Artykuł metodologiczny

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

DOI:

10.3791/61786

⸱

13 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w spektrometrii mas zaowocowały głęboką analizą proteomiczną wraz z generowaniem solidnych i powtarzalnych zestawów danych. Jednak pomimo znacznego postępu technicznego, przygotowanie próbek z próbek biologicznych, takich jak krew pacjenta, płyn mózgowo-rdzeniowy i tkanki, nadal stanowi poważne wyzwanie. Proteomika tkankowa często stanowi atrakcyjne źródło próbek, które pozwalają przełożyć wyniki badań z laboratorium na praktykę kliniczną. Może ujawnić potencjalne potencjalne biomarkery do wczesnej diagnozy raka i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona itp. Proteomika tkankowa dostarcza również wielu informacji ogólnoustrojowych opartych na obfitości białek i pomaga odpowiedzieć na interesujące pytania biologiczne.

Ilościową analizę proteomiczną można podzielić na dwie szerokie kategorie: podejście oparte na etykietach i bezetykietowe. W podejściu opartym na znakowaniu białka lub peptydy są znakowane za pomocą stabilnych izotopów, takich jak SILAC (znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej) lub za pomocą znaczników chemicznych, takich jak ICAT (znaczniki powinowactwa kodowane izotopowo), TMT (znaczniki masy tandemowej) lub iTRAQ (znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej). Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że dokładniejsze oznaczanie ilościowe białek i przy użyciu etykiet izobarycznych można analizować wiele próbek w jednym eksperymencie. Podejście bezetykietowe stanowi opłacalną alternatywę dla podejść opartych na etykietach. Setki próbek pacjentów należących do określonej kohorty można analizować i porównywać z innymi kohortami na podstawie cech klinicznych. W tym miejscu opisaliśmy zoptymalizowany ilościowy przepływ pracy proteomiki dla próbek tkanek przy użyciu metod profilowania proteomu bez znaczników i opartych na znacznikach, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań w naukach przyrodniczych, zwłaszcza projektów opartych na odkrywaniu biomarkerów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie proteomiczne mają potencjał, aby umożliwić identyfikację i kwantyfikację potencjalnych markerów, które mogą pomóc w wykrywaniu i prognozowaniu choroby1. Ostatnie postępy w dziedzinie spektrometrii mas przyspieszyły badania kliniczne na poziomie białek. Naukowcy starają się sprostać wyzwaniu, jakim jest skomplikowana patobiologia kilku chorób, wykorzystując proteomikę opartą na spektrometrii mas, która obecnie oferuje zwiększoną czułość identyfikacji i kwantyfikacji białek2. Dokładny pomiar ilościowy białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznej i przestrzennej współpracy między białkami u osób zdrowych i chorych3; Jednak taka analiza w skali całego proteomu nie jest łatwa.

Jednym z głównych ograniczeń profilowania proteomicznego próbek klinicznych jest złożoność próbek biologicznych. W celu zbadania proteomu choroby przebadano wiele różnych typów próbek, takich jak linie komórkowe, osocze i tkanki4,5. Linie komórkowe są szeroko stosowane jako modele w eksperymentach in vitro w celu naśladowania różnych etapów postępu choroby. Jednak jednym z głównych ograniczeń linii komórkowych jest to, że łatwo nabywają one zmiany genotypowe i fenotypowe podczas procesu hodowli komórek6. Płyny ustrojowe, takie jak osocze, mogą być atrakcyjnym źródłem do odkrywania biomarkerów; Jednak ze względu na dużą ilość białek i dynamiczny zakres stężenia białek, proteomika osocza jest nieco bardziej wymagająca7. W tym przypadku peptydy pochodzące z najliczniejszych białek mogą tłumić te pochodzące z białek o niskiej obfitości, nawet jeśli stosunek masy do ładunku jest taki sam6. Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat nastąpił postęp w technologiach zubożenia i frakcjonowania, uzyskanie dobrego pokrycia nadal pozostaje głównym ograniczeniem proteomiki osocza8,9. Preferowane jest wykorzystanie tkanek do proteomicznych badań biologii choroby, ponieważ próbki tkanek znajdują się najbardziej bliżej miejsc choroby i oferują wysokie informacje fizjologiczne i patologiczne, aby zapewnić lepszy wgląd w biologię choroby10,11.

