzy błony podstawnej zawierającą 2,5% matrycy błony podstawnej, 10% FBS i 1% Pen/Strep w podłożu....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ brak jednorodności w wielkości sferoidów jest jedną z głównych wad obecnie dostępnych systemów hodowli sferoidów 3D13, celem tej pracy było stworzenie niezawodnego i powtarzalnego protokołu do uzyskania jednorodnych sferoid. Po pierwsze, aby ustalić idealne warunki pracy, przetestowano różną liczbę komórek Caco2, w zakresie od 50 do 2000 komórek na mikrostudzienkę/sferoidę za pomocą dedykowanych płytek (Tabela 1). W efekcie, każda studzien.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele 3D in vitro przezwyciężają główne wady eksperymentalne hodowli komórek nowotworowych 2D, ponieważ wydają się być bardziej wiarygodne w rekapitulacji typowych cech nowotworu, w tym mikrośrodowiska i heterogeniczności komórek. Powszechnie stosowane modele 3D sferoid są bezrusztkowe (hodowane w warunkach niskiego przylegania) lub oparte na rusztowaniach (wykorzystujące biomateriały do hodowli komórek). Metody te mają różne wady, ponieważ zależą od charakteru zastosowanego rusztowania lub powodują powstawanie sferoid .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uznajemy platformy obrazowania i histologii Anipath recherche (CRCL, CLB). Jesteśmy wdzięczni aptece szpitala Centre Léon Bérard (CLB) za miły dar w postaci FOLFOX i FOLFIRI. Dziękujemy również Brigitte Manship za krytyczną lekturę rękopisu. Prace były wspierane przez FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) oraz przez Inków (PLBIO19-289). MVG i LC otrzymały wsparcie od FRM, a CF otrzymało wsparcie od fundacji ARC i Centre Léon Bérard.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37 &mikro; m Filtr siatkowy odwracalny, duży STEMCELL Technologies27250Do stosowania z probówkami stożkowymi 50 ml
5-FluorouracylPrezent od Apteki Centrum Leon Berard (CLB)-roztwór podstawowy, 5 mg/100 ml; stężenie końcowe, 50 &mikro; g/ml
agarozy SigmaA9539
Aggrewell 400 24-dołkowe płytkiSTEMCELL Technologies344111,200 mikrostudzienek na studzienkę do tworzenia i wzrostu sferoidów
Anty kaspaza3 - Sygnalizacja komórek królika9661rozcieńczenie 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82rozcieńczenie 1:500
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu x 100 mlSTEMCELL Technologies07010
Anty-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82rozcieńczenie 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107rozcieńczenie 1:2000
Anty-PCNA - MyszDakoM0879rozcieńczenie 1:1000
Anty-β-katenina - MyszSanta Cruz BiotechnologySC-7963Rozcieńczenie 1:50
Płytki wielodołkoweThermo Fisher Scientific237108
Monohydrat kwasu cytrynowegoSigmaC1909
Aparatura CLARIOstar Czytnik mikropłytekBMG Labtech
Długopisdo zaznaczania okręgów na szkiełkach do tworzenia barier dla płynów
Przeciwciało wtórne Donkey anty-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202rozcieńczenie 1:1000
Donkey anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) wtórne, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi (H+L) Silnie zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-królicze IgG osła (H + L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042rozcieńczenie 1:1000
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM) Glutamax (dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy)Gibco10569010
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco16000044
Pożywka montażowa Fluorogel z DAPIInterchimFP-DT094B
Kozie przeciwciało wtórne anty-Rat IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077rozcieńczenie 1:1000
OprogramowanieAnaliza obrazu sferoidalnego
Irynotekan& nbsp;Prezent od AptekiCLB-roztwórpodstawowy, 20 mg/ml; stężenie końcowe, 100 &mikro; Odwrotna transkryptaza iScript g/mL
 Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLB-roztwórpodstawowy, 50 mg/ml; stężenie końcowe, 25 &mikro; g/mL
Matrigel Podstawna matryca membranowaCorning354234Macierz błony podstawnej
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinPrezent z apteki CLB-roztwórpodstawowy, 100 mg/20 mL;stężenie końcowe, 10 &mikro; g/ml
Penicylina-streptomycynaGibco15140130
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020barwienie kwasem nukleinowym; rozcieńczenie 1:5000
Trypsyna-EDTA (0,05 %)Gibco
odwrócony Zeiss-Axiovertdo pozyskiwania obrazów sferoid
Dako marker ImageJ 25300062mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla sferoid wkom rki Caco2tworzenie sferoid wmarkery macierzystych kom rek nowotworowychodpowied na chemioterapitworzenie wiat awzorce proliferacji kom rekmacierz b ony podstawnejjednorodny rozmiar sferoid w

Powiązane artykuły