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy uproszczony protokół dla ilościowej proteomiki próbek tkanek. Do przygotowania lizatu tkankowego użyliśmy buforu zawierającego 8 M mocznika, ponieważ bufor ten jest kompatybilny z badaniami opartymi na spektrometrii mas. Jednak obowiązkowe jest oczyszczenie peptydów w celu usunięcia soli przed wstrzyknięciem ich do spektrometru mas. Ważną kwestią, o której należy pamiętać, jest zmniejszenie stężenia mocznika do mniej niż 1 M przed dodaniem trypsyny do trawienia białek, ponieważ trypsyna wykazuje niską aktywność przy stężeniu 8 M mocznika. Wyjaśniliśmy dwa podejścia do ilościowej proteomiki globalnej: kwantyfikację opartą na znacznikach za pomocą iTRAQ (znaczniki izobaryczne do kwantyfikacji względnej i bezwzględnej) oraz kwantyfikację bez znaczników (LFQ). Proteomika ilościowa oparta na iTRAQ jest stosowana głównie do porównywania wielu próbek różniących się stanem biologicznym (np. próbki normalne kontra próbki chore lub poddane działaniu środka). Podejście to wykorzystuje odczynniki izobaryczne do oznaczania N-końcowych amin pierwszorzędowych peptydów12. Odczynniki iTRAQ zawierają jedną grupę reporterową N-metylopirazyny, grupę równoważącą i jedną grupę estrową N-hydroksysukcynimidu, która reaguje z N-końcowymi aminami pierwszorzędowymi peptydów13. Strawione peptydy z każdego stanu są znakowane określonym odczynnikiem iTRAQ. Po znakowaniu reakcja zostaje zatrzymana, a znakowane peptydy z różnych stanów są łączone w jednej probówce. Ta połączona mieszanina próbek jest analizowana za pomocą spektrometru mas w celu identyfikacji i kwantyfikacji. Po analizie MS/MS generowane są fragmenty jonów reporterowych o małych masach cząsteczkowych, a intensywność jonów reporterowych jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania białek.

Inne podejście, kwantyfikacja bez znaczników jest używana do określenia względnej liczby białek w złożonych próbkach bez znakowania peptydów stabilnymi izotopami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez instytucjonalne komisje rewizyjne oraz komisję etyki Indyjskiego Instytutu Technologii w Bombaju (IITB-IEC/2016/026). Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w tym badaniu.

1. Przygotowanie lizatu tkankowego

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki na lodzie, aby proteazy były nieaktywne. Upewnij się, że skalpele i wszelkie używane probówki są sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

  1. Weź ~ 30 mg tkanki do probówki do ubijania kulek, dodaj 200 μL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zwiruj ją.
    UWAGA: W tym badaniu do przygotowania lizatu pobrano świeżo mrożone tkanki guza mózgu ludzkiego. Protokół może być stosowany do każdej świeżo zamrożonej tkanki z pewnymi zmianami w zależności od rodzaju tkanek (tkanki miękkie lub twarde) i złożoności komórkowej tkanek.
  2. Następnie obróć probówkę, aby osadzić tkankę i ostrożnie usuń PBS za pomocą pipety. Wykonaj kolejne płukanie PBS, jeśli w tkance nadal pozostały ślady krwi.
  3. Dodać 300 μl buforu do lizy mocznika (8 M mocznika, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) i koktajl inhibitorów proteazy () zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Objętość buforu do lizy powinna być wystarczająca do zmielenia tkanki podczas procesu sonikacji i zawieszenia tego, co jest ekstrahowane. Zbyt mała ilość buforu do lizy może skutkować nieefektywną lizą tkanek, natomiast zbyt duża ilość buforu do lizy spowoduje rozcieńczenie lizatu białkowego.
  4. Umieść probówkę na lodzie i poddaj sonifikację tkanki o amplitudzie 40% przez 2,5 minuty z cyklami pulsacyjnymi 5 s (odpowiednio ON/OFF).
  5. Dodaj kulki cyrkonu do probówek i homogenizuj tkankę za pomocą ubijaka do kulek przez 90 s z 5-minutową inkubacją na lodzie. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  6. Gdy tkanka jest odpowiednio homogenizowana, inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut.
  7. Po inkubacji odwirować próbkę o sile 6,018 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia resztek komórek od supernatantu.
  8. Zebrać supernatant do świeżo oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C w postaci podwielokrotności do dalszego użycia.

2. Kwantyfikacja białek i kontrola jakości lizatów tkankowych

  1. Określić ilościowo stężenie białka w lizacie tkankowym za pomocą odczynnika Bradforda, jak opisano w pliku uzupełniającym 1.
  2. Po ilościowym określeniu białka uruchom 10 μg lizatu tkankowego na 12% żelu SDS-PAGE, aby sprawdzić jakość lizatu.
    UWAGA: Dalsze przetwarzanie musi być przeprowadzane wyłącznie w odniesieniu do lizatów, które przeszły kontrole jakości.

3. Trawienie enzymatyczne białek

UWAGA: Kroki trawienia enzymatycznego są pokazane w Rysunek 1a.

  1. Do trawienia weź 50 μg białek i dodaj ddH2O, aby uzupełnić objętość do 20 μl.
  2. Teraz przygotować 20 mM Tris (2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) z podstawowego (0,5 M TCEP), dodając 0,8 μl z wywaru do lizatu białkowego w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych w białkach i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
  3. Przygotować 40 mM jodoacetamidu (IAA) w ddH2O i dodać 1,6 μl w celu alkilowania zredukowanych reszt cysteiny. Inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać bufor rozcieńczający zawierający 25 mM Tris pH 8,0 i 1 mM CaCl2 w stosunku 1:8, aby rozcieńczyć stężenie mocznika w próbce do mniej niż 1 M. W tym momencie sprawdź pH.
    UWAGA: Jeśli używasz trypsyny jako enzymu trawiącego, upewnij się, że stężenie mocznika jest mniejsze niż 1 M.
  5. Aby przeprowadzić trawienie, dodaj trypsynę w stosunku enzym/substrat 1:50. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C w suchej łaźni wstrząsającej przez 16 godzin w celu nocnego trawienia.
    UWAGA: Enzym trypsyna jest wysoce reaktywną proteazą, która jest podatna na samotrawienie. Zachowaj szczególną ostrożność i szybko dodaj trypsynę nad lodem.
  6. Po 16 godzinach inkubacji wysuszyć strawione peptydy w koncentratorze próżniowym.

4. Odsalanie strawionych peptydów

UWAGA: Aby przeprowadzić odsalanie peptydów, użyj końcówek etapu C18.

  1. Aktywuj końcówkę stopnia C18, dodając 50 μl metanolu. Odwirować końcówkę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat zebrany na dnie probówki. Powtórz dwa razy.
  2. Dodaj 50 μl acetonitrylu w 0,1% kwasie mrówkowym, aby przepłukać końcówkę sceny. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat zebrany na dnie probówki. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  3. Dodać 50 μl 0,1% (v/v) FA, aby zrównoważyć kolumnę. Ponownie przeprowadzić wirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić filtrat.
  4. Rozpuść wysuszone strawione peptydy w 50 μl 0,1% kwasu mrówkowego.
    UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz końcówek stage podczas przechodzenia przez próbkę. Końcówki etapów nie powinny być całkowicie wysuszone na etapie wirowania, ponieważ suszenie może prowadzić do utraty peptydów.
  5. Dodać rozpuszczone peptydy do aktywowanej końcówki stopnia i przepuścić próbkę przez końcówkę stopnia przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok co najmniej cztery razy. Przechowywać przepływ w temperaturze 4 °C.
  6. Aby przepłukać próbkę, dodać 50 μl 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego. Powtórzyć etap wirowania i wyrzucić filtrat.
  7. W celu elucji peptydów dodać 50 μl 40% (v/v) ACN w 0,1% kwasie mrówkowym (v/v) i przepuścić przez końcówkę etapu przez odwirowanie. Zebrać filtrat do świeżej probówki. Powtórz ten krok z 50% i 60% ACN w 0,1% kwasie mrówkowym i zbierz filtrat w tej samej świeżej probówce.
  8. Wysuszyć odsolone peptydy zebrane w świeżej probówce za pomocą koncentratora próżniowego.
    UWAGA: Wysuszone odsolone peptydy są gotowe do wstrzyknięcia lub można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. W przypadku długotrwałego przechowywania (>6 miesięcy) peptydy należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Kwantyfikacja odsolonych peptydów

  1. Wysuszone odsolone peptydy rozpuścić w 0,1% FA.
  2. Przetrzyj fotometryczną płytkę pomiarową niestrzępiącą się chusteczką przy użyciu 70% etanolu.
  3. Użyj 2 μl 0,1% FA, aby ustawić ślepą próbę.
  4. Dodać 2 μl przygotowanych próbek na płytkę w kontrpróbach.
  5. Umieścić płytkę w spektrofotometrze i zmierzyć absorbancję przy 205 nm i 280 nm.
  6. Oblicz absorpcję molową (ε) za pomocą następującego wzoru:
    ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
    UWAGA: Absorpcja molowa (ε) jest miarą prawdopodobieństwa przejścia elektronowego lub tego, jak dobrze gatunek absorbuje określoną długość fali promieniowania, które na niego pada. Wartość ε powinna mieścić się w zakresie od 31 ml mg-1 cm-1 do 33 ml mg-1 cm-1. Jeśli wartość nie mieści się w zakresie, oznacza to, że próbki nie są prawidłowo trawione.
  7. Obliczyć stężenie peptydu w μg/μl, korzystając z następującego wzoru:
    Stężenie peptydu = Netto OD (205) / 0,051 * ε

6. Kwantyfikacja bez znaczników (LFQ) strawionych peptydów

UWAGA: Do oznaczania ilościowego bez etykiet, użyj parametrów LC i MS wymienionych w Pliku uzupełniającym 2. Dane o dużym zasięgu uzyskano, gdy w spektrometrze mas przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne tego samego typu próbki.

  1. Konfiguracja chromatografii cieczowej
    1. Po ilościowym określeniu odsolonych peptydów pobrać 2 μg peptydów do fiolki i uzupełnić objętość do 10 μl przy użyciu 0,1% FA. Stężenie odsolonych peptydów wyniesie 200 ng/μL.
    2. Otworzyć automatyczny próbnik systemu chromatografii cieczowej (patrz Tabela materiałów) i umieścić fiolkę w autosamplerze.
    3. Użyj 0.1% (v/v) FA, aby zrównoważyć kolumnę wstępną i kolumnę analityczną.
    4. Pobrać 1 μg odsolonego, strawionego peptydu z fiolki i załadować go do kolumny.
    5. Ustaw gradient LC zgodnie ze złożonością próbki. W tym eksperymencie gradient LC stosowano przez 120 minut do ilościowego oznaczania próbek tkanek bez znaczników.
  2. Konfiguracja MS: Przed optymalizacją jakichkolwiek testów proteomicznych należy przeprowadzić kontrolę jakości instrumentu, monitorując niektóre peptydy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przy użyciu dowolnego oprogramowania pod kątem przydatności systemu i analizując pokrycie BSA (Rysunek 2A,B). Parametry akwizycji zostały ustawione w przyrządzie za pomocą oprogramowania do akwizycji danych MS (patrz tabela materiałów).
    1. Otwórz oprogramowanie, kliknij dwukrotnie Konfiguracja instrumentu i wybierz szablon z peptides-ID z domyślnymi parametrami.
    2. Ustaw parametry MS za pomocą pliku uzupełniającego 2 i zapisz go jako nową metodę.
    3. Teraz otwórz oprogramowanie, aby wypełnić szczegóły próbki; kliknij dwukrotnie Ustawienia sekwencji i wprowadź szczegóły, takie jak typ próbki, nazwa próbki, lokalizacja zapisu pliku, plik metody instrumentu, objętość wstrzyknięcia i pozycja próbki.
    4. Po wypełnieniu wszystkich informacji wybierz wiersz i rozpocznij uruchamianie.

7. Kwantyfikacja oparta na znacznikach (iTRAQ) strawionych peptydów

UWAGA: Kwantyfikacja na podstawie etykiet może być przeprowadzona przy użyciu różnych etykiet izobarycznych, takich jak odczynniki iTRAQ lub TMT, itp. W tym przypadku iTRAQ 4-plex został użyty do znakowania strawionych peptydów z trzech próbek tkanek. Procedura etykietowania iTRAQ 4-plex jest opisana poniżej.

  1. Znakowanie strawionych peptydów za pomocą odczynników iTRAQ.
    UWAGA: W tym eksperymencie użyto peptydów z trzech próbek tkanek. Z każdej próbki tkanki pobiera się 80 μg strawionych peptydów do czterech probówek w celu oznakowania odczynnikami iTRAQ (114, 115, 116 i 117) (szczegółowe parametry doświadczalne znajdują się w pliku uzupełniającym 3).
    1. Przed użyciem odczynnika iTRAQ należy doprowadzić każdą fiolkę odczynnika do temperatury pokojowej (około 5 min). Obracać przez około 30 sekund, aby roztwór znalazł się na dnie każdej fiolki.
      UWAGA: Upewnij się, że w każdej fiolce powinno znajdować się 10-15 μl roztworu.
    2. W przypadku znakowania iTRAQ należy rozpuścić wysuszone peptydy w 20 μl buforu do rozpuszczania znajdującego się w zestawie do etykietowania iTRAQ.
    3. Rozpuść etykiety, dodając 70 μl etanolu z fiolki dołączonej do zestawu, mieszaj roztwór przez 30 s i wiruj przez 10 s.
      UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Dodać jednorodnie wymieszane etykiety iTRAQ (114, 115, 116 i 117) do odpowiednich probówek zawierających próbki peptydów i pozwolić na przeprowadzenie reakcji znakowania.
    5. Wymieszaj składniki każdej probówki, wirując probówkę przez 30 s, a następnie obracaj probówkę przez 10 sekund, aby sprowadzić mieszaninę z powrotem na dno probówki.
      UWAGA: Sprawdź pH roztworu za pomocą bibuły pH. pH powinno być większe niż 8; jeśli nie, dodać do 10 μl buforu do rozpuszczania, aby dostosować pH.
    6. Inkubować każdą probówkę w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Pod koniec reakcji zgasić nadmiar niezwiązanej etykiety w probówce, dodając wodę klasy MS.
    7. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny.
    8. Po zakończeniu inkubacji przenieś całą oznakowaną zawartość do jednej probówki i wysusz znakowane peptydy w koncentratorze próżniowym.
      UWAGA: Podobną procedurę etykietowania można zastosować w przypadku etykietowania TMT.
  2. Konfiguracja chromatografii cieczowej
    1. Rozpuść próbki w 0,1% kwasie mrówkowym, otwórz automatyczny podajnik próbek nano LC i umieść próbki w autosamplerze. Użyj parametrów wymienionych w Pliku uzupełniającym 2 do konfiguracji LC.
    2. Ustaw gradient LC zgodnie ze złożonością próbki. W tym eksperymencie zastosowano gradient LC wynoszący 180 minut do ilościowego oznaczania próbek tkanek na podstawie znaczników (iTRAQ).
      UWAGA: W przypadku mniej złożonych próbek, krótki gradient może skutecznie oddzielić większość peptydów. Jeśli jednak próbka jest bardzo złożona, użyj dłuższego gradientu, aby lepiej oddzielić peptydy.
  3. Konfiguracja MS dla techniki iTRAQ
    1. Ustaw wszystkie parametry MS dla oceny ilościowej opartej na etykiecie w taki sam sposób, jak w przypadku oznaczania ilościowego bez etykiety, z wyjątkiem energii zderzenia, która została ustawiona na 35% dla fragmentacji MS/MS w kwantyfikacji opartej na etykiecie.

8. Analiza danych

  1. Przeanalizować surowe (widmo MS/MS) pliki uzyskane ze spektrometru mas LC za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Baza danych Human Reference Proteome firmy Uniprot (UP000005640) zawierająca 71 785 sekwencji białek została wykorzystana do uzyskania tożsamości białek za pomocą wyszukiwarek Sequest HT i Mascot (v2.6.0). Parametry dla oceny ilościowej bez etykiety i oceny ilościowej opartej na etykietach są opisane w pliku uzupełniającym 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy dwóch różnych podejść do proteomiki odkrywania: proteomiki bez znaczników i proteomiki opartej na etykietach. Profil białkowy próbek tkanek na SDS-PAGE wykazał nienaruszone białka i mógł być brany pod uwagę do analizy proteomicznej (Rysunek 2A). Kontrola jakości urządzenia była monitorowana za pomocą oprogramowania do sprawdzania przydatności systemu i wykazała dzienne zmiany w wydajności urządzenia (Rysunek 2B). Zaobserwowaliśmy 91% pokrycie sekwencji próbki BSA ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika tkanek próbek biologicznych umożliwia nam badanie nowych potencjalnych biomarkerów związanych z różnymi etapami postępu choroby. Wyjaśnia również mechanizm sygnalizacji i szlaki związane z postępem choroby. Opisany protokół ilościowej analizy proteomicznej tkanek zapewnia powtarzalne dane o dobrym pokryciu. Większość kroków została zaadaptowana z instrukcji producenta. W celu uzyskania wysokiej jakości danych najważniejsze są następujące kroki. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy projektowi MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projektowi #34_IITB do SS i MASSFIITB Facility w IIT Bombay wspieranym przez Departament Biotechnologii (BT/PR13114/INF/22/206/2015) do przeprowadzenia wszystkich eksperymentów związanych z MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Acetonitryl (klasa MS)Fisher ScientificA/0620/21
Albumina surowicy bydlęcejHiMediaTC194-25G
Chlorek wapniaFischer SicificBP510-500
Kwas mrówkowy (klasa MS)Fisher Scientific147930250
JodoacetamidSigma1149-25G
Izopropanol (klasa MS)Fisher ScientificQ13827
Chlorek magnezuFischer ScienificBP214-500
Metanol (klasa MS)Fisher ScientificA456-4
Woda klasy MSPierce51140
Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaHiMediaTL1006-500ML
Koktajl inhibitorów proteazyRoche Diagnostics11873580001
Chlorek soduMerckDF6D661300
TCEPSigma646547
Tris BaseMerck648310
Trypsyna (klasa MS)Pierce90058
Odczynnik BradfordBio-Rad
MocznikMerckMB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 kolumnaThermo25002-102130
MikropipetyGilsonF167380
StageMilliPoreZTC18M008
Kulki cyrkonowe/krzemionkoweBioSpec Produkty11079110z
Sprzęt
Ubijak do koralików (homogenizator)Bertin MinilysP000673-MLYS0-A
Czytnik mikropłytek (spektrofotometr)TermometrMultiSkan Go
pH-metrEutechCyberScan pH 510
Sonics Materials, IncVCX 130
Spektrometr
Nano LCThermoEASY-nLC1200
Koncentrator próżniowyThermoSavant ISS 110
Software
ThrermoOdkrywca Proteomu 2.2.0.388
5000205 masowy Thermo 88880028 Orbitrap Fusion Thermo FSN 10452 Proteome Discoverer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
  2. Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
  3. Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
  4. Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13(2017).
  5. Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
  6. Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
  7. Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  8. Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
  9. Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557(2016).
  10. Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
  11. Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140(2014).
  12. Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
  13. Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
  14. Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mass Spectrometry ProteomicsTissue Sample PreparationLabel Free QuantificationLabel Based QuantificationiTRAQ LabelingOrbitrap FusionLC MS AnalysisProtein DigestionPeptide DesaltingBiomarker Discovery

Powiązane artykuły